一种蜜蜂抗寒能力的鉴别方法及蜜蜂抗寒基因库

摘要

本发明公开了一种蜜蜂抗寒能力的鉴别方法及抗寒基因库，属于蜜蜂鉴定领域。本发明通过全基因组测序方法，在长白山中华蜜蜂中筛选得到了与蜜蜂抗寒性状相关的基因273个，构建了蜜蜂抗寒基因库，为进一步进行抗寒蜜蜂的品种鉴定和分子育种提供了有用的工具。本发明提供的鉴定蜜蜂抗寒能力的方法，通过测定待测蜜蜂品种基因表达量并与本发明提供的基因库进行比对，可以快速判断待测蜜蜂品种的抗寒能力，对寒冷地区蜜蜂养殖业具有重要价值。

说明书

技术领域

本发明涉及蜜蜂鉴定领域，特别是涉及一种蜜蜂抗寒能力的鉴别方法及蜜蜂抗寒基因库。

背景技术

抗寒性状是蜜蜂重要的生物学性状之一，与养蜂业的经济效益密切相关，蜜蜂耐寒性能的高低是影响其繁殖情况、越冬死亡率、分布范围和扩散速度的重要因素。在早春和晚秋时期，蜜蜂个体面对低温应激的几率很大，会造成蜜蜂的大量损伤和蜂群群势的下降；在冬季，蜂群以众多工蜂和蜂王的组合通过聚集成团的方式以抵御严寒，蜂群的安全越冬对来年的养蜂生产至关重要。因此，低温冷害是限制养蜂业生产的重要非生物逆境胁迫，抗寒性种质基因资源的挖掘和筛选，能加快推进蜜蜂抗寒的育种进程，为蜜蜂分子标记辅助育种提供基础理论依据。

全基因组重测序技术是群体基因组学研究的有效手段，可以快速进行种质资源普查筛选，寻找到大量遗传变异，实现遗传进化分析及重要性状候选基因的预测，具备高基因组覆盖度、高密度的变异位点产出等优点。随着测序成本降低和拥有参考基因组序列物种增多，全基因组重测序技术大量应用于模式生物遗传变异和进化研究，可从分子层面揭示该物种的进化机制和环境适应性。

长白山中华蜜蜂是长期适应冬季寒冷，无霜期短等严酷生态环境的强大适应性特殊种群，可以在户外零下40℃的低温条件下自然过冬。因此，针对长白山中华蜜蜂抗寒基因进行鉴别以提供一种蜜蜂抗寒基因库将为抗寒蜜蜂的品种鉴定及分子育种提供工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种蜜蜂抗寒能力的鉴别方法及蜜蜂抗寒基因库，以解决上述现有技术存在的问题，提供一种鉴别抗寒蜜蜂品种的方法以及能够用于抗寒蜜蜂鉴定及分子育种的抗寒基因库。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案之一，提供了一种蜜蜂抗寒能力的鉴别方法，具体步骤如下：

取蜜蜂样品，进行蜜蜂样品头胸部基因组DNA的提取及精准定量，随机打断成长度为350bp的片段构建高质量文库，检测插入片段，符合预期后使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量，上机测序；

将测序得到的原始图像数据经碱基识别转化为序列数据，过滤后得到高质量的有效数据；

得到的有效数据通过BWA软件，设置参数为mem-t 4-k 32-M，比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复(设置参数为rmdup)，检测抗寒基因是否差异表达，所述的抗寒基因为如下所述的基因：APICC_04184、APICC_00158、APICC_00347、APICC_00392、APICC_00415、APICC_00538、APICC_00591、APICC_00592、APICC_00593、APICC_00594、APICC_00595、APICC_00693、APICC_00766、APICC_00830、APICC_00831、APICC_00832、APICC_00890、APICC_00891、APICC_00904、APICC_00909、APICC_00932、APICC_00958、APICC_00977、APICC_01000、APICC_01035、APICC_01048、APICC_01112、APICC_01115、APICC_01116、APICC_01214、APICC_01215、APICC_01216、APICC_01223、APICC_01224、APICC_01347、APICC_01382、APICC_01404、APICC_01423、APICC_01424、APICC_01425、APICC_01439、APICC_01507、APICC_01508、APICC_01513、APICC_01522、APICC_01645、APICC_01758、APICC_01805、APICC_01827、APICC_01852、APICC_02032、APICC_02033、APICC_02039、APICC_02042、APICC_02104、APICC_02137、APICC_02145、APICC_02174、APICC_02221、APICC_02258、APICC_02285、APICC_02286、APICC_02363、APICC_02384、APICC_02391、APICC_02392、APICC_02393、APICC_02394、APICC_02395、APICC_02396、APICC_02397、APICC_02426、APICC_02440、APICC_02498、APICC_02576、APICC_02577、APICC_02578、APICC_02579、APICC_02723、APICC_02724、APICC_02759、APICC_02811、APICC_02855、APICC_02890、APICC_02963、APICC_02964、APICC_03041、APICC_03098、APICC_03193、APICC_03194、APICC_03195、APICC_03284、APICC_03321、APICC_03322、APICC_03355、APICC_03397、APICC_03558、APICC_03559、APICC_03560、APICC_03628、APICC_03629、APICC_03771、APICC_03772、APICC_03858、APICC_03961、APICC_03962、APICC_03963、APICC_04112、APICC_04171、APICC_04206、APICC_04217、APICC_04218、APICC_04219、APICC_04293、APICC_04445、APICC_04538、APICC_04539、APICC_04546、APICC_04547、APICC_04582、APICC_04684、APICC_04710、APICC_04773、APICC_04774、APICC_04775、APICC_05025、APICC_05044、APICC_05171、APICC_05202、APICC_05208、APICC_05209、APICC_05237、APICC_05426、APICC_05474、APICC_05486、APICC_05487、APICC_05537、APICC_05538、APICC_05569、APICC_05601、APICC_05617、APICC_05618、APICC_05707、APICC_05709、APICC_05768、APICC_05791、APICC_05859、APICC_05860、APICC_05868、APICC_05869、APICC_05870、APICC_05871、APICC_05881、APICC_05947、APICC_05993、APICC_06063、APICC_06066、APICC_06067、APICC_06068、APICC_06088、APICC_06189、APICC_06224、APICC_06256、APICC_06344、APICC_06373、APICC_06374、APICC_06375、APICC_06411、APICC_06412、APICC_06413、APICC_06485、APICC_06570、APICC_06598、APICC_06615、APICC_06616、APICC_06838、APICC_06936、APICC_07046、APICC_07052、APICC_07118、APICC_07224、APICC_07285、APICC_07333、APICC_07340、APICC_07341、APICC_07364、APICC_07383、APICC_07475、APICC_07503、APICC_07505、APICC_07520、APICC_07521、APICC_07543、APICC_07583、APICC_07597、APICC_07644、APICC_07647、APICC_07710、APICC_07729、APICC_07775、APICC_07780、APICC_07844、APICC_07866、APICC_07914、APICC_07929、APICC_07956、APICC_07957、APICC_07958、APICC_07962、APICC_07968、APICC_08111、APICC_08112、APICC_08114、APICC_08145、APICC_08188、APICC_08189、APICC_08193、APICC_08200、APICC_08235、APICC_08286、APICC_08471、APICC_08498、APICC_08514、APICC_08662、APICC_08663、APICC_08737、APICC_08738、APICC_08798、APICC_08849、APICC_08850、APICC_08880、APICC_08886、APICC_09022、APICC_09032、APICC_09033、APICC_09082、APICC_09138、APICC_09173、APICC_09174、APICC_09177、APICC_09178、APICC_09232、APICC_09233、APICC_09317、APICC_09356、APICC_09394、APICC_09457、APICC_09477、APICC_09494、APICC_09503、APICC_09517、APICC_09552、APICC_09553、APICC_09556、APICC_09591、APICC_09602、APICC_09608、APICC_09628、APICC_09667、APICC_09684、APICC_09703、APICC_09704、APICC_09733、APICC_09777、APICC_09779、APICC_09810、APICC_09902、APICC_09918、APICC_09936、APICC_09988、APICC_10005、APICC_10057、APICC_10146。

在一些优选的实施方案中，所述的过滤方法为：

1)过滤掉含有接头序列的读段对；

2)当单端测序读段中N的含量超过该条读段长度比例的10％时，去除此对读段对；

3)当单端测序读段中含有的Q＜＝5碱基数超过该条读段长度比例的50％时，去除此对读段对。

技术方案之二，提供了一种蜜蜂抗寒基因库，所述的基因库由以下基因组成：APICC_04184、APICC_00158、APICC_00347、APICC_00392、APICC_00415、APICC_00538、APICC_00591、APICC_00592、APICC_00593、APICC_00594、APICC_00595、APICC_00693、APICC_00766、APICC_00830、APICC_00831、APICC_00832、APICC_00890、APICC_00891、APICC_00904、APICC_00909、APICC_00932、APICC_00958、APICC_00977、APICC_01000、APICC_01035、APICC_01048、APICC_01112、APICC_01115、APICC_01116、APICC_01214、APICC_01215、APICC_01216、APICC_01223、APICC_01224、APICC_01347、APICC_01382、APICC_01404、APICC_01423、APICC_01424、APICC_01425、APICC_01439、APICC_01507、APICC_01508、APICC_01513、APICC_01522、APICC_01645、APICC_01758、APICC_01805、APICC_01827、APICC_01852、APICC_02032、APICC_02033、APICC_02039、APICC_02042、APICC_02104、APICC_02137、APICC_02145、APICC_02174、APICC_02221、APICC_02258、APICC_02285、APICC_02286、APICC_02363、APICC_02384、APICC_02391、APICC_02392、APICC_02393、APICC_02394、APICC_02395、APICC_02396、APICC_02397、APICC_02426、APICC_02440、APICC_02498、APICC_02576、APICC_02577、APICC_02578、APICC_02579、APICC_02723、APICC_02724、APICC_02759、APICC_02811、APICC_02855、APICC_02890、APICC_02963、APICC_02964、APICC_03041、APICC_03098、APICC_03193、APICC_03194、APICC_03195、APICC_03284、APICC_03321、APICC_03322、APICC_03355、APICC_03397、APICC_03558、APICC_03559、APICC_03560、APICC_03628、APICC_03629、APICC_03771、APICC_03772、APICC_03858、APICC_03961、APICC_03962、APICC_03963、APICC_04112、APICC_04171、APICC_04206、APICC_04217、APICC_04218、APICC_04219、APICC_04293、APICC_04445、APICC_04538、APICC_04539、APICC_04546、APICC_04547、APICC_04582、APICC_04684、APICC_04710、APICC_04773、APICC_04774、APICC_04775、APICC_05025、APICC_05044、APICC_05171、APICC_05202、APICC_05208、APICC_05209、APICC_05237、APICC_05426、APICC_05474、APICC_05486、APICC_05487、APICC_05537、APICC_05538、APICC_05569、APICC_05601、APICC_05617、APICC_05618、APICC_05707、APICC_05709、APICC_05768、APICC_05791、APICC_05859、APICC_05860、APICC_05868、APICC_05869、APICC_05870、APICC_05871、APICC_05881、APICC_05947、APICC_05993、APICC_06063、APICC_06066、APICC_06067、APICC_06068、APICC_06088、APICC_06189、APICC_06224、APICC_06256、APICC_06344、APICC_06373、APICC_06374、APICC_06375、APICC_06411、APICC_06412、APICC_06413、APICC_06485、APICC_06570、APICC_06598、APICC_06615、APICC_06616、APICC_06838、APICC_06936、APICC_07046、APICC_07052、APICC_07118、APICC_07224、APICC_07285、APICC_07333、APICC_07340、APICC_07341、APICC_07364、APICC_07383、APICC_07475、APICC_07503、APICC_07505、APICC_07520、APICC_07521、APICC_07543、APICC_07583、APICC_07597、APICC_07644、APICC_07647、APICC_07710、APICC_07729、APICC_07775、APICC_07780、APICC_07844、APICC_07866、APICC_07914、APICC_07929、APICC_07956、APICC_07957、APICC_07958、APICC_07962、APICC_07968、APICC_08111、APICC_08112、APICC_08114、APICC_08145、APICC_08188、APICC_08189、APICC_08193、APICC_08200、APICC_08235、APICC_08286、APICC_08471、APICC_08498、APICC_08514、APICC_08662、APICC_08663、APICC_08737、APICC_08738、APICC_08798、APICC_08849、APICC_08850、APICC_08880、APICC_08886、APICC_09022、APICC_09032、APICC_09033、APICC_09082、APICC_09138、APICC_09173、APICC_09174、APICC_09177、APICC_09178、APICC_09232、APICC_09233、APICC_09317、APICC_09356、APICC_09394、APICC_09457、APICC_09477、APICC_09494、APICC_09503、APICC_09517、APICC_09552、APICC_09553、APICC_09556、APICC_09591、APICC_09602、APICC_09608、APICC_09628、APICC_09667、APICC_09684、APICC_09703、APICC_09704、APICC_09733、APICC_09777、APICC_09779、APICC_09810、APICC_09902、APICC_09918、APICC_09936、APICC_09988、APICC_10005、APICC_10057、APICC_10146。

技术方案之三，提供了一种所述的鉴定方法或所述的基因库在抗寒蜜蜂品种鉴定中的应用。

技术方案之四，提供了一种所述的鉴定方法或所述的基因库在抗寒蜜蜂育种中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过全基因组测序方法，在长白山中华蜜蜂中筛选得到了与蜜蜂抗寒性状相关的基因273个，构建了蜜蜂抗寒基因库。通过测定待测蜜蜂品种基因表达量并与本发明提供的基因库进行比对，可以快速判断待测蜜蜂品种的抗寒能力。本发明提供的基因库还为进一步进行抗寒蜜蜂的分子育种提供了有用的工具。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明筛选得到的基因，图中框出的部分为筛选结果；

图2为本发明筛选得到基因的GO分析结果；

图3为本发明筛选得到基因的KEGG富集分析结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。本发明仅描述了优选的方法和材料，但与本文所述相似或等同的任何方法和材料均能够实施本发明。

本发明所使用的材料如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。

实施例1

耐寒性状相关基因的筛选

1、实验材料

1.1实验动物选择

以长白山中华蜜蜂的耐寒性状为目标性状，选择适应干寒环境性状明显的长白山中华蜜蜂生态型样品17只(来自长白山中华蜜蜂种质核心区的吉林省)，适应湿热环境性状明显的海南中华蜜蜂生态型样品10只(来自海南中华蜜蜂种质核心区的海南省)。

1.2样品采集

随机采集活体健康蜜蜂样品，置于75％或无水乙醇中浸泡运输，也可以干冰、液氮等低温方式运输，放入-80℃超低温冰箱内保存备用。

2、实验方法

进行蜜蜂样品头胸部基因组DNA的提取及精准定量，检验合格的DNA样品通过Covaris破碎机随机打断成长度为350bp的片段，随后采用TruSeq Library ConstructionKit进行高质量文库的构建，之后使用Agilent2100对文库的插入片段(insert size)进行检测，符合预期后使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量，最后根据文库的有效浓度及数据产出需求在Illumina平台进行PE150上机测序。

将测序得到的原始图像数据经碱基识别(base calling)转化为序列数据，这些原始测序数据(sequenced reads)中包含的接头信息，低质量碱基以及未测出的碱基等，会对后续的信息分析造成很大的干扰。我们使用以下方法进行原始数据的过滤：(1)过滤掉含有接头(adapter)序列的读段对(reads pair)，(2)当单端测序读段(read)中N的含量超过该条读段(read)长度比例的10％时，去除此对读段对(paired reads)，(3)当单端测序读段(read)中含有的低质量(Q＜＝5)碱基数超过该条读段(read)长度比例的50％时，去除此对读段对(paired reads)。经过对测序数据的严格过滤，得到高质量的有效数据(cleandata)。

有效的高质量测序数据通过BWA软件(设置参数为mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复(设置参数为rmdup)。使用的参考基因组版本为GCA_002290385.1_ApisCC1.0_genomic.fa，基因组大小为228，791，026bp。

用SAMTOOLS软件进行群体SNP的检测，通过以下方法过滤和筛选得到高质量的SNPs：(1)SNP的支持数(覆盖深度)在3以上，(2)mis(缺失)比例小于10％，(3)maf(最小次等位基因频率)大于1％。之后，利用ANNOVAR软件对SNP检测结果进行功能注释。

以Fst和θπ为指标进行选择消除分析，选择θπ&Fst的的前5％区域，共同筛选较强的选择信号，以进行长白山中华蜜蜂群体耐寒目标基因的筛选，增加了结果的精确度和准确度，结果如图1所示。

通过与参考基因组进行比对，对受选择的基因组区域内的基因进行注释。将选择消除分析后得到的受选择基因区域根据GO、KEGG数据库进行功能注释，对筛选出的区域进行基因功能富集。GO富集分析比对pfam数据库，得到GO term，使用goseq进行富集分析；KOBAS软件进行KEGG富集分析，使用的物种为Apis mellifera(honey bee)，设置blastx参数-evalue 1e-5-m8。GO富集与KEGG通路结果如图2和图3所示。

3.数据分析结果

通过筛选具有较高Fst值和θπratio值的基因组区域，鉴定出基因组中受到自然选择的片段，得到长白山中华蜜蜂群体中强烈受选择的基因数目为273个(表1)。它们参与到1621个GO项和40个KEGG通路，以P-value值≤0.05为阈值，显著富集的有99个GO项和5个KEGG通路，其中部分通路与已报道可能与昆虫抗寒相关通路一致，显示本发明构建抗寒基因库的准确性。这些基因将作为蜜蜂抗寒性状的候选基因库，在蜜蜂抗寒能力研究及抗寒蜜蜂的遗传育种中发挥作用。通过对蜜蜂品种的相关基因表达量进行检测，也能够判断该品种的抗寒能力。

表1鉴定出的长白山中华蜜蜂抗寨性状基因

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。