一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用

摘要

本发明属于生物医药领域，涉及一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用，其由外泌体膜包被纳米颗粒PLGA@Dnmt3aossmartsilencer形成；所述的外泌体膜从骨髓来源的M2巨噬细胞分离得到；所述的纳米颗粒PLGA@Dnmt3aossmartsilencer由聚乳酸‑乙醇酸共聚物PLGA和Dnmt3aossmartsilencer共乳化形成。相对于现有技术，本发明使用EM‑PLGA@Dnmt3aossmartsilencer抑制过敏性哮喘(AA)中M2巨噬细胞极化非常显著，该仿生药有效地积累在肺部并促进了基因沉默，同时减少了炎性细胞对气道的浸润程度。因此，基于M2巨噬细胞外泌体膜的PLGA NP有助于将治疗性Dnmt3aossmartsilencer递送至气道，指导其在AA小鼠模型中更有效的治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

全世界有3亿人患有哮喘，估计到2025年将影响4亿，过敏性哮喘(AA)占儿童哮喘病例的90％，占成人哮喘病例的50％。巨噬细胞是肺中最丰富的免疫细胞(约占所有免疫细胞的70％)，它们在环境变应原引起的气道炎症中起着重要的作用。过继转移M2巨噬细胞可加重小鼠过敏性气道炎症，表明M2巨噬细胞的极化在AA发作过程中起重要作用。因此，开发针对M2巨噬细胞的新策略被认为是治疗AA的一种有前途的方法。

在我们先前的研究中，成千上万个lncRNA在M1/M2极化的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)中差异表达。其中，Dnmt3aos(DNA甲基转移酶3A，相反链)是一种已知的lncRNA，位于Dnmt3a的反义链上。并且我们已经证明Dnmt3aos在M2巨噬细胞中高表达并且参与调节Dnmt3a的表达。Dnmt3aos和Dnmt3a的表达是协调一致的，在巨噬细胞极化中起关键作用。因此，M2巨噬细胞中的Dnmt3aos可能是AA的良好治疗靶标，但其在过敏性哮喘中的作用尚不清楚。

由3个小干扰RNA(siRNA)和3个反义寡核苷酸(ASO)组成的smart silencer在介导靶基因特异性沉默中起着重要作用。由于其不稳定性，有限的细胞摄取和不充分的血液循环，游离的ASO/siRNA在临床治疗中几乎不可能应用。为了克服ASO/siRNA传递的障碍，更高效并且更安全的传递载体对于ASO或siRNA治疗剂的研究和生产至关重要，例如脂质基颗粒和纳米颗粒(NP)。由于其良好的生物降解性和生物相容性，欧洲药品管理局(EMA)和美国食品药物管理局(FDA)已批准将聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)用于药物和生物分子的输送，可生物吸收的缝合线，生物成像和光疗和组织再生。特别是，载有siRNA的PLGA NPs表现出持续释放的特性，如先前报道的那样，在第一天释放35％，并显示超过10天的持续释放。因此，PLGA包裹Dnmt3aos的smart silencer对靶细胞的持续调控是值得研究的。

由于纳米载体的迅速发展，新的药物/基因递送载体也正在出现，例如细胞来源的外泌体，尤其是外泌体的膜，它们表现出优异的靶向性。从亲代细胞自然遗传的器官嗜性赋予外泌体以一系列表面粘附蛋白和特定的载体配体，以实现精确的货物穿梭。作为一种天然载体，外泌体可以将外源性miRNA或siRNA体内递送至靶细胞或组织，以调节基因表达并抑制疾病进展。然而，常规转染基因，外泌体中基因的表达较少，并且最近的研究还证明，当电穿孔诱导siRNA进入外泌体时，siRNA易于降解，表明需要建立更可靠的方案。研究表明某些NP可以与siRNA或ASO形成复合物，这种纳米复合物的形成对于完全保护RNA，防止其降解并使它们能够通过胞吞作用和细胞内释放进行细胞传递非常重要。因此，为了进一步改善NP的生物分布，稳定性，功效和生物相容性，我们迫切需要建立基于外泌体修饰的PLGA系统，以形成结合了这两种系统优点的复合物。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用，该仿生药有效地积累在肺部并促进了基因沉默，同时减少了炎性细胞对气道的浸润程度。

为了克服上述缺陷，本发明采用的技术方案包括：一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒，其特征在于，其由外泌体膜(即M2巨噬细胞外泌体膜)包被纳米颗粒(即PLGA@Dnmt3aos

一种M2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒，其由外泌体膜包被纳米粒子形成，所述的纳米粒子为表面与聚醚酰亚胺PEI偶联的纳米颗粒PLGA@Dnmt3aos

一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)纳米颗粒PLGA@Dnmt3aos

2)骨髓M2巨噬细胞外泌体膜的制备；

3)在纳米颗粒PLGA@Dnmt3aos

在步骤1)和2)之间，还包括使纳米颗粒PLGA@Dnmt3aos

步骤1)具体为：将60μg PLGA、2ug Dnmt3aos

使纳米颗粒PLGA@Dnmt3aos

步骤2)具体为：极化骨髓巨噬细胞向M2型转换，收集M2巨噬细胞的上清液，离心沉淀，除去细胞碎片；将最后的上清液离心，以获得外泌体；将收获的外泌体重悬于冰冷的TM缓冲液中，反复冻融5次；添加0.25M蔗糖重悬，离心；收集上清液，进一步离心，以收集沉淀为外泌体膜。

将外泌体膜和表面偶联PEI的PLGA@Dnmt3aos

本发明的又一个目的是提供包含前述的M2巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒的过敏性哮喘治疗性药物或者药物载体。

本发明的另一个目的是提供所述的制备方法在制备过敏性哮喘治疗性药物或者药物载体中的用途。

相对于现有技术，本发明使用EM-PLGA@Dnmt3aos

附图说明

图1.外泌体膜修饰的PLGA NPs传递Dnmt3aos

图2.仿生纳米颗粒的组装和表征。(A)代表性的TEM图像。(B)大小分布。1：PLGA@Dnmt3aos

图3.M2巨噬细胞在体外对EM-PLGA@Dnmt3aos

图4.AA小鼠中EM-PLGA@Dnmt3aos

图5.体内M2巨噬细胞对EM-PLGA@Dnmt3aos

图6.EM-PLGA@Dnmt3aos

图7.EM-PLGA@Dnmt3aos

图8.EM-PLGA@Dnmt3aos

图9.哮喘小鼠表现出异常的lncRNA Dnmt3aos和Dnmt3a表达。(A)H&E染色(放大倍数200×和400×，比例尺：200μm)。(B)在BALF中对巨噬细胞进行分选。(C)在BALF的巨噬细胞中检测到Dnmt3aos和Dnmt3a表达。将mRNA表达水平分别标准化为GAPDH，并使用2

图10.M2巨噬细胞的外泌体膜没有极化能力。(A)来自M2巨噬细胞和外泌体的CD9，CD63和HSP70的蛋白质印迹分析。(B)用20ng/mL IL-4(PeproTech)处理BMDM，以产生M2巨噬细胞。同时，我们在M0巨噬细胞中添加M2巨噬细胞的外泌体或外泌体膜(100μg/mL)。刺激48小时后，收集细胞以通过qRT-PCR进行鉴定。(C)M2巨噬细胞的外泌体和外泌体膜的蛋白质电泳。结果表示平均值±SEM。(每组n＝3孔。ns，无显著性差异，***P，<0.001)。

图11.在体内使用EM-PLGA@Dnmt3aos

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的实施方式作更进一步的说明。

在本发明中，我们探索了由M2巨噬细胞外泌体膜包被的仿生纳米颗粒(EM-PLGA@Dnmt3aos

1.材料与方法

1.1 小鼠

C57BL/6(H-2d)雌性小鼠(6-8周，20-22g)购自青龙山实验动物中心(南京，中国)，并饲养在无病原体的SPF级动物房中。所有动物实验均根据《实验动物的护理和使用指南》(中华人民共和国卫生部，1998)和皖南医学院实验动物伦理委员会的指南进行。所有实验方案均由皖南医学院动物伦理委员会评估并批准(许可号：20130138)。

1.2 诱发过敏性哮喘

为了诱导过敏性哮喘，在实验的第0、7和14天，将100μg Der f1经腹腔注射给C57BL/6小鼠。在第21-28天，每天通过雾化器将Der f1致敏给小鼠，持续15分钟，并在最后一次雾化后24小时处死小鼠。

1.3 PLGA@Dnmt3aos

PLGA NPs是根据我们以前的双重乳液溶剂蒸发法(W1/O/W2)制备的。为了生产PLGA@Dnmt3aos

为了增强NPs(即前述的纳米颗粒)连接蛋白(包括外泌体膜)的能力，我们进一步用PEI(即聚醚酰亚胺)修饰了纳米球(即PLGA@Dnmt3aos

表1.smart silencer序列

以上序列依次为SEQ ID NO.1-6。

Dnmt3aos

表2.引物序列

以上序列依次为SEQ ID NO.7-24。表2中的引物是倍数变化条形图里所检测基因的引物。

1.4 从骨髓巨噬细胞(BMDMs，M2)中分离外泌体

使用先前描述(·Lv et al.FASEB J.2020；34(4):5077-5091.PMID:32052888)的方法极化源自骨髓的M2巨噬细胞(即极化骨髓巨噬细胞，使其向M2型转换)。收集M2巨噬细胞的上清液，以1500rpm离心20分钟使细胞沉淀，然后以10，000×g离心30分钟以除去细胞碎片。将最后的上清液(即经过前述的细胞沉淀、除去细胞碎片步骤后所得的上清液)以100，000×g超速离心4h，以获得外泌体。将外泌体重悬于PBS中，并在使用前储存在-80℃下。

随后，使用BCA蛋白检测试剂盒确定纯化的外泌体的蛋白浓度。Western blot检测TSG101，CD9和HSP70在外泌体中的表达。使用粒子跟踪分析仪(Particle Metrix，德国)测量尺寸分布。使用PALS Zeta仪器(布鲁克哈芬仪器公司)来测量Zeta电位。用TEM观察外泌体的大小和形态。

1.5 外泌体膜的分离及其极化能力的检测

简而言之，分离外泌体膜。将步骤1.4收获的外泌体重悬于冰冷的Tris-镁缓冲液(TM缓冲液，pH 7.4、0.01M Tris和0.001M MgCl

为了评估外泌体膜的安全性，我们检测了外泌体膜的极化能力，我们首先制备了小鼠骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM，M0)。然后用20ng/mL IL-4处理BMDM,我们在其他孔中添加M2巨噬细胞的外泌体或外泌体膜(100μg/mL)。刺激48小时后，收集得到的细胞用于qRT-PCR鉴定。

1.6 EM-PLGA@Dnmt3aos

巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒(即EM-PLGA@Dnmt3aos

Cy5标记的Dnmt3aos

如上所述制备EM-PLGA@Dnmt3aos

1.7 Dnmt3aos

为了检测纳米粒子的稳定性，将PLGA@Dnmt3aos

1.8 PLGA@Dnmt3aos

使用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 800，德国)对PLGA@Dnmt3aos

1.9 体外细胞摄取

将BMDM(M2巨噬细胞)接种在24孔板中6小时。接下来，将外泌体修饰的PLGA@Dnmt3aos

1.10 体外测定Dnmt3aos/Dnmt3a表达

将BMDM(M2巨噬细胞)接种在6孔板中(1×106细胞/孔)，并以200nM的剂量与EM-PLGA@Dnmt3aos

1.11 EM-PLGA@Dnmt3aos

1.11.1 总IgE和Der f1特异性IgG的测量

根据说明书收集小鼠血清用于酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(R&D Systems)来检测总IgE的水平。

1.11.2 气道高反应性检测

用戊巴比妥(Sigma-Aldrich)以25mg/kg体重的剂量麻醉小鼠。使用FinePointeRC系统(Buxco Research Systems)测量气道阻力。

1.11.3 肺组织病理学

为了进行进一步的组织学分析，随后将哮喘小鼠的肺组织取出，并将其在4％多聚甲醛中固定24小时。随后，进行苏木精和曙红(H&E)染色和高碘酸席夫(PAS)染色以评估肺部炎症。

1.11.4 ELISA评估细胞因子

根据说明书使用ELISA试剂盒(杭州MultiSciences(Lianke)Biotech Co.，Ltd.)在BALF中对IL-4，IL-5和IL-13细胞因子水平进行定量。

1.11.5 流式细胞仪分析

根据说明书将从BALF收集的细胞与不同的抗体一起孵育。在Beckman FC500流式细胞仪上分析细胞，并使用FlowJo软件包分析数据。

1.11.6 通过qRT-PCR和Western blot检测Dnmt3aos/Dnmt3a的体内表达

将EM-PLGA@Dnmt3aos

1.12 体内成像和分布分析

构建哮喘小鼠评估EM-PLGA@Dnmt3aos

1.13 体内细胞摄取

将等体积(200μL)的Cy5标记的EM-PLGA@Dnmt3aos

另一方面，以1200×g离心10分钟收集的肺细胞，并用PE-Cy7标记的抗F4/80，APC标记的抗iNOS，APC标记的抗CD206和FITC标记的抗CD4染色30分钟分钟通过离心洗涤染色的细胞以去除多余的抗体，并通过Beckman Cytoflex流式细胞仪进行分析。

1.14 评估EM-PLGA@Dnmt3aos

1.14.1 PLGA@Dnmt3aos

将小鼠随机分为3组(n＝5)，并且将其进行静脉注射。在第21-27天分别注射Dnmt3aos

1.14.2 抗肿瘤能力检测

AA小鼠于s.c.首次免疫尘螨主要变应原Der f1后一天，在右腹股沟注射A549细胞(每只小鼠2×10

1.15 统计分析

所有测得的参数均表示为平均值±SEM。统计软件GraphPad Prism(6.0版)用于分析。使用GraphPad Prism软件(6.0版)进行统计分析。进行了t检验以确定两个独立组之间的差异。P值<0.05被认为具有统计学意义。

2.结果

2.1 哮喘小鼠lncRNA Dnmt3aos和Dnmt3a呈表达

我们先前发现，lncRNA Dnmt3aos和Dnmt3a的表达水平是协调的，两者均与巨噬细胞极化有关。由于巨噬细胞是哮喘发病机理的关键因素，因此我们首先在肺泡灌洗液中分离巨噬细胞，并评估了过敏性哮喘小鼠中Dnmt3aos和Dnmt3a表达。Dnmt3aos和Dnmt3a在来自Der f1诱导的小鼠巨噬细胞中高水平表达，而在PBS诱导的小鼠中观察到Dnmt3aos和Dnmt3a低表达(图9B-C)。总体而言，这些结果表明lncRNA Dnmt3aos和Dnmt3a参与了过敏性哮喘的进展。

2.2 EM-PLGA@Dnmt3aos

如图1所示，为了成功设计EM-PLGA@Dnmt3aos

接下来分离外泌体膜，TEM观察到EM-PLGA@Dnmt3aos

2.3 EM-PLGA@Dnmt3aos

在PLGA的帮助下，Dnmt3aos

流式细胞术分析也证实了EM-PLGA@Dnmt3aos

2.4 来源于M2巨噬细胞的外泌体膜没有极化能力

为了确认来源于M2巨噬细胞的外泌体膜的极化能力，我们将外泌体膜与M0巨噬细胞共培养了48小时。结果(图10B)证实了我们的假设，表明外泌体膜不能将M0巨噬细胞极化为M2。这是因为外泌体的含量被释放，这也被蛋白质电泳的结果所证实(图10C)，因此可以安全地用于我们随后的实验中。

2.5 外泌体膜和PLGA NP的结合有效地将Dnmt3aos

巨噬细胞是AA气道炎症发生的主要因素，因此，我们首先评估了Dnmt3aos

2.6 使用EM-PLGA@Dnmt3aos

我们以前的研究表明，lncRNA Dnmt3aos调节M0巨噬细胞向M2的极化，并参与调节Dnmt3a的表达。由于M2巨噬细胞极化在AA的发病机理中起着重要作用，因此抑制巨噬细胞中Dnmt3aos的表达有望成为治疗AA的有效策略。为了确定EM-PLGA@Dnmt3aos

2.7 体内EM-PLGA@Dnmt3aos

为了进一步确认EM-PLGA@Dnmt3aos

另一方面，在注射后2小时收集肺，并准备冷冻切片用于免疫荧光染色。正如在共聚焦图像中发现的那样(图5A)，Cy5标记的EM-PLGA@Dnmt3aos

随后，我们确定EM修饰的PLGA@Dnmt3aos

2.8 EM-PLGA@Dnmt3aos

接下来，我们评估了使用EM-PLGA@Dnmt3aos

为了进一步评估EM-PLGA@Dnmt3aos

鉴于M2巨噬细胞在介导哮喘发病机制中的关键作用，我们在AA中用游离Dnmt3aos

2.9 EM-PLGA@Dnmt3aos

简而言之，将小鼠随机分为4组(n＝5)，并且将其静脉内注射。注入PBS，Dnmt3aos

此外，小鼠的抗肿瘤能力通常被用作监测人体总体免疫功能的指标之一。AA小鼠是s.c.首次免疫Der f1后第1天，在右腹股沟注射A549细胞(每只小鼠1×106细胞)。然后，将小鼠随机分为三组(每组七只小鼠)，并在第21-27天通过尾静脉给予EM-PLGA@Dnmt3aos

siRNA药物在体内的运输是一个不容忽视的问题。由于ASO/siRNA的稳定性和低脱靶效应，一些ASO/siRNA介导的基因沉默已成功实现了临床翻译。但是，作为聚阴离子和亲水性分子，裸露的ASO/siRNA无法自动穿透带负电的细胞膜到达目标mRNA所在的细胞内空间。此外，存在脱靶效应和免疫原性的潜力。因此，复杂的ASO递送仍然是对基于ASO的治疗方法发展的重大挑战。为此，本发明设计了一种可生物降解的高分子有机化合物和外泌体膜复合物，以实现高效的Dnmt3aos抑制剂输送，并进一步改善纳米载体对肺组织中M2巨噬细胞的靶向性，完全克服了寡核苷酸纳米载体从目标组织脱落的问题。

外泌体膜修饰的PLGA NPs源自M2巨噬细胞的外泌体，并通过反复冷冻和融化，重复离心，然后与PLGA NPs杂交来除去内含物。其中，外泌体膜的应用可使EM-PLGA@Dnmt3aos

在本发明中，我们将smart silencer用于lncRNA Dnmt3aos沉默，而不是单个ASO或siRNA。我们使用了由3个siRNA和3个ASO组成的lncRNA智能沉默子抑制剂系列，它们具有比普通siRNA更高的敏感性和抑制效率。体内和体外实验的结果也证实了Dnmt3aos

总而言之，本发明成功设计了EM-PLGA@Dnmt3aos

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院）

<120> 一种巨噬细胞外泌体膜包被仿生纳米颗粒及其制备方法和应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ggactcactt cctgttggt 19

<210> 2

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

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tgaccaactt gggaggcact 20

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

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tcatgggtgg ttcctgccag 20

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<212> DNA/RNA

<213> Artificial sequence

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caccaacatg catcacttt 19

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<212> DNA/RNA

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tgtgctggca actagtggat 20

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