可塑形的长段骨修复材料及生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法

摘要

本发明涉及再生医学材料技术领域，公开了一种可塑形的长段骨修复材料及生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法。所述长段骨修复材料按照质量份计，包括溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料10～40份、生物陶瓷粉体20～60份、油性溶剂50～100份、水溶性生物活性因子0.1～1份、水2～40份、乳化剂大于0小于1份。所述可塑形的长段骨修复材料通过高分子材料与生物陶瓷粉体结合，以便材料成型后具有各向异性力学特性及宏－微观结构，保持良好力学强度及仿生骨组织结构，形成具有较高孔隙率和机械强度的骨组织工程支架，解决现有的骨组织工程支架在较高的孔隙率和机械强度不能同时兼容的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及再生医学材料技术领域，特别是涉及一种可塑形的长段骨修复材料及生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法。

背景技术

随着当今社会老龄化的迅速加剧，外伤、退行性疾病、骨肿瘤和骨畸形等疾病的发病率逐年上升。面对这些疾病，手术骨重建往往是最重要的，所以骨科手术植入仿生材料需求也在逐年增长。据统计，在我国每年因肿瘤、创伤等原因引起的骨缺损患者人数超过了100万，而且呈逐年上升的趋势。目前治疗骨缺损的方法主要有自体骨移植和同种异体骨移植。然而，由于自体骨的来源非常有限，机体获取可能在患者供骨部位造成新的骨缺损，严重限制了自体骨的应用。而同种异体骨虽然获得渠道比自体骨广泛但其骨诱导能力比自体骨弱，而且由于异体获取，使其临床应用中存在疾病传播和排斥反应的风险，所以异体骨的应用也存在了很大缺陷。

组织工程这个术语最早是由美国在1987年提出的，它由科学基金会正式提出，是指生命科学的原理和生物工程的技术方法的应用发展修复或改善受损器官的结构和功能的生物替代品的科学。组织工程结合材料科学、生物学、工程学等领域的先进技术来发展生物学修复或维持其正常生理功能的活性组织或器官替代物，是再生医学的一个重要领域。

近年来，聚乳酸等可生物降解合成高分子材料不断发展，在骨组织工程研究中具有广阔的应用前景。这些可生物降解的合成高分子材料具有良好的生物相容性和机械性能，在骨组织工程中作为骨缺损修复支架具有良好的可加工性。

骨组织工程材料的三大要素是支架材料、种子细胞和生长因子。支架作为细胞和生长因子的载体材料，其制备是组织工程的核心和关键。骨缺损的修复需要支架提供细胞生长粘附的支点，并逐渐形成新的骨组织取代支架材料。但在使用以往的移植材料治疗骨缺损时，经常会遇到以下矛盾：骨缺损部位负重需要一定强度的支架来提供足够的前期机械支撑，才能形成新骨；同时，营养物质的转移以及血管和细胞的快速生长需要支架的连通性和高孔隙度。而传统的孔隙度支架不能提供高的机械强度和较好的孔隙连通性，其高孔隙率必然导致支架力学强度降低。因此，如何平衡孔与支架强度之间的关系，是提高骨修复支架的关键研究方向。

发明内容

本发明的目的是：解决现有的骨组织支架较高的孔隙率和机械强度不能同时兼容的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种可塑形的长段骨修复材料，所述材料按照质量份计，包括溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料10～40份、生物陶瓷粉体20～60份、油性溶剂50～100份、水溶性生物活性因子0.1～1份、水2～40份、乳化剂大于0小于1份。本发明通过溶于有机溶剂且不容于水的高分子材料与生物陶瓷粉体结合，以便材料成型后形成具有较高孔隙率和机械强度的骨组织工程支架，解决现有的骨组织工程支架在较高的孔隙率和机械强度不能同时兼容的问题。

所述溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料为聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、消旋聚乳酸(PDLLA)、乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)、左旋聚乳酸(PLLA)、聚－β－羟丁酸(PHB)、聚羟基丁酸戊酯(PHBV)中的一种，不仅扩大临床骨缺损修复材料的获取渠道，也克服了排斥反应、疾病传播等不良并发症。PLGA的生物降解速率可以通过调节已交酯与丙交酯的比例和聚合物分子量进行控制。并且随着新骨的长入，所述高分子材料慢慢降解，降解产物主要为乳酸，乳酸也是人体内的一种正常代谢产物，可以进一步代谢为二氧化碳和水，可以通过人体正常的物质更新渠道排出体外，具有良好的生物相容性。

所述生物陶瓷粉体为纳米磷酸钙、β－磷酸三钙、纳米羟基磷灰石、氧化铝陶瓷(Al

所述油溶性溶剂为二氯甲烷(DCM)或三氯甲烷。

所述水为去离子水，所述乳化剂为聚氧乙烯、山梨醇酐单月桂酸酯(T－WEEN20)、聚乙烯醇(PVA)、司盘80、纤维素酯中的一种。山梨醇酐单月桂酸酯，即吐温20，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用，在本市发明中用于使制备的可塑形的长段骨修复材料在形成仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水具有很好的稳定性，不会轻易分层造成各物质成分的分布不均匀。

所述水溶性生物活性因子为卡非佐米(分子式：C

PR171诱导Wnt/β－catenin/TCF转录活性，核β－catenin与T细胞因子/淋巴增强因子(tcf/lef)家族的转录因子结合并激活，启动β－catenin核聚集的信号级联反应，激活下游成骨分化基因的表达，从而促进成骨细胞分化；PR171也可在体外直接抑制OC形成，在体外直接抑制骨吸收，诱导ALP活性增强，诱导成骨转录因子osterix、骨桥蛋白、骨钙蛋白表达增强。

利用BPV(pic)抑制PTEN基因，促进神经细胞再生，联合生物支架，促进大鼠脊髓半切损伤的修复，含有BPV(pic)的移植物减少了脊髓组织的空化并促进了运动能力的改善，而将BPV(pic)的移植物与脱细胞脊髓支架组合使用则显示了更好的效果，故我们用来修复脊柱骨的损伤，并且在神经细胞再生的同时协同骨与血管的再生。

FK506能抑制T细胞活化，协同刺激BMP信号通路。FK506具有较强的促BMSCs细胞成骨分化能力，并通过抑制炎症反应在炎症环境中发挥一定的成骨作用。

HA15可靶向HSPA5抑制内质网应激，最终促进成骨、骨再生和血管生成。

LF3是一种4－硫脲基－苯磺酰胺衍生物，是β－catenin/TCF4相互作用的抑制剂，已被证明可以阻止癌症干细胞的自我更新，故我们尝试用来进行骨肿瘤导致长段骨缺损的治疗，利用支架负载此材料进行肿瘤细胞的抑制。通过调节加入生物活性因子的量来控制促成骨细胞的可控缓释。

本发明还提供一种基于上述可塑形的长段骨修复材料的生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：

S1、原料混液：将溶于有机溶剂不溶于水的高分子材料溶于油性溶剂中形成有机高分子材料/油性溶剂溶液；接着将生物陶瓷粉体溶于所述有机高分子材料/油性溶剂溶液中，制得有机高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液；

S2、活性材料溶液制备：将水溶性生物活性因子溶于水中形成水溶性成骨溶液；

S3、混液均质：将步骤S1制得的有机高分子材料/生物陶瓷粉体/油性溶剂溶液和S2制得的水溶性成骨溶液，以及乳化剂混合搅拌均匀，得到仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水；

S4、骨组织工程支架打印：将所述仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水在低温下通过低温3D打印机按照预设模型打印得到生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架；

S5、骨组织工程支架成型：将所述生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架在低温下进行干燥得到生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架成品。

所述生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架成品的孔隙率为50～90％，所述孔隙的一级孔径为200～2500μm，次级孔径为1～99μm。

所述步骤S4中的低温范围为－10～－40℃。

所述步骤S2中的水溶性成骨溶液还能通过灌注分布到所述骨组织工程支架上。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明的可塑形的长段骨修复材料，通过溶于有机溶剂且不容于水的高分子材料与生物陶瓷粉体结合，以便材料成型后具有各向异性力学特性及宏－微观结构，保持良好力学强度及仿生骨组织结构，可促进所负载干细胞的成骨分化，形成具有较高孔隙率和机械强度的骨组织工程支架，解决现有的骨组织工程支架在较高的孔隙率和机械强度不能同时兼容的问题；同时可塑形的长短骨修复材料在制造阶段是一种呈粘稠状的乳液，以便通过低温3D打印制备个性化、可塑形的组织工程支架。

本发明的生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法利用可塑形的长段骨修复材料制备得到的骨组织工程支架，并通过在材料本身添加的生物活性因子或者骨组织支架成型后的生物活性因子的灌注，实现不同生物活性因子在骨组织工程支架不同区位的负载、不同的负载量实现可控缓释，促进不同部位的骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化。

附图说明

图1是本发明实施例1制备的骨组织工程支架的影像图。

图2是本发明实施例2制备的骨组织工程支架在SEM电镜扫描下200μm尺度的载药图片。

图3是本发明实施例2制备的骨组织工程支架在SEM电镜扫描下100μm尺度的载药图片。

图4是本发明实施例3制备的骨组织工程支架在SEM电镜扫描下2μm尺度的载药图片。

图5是本发明实施例3制备的骨组织工程支架在SEM电镜扫描下1μm尺度的载药图片。

图6是是本发明实施例1制备的骨组织工程支架经过3天培养的细胞在倒置荧光显微镜下100μm尺度的观测结果图。

图7为本发明实施例1制备的骨组织工程支架的生物力学性能变化图，图中，纵坐标代表骨组织工程支架在竖立状态所受到的应力，也叫压应力，横坐标为对应收到对应压应力值时的应变，图中曲线为机械强度测试时制备的组织工程支架的压缩应力－应变曲线。

图8为本发明实施例2制备的骨组织工程支架的生物力学性能变化图，图中，纵坐标代表骨组织工程支架在竖立状态所受到的应力，也叫压应力，横坐标为对应收到对应压应力值时的应变，图中曲线为机械强度测试时制备的组织工程支架的压缩应力－应变曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例所采用的低温3D生物打印设备为多喷头打印机，且打印环境温度可降低为0～－100℃。在低温3D打印机内部的原始打印台上安装了一个定制的低温基板(－30℃)，以提供一个低温环境。

实施例1：本实施例提供一种可塑形的长段骨修复材料及生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法。所述材料包括溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料15份、生物陶瓷粉体25份、油性溶剂50份、水溶性生物活性材料0.3份、水5份、乳化剂0.8份。

所述溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料为乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)，油性溶剂具体为二氯甲烷(DCM)，生物陶瓷为β－磷酸三钙，生物活性因子为PR171；水为去离子水，乳化剂为质量分数为5％的聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)水溶液。

本实施例然后按照以下步骤制备骨组织工程支架成品：

S1、将3g的乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解到10ml的DCM中，旋涡搅拌15min至PLGA充分溶解；将3g的β－磷酸三钙(β－TCP)加入到制备好的PLGA有机溶液中，超声震荡15min使β－磷酸三钙(β－TCP)粉末混合于溶液中，制得PLGA/β－TCP/DCM溶液；

S2、在盛有1.8ml的去离子水的试管中加入150mgPR171震荡均匀后形成水溶性成骨溶液；

S3、将5％的聚氧乙烯(20)和山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)水溶液、水溶性成骨溶液、以及事先预混合好的PLGA/β－TCP/DCM溶液中，继续震荡混合搅拌至均匀，防止细微颗粒堵塞打印喷头，得到仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水；

S4，将配合好的仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水加入台式低温3D打印机(－35℃)的外径0.4mm的喷嘴贮液器中，使用螺旋挤压推进，使乳液型混合物的进料速度保持在0.3ml/min。印刷速度设定为4mm/min，每个打印出来的支板在2s内凝固，最后制备成长3mm、宽2mm、高15mm的圆柱体材料，即生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架；

S5，待所述生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架打印完成后通过低温(10～25℃)风干去除溶剂，将骨结构中残存的溶剂风干得到生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架成品。

实施例2：本实施例提供一种可塑形的长段骨修复材料及生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法。所述材料包括溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料20份、生物陶瓷粉体20份、油性溶剂60份、水溶性生物活性材料0.1份、水7份、乳化剂0.5份。

所述溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料为乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)，油性溶剂具体为二氯甲烷(DCM)，生物陶瓷为β－磷酸三钙，生物活性因子为FK506；水为去离子水，乳化剂为质量分数3％聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)水溶液。

本实施例然后按照以下步骤制备骨组织工程支架成品：

S1、将4g的乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解到12ml的DCM中，旋涡搅拌15min至PLGA充分溶解；将4g的β－磷酸三钙(β－TCP)加入到制备好的PLGA有机溶液中，超声震荡15min使β－磷酸三钙(β－TCP)粉末混合于溶液中，制得PLGA/β－TCP/DCM溶液；

S2、在盛有2.5ml的去离子水的试管中中加入80mgFK506震荡均匀后形成水溶性成骨溶液；

S3、将质量分数3％的聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)水溶液、加入水溶性成骨溶液、以及事先预混合好的PLGA/β－TCP/DCM溶液中，继续震荡混合搅拌至均匀，防止细微颗粒堵塞打印喷头，得到仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水；

S4，将配合好的仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水加入台式低温3D打印机(－35℃)的外径0.4mm的喷嘴贮液器中，使用螺旋挤压推进，使乳液型混合物的进料速度保持在0.3ml/min。印刷速度设定为4mm/min，每个打印出来的支板在2s内凝固，最后制备成长3mm、宽2mm、高15mm的圆柱体材料，即生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架；

S5，待所述生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架打印完成后通过自然风风干去除溶剂，将骨结构中残存的溶剂风干得到生物活性因子可控缓释的组织工程支架成品。

实施例3：本实施例提供一种可塑形的长段骨修复材料及生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架的制备方法。所述材料包括溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料25份、生物陶瓷粉体25份、油性溶剂55份、水溶性生物活性材料0.125份、水8份、乳化剂0.25份。

所述溶于有机溶剂且不溶于水的高分子材料为乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)，油性溶剂具体为二氯甲烷(DCM)，生物陶瓷为β－磷酸三钙，生物活性因子为HA15；水为去离子水，乳化剂为1.5％聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)水溶液。

本实施例然后按照以下步骤制备骨组织工程支架成品：

S1、将3.75g的乳酸－羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解到11ml的DCM中，旋涡搅拌15min至PLGA充分溶解；将3.75g的β－磷酸三钙(β－TCP)加入到制备好的PLGA有机溶液中，超声震荡15min使β－磷酸三钙(β－TCP)粉末混合于溶液中，制得PLGA/β－TCP/DCM溶液；

S2、在盛有2.9ml的去离子水的试管中加入100mg HA15震荡均匀后形成水溶性成骨溶液；

S3、将质量分数为1.5％的聚氧乙烯(20)山梨醇酐单月桂酸酯(tween20)水溶液、水溶性成骨溶液、以及事先预混合好的PLGA/β－TCP/DCM溶液中，继续震荡混合搅拌至均匀，防止细微颗粒堵塞打印喷头，得到仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水；

S4，将配合好的仿生长段骨的骨组织工程支架成型墨水加入台式低温3D(－35℃)打印机的外径0.4mm的喷嘴贮液器中，使用螺旋挤压推进使乳液型混合物的进料速度保持在0.3ml/min。印刷速度设定为4mm/min，每个打印出来的支板在2s内凝固，最后制备成长3mm、宽3mm、高13mm的圆柱体材料，即生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架；

S5，待所述生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架打印完成后通过较低温度的自然冷风风干去除溶剂，将骨结构中残存的溶剂风干得到生物活性因子可控缓释的组织工程支架成品。

实施例1和2制备的所述生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架成品的孔隙率如图1、2、3所示，为40～99％或35～89％，一级孔径为300～3000μm或100～2000μm，次级孔径为3～99μm或5～100μm。

生物活性测试

将实施例1制备得到的组织工程支架培养三天，在37℃、5％二氧化碳培养箱内培养后进行细胞活性检测。在检测过程中，先用磷酸盐缓冲液冲洗细胞－组织工程支架材料复合体表面，然后采用死活细胞检测试剂盒，将细胞－组织工程支架材料复合体放置于含有工作浓度(试剂盒储存浓度在DMEM培养基中吸湿1000倍)的死活细胞荧光染料的培养基中，在37℃的细胞培养箱中孵育半小时，然后用倒置荧光显微镜观测死活细胞。

力学性能测试

将实施例1－2制得的骨组织工程支架按照GB/T1041－1992的测试标准，测试其力学性能并绘制相应的压缩应力－应变曲线，得到表1、表2和图7与图8。

表1：实施例1制备的骨组织工程支架的力学性能测试结果表

表2：实施例2制备的骨组织工程支架的力学性能测试结果表

从上述表1和表2及附图1－6来看，图2和图3表明本发明实施例制备的组织工程支架的孔隙率高度连通，孔隙之间无材料形成的阻隔，且高分子材料和生物陶瓷材料形成的骨组织工程支架具有良好的网格状结构，便于成骨细胞长入和负载生物活性因子。作为本发明的优选实施例，实施例1缓释了生物活性因子PR171的生物材料和实施例2缓释了生物活性因子FK506的生物材料的抗压强度分别为1.193MPa和1.339MPa。可以看出，缓释生物活性因子FK506的骨组织工程支架的抗压强度比PR171高13％，抗压强度在骨小梁的低范围(1.3－4.4MPa)内，被认为更适合用于骨缺损的承重应用，缓释了PR171的生物材料也与骨小梁的低范围相似，仍然保持了良好的生物力学性能。这些试样的抗压强度和杨氏模量均与骨小梁相似。从图4可以看出，本发明实施例制备的所述骨组织工程支架的孔隙可促进骨组织的长入。作为优选的实施例1，图6是经过3天培养的细胞的倒置荧光显微镜观测结果，图6中圆形点状即为活细胞。说明带有生物活性物质PR171和生物陶瓷粉体的组织工程支架可以更好的为细胞黏附增殖、扩展提供帮助，而细胞更倾向于保持圆形结构，向骨细胞分化。因此，我们认为本发明的长段骨修复材料很适合作为骨缺损的仿生骨可降解生物材料，来制备所述骨组织工程支架，制备的生物活性因子可控缓释的骨组织工程支架即具有较高的孔隙率，也具有良好的机械强度，解决了背景技术中的技术问题。同时以不同生物活性因子对成骨、促神经再生、抗炎等作用，对于骨组织工程支架起到更多元化的应用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对于上述实施例所记载的技术方案及其中部分技术特征做出若干改进和同等替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围。