一株猪DC细胞的传代细胞系及其建立方法与应用

摘要

本发明属于生物免疫学领域，具体涉及一株猪DC细胞的传代细胞系及其建立方法与应用，本发明利用猪血液中的单核细胞分化成树突状细胞，在传代过程中发现一细胞集落，经反复传代后，建成一猪树突状细胞系。通过研究传代细胞的生长、表面标志、吞噬和抗原递呈作用，发现其细胞系具有树突状细胞特性，并具有很好的刺激T细胞增殖、细胞因子分泌和激发CTL细胞毒作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物免疫学领域，具体涉及一株猪DC细胞的传代细胞系及其建立方法与应用。

背景技术

树突状细胞(dendritic cell,DC)是重要的抗原提呈细胞及连接机体固有免疫和适应性免疫应答的桥梁细胞。DC细胞通过表面表达受体识别并吞噬病原体，参与抗原提呈，并发育成熟，同时分泌不同类型的细胞因子，决定T细胞分化方向，最终影响细胞免疫应答效应。

DC细胞是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟的DC细胞具有较强的迁移能力，成熟DC细胞能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。一般从动物体内分离的原代细胞只能传代几次，无法长期传代。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明利用猪血液中的单核细胞分化成树突状细胞，在传代过程中发现一细胞集落，经反复传代后，建成一猪树突状细胞系。通过研究传代细胞的生长、表面标志、吞噬和抗原递呈作用，发现其细胞系具有树突状细胞特性，并具有很好的刺激T细胞增殖、细胞因子分泌和激发CTL细胞毒作用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一株猪DC细胞的传代细胞系的建立方法，具体包括以下步骤：

步骤S1：细胞培养；

步骤S2：细胞传代培养；

步骤S3：光学显微镜观察细胞生长状况；

步骤S4：解冻后细胞生长特性测试；

步骤S5：DC细胞形态观察；

步骤S6：DC细胞表型鉴定；

步骤S7：DC细胞分泌细胞因子检测；

步骤S8：DC细胞生长曲线测定；

步骤S9：DC细胞对甘露糖修饰纳米颗粒包裹的GFP蛋白的吞噬。

进一步地，所述步骤S1具体为：

(1)猪外周血分离单个核细胞：

①取新鲜EDTA抗凝全血，用等体积的稀释液或者PBS稀释全血；

②在离心管中加入适量分离液，当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL时，加入等体积分离液，但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰；

③在室温下，水平转子500-1000g，离心20-30min；

④离心后将出现明显的分层，最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，其间含有单个核细胞，离心管底部是红细胞与粒细胞；

⑤小心吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min；

⑥弃上清，用5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min；

⑦重复步骤⑥；

⑧弃上清，细胞重悬备用；

(2)将猪血外周血分离的单个核细胞用RPMI1640培养基，含10％胎牛血清、2％双抗，培养24h,弃未贴壁细胞。

(3)单核细胞培养分化DC细胞：

①将单核细胞培养在含10ng/mL GM-CSF和20ng/mL IL-4的RPMI1640培养基液中，细胞浓度为1×10

②培养第三天换液，轻轻吸去原培养液，加入等量含有IL-4和GM-CSF的新鲜RPMI1640培养液，继续置CO

③单核细胞经与IL-4和GM-CSF的共同孵育，发现一株DC细胞能够长期传代。

进一步地，所述步骤S2具体为：

①小心吸弃培养皿内培养液；

②加入1mL胰酶充分接触，放置37℃培养箱3min；

③弃上清，加入1mL新RPMI1640培养液吹打混匀；

④离心800rpm，3min；

⑤细胞铺板，37℃培养2-3天；

⑥重复①-⑤。

进一步地，所述步骤S6具体为：

将DC细胞铺24孔板，1×10

流式细胞仪检测方法如下：

①吸取细胞上清液于–20℃保存，用于检测细胞因子，再用PBS清洗细胞两遍，加入200μL胰酶/孔，37℃静置4min；

②加入400μL完全培养基终止消化，将贴壁细胞吹打下来转移至离心管中；

③1000rpm，离心5min后，弃去上清液；

④用1mLPBS重悬细胞，重复步骤③；

⑤加入200μL的3％BSA溶液，重悬细胞，室温封闭15min；

⑥补加800μLPBS，颠倒混匀后，重复步骤③；

⑦重复步骤④；

⑧用100μL稀释到工作浓度的荧光抗体重悬细胞，于4℃静置1h，每隔10min震荡一次；

⑨重复步骤④两次；

⑩加入300μLPBS重悬细胞，用300目的尼龙筛网过滤至流式管中，置于冰上，利用流式细胞仪进行检测。

进一步地，所述步骤S7具体为：

将DC细胞培养上清液取出，利用ELISA检测试剂盒，按照试剂盒产品说明书，分别对致炎细胞因子IL-1β，多效性细胞因子IL-6，抗炎细胞因子IL-10，免疫调节因子IL-12进行检测。

进一步地，所述步骤S8具体为：

取生长良好的DC细胞，用胰酶消化，离心后用新培养基制成细胞悬液，计数，按2×10

进一步地，所述步骤S9具体为：

(1)共聚焦显微镜观察细胞吞噬纳米颗粒：将培养的DC细胞接种于1×10

(2)流式细胞仪检测DC细胞吞噬纳米颗粒：将培养的DC细胞接种于1×10

本发明提供一株猪DC细胞的传代细胞系，如所述的步骤S1-S9的建立方法建立。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

本发明发现一株猪DC细胞，能够无限传代，具有DC细胞的形态、表型及功能，因此确定建立了一株能长期传代的DC细胞系。该细胞系可用于生物免疫学、病原与宿主相互作用的体外研究，为促进猪健康养殖及疫病防控提供了很好的细胞学工具，为体外研究病原与猪DC细胞的相互作用、评估药物或生物制品对猪的影响，促进猪繁殖与呼吸道病毒(HP-PRRSV)和非洲猪瘟病毒(ASFV)等感染巨噬细胞引起的重大动物疫病防控技术研究。该DC细胞系的建立，消除对难以标准化的原代细胞培养的依赖，从而对涉及DC细胞的研究和临床治疗提供了重要载体和细胞学技术支撑，本发明建立DC细胞的传代细胞系将是病毒发病机制和免疫功能研究的有价值的工具。

附图说明

图1为第一代DC细胞；

图2为第四代DC细胞；

图3为第六代DC细胞；

图4为第十代DC细胞；

图5为第十代DC细胞计数；

图6为第十二代DC细胞；

图7为第十三代DC细胞；

图8为细胞诱导培养结果；

图9为血液源DC表型鉴定柱状图；

图10为CD1流式检测图；

图11为CD80流式检测图；

图12为SLA I流式检测图；

图13为SLA II流式检测图；

图14为SWC-3a流式检测图；

图15为细胞因子检测柱状图；

图16为细胞生长曲线图；

图17为DC细胞吞噬甘露糖修饰纳米颗粒包裹的GFP蛋白共聚焦检测图；

图18为DC细胞吞噬甘露糖修饰纳米颗粒包裹的GFP蛋白流式检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

实施例1

一株猪DC细胞的传代细胞系的建立方法，具体步骤如下：

步骤S1：细胞培养

(1)猪外周血分离单个核细胞：

①取新鲜EDTA抗凝全血，用等体积的稀释液或者PBS稀释全血；

②在离心管中加入适量分离液，当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL时，加入等体积分离液，但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果，将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰；

③在室温下，水平转子500-1000g，离心20-30min，血液的体积越大，所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的离心条件较实际情况而定，离心转速最大不超过1200g；

④离心后将出现明显的分层，最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，其间含有单个核细胞，离心管底部是红细胞与粒细胞；

⑤小心吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，10mL PBS或细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，250g，离心10min；

⑥弃上清，用5mL的PBS或细胞清洗液重悬细胞，250g，离心10min；

⑦重复步骤⑥；

⑧弃上清，细胞重悬备用。

(2)将猪血外周血分离的单个核细胞用RPMI1640培养基，含10％胎牛血清、2％双抗，培养24h，弃未贴壁细胞；

(3)单核细胞培养分化DC细胞：

①将单核细胞培养在含10ng/mL GM-CSF和20ng/mL IL-4的RPMI1640培养基液中，细胞浓度为1×10

②培养第三天换液，轻轻吸去原培养液，加入等量含有IL-4和GM-CSF的新鲜RPMI1640培养液，继续置CO

③单核细胞经与IL-4和GM-CSF的共同孵育，发现一株DC细胞能够长期传代。

步骤S2：细胞传代培养

①小心吸弃培养皿内培养液；

②加入1mL胰酶充分接触，放置37℃培养箱3min；

③弃上清，加入1mL新RPMI1640培养液吹打混匀；

④离心800rpm，3min；

⑤细胞铺板，37℃培养2-3天；

⑥重复①-⑤。

步骤S3：光学显微镜观察细胞生长状况

结果见图1、2、3、4、5、6、7。结果表明，DC细胞传代十六代后细胞状态依旧良好，具有无限传代的特征。

步骤S4：解冻后细胞生长特性测试

传代细胞用含10％二甲基亚砜和10％RPMI的冷冻保存液在液氮冷冻保存。在解冻和培养18h后，用含0.4％台盼蓝的PBS中排斥实验测定细胞活力，细胞活力为90％。

步骤S5：DC细胞形态观察

在体外培养诱导时期，细胞集聚成团，呈半悬浮状态，细胞在培养六天后体积明显变大、形态不一，细胞表面有数个粗细不等、长短不一的突起，是树突状细胞的典型形态。结果见图8。

步骤S6：DC细胞表型鉴定

将DC细胞铺24孔板，1×10

流式细胞检测方法如下：

①吸取细胞上清液于–20℃保存，用于检测细胞因子，再用PBS清洗细胞两遍，加入200μL胰酶/孔，37℃静置4min；

②加入400μL完全培养基终止消化，将贴壁细胞吹打下来转移至离心管中；

③1000rpm，离心5min后，弃去上清液；

④用1mLPBS重悬细胞，重复步骤③；

⑤加入200μL的3％的BSA溶液，重悬细胞，室温封闭15min；

⑥补加800μLPBS，颠倒混匀后，重复步骤③；

⑦重复步骤④；

⑧用100μL稀释到工作浓度的荧光抗体重悬细胞，于4℃静置1h，每隔10min震荡一次；

⑨重复步骤④两次；

⑩加入300μLPBS重悬细胞，用300目的尼龙筛网过滤至流式管中，置于冰上，利用流式细胞仪进行检测。

步骤S7：DC细胞分泌细胞因子检测

将DC细胞培养上清液取出，利用ELISA检测试剂盒，按照试剂盒产品说明书，分别对致炎细胞因子IL-1β，多效性细胞因子IL-6，抗炎细胞因子IL-10，免疫调节因子IL-12进行检测。结果见图15。

步骤S8：DC细胞生长曲线测定

取生长良好的DC细胞，用胰酶消化，离心后用新培养基制成细胞悬液，计数。按2×10

步骤S9：DC细胞对甘露糖修饰纳米颗粒包裹的GFP蛋白的吞噬

(1)共聚焦显微镜观察细胞吞噬纳米颗粒：将培养DC细胞接种于1×10

(2)流式细胞仪检测DC细胞吞噬纳米颗粒：将培养DC细胞接种于1×10

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。