靶向CRH基因的siRNA及其在神经病理性疼痛治疗中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，本发明公开了三组靶向人和小鼠CRH基因的siRNA及其在神经病理性疼痛治疗中的应用，通过设计并合成三组靶向CRH基因(促肾上腺皮质激素释放激素)的siRNA，体内实验时将三组siRNA鞘内注射于神经病理性疼痛模型小鼠，分子生物学实验表明两组siRNA能够在体内阻断小鼠背根神经节(DRG)中由神经损伤所诱导的CRH表达升高，表明此两组siRNA均能有效降低CRH基因的表达，但第2组效果更为明显。疼痛行为学检测表明鞘内注射第2组CRH siRNA能有效地缓解神经病理性疼痛。本发明供了靶向CRH基因的非化学修饰及化学修饰核酸分子，对神经病理性疼痛具有较好的治疗效果，对临床研发新的镇痛药物提供新的思路及实验依据，具有重大的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于基础医学和生物医药领域，主要针对促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH，也称为corticotropin-releasing factor,CRF)基因表达的调节和/或调节CRH基因表达通路的性状、疾病的化合物、组合物和方法，具体涉及靶向人和小鼠CRH基因的小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)及其在神经病理性疼痛治疗中的应用。

背景技术

急性疼痛作为对组织损伤的警报系统，对机体具有保护功能。但如果在其完成警报任务后仍然持续存在，这类疼痛就变成危害健康的病理性疼痛(或慢性疼痛)，神经病理性疼痛就是其中的一大类。神经病理性疼痛(neuropathic pain)是指由于中枢神经系统和周围神经系统的躯体感觉传递紊乱而导致的一组疼痛综合征，其产生的原因包括：神经压迫、神经切断、中风、脊髓外伤、糖尿病、病毒感染后的神经病变等。长期的神经病理性疼痛导致人疲乏、睡眠障碍、食欲下降、体重下降、性欲下降、便秘，抑郁，焦虑等症状，严重地影响患者的生活质量。更重要的是长期慢性疼痛的刺激可以促使中枢神经系统发生病理性重构，使疼痛本身变得更加难以控制。临床数据显示(数据来自文献：Pain.2014Apr；155(4):654-662:题目：Neuropathic pain in the general population:A systematic reviewof epidemiological studies)，全球神经性疼痛的患病率在0.9％至17.9％之间。目前对其基础和临床研究进展有限，而且缺乏临床治疗效果好的镇痛药物。目前，市场上的治疗药物主要有水杨酸类药物，非甾体类抗炎药，阿片类镇痛药。临床上水杨酸类药物具有较多副作用，非甾体类抗炎药对此不敏感，阿片类药物虽能缓解，但需要较高剂量并药物耐受限制了其长期使用，为此开发新的靶点及镇痛药亟待解决。

小分子干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)也称为沉默RNA，是一种长20-25个核苷酸的双链RNA，靶向特定信使RNA(mRNA)使其降解，故而其基因功能减弱或丧失。小分子干扰RNA(siRNA)已被临床测试用于几种疾病的治疗，如老年性黄斑退化、肌萎缩侧索硬化、类风湿性关节炎、肥胖症等。siRNA进入体内后干扰特定疾病基因的mRNA，使该基因无法表达蛋白，因而起到疾病治疗作用。与传统临床治疗药物相比，siRNA药物毒副作用小、效率高，是一种最具潜力的基因治疗方法。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供靶向人和小鼠CRH基因的siRNA及其在神经病理性疼痛治疗中的应用。

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供一种靶向CRH基因的siRNA，其特征在于，所述siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：

CRH siRNA 1

正义序列：5′-GAUGGAGAUUAUCGGGAAATT-3′

反义序列：5′-UUUCCCGAUAAUCUCCAUCTT-3′；

或

CRH siRNA 2

正义序列：5′-GGAUCUCACCUUCCACCUUTT-3′

反义序列：5′-AAGGUGGAAGGUGAGAUCCTT-3′；

或

CRH siRNA 3

正义序列：5′-CAGCUCCGAUAUCAUUUGUTT-3′

反义序列：5′-ACAAAUGAUAUCGGAGCUGTT-3′。

一种抑制CHR基因标的siRNA，其特征在于，所述siRNA为以下双链RNA分子中的任意一种：

CRH siRNA 2

正义序列：5′-GGAUCUCACCUUCCACCUUTT-3′

反义序列：5′-AAGGUGGAAGGUGAGAUCCTT-3′；

或

CRH siRNA 3

正义序列：5′-CAGCUCCGAUAUCAUUUGUTT-3′

反义序列：5′-ACAAAUGAUAUCGGAGCUGTT-3′。

本发明的实施例还提供一种CRH表达抑制剂，其含有CRH siRNA2或CRH siRNA 3中的一种。

优选的，一种CRH表达抑制剂，其含有CRH siRNA2，本发明的实施例证明了其中二组可以在体内有效降低CRH基因的表达；且第2组的siRNA分子抑制CRH基因表达最优。

本发明的实施例还提供靶向CRH基因的siRNA在制备治疗神经病理性疼痛药物中的应用。

本发明的实施例另外还提供一种治疗神经病理性疼痛的药物，其特征在于，该药物至少包含有效量的CRH siRNA 2、CRH siRNA 3中的一种或两种。

本发明的实施例另外还提供靶向CRH基因的siRNA在治疗神经病理性疼痛中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备神经病理性疼痛模型小鼠；

S2、在SNI后，检测模型小鼠DRG中CRH的mRNA表达变化，具体包括：动物组织样品RNA提取、逆转录和Real-time PCR过程；

S3、免疫荧光染色检测模型小鼠DRG中CRH蛋白表达；

S4、小鼠SNI 3天后，鞘内注射siRNA验证CRH的siRNA的敲除效果；

S5、小鼠SNI后3天时鞘内注射CRH的siRNA，通过行为学检测方法验证siRNA是否可缓解SNI引起的机械性触诱发痛。

上述的，所述siRNA包括CRH siRNA1、CRH siRNA 2和CRH siRNA 3。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

(1)本发明为神经病理性疼痛治疗药物的研发提供了新靶点和新方法；提供了靶向CRH基因的非化学修饰及化学修饰核酸分子，对神经病理性疼痛具有较好的治疗效果，对临床研发新的镇痛药物提供新的思路及实验依据，具有重大的临床应用价值。

(2)基于本研究小组在前期的研究中发现，外周神经损伤(腓总神经和胫神经结扎损伤，简称SNI)诱导的神经病理性疼痛小鼠模型的DRG中CRH的mRNA和蛋白表达均显著上调；本发明提供了三组靶向CRH基因的化学修饰核酸siRNA分子，本发明的实施例证明了其中二组可以在体内有效降低CRH基因的表达；且第2组的siRNA分子抑制CRH基因表达最优，并能够有效缓解SNI诱导产生的机械性痛觉过敏，因此，本发明所设计的二组化学修饰核酸siRNA分子可以有效抑制CRH基因表达的siRNA，可用于神经病理性疼痛治疗药物的研发；为临床治疗性疼痛奠定了基础，具有重大的应用推广价值。

(3)本发明的实施例中，通过鞘内注射CRH的siRNA的相关实验，验证了鞘内注射CRH的siRNA能缓解外周神经损伤引起的机械性痛觉过敏并下调CRH的表达，因此，通过应用小干扰RNA下调或抑制CRH的基因和蛋白表达，是治疗神经病理性疼痛的一种有效途径。

附图说明

图1为本发明的实施例中CRH siRNA 1靶序列位于人和小鼠CRH基因序列保守区域。

图2为本发明的实施例中CRH siRNA 2靶序列位于人和小鼠CRH基因序列保守区域。

图3为本发明的实施例中CRH siRNA 3靶序列位于人和小鼠CRH基因序列保守区域。

图4为本发明的实施例中SNI诱导神经病理性疼痛模型DRG中CRH mRNA表达增加。

图5为本发明的实施例中SNI诱导的神经病理性疼痛模型小鼠DRG中CRH蛋白表达增加。其中，图5A为SNI后第3天Sham组荧光信号图，图5B为SNI后第3天CRH组荧光信号图。

图6为本发明的实施例中本发明体内实验验证CRH siRNA对DRG中CRH mRNA的沉默效率。

图7为本发明的实施例5中利用siRNA2干扰后缓解神经病理性疼痛小鼠的机械性痛觉过敏的结果图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例一、siRNA的设计与合成

关于siRNA序列设计，利用RNAi Designer等软件，参数设置为：GC含量为35％-55％；靶点区域为基因编码区和进化保守区。根据人(NM_000756.4)和小鼠(NM_205769.3)的CRH mRNA序列设计合成如下三组双链siRNA：

本发明所设计针对CRH的三组siRNA，能够同时靶向人和小鼠的CRH基因，其靶点序列位于CRH基因的编码区域，具体靶向位置见图1-3。

实施例二、神经病理性疼痛模型小鼠DRG中CRH mRNA表达变化检测

实时定量PCR结果显示，在SNI后，DRG中CRH的mRNA表达从第1天开始表达增加，可以持续到21天以上，到第10天表达达到峰值。具体实验过程如下：

2.1神经病理性疼痛模型小鼠制备

成年健康的小鼠术前适当禁水禁食，透明麻醉盒进行预麻，用动物剃毛器剃除腿部毛，然后放置在动物加热毯上，通过面罩麻醉机使小鼠保持麻醉状态。用酒精和碘伏消毒腿部手术部位后，使用手术刀在小鼠膝盖附近做纵向切口，用尖镊和弯镊分离肌肉层，通过股二头肌暴露坐骨神经，识别腓总神经、胫神经、腓肠神经，用玻璃电极小心使腓总神经和胫神经游离，用6-0丝线对腓总神经和胫神经进行结扎，结扎后缝合肌肉及皮肤切口，碘伏消毒后放置在动物加热毯上待其苏醒，术中保持无菌。在假手术小鼠中，除不结扎神经外，其他操作和上述一致。

2.2动物组织样品RNA提取、逆转录和Real-time PCR过程：

2.2.1RNA提取

(1)将用生理盐水灌注取得的DRG放入含100μl Trizol的1.5ml RNAase Free EP管中，放置在冰上，用微量匀浆器匀浆1次/60s，共6次，匀浆结束后再加900μl Trizol，冰上静置5min；

(2)每管加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，静置2min；

(3)离心机4℃、12000rpm离心15min；

(4)吸上清至1.5ml RNAase Free EP管中，加入等体积异丙醇，轻柔混匀直至无肉眼可见的丝状物，静置10min；

(5)离心机4℃、12000rpm离心15min；

(6)弃上清，加入1ml无水乙醇轻混，离心机4℃、12000rpm离心15min；

(7)弃上清，倒扣在滤纸上室温晾干，直至沉淀半透明；

(8)每管加入10μl RNase-free H2O，60℃水浴10min促溶，溶解后置于冰上；

(9)用OD仪检测RNA浓度。

2.2.2总RNA逆转录为cDNA

(1)去除基因组DNA(10μl)

(2)RNA逆转录为cDNA(20μl)

逆转录为cDNA后加入ddH2O稀释8倍，-20℃保存备用。

(3)引物序列

引物设计，选用NCBI数据库中小鼠CRH的mRNA序列，在NCBI网站上设计引物，并用BLAST特异性验证，预判扩增产物大小，根据溶解曲线和琼脂糖凝胶跑胶结果具体验证引物特异性，引物序列由Invitrogen(上海)合成。

实验中所需引物序列如下表

2.2.3Real-time PCR实验

(1)按照如下表格配置Real-time PCR反应体系(10μl)：

(2)使用PCR仪(Life Technology)反应，条件如下：

Real-time PCR结果，如图4所示，SNI诱导CRH的mRNA在DRG中表达增加，其增加从手术后第1天开始，第10天达到顶峰，第21天仍然增加显著。每组5小鼠，Real-time PCR结果采用t检验(Student’s T-test)，与对应时间点的Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实施例三、模型小鼠DRG中CRH蛋白表达检测

免疫荧光结果显示，与Sham 3d组相比，SNI 3d的DRG中CRH蛋白和阳性细胞数表达显著高于Sham 3d组，具体实验过程如下：

3.1组织切片准备

小鼠经异氟烷深度麻醉后，经生理盐水和多聚甲醛灌注后置于冰上取DRG，将DRG放置于1.5ml管中加4％多聚甲醛置于4℃，待DRG沉底后换20％蔗糖置于4℃，待DRG沉底后换30％蔗糖置于4℃脱水，DRG再次沉底后。将DRG取出，在模型槽内浅浅铺一层包埋剂，将修剪好的DRG按顺序置于模型槽中，模型槽放入切片机速冻台上快速冷冻，待凝固后用包埋剂将槽内补满。凝固成型后将包埋块使用OTC粘于冻台上，进行冰冻切片。DRG切片贴片厚度为15μm，贴于粘附载玻片上，切好后可直接放入PBS中进行免疫荧光染色，或放入-80℃冻存备用。

3.2免疫荧光染色

(1)将切片放在含有0.01mol/L PBS的缸中，摇床漂洗3次，每次10min；

(2)洗片后，加入1％BSA封闭液，室温封闭2h(贴片需要在组织周围用组化笔画上圈，以免封闭液溢出)。

(3)封闭后，加入配好的一抗，加入一抗后4℃过夜孵育。

(4)次日拿出，室温复温1-2h后，将一抗回收，0.01mol/L PBS洗3次，10min/次。

(5)0.01mol/L PBS稀释二抗，室温避光孵育2h。

(6)弃去二抗，0.01mol/L PBS避光洗片3次，10min/次。

(7)室温避光放置，片子晾半干时用封片剂封片，晾干后使用荧光显微镜拍摄。

免疫荧光单标结果，如图5所示，SNI后第3天CRH组荧光信号较Sham组相比显著增强，提示CRH蛋白和表达的阳性神经元数量在SNI后表达增加，比例尺＝100μm。

实施例四、CRH siRNA敲除效率验证

本发明首先在小鼠SNI 3天后鞘内注射siRNA验证CRH的siRNA的敲除效果，Real-time PCR结果显示，3个靶向CRH的siRNA中有两个能抑制CRH的表达。具体过程参见2.2进行。

本发明的实施例中鞘内注射CRH siRNA后，利用Real-time PCR检测CRH mRNA表达水平；结果如图6所示显示，3个靶向CRH的siRNA中的2个都能显著抑制CRH的表达。统计结果采用(One-way ANOVA)和NC组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

实施例五、CRH siRNA对神经病理性疼痛小鼠的机械性疼痛行为影响

本发明采用腓肠神经和胫神经结扎(SNI)后3天时鞘内注射CRH siRNA，然后检测siRNA是否缓解了SNI引起的机械性触诱发痛。行为学结果显示，CRH siRNA能够缓解SNI引起的机械性触诱发痛，从注射后3h开始起效，持续到第二天，如图7所示。具体实验过程如下：

5.1小鼠鞘内注射CRH siRNA

在制备SNI模型后3天鞘内注射CRH siRNA2。SNI参见2.1，将siRNA2稀释，5μg/10ul，SNI 3天后鞘内注射CRH siRNA2。NC siRNA作为对照，用同样方法进行注射。

5.2小鼠行为学检测

小鼠行为检测前提前三天进行适应，保持相同的环境，检测采用盲法检测。

对于机械性痛觉行为检测，将小鼠放置在铁架上的透明九宫格中，适应1h。根据不同Von Frey filament(0.02g、0.04g、0.07g、0.16g、0.40g、0.60g、1.0g和2.0g)进行测量。Von Frey filament垂直刺激小鼠左侧足底外侧直至弯曲到45°，重复5次，观察小鼠是否存在抬爪、甩爪及舔爪行为，若出现3次上述行为有则记为X，若低于则记为O。第一次先使用0.16g刺激，如果是X换小一级刺激，如果是O则换大一级刺激，以此类推。最后得到4个字符“XXXX”或者五个字符“OOOOO”或六个字符如“OXXXOX”，根据阈值表将字符换算为缩爪阈值Paw withdrawal threshold(g)，缩爪阈值越大，则其痛觉越弱。

本发明在SNI 3天后鞘内注射之前干扰效果最好的第2组CRH siRNA，然后检测该siRNA是否缓解SNI引起的机械性触诱发痛。行为学结果显示，CRH的siRNA能够缓解SNI引起的机械性触诱发痛，从注射后3小时开始起效，持续到第二天。行为学统计分析采用双因素方差分析(Two-way ANOVA)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与相应时间点的NC siRNA组比较。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通大学

<120> 靶向CRH基因的siRNA及其在神经病理性疼痛治疗中的应用

<141> 2021-04-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CRH siRNA1 正义序列(CRH siRNA1-F)

<400> 1

gauggagauu aucgggaaat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CRH siRNA1 反义序列(CRH siRNA1-R)

<400> 2

uuucccgaua aucuccauct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CRH siRNA2 正义序列(CRH siRNA2-F)

<400> 3

ggaucucacc uuccaccuut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CRH siRNA2 反义序列(CRH siRNA2-R)

<400> 4

aagguggaag gugagaucct t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CRH siRNA3 正义序列(CRH siRNA3-F)

<400> 5

cagcuccgau aucauuugut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> CRH siRNA3 反义序列(CRH siRNA3-R)

<400> 6

acaaaugaua ucggagcugt t 21