一种大豆高油分相关的分子标记和鉴定高油分大豆的方法

摘要

本发明提供了一种大豆高油分相关的分子标记和鉴定高油分大豆的方法，属于生物技术领域。为了快速和准确的筛选高油分优质大豆品种。本发明提供了一种大豆高油分相关的分子标记，本发明提供了大豆高油分相关的分子标记SNP1、SNP2、SNP3、SNP4和SNP5，它们对应的核苷酸位点分别为Gm02_45782543、Gm05_34698561、Gm05_40120889、Gm06_38700895和Gm06_38795846。通过对标记的选择来实现对性状的选择，大幅度提高育种效率，实现定向改良大豆品种的作用即可以选择出高蛋白的大豆品种。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大豆高油分相关的分子标记和鉴定高油分大豆的方法。

背景技术

大豆有着丰富的营养成分，油分在20％左右。大豆蛋白质中含有8种人体必需氨基酸，人们可以通过食用大豆用以补充所需的营养物质，并且可以预防人体的心血管疾病，大豆同时是重要的油料作物，可以被加工为食用油，可以满足人们的饮食需求，同时主要由五种脂肪酸组成，而脂肪酸可以预防心脏病、癌症等。随着人们的生活水平日益提高，越来越多的人更多的注重于食用健康与食物的营养价值，因此对大豆的需求很大，但我国的大豆更多的是依赖于从其他国家进口，所以我国急需提高大豆油分含量及培育高蛋白、高油大豆品种，满足人们的日常所需。

大豆子粒的油分是品质相关性状，是比较复杂的数量性状，受到多个基因控制，一直以来受到遗传特性和育种方法的限制，传统方法过于缓慢，随着科技的不断进步，分子辅助选择被提出，在传统杂交育种方法的基础上利用分子标记与决定目标性状的基因紧密连锁，通过对标记的选择来实现对性状的选择，大幅度提高育种效率，实现定向改良大豆品种的作用即可以选择出高油分的大豆品种。

发明内容

本发明的目的是为了快速和准确的筛选高油分优质大豆品种，本发明提供了一种大豆高油分相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为SNP1，所述SNP1的序列为大豆2号染色体上45.78Mb-46.05Mb位置的的核苷酸序列，且Gm02号染色体的第45782543核苷酸位点为A或T；

扩增所述SNP1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25或如SEQ ID NO.26所示，扩增所述SNP1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

本发明提供了一种大豆高油分相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为SNP2，所述SNP2的序列为大豆5号染色体上3.79Mb-40.12Mb位置的的核苷酸序列，且Gm05号染色体的第34698561核苷酸位点为A或G；

扩增所述的SNP2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31或如SEQ ID NO.32所示，扩增所述的SNP2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示。

在一种实施方式中，所述SNP2的序列上第40120889核苷酸碱基位点为T和C；

扩增所述的SNP2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.40或如SEQ ID NO.41所示，扩所述的SNP2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示。

本发明还提供了一种大豆高油分相关的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列为SNP3，所述SNP3的序列为大豆6号染色体上6.67Mb-38.79Mb位置的的核苷酸序列，且Gm6号染色体的第38700895核苷酸位点为C或G；

扩增所述的SNP3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.46或如SEQ ID NO.47所示，扩增所述的SNP3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.48所示。

在一种实施方式中，所述SNP3的序列上第38795846核苷酸碱基位点为T和G；

扩增SNP3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.49或如SEQ ID NO.50所示，扩增所述的SNP3的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.51所示。

本发明还提供了一种鉴定高油分含量大豆的方法，所述方法的具体步骤为：

(1)提取待检测大豆的DNA；

(2)利用SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为TT基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为GG基因型则待检测品种的大豆为低油分含量的大豆。

本发明还提供了一种鉴定高油分含量大豆的方法，所述方法的具体步骤为：

(1)提取待检测大豆的DNA；

(2)利用SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为GG基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为AA基因型则待检测品种的大豆为低油分含量的大豆。

本发明还提供了一种鉴定高油分含量大豆的方法，所述方法的具体步骤为：

(1)提取待检测大豆的DNA；

(2)利用SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为TT基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为CC基因型为低油分含量的大豆。

本发明还提供了一种鉴定高油分含量大豆的方法，所述方法的具体步骤为：

(1)提取待检测大豆的DNA；

(2)利用SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为GG基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为CC基因型为低油分含量的大豆。

本发明还提供了一种鉴定高油分含量大豆的方法，所述方法的具体步骤为：

(1)提取待检测大豆的DNA；

(2)利用SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为GG基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为TT基因型为低油分含量的大豆。

有益效果：本研究利用643份经过全基因组重测序的资源群体结合其2年3次重复的大豆子粒贮藏物质的表型数据，利用分层评价的方法筛选出与油分极显著相关的SNP位点，采用SNP分子标记技术中的KASP在162份大豆非测序极端油分资源材料中进行验证，根据其分型结果及其表型数据，开发出与油分相关的分子标记，用以在生产中提前筛选高油分优质品种提供一种高速准确的方法。

附图说明

图1为2018、2019年资源测序材料油分含量及BLUP分布直方图，其中，图A为2018年油分含量分布直方图，B是2019年油分含量分布直方图，C是2年油分BLUP分布直方图，横坐标是组别，纵坐标是频率；

图2为20条染色体上SNP位点数目分布，其中，横坐标是染色体，纵坐标是SNP个数；

图3为20条染色体上与油分相关的SNP位点数目分布，其中，横坐标是染色体，纵坐标是SNP个数；

图4为与油分相关的SNP位点突变基因组对应等位基因与参考基因组对应表型效应值差值，其中，横坐标是组别，纵坐标是表型效应之差值；

图5为与油分相关SNP位点的高油分优异单倍型与低油分单倍型表型均值，其中，横坐标是组别，纵坐标是蛋白质含量；

图6为SNP标记在162份个大豆极端油分资源材料中的KASP基因分型。

具体实施例

大豆油分含量的MQTL记载在文献Qi et al.2018Meta-analysis andtranscriptome profiling reveal hub genes for soybean seed storage compositionduring seed development。

实施例1.

实验群体：选取643份东北地区大豆核心种质测序资源作为实验群体，于2018、2019年在吉林省农科院及东北农业大学向阳农场试验田中种植且3次重复，1m行长，每1行播撒20粒种子，播种的深度为3-4cm，田间管理方法同大田管理，收获后考察各个性状，选择长势一致的5株进行测量。在营养生长阶段，采取植株顶端最幼嫩处叶片用于提取DNA，收获时每个株系随机取5株进行脱粒，用于测定油分含量。

一、大豆子粒油分含量测定及处理：使用FOSS谷物分析仪(Infratec1241)用大量法测出实验材料及验证材料的油分含量，该仪器利用近红外透射技术进行全谱扫描，可获得丰富的光谱信息，通过对比定标数据库从而获得精度非常高的油分含量表型数据。测量时要保证子粒在安全含水量范围内，每份单株子粒重复测量3次，取3次测量数据的平均值作为最终油分含量表型数据。利用Microsoft Office excel2013进行表型数据处理，取其平均值，利用SPSS统计分析2年3次重复的大豆子粒油分数据，包括显著性检验，频率分布直方图，计算均值等。通过R软件进行最佳线性无偏预测值(The Best Linear UnbiasedPredictions，BLUP)的计算。

由表1可知，该群体1个品质相关性状两年均无较大变幅，变异系数在4％-5％之间，其中油分的变异系数最小，达到4.73％。油分性状标准差较小，2年分别为0.98、0.99。通过分析峰度、偏度发现，该群体的1个品质相关性状的油分表现为高度偏态分布。将2018、2019两年油分表型数据进行BLUP分析，并将2018、2019两年油分均值(图1中A和B)及BLUP值利用SPSS软件做了正态分布图(图1中C和D)，从图中可看出测得的大豆子粒油分的两年数据和BLUP值均显示连续分布，而且分布趋势均很明显，从正态曲线上也能得知大豆子粒油分均呈现出正态分布。其次，从油分的2年及其BLUP值的图中也可以看出，BLUP值的峰值较两年数据也是较低一些，数据分布也较广且较均匀，且该品质性状的BLUP值分布特征也符合数量性状遗传特点，更适合利用BLUP值进行后续分析研究。

表1大豆测序材料2018、2019年油分品质性状的描述性分析

DNA提取方法：取大豆3-4g新鲜叶片装入1.5mL离心管，再加入3颗3mm灭菌的小钢珠。将离心管浸于液氮中，应用组织研磨仪将冻干的叶片组织震荡成粉末。加入650-700μL预先在65℃水浴锅中水浴的CTAB提取液，置于涡旋震荡仪上充分混匀，65℃水浴1小时，每15min颠倒混匀一次。加入等体积氯仿充分混匀，12,000rpm离心20min，吸取上清液注入新的离心管中，重新加入700μL氯仿，充分颠倒混匀后离心12,000rpm，20min，吸取上清匀速滴加入预先装有-20℃预冷异丙醇的离心管中，-20℃环境下保存20min。8,000rpm离心10min，将上清液倒入废液缸，分别用无水乙醇和75％乙醇洗涤底部团状DNA。将离心管开盖置于超净工作台中吹干，加入灭菌水。用分光光度计(NanoDrop)检测提取得到的DNA的质量水平，利用琼脂糖凝胶电泳检测出DNA浓度，统一稀释到工作液浓度20ng/μL。

二、资源测序材料SNP位点的分层评价：选取643份大豆资源群体进行重测序，20条染色体共获得SNP位点53,946个，SNP质量控制MAF<0.05，杂合率<10％，平均每条染色体含有2,697个。其中Chr18染色体中SNP数量最多，有4,462个；Chr11染色体中SNP数量最少，有862个，其余染色体上的SNP数目见图2。

三、重要等位基因挖掘：(1)针对表型将材料进行分类，分别按照研究的性状不同即大豆油分，求其所有数据平均值及其标准差，将平均值分别加减标准差所得数据分别作为临界，高于平均值加标准差材料作为高油分材料。

(2)把研究的该SNP位点的测序结果根据是参考基因组的等位基因还是突变后基因组对应的等位基因统计分析，并且结合表型数据即油分按照平均值加减一倍标准差作为标准将材料进行分类，取两端高于和低于该标准材料，将所统计得到的数据列入如下四联表如表2中，进行卡方检测：

表2卡方分析的四联表

注：i为A/C/T/G，a

(3)原假设H0：油分含量的大小与i等位基因相互独立，HA：2个变数有关联。通过下列公式得到χ2结果，当所得到的χ2＜χ2α时，同意H0成立；当所得到的χ2≥χ2α时，不同意H0成立，HA成立。因此根据得到的χ2值与α＝0.001时的阈值针对研究的SNP位点进行判断。

(4)重复(2)、(3)步骤，对油分性状的所有SNP位点进行独立性检验，用以来判断对该研究性状的具体影响，本实验以alpha＝0.001作为阈值，当所得到的结果对应的P＜0.001时，则判断该SNP位点为影响该性状的显著位点，进行后续研究，而P≥0.001时，则放弃继续研究该位点。

(5)对于(4)步骤所选出的显著位点进行下一步的表型效应值验证，在所有材料中对显著位点进行表型效应计算，通过以下公式：

注：Rate of change表示效应值，A等位基因表示该SNP位点的参考基因组对应的等位基因，Value A表示有着A样品的油分含量的均值，B等位基因表示该SNP位点的突变基因组对应的等位基因，Value B表示有着B样品的油分含量的均值。

结果：采取卡方分析时针对油份表型数据即其平均值加减一倍标准差为标准取两端油分表型及测序结果，将其进行分层评价，通过利用卡方分析方法，依旧选择显著性alpha＝0.001作为分层阈值，将分析所得到结果进行分层，当检验P值小于0.001时，则认为是与油分相关的极显著的SNP位点，其余P值大于0.001的相较之下效应相对小，选择意义甚小，因此得到与油分相关极显著位点个数9,211，其中9号染色体上最多为1,448个，其他染色体上数目见图3，为进一步挖掘好的位点因此针对其SNP位点突变分别在高低表型中占比进行进一步限制，并且将其得到极显著位点与大豆油分MQTL结果相比较找到重合区间的位点，比较后得到的相关SNP位点个数为193个，与油分相关的SNP位点在20号染色体上最多，达73个。

经卡方检测及与MQTL对比得到的关键SNP位点突变前后的效应各不相同，有些是对油分含量起正向效应，有些为负向效应：如果含有某等位基因的油分含量平均值比所有资源的油分含量平均值高，那么该等位基因能够增加油分含量；相反，如果含有其突变等位基因的油分含量平均值比所有资源油分含量平均值低，那么该等位基因具有能够减少油分含量的作用。SNP位点对油分含量的效应值有所不同(如图4)，图中上方的点列出的是突变对应等位基因的表型效应值与参考基因组对应等位基因的表型效应值的差值为正值，即突变后油分含量增加，图中下方的点是突变对应等位基因的表型效应值与参考基因组对应等位基因的表型效应值的差值为负值，即突变后油分含量减少。

在1号染色体上39.67-41.16(代表在染色体上的位置)的28个SNP位点，其占高油分的比例为60％-69.23％，其表型效应率在1.03％-2.83％；在2号染色体上45.78-46.05的32个SNP位点，其占高油分的比例为64.66％-72.31％，其表型效应率在0.96％-2.21％；在3号染色体上38904164处的SNP位点，其占高油分的比例为61.54％，其表型效应率均为2.17％；在5号染色体上3.79-40.12的22个SNP位点，其占高油分的比例为60％-73.85％，其表型效应率在1.39％-2.28％；在6号染色体上6.67-38.79的4个SNP位点，其占高油分的比例为60％-69.23％，其表型效应率在1.47％-2.26％；在11号染色体上7.61-9.07的6个SNP位点，其占高油分的比例为60％-63.08％，其表型效应率为1.47％-1.58％；在13号染色体上20.17-20.33的15个SNP位点，其占高油分的比例为72.31％-78.46％，其表型效应率1.59％-2.40％；在14号染色体上30524559、31571725的2个SNP位点，其占高油分的比例为76.92％，其表型效应率分别为1.92％、2.24％；在16号染色体上31468397处的SNP位点，其占高油分的比例为61.54％，其表型效应率2.37％；在18号染色体上50.33-55.08的9个SNP位点，其占高油分的比例为61.54％-76.92％，其表型效应率在1.92％-2.63％；在20号染色体上13.66-41.76的73个SNP位点，其占高油分的比例为60％-75.38％，其表型效应率在1.48％-2.63％(结果如表3)。以上大豆的染色体的信息是来自于网站：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Gmax。

表3筛选后的与油分相关的SNP位点

四、油分相关SNP位点单倍型分析：分析193个其变异位点的单倍型，将接近的位点分为一组共同分析，共得到44组，每组均产生不同单倍型，分析得到该单倍型在643份测序材料中所占比例，并计算出该单倍型的表型均值，最后分析得到分析17组位点的最优单倍型和最差单倍型的油分表型均值有较大差异，能够较好的达到油分的分离见图5。

在1号染色体上40386604处分析得到，高油分优异单倍型Hap_(TGATTCTAGTCGTTC)和低油分单倍型Hap_9(CAGCGACTAGTAGAG)，高油分优异单倍型占47.83％，油分主要分布在20-23左右，低油分单倍型占8.36％，油分主要分布在20-21，达到明显差异；在1号染色体上40780703处分析得到，高油分优异单倍型Hap_1(GAAGAAAG)和低油分单倍型Hap_9(CGGCCACC)，高油分优异单倍型占48.33％，油分主要分布在20-23左右，低油分单倍型占1.34％，油分主要分布在20.5-21，达到明显差异；在1号染色体上40884357处分析得到，高油分优异单倍型Hap_1(AAC)和低油分单倍型Hap_5(GAT)，高油分优异单倍型占48.66％，油分主要分布在20-23左右，低油分单倍型占2.01％，油分主要分布在19-20，达到明显差异；在1号染色体40959307、41034358、41037022、41156486处也均得到高油分优异单倍型及低油分单倍型，油分的分布均达到差异明显，在2、5、6、11、13号染色体上的位点处也均产生高油分优异单倍型及低油分单倍型，油分的分布均达到差异明显。

五、验证群体：162份东北地区大豆核心非测序极端油分资源材料，如表4用于重要等位基因挖掘的验证，种植、管理、采样、收获方法同实验材料。

表4 162份大豆非测序极端油分材料品种名称及油分含量

SNP位点的标记筛选及方法：KASP反应体系由混合引物，Master Mix和样本DNA组成。根据分层评价得到的SNP位点，通过本地Blast提取SNP位点上下游各50bp的碱基序列，利用Primer 5.0软件设计KASP引物。每一个位点的引物皆由2条具有不同等位基因和荧光标签的特异性正向引物(F1/F2)以及1条公共的反向引物(R)构成，其中各组分主要配方分别是46μL的ddH

KASP反应所需组分加于384孔板，采用罗氏LightCycler480Ⅱ实时荧光定量PCR仪并在反应终止后读取终端荧光信号，其PCR扩增程序：95℃，15min；95℃，20s；65℃，25s；Goto step 2，10cycles，-0.8℃per cycle；95℃，10s；57℃，1min；Go to step 4，35cycles；4℃，∞。

表5引物序列信息

KASP分型验证：罗氏LightCycler480Ⅱ得到分型结果，转置到Excel软件，进行分析，计算该位点符合率，基本思路为：

(1)根据不同的极端大豆油分非测序材料，统计出每个引物在高油分、低油分材料中SNP位点的参考基因组对应的等位基因及突变基因组对应的等位基因的个数及分布，构建符合率的四格表如表6所示：

表6符合率的四格表

注：x、y为SNP位点设计引物的KASP分型的基因型，a为非测序高油分材料分型结果中有x等位基因数量，b为非测序低油分材料分型结果中有x等位基因数量，c为非测序高油分材料分型结果中有y等位基因数量，d为非测序低油分材料分型结果中有y等位基因数量，M为非测序高油分材料总数，N为非测序低油分材料的总数。

(2)原假设H

(3)重复(1)、(2)步骤，对油分性状的所有引物分型结果进行独立性检验，用以来验证对该性状的影响，对于(3)步骤所得到的所有结果进行进一步表型效应验证，在所有材料中对主效位点进行表型效应计算，利用以下公式：

为验证SNP位点挖掘优异等位基因，选取与油分相关的21个SNP位点，根据KASP引物设计原则查找是否有特异性，并加上荧光标签最终设计出21个引物，引物序列信息见附表A8，利用KASP平台分别对162份极端油分资源材料进行验证分析，进一步得到关键SNP位点。

与油分相关的标记最终21个分型成功，图6表示1个KASP分型成功标记的的结果示意图，图中表明2种不同的纯合等位基因型(CC、TT)，还有表示杂合基因型(CT)。与油分相关的Gm02_45782543标记在高油分材料中41份AA基因型，低油分材料中53份为TT基因型，分别占高油分、低油分材料为51.28％和64.29％，其表型效应值为3.27％；与油分相关的Gm05_34698561标记在高油分材料中65份GG基因型，低油分材料中68份为AA基因型，分别占高油分、低油分材料为83.33％和76.19％，其表型效应值为10.76％；与油分相关的Gm05_40120889标记在高油分材料中47份TT基因型，低油分材料中84份为CC基因型，分别占高油分、低油分材料为60.26％和100％，其表型效应值为10.29％；油分与油分相关的Gm06_38700895标记在高油分材料中73份GG基因型，低油分材料中78份为CC基因型，分别占高油分、低油分材料为93.59％和88.10％，其表型效应值为11.02％；与油分相关的Gm06_38795846标记在高油分材料中78份GG基因型，低油分材料中63份为TT基因型，分别占高油分、低油分材料为94.87％和70.24％，其表型效应值为11.34％。

Gm02_45782543标记的高油大豆为AA基因型，低油分大豆为TT基因型，Gm05_34698561标记的高油分大豆为GG基因型，低油分大豆为AA基因型，Gm05_40120889标记的高油分大大豆为TT基因型，低油分的大豆为CC基因型，Gm06_38700895标记的高油分大豆为GG基因型，低油分大豆为CC基因型，Gm06_38795846标记的高油分大豆为GG基因型，低油分大豆为TT基因型。

实施例2.

一、一种筛选高油分大豆的试剂盒：(a)～(e)分子标记：

(a)SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27；

(b)SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33；

(c)SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42；

(d)SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48；

(e)SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51。

二、筛选方法：

选择未知大豆油分含量的样品，利用步骤一所述的筛选高油分大豆的试剂盒，进行PCR扩增程序：95℃，15min；95℃，20s；65℃，25s；Go to step 2，10cycles，-0.8℃ percycle；95℃，10s；57℃，1min；Go to step 4，35cycles；4℃，∞。具体方法如下：

本发明还提供了一种鉴定高油分含量大豆的方法，

(1)提取待检测大豆的DNA；

(2)利用SEQ ID NO.25或SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.27进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为TT基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为GG基因型则待检测品种的大豆为低油分含量的大豆；利用SEQ ID NO.31或SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.33进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为GG基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为AA基因型则待检测品种的大豆为低油分含量的大豆；SEQ ID NO.40或SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为TT基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为CC基因型为低油分含量的大豆；SEQ ID NO.46或SEQ ID NO.47和SEQID NO.48进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为GG基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为CC基因型为低油分含量的大豆；利用SEQ ID NO.49或SEQ ID NO.50和SEQID NO.51进行PCR反应，检测待检测品种的大豆为GG基因型则待检测品种的大豆为高油分含量的大豆，若为TT基因型为低油分含量的大豆。

结果：检测未知的大豆蛋白含量的样品中大豆油分含量有大于20％，利用(a)组引物标记为AA基因型，利用(b)组引物标记标记为GG基因型，利(c)组引物标记标记为TT基因型，利用(d)组引物标记标记为GG基因型，利用(e)组引物标记标记为GG基因型，大豆高油分的含量与标记检测得到的基因型是相符的。大豆低油分的含量与标记检测得到的基因型是相符的。

SEQUENCE LISTING

<110> 东北农业大学

<120>一种大豆高油分相关的分子标记和鉴定高油分大豆的方法

<130>

<160> 80

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_40250042-F1

<400> 1

gaaggtgacc aagttcatgc taatagtagc cggctctcat 40

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_40250042-F2

<400> 2

gaaggtcgga gtcaacggat taatagtagc cggctctcac 40

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Gm01_40250042-R

<400> 3

agccttcaca ccgggggcac 20

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Gm01_40386604-F1

<400> 4

gaaggtgacc aagttcatgc tttgcttatc acgcttatt 39

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Gm01_40386604-F2

<400> 5

gaaggtcgga gtcaacggat tttgcttatc acgcttatc 39

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Gm01_40386604-R

<400> 6

tgcaaaaggt aaaacctagg 20

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm01_40780703-F1

<400> 7

gaaggtgacc aagttcatgc taaatttgct ttgttctctg ag 42

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm01_40780703-F2

<400> 8

gaaggtcgga gtcaacggat taaatttgct ttgttctctg ac 42

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm01_40780703-R

<400> 9

gccacccaat tggagacttg tagag 25

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_40884357-F1

<400> 10

gaaggtgacc aagttcatgc taaaaaaaaa gtgtggttca 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_40884357-F2

<400> 11

gaaggtcgga gtcaacggat taaaaaaaaa gtgtggttcg 40

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Gm01_40884357-R

<400> 12

ggcaccttcg tcgctgttag 20

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_40959307-F1

<400> 13

gaaggtgacc aagttcatgc tttagttgga attttattaa 40

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_40959307-F2

<400> 14

gaaggtcgga gtcaacggat tttagttgga attttattag 40

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm01_40959307-R

<400> 15

ataaaaaata atcccatggc cgaaa 25

<210> 16

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm01_41034358-F1

<400> 16

gaaggtgacc aagttcatgc tggactgcat gctagacaca ta 42

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm01_41034358-F2

<400> 17

gaaggtcgga gtcaacggat tggactgcat gctagacaca tg 42

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm01_41034358-R

<400> 18

tttttcgact tgtgaggcat a 21

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_41037022-F1

<400> 19

gaaggtgacc aagttcatgc ttgagagaaa tgaaggagaa 40

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm01_41037022-F2

<400> 20

gaaggtcgga gtcaacggat ttgagagaaa tgaaggagag 40

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm01_41037022-R

<400> 21

accaaagcat ttctcatgta a 21

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm01_41156486-F1

<400> 22

gaaggtgacc aagttcatgc tatggttcat taagtaagag aa 42

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm01_41156486-F2

<400> 23

gaaggtcgga gtcaacggat tatggttcat taagtaagag ag 42

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm01_41156486-R

<400> 24

ccactatttg cttcagacgg ggtat 25

<210> 25

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm02_45782543-F1

<400> 25

gaaggtgacc aagttcatgc ttccaacgtt tgaattaggg a 41

<210> 26

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm02_45782543-F2

<400> 26

gaaggtcgga gtcaacggat ttccaacgtt tgaattaggg t 41

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Gm02_45782543-R

<400> 27

caatttctcg gaaaattatg aca 23

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm02_45828485-F1

<400> 28

gaaggtgacc aagttcatgc tatctccttc tgatcctcat 40

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm02_45828485-F2

<400> 29

gaaggtcgga gtcaacggat tatctccttc tgatcctcac 40

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm02_45828485-R

<400> 30

gagagagaga aaaaaaaaag cagtt 25

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm05_34698561-F1

<400> 31

gaaggtgacc aagttcatgc tattctgcac acagccctca 40

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm05_34698561-F2

<400> 32

gaaggtcgga gtcaacggat tattctgcac acagccctcg 40

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> Gm05_34698561-R

<400> 33

gcaactgcag ataaagtgac ttc 23

<210> 34

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm05_34705563-F1

<400> 34

gaaggtgacc aagttcatgc tatgactcag gttcttccgt g 41

<210> 35

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm05_34705563-F2

<400> 35

gaaggtcgga gtcaacggat tatgactcag gttcttccgt a 41

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> Gm05_34705563-R

<400> 36

atgaatgaca ctgatgtcta aaagaaa 27

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm05_34714762-F1

<400> 37

gaaggtgacc aagttcatgc taaggagtgt aaaggggagg 40

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm05_34714762-F2

<400> 38

gaaggtcgga gtcaacggat taaggagtgt aaaggggagc 40

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> Gm05_34714762-R

<400> 39

ttttaacttt tatcaacctt aagaattt 28

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm05_40120889-F1

<400> 40

gaaggtgacc aagttcatgc taacccctct gttattccat 40

<210> 41

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm05_40120889-F2

<400> 41

gaaggtcgga gtcaacggat taacccctct gttattccac 40

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm05_40120889-R

<400> 42

gctaaaactt caacatcaag c 21

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm06_38700819-F1

<400> 43

gaaggtgacc aagttcatgc tggatggaaa aaagggtggc 40

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm06_38700819-F2

<400> 44

gaaggtcgga gtcaacggat tggatggaaa aaagggtggt 40

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm06_38700819-R

<400> 45

tgtggctcca catgatttag g 21

<210> 46

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm06_38700895-F1

<400> 46

gaaggtgacc aagttcatgc tgagaacatt atagtgtgca c 41

<210> 47

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm06_38700895-F2

<400> 47

gaaggtcgga gtcaacggat tgagaacatt atagtgtgca g 41

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm06_38700895-R

<400> 48

aagcctcttt gatagcctta a 21

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm06_38795846-F1

<400> 49

gaaggtgacc aagttcatgc taatgatgga aatgacttgg tt 42

<210> 50

<211> 42

<212> DNA

<213> Gm06_38795846-F2

<400> 50

gaaggtcgga gtcaacggat taatgatgga aatgacttgg tg 42

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> Gm06_38795846-R

<400> 51

ttagcccaaa aactcttagg 20

<210> 52

<211> 39

<212> DNA

<213> Gm11_7609142-F1

<400> 52

gaaggtgacc aagttcatgc tttctaatga tggggtagt 39

<210> 53

<211> 39

<212> DNA

<213> Gm11_7609142-F2

<400> 53

gaaggtcgga gtcaacggat tttctaatga tggggtagc 39

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm11_7609142-R

<400> 54

ttctgcattt gatacagcat cagca 25

<210> 55

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm11_7640966-F1

<400> 55

gaaggtgacc aagttcatgc tatggcacac ccgtgtttct c 41

<210> 56

<211> 41

<212> DNA

<213> Gm11_7640966-F2

<400> 56

gaaggtcgga gtcaacggat tatggcacac ccgtgtttct t 41

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm11_7640966-R

<400> 57

cacaacatca gtggcagtga agaag 25

<210> 58

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm11_7915040-F1

<400> 58

gaaggtgacc aagttcatgc tcaatggctt tgtagacccc 40

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm11_7915040-F2

<400> 59

gaaggtcgga gtcaacggat tcaatggctt tgtagaccct 40

<210> 60

<211> 21

<212> DNA

<213> Gm11_7915040-R

<400> 60

gcagaatgct tgccagacac t 21

<210> 61

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm11_8038855-F1

<400> 61

gaaggtgacc aagttcatgc taaaacagag gactctgttt 40

<210> 62

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm11_8038855-F2

<400> 62

gaaggtcgga gtcaacggat taaaacagag gactctgttc 40

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm11_8038855-R

<400> 63

accaagcaca tcataaaggg aagcc 25

<210> 64

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm13_20180404-F1

<400> 64

gaaggtgacc aagttcatgc ttaccctttg caagagctaa 40

<210> 65

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm13_20180404-F2

<400> 65

gaaggtcgga gtcaacggat ttaccctttg caagagctac 40

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> Gm13_20180404-R

<400> 66

tggaagatgt ggatgctgtc 20

<210> 67

<211> 39

<212> DNA

<213> Gm13_20320875-F1

<400> 67

gaaggtgacc aagttcatgc tttgaatccg aattgcaat 39

<210> 68

<211> 39

<212> DNA

<213> Gm13_20320875-F2

<400> 68

gaaggtcgga gtcaacggat tttgaatccg aattgcaac 39

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm13_20320875-R

<400> 69

ttctcgttcc atgtcttttg aaacc 25

<210> 70

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm13_20320876-F1

<400> 70

gaaggtgacc aagttcatgc tttgaatccg aattgcaata 40

<210> 71

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm13_20320876-F2

<400> 71

gaaggtcgga gtcaacggat tttgaatccg aattgcaatt 40

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm13_20320876-R

<400> 72

tttctcgttc catgtctttt gaaac 25

<210> 73

<211> 44

<212> DNA

<213> Gm18_50329135-F1

<400> 73

gaaggtgacc aagttcatgc tcctagatcc tcatttcaac tcac 44

<210> 74

<211> 44

<212> DNA

<213> Gm18_50329135-F2

<400> 74

gaaggtcgga gtcaacggat tcctagatcc tcatttcaac tcag 44

<210> 75

<211> 23

<212> DNA

<213> Gm18_50329135-R

<400> 75

agcagttgaa gtgcttattc aaa 23

<210> 76

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm20_34495862-F1

<400> 76

gaaggtgacc aagttcatgc tgtgaatacc ttggatatgg 40

<210> 77

<211> 40

<212> DNA

<213> Gm20_34495862-F2

<400> 77

gaaggtcgga gtcaacggat tgtgaatacc ttggatatgt 40

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> Gm20_34495862-R

<400> 78

ctatgtttgt tcctatctca agtcc 25

<210> 79

<211> 21

<212> DNA

<213> 荧光标签FAM

<400> 79

gaaggtgacc aagttcatgc t 21

<210> 80

<211> 21

<212> DNA

<213> 荧光标签HEX

<400> 80

gaaggtcgga gtcaacggat t 21