异源初次免疫加强疫苗组合物及方法

摘要

可以依次施用各自编码目标免疫原的猿猴腺病毒载体和RNA分子以提供强力和持久的免疫力。

说明书

技术领域

本发明属于传染病防治领域。具体地，本发明涉及编码疾病相关抗原的腺病毒载体和编码疾病相关抗原的自扩增RNA分子。它们可以在初次免疫加强方案中结合产生强烈和持久的体液和细胞免疫反应。

背景技术

疫苗接种是预防传染病的最有效方法之一。然而，单次施用抗原通常不足以给予最佳免疫和/或持久反应。对特定病原体建立强烈且持久的免疫的方法包括重复疫苗接种，即，通过施用一个或多个进一步剂量的抗原来加强免疫反应。此类进一步施用可以用相同疫苗(同源加强)或用不同疫苗(异源加强)进行。

已经证明腺病毒载体提供预防性和治疗性的递送平台，其中编码预防性或治疗性分子的核酸序列被加入到腺病毒基因组中，并且在将腺病毒颗粒施用给所治疗的受试者时表达。大部分人类暴露于人腺病毒并出现对其的免疫。因此，需要这样的载体：其将预防性或治疗性分子有效地递送给人类受试者，同时最小化对人腺病毒血清型的预存免疫(pre-existing immunity)的影响。猿猴腺病毒在此方面有效，因为人类对猿猴病毒有很少或没有预存免疫，然而这些病毒与人类病毒足够密切相关，能够有效地诱导对递送的外源抗原的免疫。

RNA疫苗来源于缺失病毒结构蛋白的基因组复制子，并且表达异源抗原代替病毒结构蛋白。这些自复制或者自扩增的RNA分子(SAM)能够通过合成产生，或者在允许表达一轮携带编码疫苗抗原的RNAs的传染性颗粒的包装细胞系中产生。随后，细胞质中的RNA扩增会产生编码抗原的mRNAs的多个拷贝并且创建双链RNA中间体，该中间体被认为是先天免疫(即，对几乎任何微生物迅速展开的抗原非特异性防御机制)的强力刺激剂。已经证明合成型复制子RNA疫苗在不使用活病毒的情况下实现了瞬时高水平的抗原产生(Brito等，(2015)Adv.Genetics 89:179)。

疫苗接种策略的一个限制是诱导抗载体免疫，导致在再次施用相同载体时得不到有效加强效率。这一限制能通过合适的给药间隔来部分抵消，或者通过采用组合使用不相关载体的异源方案来完全克服。已观察到各种异源初次免疫-加强方案改善了猿猴腺病毒初次免疫之后的抗原特异性免疫反应(Kardani等，(2016)Vaccine 34:413)。

已经证明，异源初次免疫加强策略通过用甲病毒属复制子DNA初次免疫和用编码猪瘟病毒抗原的人腺病毒加强而改善了甲病毒属复制子载体DNA在猪体内的免疫原性(Zhao等，(2009)Vet.Immunol.Immunopath.131:158)，并且已经报道了关于肿瘤抗原的异源初次免疫加强策略(Blair等，(2018)Cancer Res.78:724)。目前，如在临床前环境和一些临床环境中证明的，探索最多的初次免疫加强组合之一是用腺病毒载体疫苗初次免疫，随后用重组修饰安卡拉痘苗(MVA)病毒加强(Ewer等，(2016)Curr.Opinion Immunol.41:47)。尽管有前景，但是由于制造MVA的复杂性，用于临床应用的基于MVA病毒载体的疫苗生产仍存在挑战。因此，在本领域中仍需要提供强大免疫原性而不会诱导抗载体免疫的异源初次免疫加强方案。

发明内容

本发明提供了强力的初次免疫-加强疫苗接种方案，其中RNA和腺病毒疫苗平台用于诱导对多种抗原的强烈和耐久的免疫。

本发明的第一方面提供了组合物，该组合物包含如本文所述的构建体、载体、RNA分子或腺病毒分子中的一种或多种，或者由如本文所述的构建体、载体、RNA分子或腺病毒分子中的一种或多种组成。可替代地或另外地，组合物包含免疫有效量的如本文所述的构建体、载体、RNA分子或猿猴腺病毒分子中的一种或多种，或者由免疫有效量的如本文所述的构建体、载体、RNA分子或猿猴腺病毒分子中的一种或多种组成。

在一个实施方式中，本发明提供了疫苗组合，该疫苗组合包含第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的腺病毒载体，该第二组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的RNA分子，其中所述组合物中的一种为初次免疫组合物，并且另一种组合物为加强组合物。

在一个实施方式中，本发明提供了疫苗组合，该疫苗组合包含第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的腺病毒载体，该第二组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的自扩增RNA载体，其中所述组合物中的一种是初次免疫组合物，并且另一种组合物是加强组合物。在一个实施方式中，这种自扩增RNA载体通过合成产生。在另一方面，这种自扩增RNA载体通过体外翻译产生。

在一个实施方式中，本发明提供了疫苗组合，该疫苗组合包含第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的猿猴腺病毒载体，该第二组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的RNA分子，其中所述组合物中的一种为初次免疫组合物，并且另一种组合物为加强组合物。

本发明的第二方面提供了诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该方法通过以下进行：施用初次免疫疫苗，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的抗原；随后施用加强疫苗，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的抗原，其中，如果初次免疫疫苗由腺病毒载体编码，则加强疫苗由RNA分子编码，并且如果初次免疫疫苗由RNA分子编码，则加强疫苗由腺病毒载体编码。

在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体编码的抗原。在另一方面，本发明提供了用初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由RNA分子编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由猿猴腺病毒载体编码的抗原。在另一方面，本发明提供了用初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由RNA分子编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体编码的抗原。在另一方面，本发明提供了用初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由自扩增RNA载体编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体编码的抗原。在仍然进一步的实施方式中，本发明提供了用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该加强疫苗包含免疫有效量的由RNA分子编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该加强疫苗包含免疫有效量的由猿猴腺病毒载体编码的抗原。在仍然进一步的实施方式中，本发明提供了用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该加强疫苗包含免疫有效量的由自扩增RNA载体编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体编码的抗原。在仍然进一步的实施方式中，本发明提供了用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该加强疫苗包含免疫有效量的由自扩增RNA载体编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗随后用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体编码的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的由RNA分子编码的抗原。在另一方面，本发明提供了用初次免疫疫苗随后用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由RNA分子编码的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体编码的抗原。

在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗随后用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的一种或多种由腺病毒载体编码的病原生物的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的一种或多种由RNA分子编码的相同病原生物的抗原。在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗随后用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的一种或多种由腺病毒载体编码的病原生物的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的一种或多种由RNA分子编码的相同病原生物的抗原，其中所述抗原具有至少一个不相同的表位。

在另一方面，本发明提供了用初次免疫疫苗随后用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的一种或多种由RNA分子编码的病原生物的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的一种或多种由腺病毒载体编码的相同病原生物的抗原。在一个实施方式中，本发明提供了用初次免疫疫苗随后用加强疫苗诱导哺乳动物的免疫反应的方法，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的一种或多种由RNA分子编码的病原生物的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的一种或多种由腺病毒载体编码的相同病原生物的抗原，其中所述抗原具有至少一个不相同的表位。

在一个实施方式中，相同病原生物的一种或多种抗原在初次免疫疫苗和加强疫苗中是相同的。在仍然进一步的实施方式中，相同病原生物的抗原中的至少一种在初次免疫疫苗和加强疫苗中是不同的。

在本文所述的任何实施方式中，免疫反应可以针对传染性生物体例如病毒、细菌或真菌。

在一个实施方式中，腺病毒载体是猿猴腺病毒载体。在一个实施方式中，猿猴腺病毒载体是黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴、猩猩或大猩猩载体。在一个实施方式中，猿猴腺病毒载体是黑猩猩载体。在一个实施方式中，黑猩猩载体是AdY25、ChAd3、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、ChAd15、SadV41、ChAd157、ChAdOx1、ChAdOx2、sAd4287、sAd4310A、sAd4312、SAdV31或SAdV-A1337。在一个实施方式中，腺病毒载体是倭黑猩猩载体。在一个实施方式中，倭黑猩猩载体是PanAd1、PanAd2、PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan7或Pan 9。

在腺病毒载体的一个实施方式中，在表达盒中编码抗原，该表达盒包含转基因和用于在宿主细胞中翻译、转录和/或表达该转基因所必需的调控元件。在一个实施方式中，转基因包含一种或多种抗原。在一个实施方式中，转基因编码多肽抗原。在一个实施方式中，转基因包含密码子优化的抗原序列或密码子对优化的抗原序列。

在一个实施方式中，初次免疫和加强免疫原性组合物中的至少一种通过选自以下的途径施用：经口腔，吸入，肌肉内，鼻内，腹膜内，鞘膜内，静脉内，口服，直肠，舌下，透皮，经阴道，或向组织间隙内。

在一个实施方式中，初次免疫和加强免疫原性组合物中的至少一种包含佐剂。

本发明的第三方面提供了用于根据任何上述实施方式的初次免疫加强施用方案的试剂盒，该试剂盒包括两个药瓶(vial)，第一个药瓶含有用于初次免疫施用的疫苗，第二个药瓶含有用于加强施用的疫苗。

附图说明

图1A.在单次剂量之后病毒中和抗体(VNA)对狂犬病RG抗原的滴度的幅度(magnitude)和动力学。VNA滴度以IU/ml表示。ChAd 10

图1B.在单次剂量之后血液中CD8+反应的幅度和动力学。CD8+T细胞对狂犬病RG抗原特异性五聚肽的反应表示为阳性细胞百分比。ChAd 10

图1C.在单次剂量后第8周在脾细胞中诱导T细胞细胞因子分泌。数据以IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/10

图2A.初次免疫剂量和同源或异源加强剂量之后病毒中和抗体(VNA)滴度的幅度和动力学。每个点表示单个动物的抗体滴度，水平线指示组几何平均数。七个初次免疫加强方案中每一个的狂犬病VNA滴度以IU/ml表示。在初次免疫剂量之后第2、4和8周(w2，w4，w8)以及在加强剂量之后第2、4和8周(w2pb，w4pb，w8pb)测量滴度。

图2B.在狂犬病RG抗原的初次免疫剂量和加强剂量之后血液中CD8+T细胞反应的幅度和动力学。CD8+T细胞对Rg抗原-特异性五聚肽的反应以阳性细胞百分比表示。单个数据点表示每一只动物的RG CD8+反应。水平线指示组几何平均数。

图2C.在狂犬病RG抗原的初次免疫剂量和加强剂量之后第8周在脾细胞中诱导的T细胞的细胞因子分泌。数据以IFN-γ斑点形成细胞(SFC)/10

图3.在单次剂量的编码HIV GAG转基因的猿猴腺病毒之后总抗原特异性抗体滴度的幅度和动力学。HIV1 GAG抗体滴度以第14、28、42和56天的终点滴度表示。将3x10

图4A.在单次剂量的编码HIV GAG抗原的猿猴腺病毒或SAM之后血液中CD8+反应的幅度和动力学。对HIV1 GAG抗原特异性五聚肽的CD8+T细胞反应以阳性细胞百分比表示。单个数据点表示每一只动物的HIV1 GAG CD8+反应。水平线指示组几何平均数。

图4B.在单次剂量之后第8周在脾细胞中诱导的CD4+T细胞反应。数据作为IFN-γCD4+阳性细胞百分比表示。单个数据点表示每一只动物的HIV1GAG蛋白质反应，通过结合重叠肽的活性获得。水平线表示组几何平均数。

图4C.在单次剂量之后第8周在脾细胞中诱导的CD8+T细胞反应。数据作为IFN-γCD8+阳性细胞百分比表示。单个数据点表示每一只动物的HIV1GAG蛋白质反应，通过结合重叠肽的活性获得。水平线表示组几何平均数。

图5.在初次免疫剂量和加强剂量之后HIV1 GAG-特异性IgG滴度的幅度和动力学。滴度以终点滴度表达，并且在第15、29、43、57(加强日)、71、147和241天显示。

图6A.在初次免疫剂量的用编码HIV GAG抗原的猿猴腺病毒或SAM以及同源或异源加强剂量之后血液中CD8+反应的幅度和动力学。CD8+T细胞对HIV1 GAGp24-抗原特异性五聚肽的反应以阳性细胞百分比表示。单个数据点表示每一只动物中的HIV1-GAG CD8+反应。水平线指示组几何平均数。

图6B.在初次免疫剂量和加强剂量之后脾细胞中的CD8+T细胞反应的幅度和动力学。CD8+T细胞对HIV1 GAGp24-抗原特异性五聚肽的反应以阳性细胞百分比表示。单个数据点表示每一只动物中的HIV1-GAG CD8+反应。水平线指示组几何平均数。

图7A.在初次免疫之后第30、58和72天CD8+T细胞对HIV-GAG初次免疫加强方案的反应。示出了IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子和CD107a的反应。初次免疫后第72天是加强后第14天。

图7B.在初次免疫之后第30、58和72天CD4+T细胞对HIV-GAG初次免疫加强方案的反应。示出了IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子和CD107a的反应。初次免疫后第72天是加强后第14天。

图8.在初次免疫剂量的编码HIV GAG转基因的猿猴腺病毒和同源或异源加强剂量之后血液中CD8+反应的幅度和动力学。CD8+T细胞对HIV1GAGp24-抗原特异性五聚肽的反应以阳性细胞百分比表示。水平线指示组几何平均数。

图9A.在初次免疫之后第28、64、72和100天CD8+T细胞对HIV-GAG初次免疫加强方案的反应。示出了IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子和CD107a的反应。初次免疫后第72天是加强后第14天。

图9B.在初次免疫之后第28、64、72和100天CD4+T细胞对HIV-GAG初次免疫加强方案的反应。示出了IFN-γ、TNF-α、IL-2细胞因子和CD107a的反应。初次免疫后第72天是加强后第14天。

图10A.多功能CD8+T细胞对5x10

图10B.多功能CD4+T细胞对5x10

图11.UL-47对使用10

图12A.多功能CD8+T细胞对5x10

图12B.多功能CD4+T细胞对5x10

图13.Ul-47对用腺-HSV Gly VI和SAM HSV Gly VI进行的初次免疫加强方案的反应的多功能CD8+T细胞谱。显示了与盐水对照相比较的在异源初次免疫/加强之后第25日IFN-γ、TNF-α和IL2对HSV Gly VI抗原的细胞因子反应。符号表示单只小鼠的T细胞反应。中位反应以水平实线示出。

具体实施方式

本发明的初次免疫加强组合物和方法在接受者中产生强烈和持久的免疫反应而不会诱导显著的抗载体免疫，或者在一些情况中不会诱导可检测的抗载体免疫。SAM疫苗是猿猴腺病毒疫苗的强力加强剂，并且猿猴腺病毒疫苗是SAM疫苗的强力加强剂。本发明的异源初次免疫/加强组合物和方法提供了强力和有效的疫苗策略，有可能多次重新施用相同的疫苗抗原而不会诱导抗载体免疫。

免疫反应可赋予保护性免疫，其中接种疫苗的受试者能够控制针对其进行疫苗接种的病原生物的感染。出现保护性免疫反应的受试者可能仅出现该病原生物导致的疾病的轻度到中度症状，或者根本没有症状。免疫反应也可以是治疗性的，减轻或消除受试者对针对其进行疫苗接种的病原生物的反应。

术语"核酸”表示任何长度的多聚形式的核苷酸，该核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或它们的类似物。其包括DNA、RNA和DNA/RNA杂交体。其还包括DNA或RNA类似物，例如含有修饰的主链(例如肽核酸(PNAs)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。因此，本公开的核酸包括mRNA、DNA、cDNA、重组核酸、分枝核酸、质粒、载体等。当核酸为RNA形式时，其可以具有或不具有5’帽子。

本发明人在本文中公开了包含一种或多种编码抗原的核酸序列的核酸。本文所公开的核酸可具有各种形式(例如单链，双链，载体等)。核酸可以是环状或分枝的，但通常将会是线性的。

本文所用的核酸优选地以纯或基本上纯的形式提供，即基本上不含其它核酸(例如，不含天然核酸)，特别是不含宿主细胞核酸，典型地纯度为至少约50％(基于重量)，通常纯度为至少约90％。

核酸可以通过许多方式制备例如通过全部或部分化学合成，通过使用核酸酶(例如限制性酶)消化较长的核酸，通过接合较短的核酸或核苷酸(例如，使用连接酶或聚合酶)，以及由基因组或cDNA文库制备。

本文的核酸包含编码至少一种抗原的序列。通常，本发明的核酸将为重组形式，即，在自然界中不存在的形式。例如，除了编码抗原的序列之外，核酸还可以包含一个或多个异源核酸序列(例如，编码另一种抗原的序列和/或控制序列，例如启动子或内部核糖体进入位点)。核酸可以是载体的一部分，即，设计用于转导/转染一种或多种细胞类型的核酸构建体的一部分。载体可以是例如设计用于在宿主细胞中表达核苷酸序列的表达载体，或者设计用于导致产生重组病毒或病毒样颗粒的病毒载体。

可替代地，或者另外地，与编码抗原的天然序列相比，核酸的序列或化学结构可以进行修饰。核酸分子的序列可以进行修饰以便例如增加核酸的表达或复制效率，或者提供额外的稳定性和耐降解性。可替代地或额外地，本发明的疫苗构建体在体外实验中抵抗RNA酶消化。

如上所述的编码的多肽的核酸可以进行修饰以增加翻译效率和/或半衰期。例如，核酸可以是密码子优化的或密码子对优化的。可以将多聚A尾(poly A tail)(例如，约30个、约40个或约50个腺苷酸残基或更多)附接到RNA的3'端以增加其半衰期。RNA的5'端可以用结构为m7G(5’)ppp(5’)N(cap 0结构)的修饰的核糖核苷酸或其衍生物加帽(capped)，该结构可以在RNA合成过程中加入，或者可以在RNA转录之后进行酶法工程改造(例如，通过使用由mRNA三磷酸酶、鸟苷酰-转移酶和鸟嘌呤-7-甲基转移酶组成的痘苗病毒加帽酶(VCE)进行，该酶催化N7-单甲基化cap 0结构的构建)。cap 0结构在保持RNA分子的稳定性和翻译效率方面起重要作用。RNA分子的5’帽子可以用2'-O-甲基转移酶进一步修饰，导致产生cap1结构(m7Gppp[m2'-Ο]N)，这可以进一步增加翻译效率。

核酸可以包含一种或多种核苷酸类似物或修饰的核苷酸。如本文所用，“核苷酸类似物”或“修饰的核苷酸”是指在核苷的含氮碱基(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))之中或之上包含一个或多个化学修饰(例如，替代)的核苷酸。核苷酸类似物还可以在核苷的糖部分(例如，核糖、脱氧核糖、修饰的核糖、修饰的脱氧核糖、六元糖类似物或开链糖类似物)之中或之上，或者在磷酸盐部分之中或之上包含化学修饰。许多修饰的核苷和修饰的核苷酸是商业可得的。

本发明的核酸可以例如是基于RNA的疫苗。基于RNA的疫苗可以包含自扩增RNA分子。自扩增RNA分子可以是来源于甲病毒的RNA复制子。本发明的核酸可以是基于腺病毒的疫苗。基于腺病毒的疫苗可以是猿猴腺病毒。

腺病毒是具有约36kb线性双链DNA基因组的无包膜二十面体病毒。腺病毒可以转导若干哺乳动物物种的许多细胞类型(包括分裂细胞和非分裂细胞)，而不是整合到宿主细胞的基因组中。由于其已证实的安全性、在多种靶组织中实现高效基因转移的能力和较大的转基因容量，它们已经被广泛地用于基因转移应用中。人腺病毒载体目前被用于基因疗法和疫苗中，但其缺点在于，在先前接触过常见的人腺病毒之后，在世界范围内普遍存在预存免疫。某些猿猴腺病毒载体相对于其他载体可以显示以下改进特性中的一种或多种：生产能力更高，免疫原性有所改进，和转基因表达增加。

腺病毒具有二十面体衣壳的特征形态，该二十面体衣壳包含三种主要蛋白质：六邻体(II)，五邻体基底(III)和带圆头纤维(knobbed fiber)(IV)，以及多种其他小蛋白VI、VIII、IX、IlIa和IVa2。六邻体构成衣壳的大部分结构组件，该衣壳由240个三聚六邻体衣壳粒和12个五邻体基底组成。六邻体具有三个保守的双筒(double barrels)，并且顶部具有三个塔(towers)，每个塔含有来自形成衣壳的大部分的每个亚单位的环。六邻体的基底在腺病毒血清型之间是高度保守的，而表面环是可变的。五邻体是另一种腺病毒衣壳蛋白质；其形成五聚体基底，纤维附接于其上。三聚体纤维蛋白质在衣壳的12个顶点中每一个处从五邻体基底上突起，并且是带圆头杆状的结构。纤维蛋白质的主要作用是经由圆头区域与细胞受体的相互作用将病毒衣壳拴系到细胞表面。纤维的挠性轴以及圆头区域的变化是不同腺病毒血清型的特征。腺病毒纤维蛋白质在腺病毒载体的受体结合和免疫原性中起重要作用。

腺病毒基因组已经被良好地表征。线性的双链DNA与高碱性蛋白质VII和小肽pX(也称为mu)相关。另一种蛋白质V由这种DNA-蛋白质复合体包装，并且经由蛋白质VI提供了与衣壳的结构连接。在腺病毒基因组的整体组织中，对于相似定位的特异性开放阅读框，例如每个病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3、E4、L1、L2、L3、L4和L5基因。腺病毒基因组的每一端都包含被称为反向末端重复序列(ITR)的序列，这是病毒复制所必需的。腺病毒基因组的5'端含有包装和复制所必需的5'顺式元件；即，5'ITR序列(其可以作为复制的起源)和天然的5'包装加强子结构域，该结构域包含包装线性腺病毒基因组和E1启动子加强子元件所必需的序列。腺病毒基因组的3'端包含3'顺式元件(包括ITRs)，这是包装和衣壳化所必需的。病毒还包含病毒编码的蛋白酶，该蛋白酶是处理产生传染性病毒体所需的一些结构蛋白所必需的。

腺病毒基因组的结构是根据在宿主细胞转导后病毒基因的表达顺序来描述的。更具体地说，根据转录发生在DNA复制开始之前还是之后，病毒基因被称为早期(E)或晚期(L)基因。在转导的早期阶段，腺病毒的E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4基因被表达以便为病毒复制做准备。E1基因被认为是主开关，其充当转录激活，并且参与早期和晚期基因转录。E2参与DNA复制；E3参与免疫调节；并且E4调节病毒mRNA代谢。在感染晚期，晚期基因L1-L5被激活，这些基因编码病毒颗粒的结构组件。晚期基因通过选择性剪接从主要晚期启动子(MLP)转录。

从历史上看，腺病毒疫苗的开发主要集中于有缺陷的非复制载体。由于E1区基因的缺失使得它们的复制是有缺陷的，而E1区基因是复制所必需的。通常，非必要的E3区基因也会缺失，以便为外源转基因腾出空间。然后插入包含在外源启动子控制下的转基因的表达盒。这些复制缺陷病毒可以在E1互补细胞中产生。可复制腺病毒载体也可以是用于递送疫苗抗原的媒介物。在针对传染病和肿瘤适应症的临床实验中，人可复制腺病毒已经被安全地应用于成人。

术语“复制缺陷的”或“不可复制的”腺病毒是指由于其已被工程改造为至少包含功能性缺失(或“功能丧失”突变)而不能复制的腺病毒，该功能性丧失即损伤基因功能而不完全去除基因的缺失或突变例如引入人工终止密码子、缺失或突变活性位点或相互作用结构域、缺失或突变基因调控序列等，或完全去除编码对病毒复制至关重要的基因产物的基因，例如选自以下的一个或多个腺病毒基因：E1A、E1B、E2A、E2B、E3和E4(例如E3 ORF1、E3ORF2、E3 ORF3、E3 ORF4、E3 ORF5、E3 ORF6、E3 ORF7、E3 ORF8、E3 ORF9、E4 ORF7、E4 ORF6、E4 ORF4、E4 ORF3、E4 ORF2和/或E4 ORF1)。合适地，缺失E1并且任选地缺失E3和/或E4。如果缺失，当确定相对于另一序列的同一性百分比时，上述缺失的基因区域在比对中将合适地不纳入考虑。

术语“可复制的”腺病毒是指在不存在任何被包含在细胞中的重组辅助蛋白的情况下能够在宿主细胞中复制的腺病毒。合适地，可复制的腺病毒包含完整的结构基因和以下完整的或功能上必需的早期基因：E1A，E1B，E2A，E2B和E4。从特定动物分离的野生型腺病毒将在该动物中可复制。

复制缺陷载体的基因表达盒插入位点的选择主要集中于替换被认为参与病毒复制的区域。可复制载体的基因表达盒插入位点的选择必须保留复制机制。病毒通过产生由多个启动子和选择性剪接控制的高度复杂的转录单位来最大化其编码能力。因此，可复制的病毒载体必须保留复制所需的序列，同时为功能性表达盒留出空间。

在本发明的实施方式中，存在复制所必需的E1区域或其片段，并且将目标外源序列插入到完全或部分缺失的E3区域中。在一个实施方式中，载体包含左ITR区域，接着是E1区域，然后是E3区域(其被表达盒所替代，该表达盒包含启动子、目标抗原和任选地其他加强子元件)；在这些之后是纤维区、E4区和右ITR区；翻译以向右的方向进行。

术语腺病毒“载体”是指至少一种腺病毒多核苷酸或指至少一种多核苷酸和能够将多核苷酸引入细胞中的至少一种多肽的混合物。“低血清阳性率”可能意味着与人腺病毒5型(Ad5)相比，具有较低的预先存在的中和抗体水平。类似地或可替代地，"低血清阳性率"可以表示低于约40％的血清阳性率，低于约30％的血清阳性率，低于约20％的血清阳性率，低于约15％的血清阳性率，低于约10％的血清阳性率，低于约5％的血清阳性率，低于约4％的血清阳性率，低于约3％的血清阳性率，低于约2％的血清阳性率，低于约1％的血清阳性率，或无可检出的血清阳性率。可以使用如以下所述的方法测量作为具有临床相关中和滴度(定义为50％中和滴度>200)的个体的百分比的血清阳性率：Aste-Amezaga等，(2004)Hum.Gene Ther.15:293。

在一个实施方式中，本发明的腺病毒载体衍生自非人猿猴腺病毒，也称为“猿猴腺病毒”已经从黑猩猩、倭黑猩猩、恒河猴、猩猩和大猩猩等非人的猿猴类动物身上分离出许多腺病毒。来源于这些腺病毒的载体能够诱导对这些载体编码的转基因的强烈免疫反应。基于非人猿猴腺病毒的载体的某些优点包括在人类目标群体中相对缺乏针对这些腺病毒的交叉中和抗体，因此它们的使用克服了对人腺病毒的预存免疫。例如，与在某些候选人腺病毒载体情况下的35％相比，一些猿猴腺病毒与预存的人类中和抗体没有交叉反应，某些黑猩猩腺病毒与预存的人类中和抗体的交叉反应只存在于2％的目标人群中(Colloca等，(2012)Sci.Transl.Med.4:1)。

本发明的腺病毒载体可以来源于非人腺病毒，例如猿猴腺病毒例如来自黑猩猩(Pan troglodytes)、倭黑猩猩(Pan paniscus)、大猩猩(Gorilla gorilla)、恒河猴(Macaca mulatta)和猩猩(Pongo abelii和Pongo pygnaeus)。它们包括来自B组、C组、D组、E组和G组的腺病毒。黑猩猩腺病毒包括，但不限于AdY25、ChAd3、ChAd15、ChAd19、ChAd25.2、ChAd26、ChAd27、ChAd29、ChAd30、ChAd31、ChAd32、ChAd33、ChAd34、ChAd35、ChAd37、ChAd38、ChAd39、ChAd40、ChAd63、ChAd83、ChAd155、SadV41和ChAd157。可替代地、腺病毒载体可以来源于从倭黑猩猩分离的非人猿猴腺病毒、例如PanAd1、PanAd2、PanAd3、Pan 5、Pan 6、Pan 7(也称为C7)和Pan 9。载体可以全部地或部分地包含编码非人腺病毒的纤维、五邻体和六邻体的核苷酸。

在本发明的腺病毒载体的一个实施方式中，腺病毒在人类受试者中具有如下的血清阳性率：低于约40％的血清阳性率，优选地低于约30％的血清阳性率，低于约20％的血清阳性率，低于约15％的血清阳性率，低于约10％的血清阳性率，低于约5％的血清阳性率，低于约4％的血清阳性率，低于约3％的血清阳性率，低于约2％的血清阳性率，低于约1％，更优选地无血清阳性率，并且最优选在先前未接触过猿猴腺病毒的人类受试者中没有血清阳性率。

在本发明的腺病毒载体的实施方式中，腺病毒DNA能够进入哺乳动物靶细胞，即，其是传染性的。本发明的传染性重组腺病毒能够用作用于基因疗法的预防性或治疗性疫苗。因此，在一个实施方式中，重组腺病毒包含用于递送至靶细胞中的外源性分子。靶细胞为哺乳动物类。靶细胞可来源于原兽亚纲、后兽亚纲和真兽亚纲的哺乳动物，包括但不限于偶蹄目、食肉目、兔形目、灵长目和啮齿目的那些哺乳动物。举例来说，细胞可为牛细胞、犬细胞、山羊细胞、鹿细胞、黑猩猩细胞、翼手目细胞、马细胞、猫细胞、人细胞、狼细胞、绵羊细胞、猪细胞、鼠细胞、熊细胞或狐细胞。在优选实施方式中，细胞是人细胞。用于递送至靶细胞中的外源性分子可以是表达盒。

在本发明的实施方式中，载体是腺病毒载体的功能性或免疫原性衍生物。“腺病毒载体的衍生物”表示载体的形式形式例如载体的一个或多个核苷酸缺失、插入、修饰或替代。

术语“RNA疫苗”涵盖了包含核酸RNA的所有疫苗，并且编码一种或多种核苷酸序列，该核苷酸序列编码能够诱导哺乳动物的免疫反应的抗原。

“自扩增RNA”、“自复制RNA”和“RNA复制子”可互换地表示具有复制其自身的能力的RNA。术语“自扩增RNA载体”是指能够将多核苷酸引入细胞中的自扩增RNA。本发明的自扩增RNA载体包括编码一种或多种抗原的mRNA。这些mRNA能够替换编码产生传染性病毒所需的结构蛋白的核酸序列。RNA可以通过酶法转录在体外产生，从而避免与疫苗的细胞培养生生产相关的制造问题。在用本发明的自扩增RNA分子免疫之后，RNA分子的复制和扩增在转染细胞的胞质中发生，并且核酸不会被整合到基因组中。由于RNA没有整合到基因组中和转化靶细胞，自扩增RNA疫苗不会造成一些重组DNA疫苗所面临的安全性障碍。

自扩增RNA分子在本领域中是已知的，并且可以通过使用来源于例如甲病毒的复制元件和用编码目标蛋白质的核苷酸序列替代结构病毒蛋白质来制备。自扩增RNA分子通常是正链分子，其可以在递送到细胞之后被直接地翻译。这种翻译提供了RNA依赖性的RNA聚合酶，其随后从递送的RNA产生反义和有义的转录物。因此，递送的RNA导致产生多个子RNA。这些子RNA以及共线亚基因组转录物可被自身翻译以提供编码抗原的原位表达，或可以被转录以提供与所递送RNA具有相同意义的进一步转录物，其随后被翻译以提供抗原的原位表达。这种转录顺序的总体结果是引入的复制子RNA数量的巨大扩增；编码抗原成为细胞的主要多肽产物。

以这种方式实现自复制的一个合适系统是使用基于甲病毒的复制子。这些复制子是正链RNA，在其递送到细胞后，这导致复制酶(或复制酶转录酶)的翻译。复制酶被翻译成多聚蛋白，该多聚蛋白能自切割以提供复制复合物，这产生正链递送RNA的基因组链拷贝。这些负链转录物本身可以被转录以产生正链亲本RNA的进一步拷贝，并且也可以产生编码抗原的亚基因组转录物。亚基因组转录物的翻译导致抗原通过感染细胞原位表达。合适的甲病毒复制子可以使用来来自以下的甲病毒复制子：辛德毕斯病毒(Sindbis virus)，赛姆利基森林病毒(Semliki forest virus)，东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitisvirus)，委委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)等。可以使用突变或野生型病毒序列例如VEEV的减毒TC83突变体已被用于复制子中。

如本文所用，术语"甲病毒”具有其在本领域中的常规含义，并且包括各种品种，例如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(VEE)(例如特立尼达驴(Trinidad donkey)，TC83CR等)，赛姆利基病毒(Semliki Forest virus)(SFV)，辛德毕斯病毒(Sindbis virus)，罗斯里弗病毒(Ross River virus)，西方马脑炎病毒(Westernequine encephalitis virus)，东方马脑炎病毒(Eastern equine encephalitis virus)，基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)，S.A.AR86病毒，沼泽地病毒(Everglades virus)，Mucambo病毒，巴马森林病毒(Barmah Forest virus)，米德尔堡病毒(Middelburg virus)，Pixuna病毒，O'nyong-nyong病毒，Getah病毒，Sagiyama病毒，Bebaru病毒，Mayaro病毒，Una病毒，奥拉病毒(Aura virus)，Whataroa病毒，Banbanki病毒，Kyzylagach病毒，高地J病毒(Highlands J virus)，摩根堡病毒(Fort Morgan virus)，恩杜姆病毒(Ndumu virus)，和Buggy Creek病毒。术语甲病毒还可以包括包含来自多于一种甲病毒的基因组序列的嵌合甲病毒。

“甲病毒复制子颗粒"或"复制子颗粒"，即VRP，是用甲病毒结构蛋白包装的甲病毒复制子。在一个实施方式中，复制子颗粒不同于VRP。

“甲病毒复制子”(或“复制子”)是能够在体内引导自身在靶细胞中的扩增的RNA分子。复制子编码催化RNA扩增的聚合酶，并且包含复制所需的顺式RNA序列，其可通过编码的聚合酶来识别和利用。甲病毒复制子通常包含以下顺序的元件：复制所需的顺式5'病毒序列、编码生物活性甲病毒非结构蛋白(nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列、复制所需的顺式3'病毒序列和聚腺苷酸束。甲病毒复制子还可以包含指导异源和谷氨酸序列表达的一个或多个病毒亚基因组接合区启动子，其可以被修饰以增加或减少亚基因组片段的病毒转录和要被表达的异源序列。

自扩增RNA包含mRNA的基本元件，即，帽子，5’UTR，3’UTR和多聚(A)尾。它们额外地包含大型开放阅读框(ORF)，其编码非结构病毒基因和一个或多个亚基因组启动子。包含聚合酶的非结构基因形成细胞内RNA复制因子，并且以高水平转录亚基因组RNA。这种编码疫苗抗原的mRNA在细胞中被扩增，导致高水平的mRNA和抗原表达。

可替代地或额外地，本文所述的自扩增RNA分子编码(i)RNA依赖性RNA聚合酶，其可以转录来自自扩增RNA分子的RNA，和(ii)抗原。聚合酶可以是甲病毒复制酶例如包含非结构甲病毒蛋白质nsPl，nsP2，nsP3和nsP4中的一个或多个。

而除了编码非结构复制酶多聚蛋白之外，天然的甲病毒基因组还编码结构病毒体蛋白，可替代地或另外地，自扩增RNA分子不编码甲病毒结构蛋白。因此，自扩增RNA可以导致在细胞中产生其自身的基因组RNA拷贝，但是不会导致产生含有RNA的病毒体。不能产生这些病毒体表示，与野生型甲病毒不同，自扩增RNA分子不能使其自身以感染形式永存。在野生型病毒中永存所必需的甲病毒结构蛋白不存在于本发明的自扩增RNA中，并且它们的位置由编码目标免疫原的基因替代，使得亚基因组转录物而不是结构甲病毒体蛋白。

可以用于本发明的自扩增RNA分子可以具有至少两个开放阅读框。第一个开放阅读框编码复制酶；第二个开放阅读框编码抗原。可替代地或额外地，RNA可以具有一个或多个额外的(例如下游)开放阅读框，例如用于编码进一步的抗原或用于编码附属多肽。

可替代地或额外地，本文公开的自扩增RNA分子具有5'帽子(例如7-甲基鸟苷)。这种帽子可以加强RNA的体内翻译。可替代地或额外地，自扩增RNA分子的5'序列必须被选择为确保与编码的复制酶的相容性。

自扩增RNA分子可以具有3’多聚A尾。其还可以在靠近其3’端处包含A聚合酶识别序列(例如，AAUAAA)。

自扩增RNA分子可以具有各种长度，但它们通常为5000-25000个核苷酸)。自扩增RNA分子通常是单链的。单链RNA通常可以通过结合到TLR7，TLR8，RNA解旋酶和/或dsRNA-依赖型蛋白质激酶(PKR)而引发佐剂效应。以双链形式递送的RNA(dsRNA)可以与TLR3结合，这种受体也可以由单链RNA复制过程中或单链RNA二级结构内形成的dsRNA触发。

自扩增RNA可以通过体外转录(IVT)而方便地制备。IVT可以使用cDNA模板，该cDNA模板是在细菌中以质粒形式创建和繁殖的，或者合成地创建的例如通过基因合成和/或聚合酶链反应(PCR)工程改造方法。例如，DNA依赖性RNA聚合酶，例如噬菌体T7，T3或SP6 RNA聚合酶，可以用于转录来自DNA模板的自扩增RNA。合适的加帽和多聚A加成反应可以根据需要使用(尽管复制子的多聚A通常在DNA模板内编码)。这些RNA聚合酶可以具有对转录的5'核苷酸的严格要求，并且在一些实施方式中，这些要求必须与编码的复制酶匹配，以确保IVT-转录的RNA能够有效地作为其自身编码的复制酶的底物来发挥作用。

替代任何5‘帽子结构或者除了任何5’帽子结构之外，自扩增RNA还可以包含一个或多个具有修饰的核碱基的核苷酸。用于本发明的RNA优选地在核苷之间仅包含磷酸二酯键，但是在一些实施方式中，其可以包含氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或甲基膦酸酯键。

自扩增RNA分子可以编码单个异源多肽抗原或者任选地两个或更多个异源多肽抗原，该两个或更多个异源多肽抗原在表达为氨基酸序列时以每个序列均保持其同一性的方式连接在一起(例如，串联连接)。从自扩增RNA产生的异源多肽随后可以作为融合多肽生产或者以得到单独多肽或肽序列的方式进行工程改造。

本文所述的自扩增RNA分子可以进行工程改造以表达来自两个或更多个开放阅读框的多个核苷酸序列，从而允许蛋白质(例如一个、两个或多个抗原)的共表达。

本文通过快速、通用和无细胞工艺来生产合成的SAM疫苗，具有在短时间内生产数百万剂疫苗的潜力。其与腺病毒疫苗一起提供以产生强力的体液和细胞免疫。

本发明的RNA疫苗可以包含基于脂质的递送系统。这些系统可以有效地将RNA分子递送到细胞内部，然后在那里复制和表达编码的抗原。

递送系统可以具有加强编码抗原的免疫原性的佐剂效应。例如，核酸分子可以被包裹在脂质体或无毒生物可降解聚合物微粒中。“脂质体”是包裹水溶液内部的单层或多层脂质结构。

在一个实施方式中，基于核酸的疫苗包含脂质纳米颗粒(LNP)递送系统。可替代地或另外地，核分子可以作为阳离子纳米乳液(CNE)递送。可替代地或另外地，基于核酸的疫苗可以包含裸核酸，例如裸RNA(例如，mRNA)，但优选基于脂质的递送系统。

“脂质纳米颗粒(LNPs)”是非病毒体脂质体颗粒，其中可以包裹核酸分子(例如RNA)。LNP递送系统和无毒生物可降解聚合物微粒及其制备方法是本领域已知的。颗粒可以包括一些外部RNA(例如，在颗粒表面上)，但是RNA的至少一半(优选全部)是被包裹的。脂质体颗粒可以例如由饱和或不饱和的两性离子、阳离子和阴离子脂质的混合物形成，例如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)(两性离子的，饱和的)，1,2-二亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DlinDMA)(阳离子的，不饱和的)，和/或1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋(rac)-甘油(DMG)(阴离子的，饱和的)。脂质体将通常包含辅助脂质。有用的辅助脂质包括两性离子脂质，例如DPPC，DOPC，DSPC，十二烷基磷酸胆碱，1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)，和1,2-二植酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺(DPyPE)；固醇类，例如多个层；和聚乙二醇化脂质，例如PEG-DMPE(PEG-轭合的1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)])或PEG-DMG(PEG-轭合的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇)。在一些实施方式中，有用的聚乙二醇化脂质可以是PEG2K-DMPE(PEG-轭合的1,2-二肉豆蔻酰基-Sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000])或PEG2K-DMG(PEG-轭合的1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇-2000)。用于本发明的优选的LNPs包括两性离子脂质，其可以任选地与至少一种阳离子脂质(例如，N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵甲基硫盐(DOTAP)，二(2-甲基丙烯酰基)氧基乙基二硫化物(DSDMA)，2,3-二油酰氧基-1-(二甲基氨基)丙烷(DODMA)，1,2-二亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)，N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)等)组合形成脂质体。DSPC、DlinDMA、PEG-DMG和胆固醇的混合物是特别是有效的。可替代地或额外地，LNPs是包含RV01的脂质体。

RV01

可替代地或额外地，LNP包括中性脂质、阳离子脂质、胆固醇和聚乙二醇(PEG)，并且形成包裹自扩增RNA的纳米颗粒。在一些实施方式中，本文的阳离子脂质包含式I的结构：

其中n＝1至3的整数，并且

(i)R

(ii)R

(iii)R

其中o是0或1；

其中X是：

(i)

(ii)-CH(-R

(1)R

(2)R

(3)p和p’独立地是0、1、2、3或4；和

(4)R

(A)在ω6和9位置中的一个或两个处具有一个或两个顺式烯烃基团的-C

(B)-C

(C)-C

(D)-C(-C

(E)-C[-C-O-C(O)-C

(F)-C

在一个实施方式中，R

在一个实施方式中，X是

在一个实施方式中，X是-CH(-R

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在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV28，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV31，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV33，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV37，其具有以下结构：

在一个实施方式中，LNP包括阳离子脂质RV39，即，2，5-二((9Z，12Z)-十八碳-9，12-二烯-1-基氧基)苄醇4-(二甲基氨基)丁酸酯):

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV42，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV44，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV73，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV75，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV81，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV84，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV85，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV86，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV88，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV91，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV92，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV93，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是2-(5-((4-((1，4-二甲基哌啶-4-羰基)氧基)十六烷基)氧基)-5-氧代戊基)丙烷-1，3-二醇二辛酸酯(RV94)，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV95，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV96，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV97，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV99，其具有以下结构：

在一个实施方式中，示例性的阳离子脂质是RV101，其具有以下结构：

在一个实施方式中，阳离子脂质选自下组：RV39、RV88和RV94。

用于合成具有式I的化合物的组合物和方法以及RV28、RV31、RV33、RV37、RV39、RV42、RV44、RV73、RV75、RV81、RV84、RV85、RV86、RV88、RV91、RV92、RV93、RV94、RV95、RV96、RV97、RV99和RV101可在以下中找到：WO/2015/095340，WO/2015/095346)和WO/2016/037053)。

RNA与脂质之比可变。核苷酸(N)与磷脂(P)之比可在例如以下范围内：1N:1P，2N:1P，3N:1P，4N:1P，5N:1P，6N:1P，7N:1P，8N:1P，9N:1P，或者10N:1P。核苷酸(N)与磷脂(P)之比可在例如以下范围内：1N:1P至10N:1P，2N:1P至8N:1P，2N:1P至6N:1P或3N:1P至5N:1P。可替代地或额外地，核苷酸(N)与磷脂(P)之比为4N:1P。

可替代地或额外地，基于核酸的疫苗包含阳离子纳米乳液(CNE)递送系统。阳离子水包油乳液可以用于将带负电荷的分子，例如RNA分子，递送到细胞内部。乳液颗粒包含疏水性油芯和阳离子脂质，后者可以与RNA相互作用，从而将其固定到乳液颗粒。在CNE递送系统中，编码抗原的核酸分子(例如，RNA)与阳离子水包油乳液的颗粒复合。

因此，在本发明的基于核酸的疫苗中，编码抗原的RNA分子可以与阳离子水包油乳液的颗粒复合。颗粒通常包含油芯(例如植物油或角鲨烯)(其在25℃时处于液相)、阳离子脂质(例如磷脂)和任选地表面活性剂(例如脱水山梨糖醇三油酸酯，聚山梨酯80)；还可以包含聚乙二醇。可替代地或额外地，CNE包含角鲨烯和阳离子脂质，例如1,2-二油酰氧基-3-(三甲基铵基)丙烷(DOTAP)。在一个实施方式中，CNE是用聚山梨酯稳定的DOTAP和角鲨烯的水包油乳液。

可替代地或额外地，自扩增RNA的制备方法包括体外转录(IVT)步骤。在一些实施方式中，自扩增RNA的制备方法包括产生RNA随后进行加帽5’二核苷酸m7G(5’)ppp(5’)G反应的IVT步骤，并且还包含将RNA与非病毒递送系统结合的步骤。可替代地或额外地，自扩增RNA的制备方法包括产生RNA的IVT，并且还包含将RNA与基于脂质的递送系统结合的步骤。

本发明的LNP和CNE递送系统可以特别有效地诱导对由自扩增载体表达的抗原的体液和细胞免疫反应。这些递送系统的优点还包括不存在限制性抗载体免疫反应。

本发明提供了可用作免疫原性组合物的组分的构建体，其用于诱导受试者针对由传染性病原生物引起的疾病的免疫反应。这些构建体可用于抗原的表达、其在治疗中的使用方法以及其制备过程。“构建体”是一种基因工程改造的分子。“核酸构建体”是指基因工程改造的核酸，并且可以包含RNA或DNA，包括非天然的核酸。在一些实施方式中，本文公开的构建体编码病原生物(例如，病毒、细菌、真菌、原生动物或寄生虫)的野生型多肽序列、其变体或片段。

“载体”是指相对于野生型序列已发生实质性改变的核酸，和/或插入了异源序列(即，从不同来源获得的核酸)并且在引入细胞(即“宿主细胞”)时，复制和/或表达插入的多核苷酸序列的核酸。在复制缺陷型腺病毒的情况下，宿主细胞可以能是E1互补的。

如本文所用，术语“抗原”是指包含一个或多个表位(例如，线性、构象或两者)的分子，其将刺激宿主的免疫系统以产生体液(即，B细胞介导的抗体产生)和/或细胞抗原特异性免疫反应(即，T细胞介导的免疫)。

“表位”是决定其免疫特异性的抗原部分。

T-和B-细胞表位可以通过经验鉴定(例如，使用PEPSCAN或类似方法)。它们也可以通过已知方法来预测(例如，使用Jameson-Wolf抗原指数，基于矩阵的方法，TEPITOPE，神经网络，OptiMer&EpiMer，ADEPT，Tsites，亲水性或抗原指数。

多肽序列的“变体”包括与参考序列相比具有一个或多个氨基酸添加、替代和/或缺失的氨基酸徐磊。变体可以包含与全长野生型多肽至少至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或者至少99％相同的氨基酸序列。可替代地，或者另外地，多肽的片段可以包含全长多肽的免疫原片段(即包含表位的片段)，其可以包含与全长多肽的连续氨基酸序列相同的至少8个，至少9个，至少10个，至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，至少16个，至少17个，至少18个，至少20个，或者更多个氨基酸的连续氨基酸序列或由这样的连续氨基酸序列组成。

可替代地或额外地，可以通过包含抗原medoid序列来增加疫苗构建体的交叉保护宽度。“Medoid”是指与其他序列具有最小相异性的序列。可替代地或额外地，本发明的载体包含蛋白质或其免疫原片段的medoid序列。可替代地或额外地，本发明的自扩增RNA构建体包含蛋白质的medoid序列。可替代地或额外地，medoid序列来源于NCBI数据库中注释的所有相关蛋白质序列中具有最高平均氨基酸同一性百分比的天然病毒株。

由于遗传密码子的冗余性，多肽可以由多种不同的核酸序列编码。编码偏向于使用一些同义密码子，即，编码相同氨基酸的密码子多于其他密码子。“密码子优化”是指在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行修饰。密码子优化已经用于通过使用生物体特异性的密码子使用频率来改进不同的生物体中的mRNA表达。

除了密码子偏好之外，并且与密码子偏好无关地，有一些同义密码子对的使用也比其他更频繁。这种密码子对偏好表示一些密码子对的出现频率过高(overrepresented)，其他的则出现频率不足(underrepresented)。“密码子对优化”是指在不改变氨基酸序列的情况下在密码子对中进行修饰。

密码子对去优化已经用于降低病毒毒力。例如，有报道称，与野生型脊髓灰质炎病毒相比，被修饰为包含出现频率不足的密码子对的脊髓灰质炎病毒显示翻译效率降低并且被减毒(WO 2008/121992；Coleman等，(2008)Science 320:1784)。Coleman等，证实了通过密码子对去优化来对减毒病毒进行工程改造可以产生与野生型编码相同的氨基酸序列但是使用不同的统一密码子配对排列的病毒。通过密码子对去优化减毒的病毒比野生型产生的斑块少至多1000倍，产生更少的病毒颗粒，并且需要约100倍那么多的病毒颗粒来形成斑块。

相比之下，被修饰成包含在人类基因组中出现频率过高的密码子对的脊髓灰质炎病毒的行为方式类似于野生型RNA，并产生与野生型RNA幅度相同的斑块(Coleman等，(2008)Science 320:1784)。尽管存在以下事实，即具有出现频率过高的密码子对的病毒与具有出现频率不足的密码子对的病毒包含相似数量的突变，并且与野生型相比表现出更强的翻译，还是会发生这样的情况。

可替代地或额外地，本发明的构建体包含密码子优化的核酸序列。可替代地或额外地，本发明的腺病毒或自扩增RNA构建体包含蛋白质或其免疫原性衍生物或片段的密码子优化序列。

可替代地或额外地，本发明的构建体包含密码子对优化的核酸序列。可替代地或额外地，本发明的自扩增RNA构建体包含蛋白质或其免疫原性衍生物或片段的密码子对优化序列或由这样的密码子优化序列组成。

“多肽”是指定义序列并且通过酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。该术语与“肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且不限于最小长度的多肽。如本领域中已知的，术语多肽还涵盖通过化学或酶催化的反应引入的翻译后修饰。该术语可以指多肽的片段或多肽的变体，例如添加、缺失或替代。

可替代地或额外地，本文的多肽可为非-天然形式的(例如重组或修饰形式)。本发明的多肽可以在C-末端和/或N-末端具有共价修饰。它们还可以具有各种形式(例如，天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、微粒、变性等)。多肽可以是天然或非天然糖基化的(即，多肽可以具有与相应的天然多肽中发现的糖基化模式不同的的糖基化模式)。

本文的非天然形式的多肽可以包含除抗原序列之外的一个或多个异源氨基酸序列(例如，另一抗原序列、另一信号序列、可检测标签等)。例如，本文的多肽可以是融合蛋白。可替代地，或者另外地，与天然多肽序列相比，多肽的氨基酸序列或化学结构可以进行修饰(例如，用一个或多个非天然氨基酸，通过共价修饰，和/或通过具有不同的糖基化模型例如通过去除或添加一个或多个糖基基团)。

与序列的同一性在本文中定义为，在序列比对并且在必要的情况下引入间隙以实现最大百分比序列同一性之后，并且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分，候选序列中与参考氨基酸序列相同的氨基酸残基的百分比。

序列同一性可以通过通常用于比较两个多肽的氨基酸位置的相似性的标准方法来确定。使用例如BLAST或FASTA的计算机程序，比对两个多肽以实现其各自氨基酸的最佳匹配(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个或两个序列的预定部分)。这些程序提供了默认开启罚分(default opening penalty)和默认缺口罚分(default gap penalty)，并且可以将打分矩阵如PAM250或swgapdnamt与该计算机程序一起使用。在一个实施方式中，缺口开启罚分15，缺口延伸罚分为6.66，缺口分离罚分范围是8，并且比对延迟的百分比同一性为40。通过示例的方式，百分比同一性可以被计算相同匹配的总数乘以100，然后除以匹配范围内较长序列的长度和引入到较短序列中的缺口数之和，以比对两个序列。

如果本公开通过引用UniProt或GenBank登录号来引用序列，则所引用的序列是截至本申请的提交日期的当前版本。

本领域技术人员将认识到，蛋白质的改变、添加或缺失单个氨基酸或一小部分氨基酸的个别替代、缺失或添加是“免疫原性衍生物”，其中改变导致氨基酸被功能相似的氨基酸替代，或导致不影响免疫原性功能的残基的替代/缺失/添加。

提供功能相似氨基酸的保守替代表在本领域是众所周知的。一般来说，此类保守替代将落在下面指定的氨基酸组之一内，尽管在某些情况下，可能可以进行其他替代而不会实质性地影响抗原的免疫原性特性。以下八组均包含通常是彼此的保守替代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)

合适地，此类替代不会发生在表位区域，并且不会对抗原的免疫原性特性产生显著影响。

免疫原性衍生物还可以包括其中与参考序列相比插入了其他氨基酸的那些。合适地，这种插入不会发生在表位区域中，并且因此对抗原的免疫原性特性没有显著影响。插入的一个示例包括一小段组氨酸残基(例如2-6个残基)以帮助所考虑的抗原的表达和/或纯化。

免疫原性衍生物包括其中与参考序列相比已经确实了氨基酸的衍生物。合适地，此类缺失不会发生在表位区域，因此不会对抗原的免疫原性特性产生显著影响。本领域技术人员将认识到，特定免疫原性衍生物可以包括替代、缺失和添加(或其任何组合)。

腺病毒或RNA分子可以用于递送所需的RNA或蛋白质序列，例如异源序列，用于体内表达。本发明的包含目标基因的载体可以包括任何遗传元件，包括DNA、RNA、噬菌体、转座子、粘粒、附加体、质粒或病毒成分。本发明的载体可以包含猿猴腺病毒DNA和表达盒。“表达盒”包括转基因和用于在宿主细胞中翻译、转录和/或表达转基因所必需的调控元件。

“转基因”是与该转基因两侧的载体基因异源的和核酸序列，其编码目标多肽。“转基因”和“免疫原”在本文中可互换地使用。核酸编码序列以允许转基因转录、翻译和/或在宿主细胞中表达的方式可操作地连接到调控组分。在本发明的实施方式中，载体以治疗或预防水平表达转基因。转基因多肽的“功能性衍生物”是多肽的修饰形式例如其中一个或多个氨基酸缺失、插入、修饰或替代。

转基因可以用于预防或治疗，例如作为诱导免疫反应的疫苗，以便通过纠正或替换缺陷或缺失的基因来纠正遗传缺陷，或作为癌症治疗剂。如本文所用，“诱导免疫反应”是指蛋白质诱导T细胞和/或对该蛋白质的体液抗体免疫反应的能力。如本文所用，“诱导免疫反应”是指蛋白质诱导对该蛋白质的T细胞和/或体液抗体免疫反应的能力。

转基因序列的组成将取决于最终载体的用途。在一个实施方式中，转基因是编码可用于生物学和医学中的产物的序列，例如预防性转基因、治疗性转基因或免疫原性转基因，例如蛋白质或RNA。蛋白质转基因包括抗原。本发明的抗原性转基因诱导对导致疾病的生物体的免疫反应。RNA转基因包括tRNA、dsRNA、核糖体RNA，催化RNAs和反义RNAs。有用的RNA序列的示例是在被治疗动物中抑制标靶核酸序列的表达的序列。

除转基因之外，表达盒还包括常规控制元件，该常规控制元件以允许其在用腺病毒载体转染的细胞中转录、翻译和/或表达的方式可操作地连接到转基因。如本文所使用的，“可操作地连接的”序列包括与目标基因相邻的表达控制序列和以反式作用或在一定距离处作用以控制目标基因的表达控制序列。

转基因引起的免疫反应可以是抗原特异性B细胞反应，这产生中和抗体。引起的免疫反应可以是抗原特异性T细胞反应，这可以是全身性和/或局部性反应。抗原特异性T细胞反应可以包括CD4+辅助T细胞反应，例如涉及表达细胞因子(例如，IFN-γ(IFN-γ)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)和/或白介素2(IL2))的CD4+T细胞。可替代地，或者另外地，抗原特异性T细胞反应包括CD8+细胞毒性T细胞反应，例如涉及表达细胞因子(例如，IFN-γ、TNF-α和/或IL2)的CD8+T细胞的反应。

“免疫有效量”是足以引起抗体或T细胞反应或二者的活性组分的量，该量足以对受试者具有有益作用例如预防性或治疗性作用。

转基因序列可以包括报告基因序列，该序列在表达时产生可检测的信号。此类报告基因序列包括，但不限于，编码以下的DNA序列：β-内酰胺酶，β-半乳糖苷酶(LacZ)，碱性磷酸酶，胸苷激酶，绿色荧光蛋白(GFP)，氯霉素乙酰转移酶(CAT)，荧光素酶，膜结合蛋白(包括例如，CD2+、CD4+、CD8+)，流感血凝素蛋白，以及本领域公知的存在或可以通过常规方法生产的针对其的高亲和性抗体的其他蛋白，以及包含适当地与来自血凝素或Myc等的抗原标记结构域融合的膜结合蛋白的融合蛋白。这些编码序列在与驱动其表达的调控元件缔合时，提供通过常规方法(包括酶法、射线照相法、比色法、荧光法或其他光谱分析法、荧光激活细胞分选分析法和免疫分析法，包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)和免疫组织化学)可检测的信号。

本发明的构建体可以包含密码子优化的核酸序列作为转基因。可替代地或额外地，本发明的载体可以包含转基因或其免疫原性衍生物或片段的密码子优化的序列。本发明的构建体可以包含密码子对优化的核酸序列作为转基因。可替代地或额外地，本发明的载体可以包含转基因或其免疫原性衍生物或片段的密码子对优化的序列。

如果需要，腺病毒和自扩增RNA分子可以使用本领域技术人员已知的各种体外或体内检测方法进行筛选或分析以确定它们的治疗性和预防性特性。例如，ELISA分析可以测量转基因抗原的特异性免疫球蛋白水平。荧光抗体病毒中和实验(FAVN)可以检测抗原诱导的抗体对病毒的中和活性。可以测试本发明的疫苗对目标特定淋巴细胞类型(例如，B细胞、T细胞、T细胞系或T细胞克隆)的增殖诱导或效应子功能的影响。例如，可以分离被免疫小鼠的脾细胞，并且细胞毒性T淋巴细胞溶解自体靶细胞的能力，该自体靶细胞包含编码抗原的自扩增RNA分子。此外，可以通过ELISA测量TH1(IL-2和IFN-γ)和/或TH2(IL-4和IL-5)的增殖或产生分析辅助T细胞分化，或者直接在CD4+T细胞中通过胞质细胞因子染色和流式细胞术分析辅助T细胞分化。抗原特异性T细胞可以通过本领域已知的方法测量，例如五聚体染色分析。

也可以测试编码抗原的腺病毒和自扩增RNA分子诱导体液免疫反应的能力，例如通过诱导B细胞产生对目标抗原有特异性的抗体所证实的。例如，可以使用来自被免疫个体的外周血B淋巴细胞来进行这些分析。此类分析方法是本领域技术人员已知的。可以用于表征本发明载体的其它分析涉及检测目标细胞对编码抗原的表达。例如，荧光活化细胞分选(FACS)可以用于检测细胞表面或细胞内的抗原表达。FACS选择的另一个优点是可以对不同的表达水平进行排序，因为有时可能需要较低的表达水平。鉴定表达特定抗原的细胞的其他合适方法包括在平板上使用单克隆抗体摇摄或使用涂有单克隆抗体的磁珠捕获。

本发明提供了包含核酸的组合物，该核酸包含编码多肽(例如抗原)的序列。组合物可以是药物组合物例如免疫原性组合物或疫苗组合物。组合物可以包含腺病毒或SAM。因此，组合物还可以包含药学上可接受的载剂。

"药学上可接受的载剂”包括本身不会诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载剂。本发明的组合物还可以包含药学上可接受的稀释剂，例如水，灭菌无热原水，盐水，磷酸盐缓冲生理盐水，甘油等。另外地，可以存在辅助物质，例如湿润或乳化剂，pH缓冲物质等。

药物组合物可以包含在淡水(例如，注射用(w.f.i.))中或在缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，硼酸盐缓冲液，琥珀酸盐缓冲液，组氨酸缓冲液，或者柠檬酸缓冲液)中的如本文其他地方描述的构建体、核酸序列和/或多肽。通常将包含5-20mM范围内的缓冲盐。药物组合物可以具有5.0和9.5之间的缓冲盐。组合物可以包含钠盐(例如氯化钠)以提供张力。通常为10±2mg/ml浓度的NaCl，例如约9mg/ml。组合物可以包含金属离子螯合剂。这些可以通过去除能够加速磷酸二酯水解的离子来延长RNA稳定性，并且有助于腺病毒载体稳定性。因此，组合物可以包含EDTA、EGTA、BAPTA、三胺五乙酸等中的一种或多种。此类螯合剂通常在10-500μΜ(例如0.1mM)之间存在。柠檬酸盐例如柠檬酸钠，也可以用作螯合剂，同时还有利地提供缓冲活性。

药物组合物可以具有200mOsm/kg和400mOsm/kg之间的渗透压，例如240-360mOsm/kg之间，或者290-310mOsm/kg之间。药物组合物可以包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞钠或2-苯氧基乙醇。优选无汞组合物，并且可以优选无防腐剂疫苗。药物组合物可以是无菌的(aseptic)或灭菌的(sterile)。药物组合物可以是无热原的，例如每剂量包含<1EU(内毒素单位)，并且优选每剂量包含<0.1EU。药物组合物可以是无麸质的。药物组合物可以是以单位剂量形式制备的。可替代地或额外地，单位剂量可以具有0.1-2.0ml之间的体积，例如约1.0或0.5ml。

本发明的组合物可以在有或没有佐剂的情况下施用。可替代地或额外地，组合物可以包含一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)或者与一种或多种佐剂(例如疫苗佐剂)联合施用。

“佐剂”是指加强、刺激、激活、加强或调节对组合物活性成分的免疫反应的药剂。可能在细胞或体液水平或两者上发生佐剂作用。佐剂刺激免疫系统对实际抗原的反应，但本身没有免疫作用。可替代地或另外地，本发明的辅助组合物可以包含一种或多种免疫刺激剂。“免疫刺激剂”是指诱导受试者的免疫反应的普遍、暂时增加的药剂，无论其是与抗原一起施用还是单独施用。

本发明提供了用于在需要其的受试者中诱导针对病原生物的免疫反应的方法，该方法包括施用免疫有效量的如本文公开的构建体或组合物的步骤。一些实施方式提供了本文公开的构建体或组合物用于在需要其的受试者中诱导对抗原的免疫反应的的用途。一些实施方式提供了如本文公开的构建体或组合物在制造在受试者中诱导对抗原的免疫反应的药物中的用途。

“受试者”是指哺乳动物，例如人或兽类哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。

“初次免疫(priming)”是指如下的免疫原性组合物的施用，当随后进行后续的相同或不同免疫原性组合物的施用时，与通过施用单次免疫原性组合物获得的免疫反应相比，该免疫原性组合物的施用诱导较高水平的免疫反应。

“加强(boosting)”是指在初次免疫免疫原性组合物的施用之后的后续免疫原性组合物的施用，其中与单次施用免疫原性组合物的免疫反应相比，该后续施用产生较高水平的免疫反应。

“异源初次免疫加强”是指用抗原启动(初次免疫)免疫反应，并且随后用通过不同分子和/或载体递送的抗原加强免疫反应。例如，本发明的异源初次免疫加强方案包括用RNA分子初次免疫并用腺病毒载体加强，以及用腺病毒载体初次免疫并用RNA分子加强。

本文公开的组合物通常将直接施用给受试者。直接递送可以通过肠胃外施用方式实现：例如经口腔，吸入，肌肉内，鼻内，腹膜内，鞘膜内，静脉内，口服，直肠，舌下，透皮，经阴道，或向组织间隙内。

如本文所用，在施用组合物“之后”施用组合物表示在第一组合物的施用于第二组合物的施用之间经过一段时间间隔，无论第一组合物和第二组合物是相同的还是不同的。

施用量以及使用速率和时间进程将取决于素哦治疗的情况的特质和严重性。治疗的处方例如关于剂量的决定等，在全科医生和其他医生以及健康护理提供者的专长范围内。通常考虑要被预防或治疗的状况，施用的方法，以及实施者所知的其他因素。

本发明提供了一种随时施用(ready administration)免疫原性、预防性或治疗性方案的药物试剂盒，该方案用于治疗由病原生物引起的疾病或状况。试剂盒设计用于通过施用初次免疫疫苗随后施用加强疫苗来诱导免疫反应的方法：所述初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的一种或多种抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的一种或多种抗原。

试剂盒包含至少一种含有编码抗原的腺病毒载体的免疫原性组合物和至少一种含有编码抗原的RNA分子的免疫原性组合物。试剂盒可以组分载体中每一种的多个预包装剂量，用于每一种的多次施用。试剂盒的组分可以被包含在药瓶中。

本发明提供了用于随时施用免疫原性、预防性或治疗性方案的药物试剂盒，该方案用于治疗由传染性病原生物引起的疾病或状况。试剂盒设计用于通过施用初次免疫疫苗随后施用加强疫苗来诱导免疫反应的方法：所述初次免疫疫苗包含免疫有效量的由猿猴腺病毒载体或RNA分子编码的一种或多种抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的由猿猴腺病毒载体或RNA分子编码的一种或多种抗原。

试剂盒包含至少一种含有编码抗原的猿猴腺病毒载体的免疫原性组合物和至少一种含有编码抗原的RNA分子的免疫原性组合物。试剂盒可以组分载体中每一种的多个预包装剂量，用于每一种的多次施用。试剂盒的组分可以被包含在药瓶中。

试剂盒还包含用于在本文所述的初次免疫/加强方法中使用免疫原性组合物的使用说明。其还可以包含用于执行与组分的免疫原性相关的分析的使用说明。试剂盒还可以包含赋形剂，稀释剂，佐剂，注射器，施用免疫原性组合物的其他合适工具，或者去污染或其他处置说明。

使用本文提供的技术和序列，结合本领域技术人员已知的技术来生成本发明的载体。此类技术包括cDNA的常规克隆技术，例如文本中描述的那些，使用腺病毒基因组的重叠寡核苷酸序列，聚合酶链反应，以及提供所需核苷酸序列的任何合适方法。

除非另有解释，本文中所用的所有技术和科学术语均具有与本公开所述领域普通技术人员共同理解的相同含义。除非上下文中另有明确说明，否则单数术语“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数个指代物。类似地，除非上下文中另有明确说明，词语"或/或者”旨在包含“和”。术语"多个"是指两个或更多个。另外地，对于物质的浓度或水平(例如溶液组分浓度或其比率)和反应条件(例如温度、压力和循环时间)给出的数值限制旨在为近似的。与数值相关的术语“约”是任选的，并且意味着例如数量±10％。

术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”例如包含X的组合物可以仅含有X或者可以包括其他的一些东西，例如X+Y。术语“基本上”并不排除“完全”。例如，基本上不含Z的构图可以完全不含Z。

在以下实施方式中进一步地例示本发明。

a.疫苗组合包含第一组合物和第二组合物，该第一组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的腺病毒载体，该第二组合物包含免疫有效量的至少一种编码至少一种抗原的RNA分子，其中所述组合物中的一种是初次免疫组合物，另一种是加强组合物。

b.(a)的组合物，其中该疫苗组合有效地用于预防或治疗哺乳动物受试者的传染性状况。

c.(b)的组合物，其中该疫苗组合不用于预防或治疗癌症。

d.(a)或(b)的组合物用于预防或治疗人的传染性状况的用途。

e.(a)或(b)的组合物用于制备用于传染性状况的药物的用途。

f.在哺乳动物中诱导对传染病的免疫反应的方法，包括：

i.施用初次免疫疫苗，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的一种或多种抗原，和

ii.施用加强疫苗，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的一种或多种抗原，

其中如果初次免疫疫苗由腺病毒载体编码，则加强疫苗由RNA分子编码，并且如果初次免疫疫苗由RNA分子编码，则加强疫苗由腺病毒载体编码。

g.(d)-(f)中任一项的方法或用途，其中初次免疫疫苗包含免疫有效量的一种或多种由腺病毒载体编码的抗原，并且加强疫苗包含免疫有效量的一种或多种由RNA分子编码的抗原。

h.(d)-(g)中任一项的方法或用途，其中初次免疫疫苗包含免疫有效量的一种或多种由RNA分子编码的抗原，加强疫苗包含免疫有效量的一种或多种由腺病毒载体编码的抗原。

i.(d)-(h)中任一项的方法或用途，其中一种或多种抗原来自相同的病原生物。

j.(d)-(i)中任一项的方法或用途，其中一种或多种抗原在初次免疫疫苗和加强疫苗中是相同的。

k.(d)-(j)中任一项的方法或用途，其中一种或多种抗原的表位的至少一个在初次免疫和加强疫苗中是不同的。

l.(d)-(k)中任一项的方法或用途，其中腺病毒载体是猿猴腺病毒载体。

m.(l)的方法或用途，其中猿猴腺病毒载体选自以下：黑猩猩，倭黑猩猩，恒河猴，猩猩和大猩猩载体。

n.(m)的方法或用途，其中猿猴腺病毒载体是黑猩猩载体。

o.(n)的方法，其中黑猩猩载体选自以下：AdY25，ChAd3，ChAd15，ChAd19，ChAd25.2，ChAd26，ChAd27，ChAd29，ChAd30，ChAd31，ChAd32，ChAd33，ChAd34，ChAd35，ChAd37，ChAd38，ChAd39，ChAd40，ChAd63，ChAd83，ChAd155，ChAd157，ChAdOx1，ChAdOx2，SadV41，sAd4287，sAd4310A，sAd4312，SAdV31和SAdV-A1337。

p.(d)-(o)中任一项的方法或用途，其中RNA分子是信使RNA(mRNA)分子。

q.(p)的方法或用途，其中mRNA分子是自扩增RNA载体。

r.(d)-(q)中任一项的方法或用途，其中抗原在包含表达盒的腺病毒载体中编码，该表达盒包含转基因和在宿主细胞中翻译、转录和/或表达该转基因所必需的调节元件。

s.(r)的方法或用途，其中抗原是多肽抗原。

t.(d)-(s)中任一项的方法或用途，其中RNA分子作为阳离子纳米乳液(CNE)或脂质纳米颗粒(LNP)递送。

u.(t)的方法或用途，其中LNP包含选自下组的阳离子脂质：

(i)

(ii)

(iii)

(iv)

(v)

(vi)

(vii)

(viii)

(ix)

(x)

(xi)

(xii)

(xiii)

(xiv)

(xv)

(xvi)

(xvii)

(xviii)

(ixx)

(xx)

(xxi)

(xxii)

(xxiii)，和

v.(d)-(u)中任一项的方法或用途，其中免疫反应是抗体反应。

w.(d)-(u)中任一项的方法或用途，其中免疫反应是T细胞反应。

y.(d)-(w)中任一项的方法或用途，其中所述初次免疫和加强免疫原性组合物中的至少一种包含佐剂。

z.用于治疗或预防由传染性病原生物引起的疾病的初次免疫疫苗和随后的加强疫苗，该初次免疫疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的抗原，该加强疫苗包含免疫有效量的由腺病毒载体或RNA分子编码的抗原，其中，如果初次免疫疫苗由腺病毒载体编码，则加强疫苗由RNA分子编码，并且如果初次免疫疫苗由RNA分子编码，则加强疫苗由腺病毒载体编码。

aa.用于初次免疫加强施用方案的根据(a)-(c)或(y)的试剂盒，该试剂盒包含至少两个药瓶，第一个药瓶含有用于初次免疫施用的疫苗，第二个药瓶用于加强施用的疫苗。

现在将通过以下非限制性实施例的方式进一步描述本发明。

实施例

以下所述实施例描述了使用三种模型抗原(狂犬病糖蛋白、HIV1-GAG和HSV GlyVI)表征通过腺病毒和RNA疫苗引起的免疫反应的动力学和幅度的免疫原性初次免疫加强方案。选择这些抗原作为不同类别抗原的示例以证实腺病毒/RNA初次免疫加强组合的普适性。狂犬病G蛋白是包膜糖蛋白的示例，HIV GAG是病毒衣壳蛋白的示例，并且HSV Gly IV是人工融合多抗原的示例。以下实施例证实了猿猴腺病毒和少量自扩增RN可以在异源初次免疫/加强方案中组合一引起对多种编码抗原的体液和细胞免疫反应。

将编码密码子对优化的狂犬病糖蛋白(RG)抗原转基因序列的猿猴腺病毒载体(WO2018/104919)克隆并用于制备黑猩猩腺病毒155(ChAd155)中的腺病毒颗粒。将编码密码子对优化的狂犬病糖蛋白抗原序列的自扩增RNA载体克隆并用于制备体外转录的加帽RNA(SAM-RG)。

分别表征了腺病毒载体(ChAd-RG)和自扩增RNA(SAM-RG)各自的体外效价，并且将它们配制用于小鼠的疫苗注射。腺病毒载体在10mM Tris pH 7.4，10mM组氨酸，75mM NaCl，5％蔗糖，0.02％多山梨酸酯80，0.1mM EDTA，1mM MgCl

实验1：单次施用狂犬病抗原

六周大雌性BALB/c小鼠分成十组，并且根据下表中所示方案进行肌肉内施用。腺病毒以10

在免疫后八周内采集的样品进行狂犬病特异性体液和细胞免疫反应的分析。狂犬病病毒中和抗体(VNA)滴度通过标准的、WHO批准的荧光抗体病毒中和(FAVN)分析来测量。高于0.5Iu/ml的滴度被认为是保护性的。

图1显示了一次剂量的编码RG的腺病毒或RNA之后的抗体免疫反应。两种疫苗均诱导高水平的中和抗体滴度，以IU/ml(图1A)表示。两种疫苗在较高剂量下均引起更强烈的反应，在所有滴度峰值出现在免疫后约四周，随后稍微回缩并稳定。

在结合了对RG抗原有特异性的五聚体之后，用基于流式细胞术的染色分析量化CD8+T细胞反应。五聚体由主要组织相容性复合体I H-2Ld-限制性LPNWGKYVL RG抗原免疫最主要的CD8表位组成，并且与别藻蓝蛋白(APC)荧光染料轭合以允许量化抗原特异性T细胞。将包含RG抗原特异性T细胞的外周全血与APC-五聚体和荧光染料标记的T细胞标记物抗体一起孵育。在洗涤步骤之后，通过流式细胞术来量化阳性细胞。结果表示为RG-抗原特异性(即，对五聚体染色为阳性)的CD8+T细胞的百分比。

图1B证实了腺病毒和SAM狂犬病疫苗二者在所测试的所有剂量和配方下均以剂量依赖性方式引起对RG抗原的强烈的CD8+T细胞反应。

随后通过用IFNγELISpot测量脾细胞中的功能性T细胞反应，使用包含整个RG蛋白质氨基酸序列的重叠15聚肽库进行刺激(图1C)。IFNγELISpot分析允许计数分泌细胞因子的抗原特异性T细胞，使用夹层结构的IFN-γ捕获抗体与膜结合，标记生物素化抗体和链霉亲和素的复合物与碱性磷酸酶偶联，导致沉淀在抗原特异性细胞所在的膜上产生一个点的显色底物。在第8周对脾细胞的评价证实，两种疫苗均引起强烈的功能性T细胞反应，即，在对RG抗原的反应中，T细胞以剂量依赖性方式分泌细胞因子(图1C)。

用狂犬病抗原初次免疫/加强

基于单次施用数据，选择10

将六周龄雌性BALB/c小鼠分成十组并且以下表中所示的方案肌肉内施用腺病毒或RNA分子。动物在初次免疫后第2，4和8周采血；随后在第16周处死，采集脾脏以测定T细胞功能性。如同单次施用那样执行中和抗体血清学和T细胞分析。

图2A显示了对上图中所示的初次免疫加强方案的抗体免疫反应。第2，4和8周的血清学证实，单次肌肉内疫苗接种腺病毒-RG或RNA-RG在所有小鼠中引起的病毒中和抗体滴度均良好地高于保护阈值0.5IU/ml。在加强后的数周(“wpb”)，加强进一步将这些反应扩大约两个对数之多。异源腺病毒初次免疫和RNA加强方案与同源RNA初次免疫加强方案一样有效地提高了产生滴度的幅度。根据加强后滴度的增加，RNA显示为比腺病毒更强力的加强剂。

对从全血中定量的抗原特异性T细胞的分析显示，用腺病毒RG和RNA-RG进行初次免疫/加强疫苗接种引起对RG抗原的强烈的CD8+T细胞反应，并且异源腺病毒/RNA方案是最强力的疫苗接种方案之一。图2B显示了对于初次免疫加强方案中的每一个，加强对CD8+T细胞反应的作用。图2C显示了第16周时脾细胞的IFNγELISpot分析的结果。所有方案均引起对RG抗原的强效、持久的功能性T细胞反应。

概括来说，实施例1中的数据显示，腺病毒和RNA疫苗平台能成功地在异源初次免疫/加强方案中结合用于引起和加强对编码模型抗原的体液和细胞反应二者。用小微克量的RNA引发反应。

将编码HIV1 GAG抗原转基因的腺病毒载体克隆和用于在黑猩猩腺病毒155(ChAd155)中制备腺病毒颗粒。将编码HIV1 GAG抗原序列的自扩增RNA载体克用于制备体外转录的加帽RNA(SAM-HIV1)。

对腺病毒载体和RNA各自表征其体外效价并且配制用于小鼠中的疫苗注射。腺病毒颗粒在Tris-NaCl中配制。SAM-HIV1 GAG在脂质纳米颗粒(LNP)中配制，使用RV39作为脂质。

单次施用HIV1 GAG

将六周大的雌性BALB/c小鼠分为二十组，并且根据下表中所示的方案肌肉内施用腺病毒或RNA。将动物在第2，4，6和8周采血用于抗体分析和T细胞反应。在第2，4，6和8周中的每一个，将每组中的五只动物处死，并且采集脾脏以测定抗原特异性T细胞反应。

在免疫后八周期间获取的样品上执行HIV1-特异性体液和细胞免疫反应的分析。通过ELISA测量HIV1特异性总IgG滴度。

图3显示了在一次剂量的编码HIV1 GAG抗原的腺病毒或RNA之后的抗体免疫反应。与盐水对照物相比，两种疫苗均在14-56天诱导高抗体滴度，以测得滴度的对数表示。在3x10

全血中的HIV1抗原特异性CD8+T细胞使用缀合五聚体来量化，该缀合的五聚体由与对主要组织相容性复合体(MHC)H-2类有特异性的T细胞受体结合的TAMQMLKET免疫最主要的CD8+T细胞表位组成。在第2，4，6和8周采集全血，并且用H-2d-限制性HIV1 GAG-特异性CD8+五聚体和荧光染料标记的T细胞标记物抗体染色。通过流式细胞术测量阳性抗原特异性CD8+T细胞。

图4A显示了在一次剂量的编码HIV1抗原的腺病毒或RNA之后的CD8+T细胞的反应。数据表示为CD8+T细胞群中HIV1 GAG特异性(五聚体+)细胞的频率。用腺病毒HIV1或RNA-HIV1进行疫苗接种可以引起强烈的CD8+T细胞反应，腺病毒构建体比RNA构体建诱导更多的五聚体阳性细胞。

使用包含HIV-GAG蛋白序列的重叠15聚肽的抗原池，通过细胞内细胞因子染色(ICS)测量脾细胞的功能性T细胞反应。脾细胞的ICS分析显示检测到了CD4+T细胞中的IFNγ反应，尽管频率较低(图4B)。腺病毒-HIV1和RNA-HIV1疫苗二者均能诱导对抗原的强烈的功能性CD8+T细胞反应(图4C)。较高剂量的腺病毒和RNA构建体比较低剂量更早地达到峰值反应，对于腺病毒和RNA二者都是在疫苗接种后2-4周观察到IFN-γ分泌峰值。

用HIV1-GAG初次免疫/加强

实验1

根据单次施用的结果，选择10

将六至八周龄的雌性BALB/c小鼠分为十组或二十组，以下表中所示的方案肌肉内施用ChAd或SAM载体。将第1-3组的动物在初次免疫之后的第2，4，6和8周以及随后的每个月采血。所有动物在第10周和随后的每个月采血。用腺病毒-HIV1初次免疫并且用修饰的安卡拉痘苗(Modified Vaccinia Ankara，MVA)病毒加强的异源组加入作为阳性对照。如同单次施用那样执行中和抗体血清学和T细胞分析。

图5显示了在上表中所示的初次免疫之后第15，29，43，57天(加强日)和加强之后第71、147和241天测量的抗体免疫反应。通过ELISA分析测定的HIV1 GAG特异性IgG滴度显示，单次肌肉内接种腺病毒-HIV1或RNA-HIV1在所有小鼠中引起抗原-特异性IgG滴度，并且在所有组别中通过第二次免疫加强反应。异源腺病毒-HIV1初次免疫和RNA-HIV1加强方案显示与同源腺病毒-HIV1初次免疫或RNA HIV1加强方案相比产生更高IgG滴度的倾向，并且也比异源腺病毒-HIV1初次免疫加MVA加强产生更高的IgG滴度。所有抗体免疫反应持续至少241天。

如图5所示，在所有加强组别中观察到加强作用。以腺病毒作为初次免疫剂和SAM作为加强剂观察到最强烈的抗体反应，甚至超过腺病毒初次免疫和MVA加强所引起的反应，后者在本领域中被描述为一种有效的疫苗接种方法。

通过HIV1-GAG特异性结合实验来定量CD8+T细胞反应。通过用氨基酸序列AMQMLKET的H2-Kd限制性五聚体染色来定量HIV1-GAG特异性CD8+T细胞。图6显示了用全血(6图)和脾细胞(图6B)进行的五聚体染色的GAG-特异性CD8+T细胞反应的结果。图6A显示了用腺病毒-HIV1初次免疫并且用MVA-HIV1、RNA-HIV1或腺病毒-HIV1加强在外周血循环中引起了强烈的CD8+T细胞反应。对腺病毒/RNA异源初次免疫加强方案的反应优于对腺病毒/MVA方案的反应。图6B显示了在脾细胞中的类似T细胞反应。

图7显示了对于IFN-γ、TNFα、白介素2(IL-2)和对于CD107a(其是自然杀伤细胞活性的标记物)的细胞内细胞因子染色(ICS)结果。脾细胞的ICS分析证实，上表中所示的所有方案均诱导对HIV1 GAG抗原的强大功能性T细胞反应，其中异源腺/RNA组合显示最高的CD8+T细胞反应(图7A)和CD4+T细胞反应(图7B)。腺病毒/腺病毒、腺病毒/MVA和RNA/RNA诱导了总体上相同水平的CD8+和CD4+细胞反应，其中不同细胞因子之间存在一些差异(图7A和B)。

在加强之后六个月，GAG-五聚体特异性CD8+T细胞主要是中枢记忆和效应记忆T细胞，而不是效应T细胞。在加强后六个月，与其他初次免疫加强方案相比，用腺病毒-HIV1-GAG初次免疫和用RNA-HIV1-GAG加强的动物显示了CD4+/IFNγ+T细胞和CD8+/IFNγ+T细胞二者的更大增加。

与实施例1中所示的数据一致，用第二种模型抗原产生的数据显示，腺病毒和RNA疫苗平台能够成功地在异源初次免疫/加强方案中结合，引起和增强对编码抗原的体液和细胞反应。加强HIV1-特异性免疫反应的异源腺病毒初次免疫/RNA加强组合的效率略高于腺病毒初次免疫/MVA加强组合。同样，反应由小微克量的RNA引起的。

实验2

执行第二个实验以测定对用猿猴腺病毒和自扩增RNA进行的异源初次免疫和加强的T细胞反应的动力学。将Balb/c小鼠分为八组，每组20只(第3-8组)或30只(第1和2组)，对其给予1x10

图8显示了在与对HIV1 GAG有特异性的五聚体结合之后，用基于流失细胞术的染色实验量化的T细胞反应，并且表达为总CD8+T细胞百分比。通过用氨基酸序列AMQMLKET的H2 Kd限制的五聚体染色来量化全血中的HIV1 GAG特异性CD8+T细胞。用腺病毒HIV1 GAG初次免疫并且用腺病毒、SAM或MVA加强在外周血循环中引起强烈的CD8+T细胞反应。截止加强后一周，所有加强方案均有效，在所有组别中具有相似的五聚体阳性细胞百分比。在加强后两周，对于SAM加强观察到最强烈的反应，其比MVA更有效。对异源腺/SAM初次免疫加强的反应在加强后两周(约第72天)达到峰值，优于同源腺/腺初次免疫加强。

随后使用包含HIV GAG蛋白质序列的重叠的15聚肽的抗原库来测量脾细胞的功能性T细胞反应，如同实验1一样。所有异源初次免疫加强均引起脾CD8+T细胞的多功能反应(图9A)。所测试的所有加强疫苗在每一剂量下均主要诱导GAG-特异性CD107a+/IFNγ+和CD107+/IFNγ+和TNFα+多功能细胞毒性CD8+T细胞。在第72天，所有加强疫苗和剂量均诱导CD107a、IFNγ和TNFα的稳定表达。在所有剂量的所有加强疫苗中，表达所有四种细胞因子的总的CD8+T细胞比例在第100天均高于第64天和第72天。

SAM和MVA二者均加强了腺病毒初次免疫的CD8+T细胞反应。加强反应在0.015和0.15μg SAM之间和1x10

SAM和MVA二者还增强了腺病毒初次免疫的CD4+T细胞反应，尽管反应总体上低于CD8+T细胞。图9B显示脾CD4+T细胞中IFNγ、TNFα、IL-2和CD107a的细胞内细胞因子染色结果。所有加强疫苗在每一剂量下主要诱导IFNγ+/TNFα+/IL-2+，暗示了Th1/Th0多功能CD4+T细胞。在第64天之后，反应的多样性增加，表达了更多种类的细胞因子。

CD4+T细胞的动力学和剂量反应与CD8+T细胞相似，在加强后一周观察到CD107a和IFNγ的反应峰值，并且在加强后两周观察到IL-2和TNFα的反应峰值。SAM加强和MVA加强的效价相似。从加强后1周到2-6周，CD4+T细胞的多功能增加。

概括而言，实验1和实验2均证明，用编码HIV-GAG抗原的猿猴腺病毒初次免疫、然后用编码HIV-GAG抗原的自扩增RNA加强的异源初次免疫加强疫苗接种诱导了强大的CD4+和CD8+T细胞反应。用SAM或MVA加强比用腺病毒同源加强诱导更强的反应。从约第64天到约第100天，即加强后一周到加强后6周，所有加强剂量诱导的CD8+T细胞的多功能增加。反应主要是细胞毒性(CD107a)和IFN-γ+/TNF-α+阳性。

编码单纯疱疹病毒(HSV)Gly VI抗原转基因的猿猴腺病毒载体(PCT/EP2018/076925)被克隆并用于制备ChAd155中的腺病毒颗粒(ChAd-HSV)。HSV-Gly-VI抗原转基因编码来自五种HSV抗原UL-47、UL-49、UL-39、ICP0和ICP4的选定免疫最主要的序列形成的多蛋白。将编码同一抗原序列的自扩增RNA载体克隆并用于制备体外转录加帽RNA(SAM-HSV)。

对编码HSV-Gly-VI的腺病毒载体和自扩增RNA各自的体外效价进行了表征，并将其配制用于小鼠疫苗注射。腺病毒颗粒在Tris-NaCl中配制。将SAM-HSV配制为脂质纳米颗粒(LNP)，用RV39作为脂质体。

单次施用HSV抗原

对首次接受实验的CB6F1近交系小鼠肌肉内施用生理盐水、5x10

图10A显示，小鼠在用ChAd-HSV免疫之后表现出多功能HSV-特异性CD8+T细胞反应。与盐水处理的小鼠相比，免疫小鼠引发了针对某些转基因HSV抗原的多功能HSV特异性CD8+T细胞反应，其中最主要的CD8+反应针对UL-47抗原。在单个剂量的腺病毒-HSV之后，未检测到针对ICP0、UL-39和UL-49抗原的HSV特异性CD8+T细胞反应。与施用以10

图10B显示，小鼠在用腺病毒-HSV免疫之后也表现出多功能HSV-特异性CD4+T细胞反应。主要的CD4+T细胞反应针对ICP0和UL-39抗原，较少小鼠表现出针对ICP4和UL-47的CD4+T细胞反应。

在相关实验中，首次接受实验的近交系CB6F1小鼠用盐水或10

如图11所示，对腺病毒-HSV的大多数最主要的UL-47-特异性CD8+T细胞反应是分泌IFN-γ和TNF-α而不是IL-2。对UL-47抗原的细胞因子反应HIA包括分泌(a)IFN-γ但不是TNF-α或IL-2和(b)IFN-γ、TNF-α和IL-2的CD8+T细胞组。

用HSV初次免疫/加强

将首次接受实验的CB6F1近交系小鼠用5x10

HSV-特异性CD8+(图12A)和CD4+(图12B)T细胞分泌IFN-γ、IL-2或TNF-α的频率通过细胞内染色测量。在疫苗免疫的小鼠中鉴定特异性CD4+/CD8+T细胞反应的临界值对应于在盐水组中获得的T细胞反应的第95百分位。

与图10中所示的数据一致，截止到初次免疫后20天，观察到对UL47和ICP4抗原的最主要的CD8+T细胞反应的倾向。如图12A所示A，在用腺病毒-HSV初次免疫免疫后20天(20PI)，CD8+T细胞响应于UL-47和ICP4产生了IFN-γ、TNF-α和/或IL-2，并且对ICP0和UL-49抗原的响应程度较低。在初次免疫后82天(82PI)也观察到这种反应。

图12A还显示了在用10

作为初次免疫加强方案的结果观察到的CD4+T细胞反应(图12B)也与一次剂量后观察到的反应(图10B)一致。如图12B所示，在用10

图12B还显示了在用10

检验了在腺病毒-HSV/RNA-HSV异源初次免疫/加强免疫之后的UL-47-特异性CD8+T细胞反应的多功能谱，结果如图13所示。首次接受实验的近交系CB6F1小鼠进行肌肉内免疫，每组5只小鼠，每只小鼠用5x10

与实施例1和2所示的数据一致，用第三种模型抗原产生的数据显示，腺病毒和自扩增RNA疫苗平台可以在异源初次免疫加强方案中结合产生和加强对编码抗原的细胞免疫反应。用小微克量的RNA引起这些反应。