作为抗腹泻疫苗抗原的热稳定肠毒素突变体

摘要

本发明涉及具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：NSSNYCCELCCNPACTGCY，其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N和L9T，且第二突变为A14T。

说明书

技术领域

本发明涉及针对产肠毒素性大肠杆菌(

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)(一种革兰氏阴性菌)感染是中低收入国家(LMIC)中，5岁以下儿童中的腹泻有关病和死亡的主要原因之一。这些非常常见的感染估计每年引起约25,000名儿童死亡，并且促成儿童营养不良。此外，ETEC是留在ETEC流行地区的游客和军事人员中腹泻的首要原因。全球与ETEC感染相关的死亡正在下降；然而，发病率仍然很高。值得注意的是，经反复腹泻发作而存活的儿童具有长期后遗症的较高风险，包括认知发育受损、生长迟缓和肥胖。总体而言，ETEC感染的这些短期和长期负面影响强调了对于有效干预的需要。参见：Zegeye ED，Govasli ML，Sommerfelt H，Puntervoll P. Development ofan enterotoxigenic Escherichia coli vaccine based on the heat-stable toxin.Hum Vaccin Immunother. 2018 Aug 6:1-10. doi: 10.1080/21645515.2018.1496768.[提前发布的Epub] PubMed PMID: 30081709。

ETEC定殖小肠，并且通过粪-口途径传播。细菌经由特征性定居因子(CF)粘附至肠上皮。CF是菌毛或纤丝–存在于细菌表面上的丝状蛋白质。迄今为止，已鉴定了25种不同的ETEC CF (Rivera等人，J Clin Microbiol. 2010年9月；48(9): 3198–3203)。

除CF之外，称为热稳定(ST)和热不稳定(LT)毒素的肠毒素也是ETEC腹泻中的毒力决定因素。两种毒素均通过刺激离子和水经由肠上皮细胞的净分泌来起作用。这引起水样腹泻，其在最极端的情况下可以导致霍乱样状况。

ST在20世纪80年代初被鉴定为ETEC疫苗的靶，尽管多次尝试，但尚未成功开发出基于ST的疫苗。

三个主要问题是难以将ST用作疫苗组分的原因。首先，ST多肽是固有地毒性的。其次，ST多肽以其天然形式是非免疫原性的。最后，ST紧密类似于内源性多肽鸟苷素和尿鸟苷素，其增加了抗热稳定毒素抗体可能交叉反应，并且引起疫苗接种者中的自身免疫反应的可能性。

猪和人ST (STp和STh)是广泛覆盖率ETEC疫苗的寻找中的目的抗原。由于其固有的毒性以及与鸟苷素和尿鸟苷素的相似性(图1)，当考虑将ST作为抗原时，毒素类似物是唯一的选项。

ST突变体已在本领域中得到公开，参见例如Taxt，A.等人

几种ST突变体已报告为降低毒性(Taxt，A.等人

WO2014/128555讨论了具有降低毒性的ST突变体。

提供既显示出降低的毒性又引发能够中和天然ST的抗体的ST突变体的问题是一个挑战。提供这样的ST突变体的问题仍然是一个重大挑战，所述ST突变体显示出降低的毒性、当与载体偶联时的特异性免疫原性以及降低的交叉反应性。

发明内容

STh和STp分别是包括三个二硫键的19和18氨基酸肽(图1)。具有三个二硫键的肽的重组表达和化学合成均为挑战性的。正确的半胱氨酸配对对于抗原性是至关重要的，并且因此对于免疫原性也是至关重要的。尽管STh和STp可以在直接氧化折叠后，作为重组肽或化学合成肽生产，但其类似物的制备仍是挑战性的，尤其是考虑到大量各种可能的异构体。

在此背景下，本申请：

(i)报告了ST突变体，特别是ST双重突变体，其包括内部突变(例如赖氨酸和/或苏氨酸，或包括与正交缀合相容的取代的氨基酸类似物)，特别是在SEQ ID NO: 1的位置9和/或14或SEQ ID NO: 2的位置8和/或13处。

(ii)公开了可能例如在其N末端处修饰的ST双重突变体的不同类似物的化学合成。

(iii)例证了“正交化学策略”，其依赖于彼此正交的三组硫醇保护基团的组合，确保非天然的ST类似物根据期望进行折叠，无论是需要天然折叠还是非天然折叠。

(iv)公开了与其链内位点选择性锚定相容的ST类似物，拓宽了作为疫苗、免疫原、诊断工具应用的潜力。

(v)显示了双重突变体

(vi)公开了ST类毒素-蛋白质缀合物，由此ST在肽链内部的单个位点附着至载体。

(vii)公开了基于与常规基于戊二醛的化学不同的缀合过程，化学合成的免疫原性ST类毒素-蛋白质缀合物。

(viii)公开了基于硫醇-马来酰亚胺缀合过程或点击化学，化学合成的免疫原性ST-蛋白质缀合物。

(ix)显示了双重突变体L9KA14T引发中和抗体，并且存在低交叉反应性或无交叉反应性。如本文使用的，术语“L9KA14T”可与术语“L9K/A14T”和“L9K-A14T”互换。

本发明人已显示了，A14T突变是解毒突变，其持续地引发中和天然STh的抗体。然而，ST的一些突变可能导致不需要的免疫优势新表位。实际上，发明人已发现，与A14T不同，A14H突变形成免疫优势的新表位，并且A14H突变体引发与天然毒素弱反应的抗体。发明人还已显示了，与尿鸟苷素共享的L9是共享表位中的中心残基，其可以引发交叉反应抗体(Taxt，A. M.等人，Towards rational design of a toxoid vaccine against the heat-stable toxin of

本发明人通过重组表达和纯化、或者与直接空气氧化折叠或位点选择性半胱氨酸配对组合的固相肽合成(SPSS)，产生了一组突变体和参考ST。虽然天然STh不依赖于方案而采用正确的半胱氨酸配对，但对于一些类毒素已观察到重要分歧，对其抗原特性具有强烈影响。

通过使用硫醇-马来酰亚胺化学产生的ST-和ST类毒素-蛋白质缀合物，证实了免疫原性。在一个实施方案中，将LT-B用作蛋白质载体，并且发明人已发现了，使用硫醇-马来酰亚胺化学的缀合并不破坏载体的五聚体结构。此外，发明人已发现了，硫醇-马来酰亚胺化学并不导致免疫优势的新表位。当视为炔-叠氮化物反应时，点击化学是硫醇-马来酰亚胺化学的替代方法，如本文例证的。当需要时，点击化学可以是促进类毒素的受控、高负载、多价呈递的替代方法。如本文使用的，术语“点击化学”指遵循自然中的实例生成产物的方式，其也通过连接小的模块单元而生成物质。

本发明的目的是提供可以用作ETEC疫苗组分的热稳定毒素突变体。具体而言，预期提供ST的突变体，其并未显示出毒性或显示出非常低的毒性，并且当与合适的载体偶联时，能够引发中和的特异性免疫应答。在一个更具体的方面，预期提供ST的突变体，其并未显示出毒性或显示出非常低的毒性；当与合适的载体偶联时，能够引发中和的特异性免疫应答；且并未显示出交叉反应性或显示出低交叉反应性。

为了解决这些问题，已执行了ST突变体(特别是STh突变体)的筛选。

突变体可以与信号序列一起表达，以指导蛋白质从宿主细胞中的分泌，并且表达可以使用大肠杆菌实验室菌株进行。在一些实施方案中，该实验模型有效地模仿了通过ETEC的天然ST产生。在其它实施方案中，突变体不具有天然ST折叠。

天然STh和STp以及ST突变体也可以重组表达为与二硫键异构酶DsbC的可切割融合物，其允许正确折叠的天然ST肽和许多ST突变肽的纯化(Govasli ML，Diaz Y，ZegeyeED，Darbakk C，Taxt AM，Puntervoll P. and Characterization of Native and VaccineCandidate Mutant Enterotoxigenic Escherichia coli Heat-Stable Toxins. Toxins(Basel). 2018 Jul 3；10(7). pii: E274. doi: 10.3390/toxins10070274.)。

可以在GC-C受体细胞测定法中，使用纯化的肽或过滤的培养上清液，来评价ST突变体的毒性。

可以使用例如ELISA测定法，如竞争性ELISA，来评价ST突变体的抗原性。

可以在测定法中使用针对抗ST突变体产生的多克隆抗体和单克隆抗体，来评价ST突变体的交叉反应性，以确定抗体可以结合内源肽(例如鸟苷素和尿鸟苷素)的程度。此类测定法包括竞争性ELISA和GC-C受体细胞测定法。

本文公开了当与载体缀合时，用作抗原或免疫原的ST突变体。此类ST突变体显示出降低的毒性，以及保留的(和/或具有改善的)抗原性或免疫原性。在一些方面，ST突变体具有降低的交叉反应性。

本文公开了用于ETEC疫苗中的ST突变体。此类ST突变体显示出降低的毒性，以及保留的(和/或具有改善的)抗原性或免疫原性。在一些方面，ST突变体具有降低的交叉反应性。

如本文使用的，术语“抗原性”指抗原(或半抗原)与免疫系统的细胞(例如借助于T细胞受体)或与抗体特异性结合的能力。如本文使用的，术语“免疫原性”指抗原(或半抗原)诱导免疫应答的能力。如果抗原(或半抗原)能够诱导应答，则它是被称为免疫原的免疫原性抗原。抗原(或半抗原)可能与T或B细胞受体特异性结合，但它可能无法诱导免疫应答；此类抗原(或半抗原)是抗原性的，但不是免疫原性的。所有的免疫原性物质都是抗原性的，但并非所有的抗原性物质都是免疫原性的。

如本文使用的，术语“大肠杆菌热稳定毒素的突变体”可以用于指“ST突变体”、“突变体”、“半抗原”、“抗原”、“突变型ST肽”或“ST突变肽”。

根据本发明的一个广泛方面，提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 1)

其中所述突变体包含在位置L9处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有突变L9K。

根据本发明的另一个广泛方面，提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY (SEQ ID NO: 2)

其中所述突变体包含在位置L8处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有突变L8K。

根据本发明的一个广泛方面，提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体包含与在位置A14处的突变组合的在位置L9处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有与突变A14T组合的在位置L9处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有与突变A14T组合的突变L9K。

在另一个实施方案中，突变体具有与突变A14K组合的在位置L9处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有与突变A14K组合的突变L9G。

根据本发明的另一个广泛方面，提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体包含与在位置A13处的突变结合的在位置L8处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有与突变A13T组合的在位置L8处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有与突变A13T组合的突变L8K。

在另一个实施方案中，突变体具有与突变A13K组合的在位置L8处的突变。

在一个实施方案中，突变体具有与突变A13K组合的突变L8G。

根据本发明的另一个方面，提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14T。

在一个实施方案中，突变体具有下述突变：L9K和A14T。

在另一个实施方案中，突变体具有下述突变：L9N和A14T。

在一个进一步实施方案中，突变体具有下述突变：L9T和A14T。

在一个实施方案中，突变体具有下述突变：L9S和A14T。

在另一个实施方案中，突变体具有下述突变：L9A和A14T。

在一个进一步实施方案中，突变体具有下述突变：L9G和A14T。

在本发明的一个进一步方面，提供了用于产生根据本发明的大肠杆菌热稳定毒素(ST)突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中通过在位置7和15处引入Fmoc-Cys(Trt)-OH、在位置10和18处引入Fmoc-Cys(Acm)-OH、以及在位置6和11处引入Fmoc-Cys(Mob)-OH，对半胱氨酸(C)进行序贯地正交侧保护。

在本发明的一个进一步方面，提供了用于产生根据本发明的大肠杆菌热稳定毒素(ST)突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(

根据本发明的另一个方面，提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13T。

在一个实施方案中，突变体具有下述突变：L8K和A13T。

在一个进一步实施方案中，突变体具有下述突变：L8N和A13T。

在另一个实施方案中，突变体具有下述突变：L8T和A13T。

在一个实施方案中，突变体具有下述突变：L8S和A13T。

在一个进一步实施方案中，突变体具有下述突变：L8A和A13T。

在另一个实施方案中，突变体具有下述突变：L8G和A13T。

在本发明的另一个方面，提供了用于产生根据本发明的大肠杆菌热稳定毒素(ST)突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中通过在位置6和14处引入Fmoc-Cys(Trt)-OH、在位置9和17处引入Fmoc-Cys(Acm)-OH、以及在位置5和10处引入Fmoc-Cys(Mob)-OH，对半胱氨酸(C)进行序贯地正交侧保护。

在本发明的另一个方面，提供了用于产生根据本发明的大肠杆菌热稳定毒素(ST)突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(

术语“大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体”和“ST突变体”在本文中可以互换使用。

在一个实施方案中，用于产生ST突变体的方法包括其中将N末端封闭的步骤。

在一个实施方案中，用于产生ST突变体的方法包括其中载体在N末端处进行偶联的步骤。

在一个实施方案中，用于产生ST突变体的方法包括其中载体在内部氨基酸处进行偶联的步骤，所述内部氨基酸例如对于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体在位置9处的氨基酸、或者对于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体在位置8处的氨基酸。

在一个实施方案中，用于产生ST突变体的方法包括其中载体的正交附着在内部氨基酸处进行的步骤，所述内部氨基酸例如对于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体在位置9处的氨基酸、或者对于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体在位置8处的氨基酸。

在一个进一步方面，本发明提供了用于产生ST突变体的方法，其中将N末端封闭。

在一个进一步方面，本发明提供了用于产生ST突变体的方法，其中载体在内部氨基酸处进行偶联，所述内部氨基酸例如对于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体在位置9处的氨基酸、或者对于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体在位置8处的氨基酸。

在一个进一步方面，本发明提供了用于产生ST突变体的方法，其中载体的正交附着在内部氨基酸处进行，所述内部氨基酸例如对于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体在位置9处的氨基酸、或者对于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体在位置8处的氨基酸。

在一个进一步方面，本发明提供了通过根据本发明的方法产生的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体。

在一个实施方案中，至少一种载体与如本文所述的突变体偶联。

在一个实施方案中，至少两种载体与如本文所述的突变体偶联。

在一个实施方案中，至少三种载体与如本文所述的突变体偶联。

在一个实施方案中，一种载体与如本文所述的突变体偶联。

在一个实施方案中，两种载体与如本文所述的突变体偶联。

在一些实施方案中，载体在内部氨基酸处与如本文所述的突变体偶联。例如，载体在内部氨基酸处与突变体偶联，其中所述突变体是野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体，并且所述内部氨基酸是在位置9处的氨基酸。在一个进一步实例中，载体在内部氨基酸处与突变体偶联，其中所述突变体是野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体，并且所述内部氨基酸是在位置8处的氨基酸。

另外或在替代的实施方案中，载体在N末端处与如本文所述的突变体偶联。

本发明人发现对于一些ST突变体，例如SEQ ID NO: 1中的L9G或SEQ ID NO: 2中的L8G，应当通过正交化学合成而不是重组合成和/或直接折叠来合成ST突变体。有利地，如本文所述的ST突变体的正交化学合成产生了这样的ST突变体，其可能并未显示出毒性或显示出非常低的毒性；和/或当与合适的载体偶联时，可能能够引发中和的特异性免疫应答；和/或可能并未显示出交叉反应性或显示出低交叉反应性。不希望受理论的束缚，正交化学合成可能通过确保形成正确的拓扑结构，来帮助确保维持中和表位，这使得能够引发中和抗体；具有不正确拓扑结构的肽趋于没有毒性或具有低毒性。

在一个实施方案中，载体是多糖。在其它实施方案中，载体是多肽。通常，载体多肽包含至少10个氨基酸。

在另一个实施方案中，突变体偶联至载体，例如CRM197或LT-B。

术语“LT-B”和“LTB”在本文中可互换使用。·

ST突变体可以与载体蛋白偶联，以产生具有改善的抗原或免疫原特性的分子。合适的载体蛋白，例如CRM197和LT-B，是本领域技术人员众所周知的。可以使用例如遗传和化学缀合方法，来实现与载体蛋白的偶联。

在一个实施方案中，突变体与载体CRM197偶联。

术语“CRM”与术语“CRM197” 可以互换使用。

在另一个实施方案中，突变体与病毒样颗粒(VLP)偶联。

ST突变体可以与VLP偶联，以产生具有改善的抗原或免疫原特性的分子。合适的VLP，例如AP205，是本领域技术人员众所周知的。可以使用例如遗传和化学缀合方法以及非化学缀合方法，例如SpyCatcher/SpyTag，来实现与VLP的偶联。

在另一个实施方案中，突变体通过化学缀合进行聚合。

ST突变体可以进行聚合，以产生具有改善的抗原或免疫原特性的分子。聚合可以通过使用多臂接头的化学缀合来实现，或者通过利用ST突变体(例如含赖氨酸的突变体)中的多重反应基团来实现。

根据本发明的另一个方面，提供的是编码本发明的ST突变体的分离的核酸。

根据本发明的另一个方面，提供的是包含本发明的核酸的载体。

根据本发明的另一个方面，提供的是包含本发明的载体的宿主细胞。

本发明的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。合适的原核宿主细胞包括细菌，例如大肠杆菌。合适的真核细胞包括酵母、昆虫细胞(例如Sf9细胞)和哺乳动物细胞系。

在一些实施方案中，通过本文公开的与载体偶联的ST突变体来诱导血清。

在一些实施方案中，通过本文公开的与载体偶联的ST突变体来诱导抗体。

根据本发明的另一个方面，提供的是对于ST突变体免疫特异性的抗体。在一些实施方案中，对于ST突变体免疫特异性的抗体能够交叉反应。在一些实施方案中，对于ST突变体免疫特异性的抗体也能够结合天然ST。在一些实施方案中，对于ST突变体免疫特异性的抗体不与尿鸟苷素和鸟苷素交叉反应。在一些实施方案中，对于ST突变体免疫特异性的抗体也能够结合天然ST，并且不与尿鸟苷素和鸟苷素交叉反应。

根据本发明的另一个方面，提供的是其为抗ST突变体的抗体。在一些实施方案中，其为抗ST突变体的抗体也是抗天然ST。在一些实施方案中，其为抗ST突变体的抗体不与尿鸟苷素和鸟苷素交叉反应。在一些实施方案中，其为抗ST突变体的抗体也是抗天然ST，并且不与尿鸟苷素和鸟苷素交叉反应。

根据本发明的另一个方面，提供的是疫苗组合物，其包含本发明的ST突变体、核酸或载体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体，其用于治疗或预防大肠杆菌感染。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体，其用于治疗或预防ETEC感染。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体，其用于治疗或预防腹泻(例如旅行者腹泻)。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体，其用于治疗或预防由ETEC或ETEC感染引起的腹泻(例如旅行者腹泻)。

根据本发明的另一个方面，提供的是用于治疗或预防大肠杆菌感染的方法，其包括将本发明的ST突变体、核酸或载体施用于有此需要的患者(例如人)。

根据本发明的另一个方面，提供的是用于治疗或预防ETEC感染的方法，其包括将本发明的ST突变体、核酸或载体施用于有此需要的患者(例如人)。

根据本发明的另一个方面，提供的是用于治疗或预防腹泻(例如旅行者腹泻)的方法，其包括将本发明的ST突变体、核酸或载体施用于有此需要的患者(例如人)。

根据本发明的另一个方面，提供的是用于治疗或预防由ETEC或ETEC感染引起的腹泻(例如旅行者腹泻)的方法，其包括将本发明的ST突变体、核酸或载体施用于有此需要的患者(例如人)。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体在制造用于治疗或预防大肠杆菌感染的药剂中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体在制造用于治疗或预防ETEC感染的药剂中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体在制造用于治疗或预防腹泻(例如旅行者腹泻)的药剂中的用途。

根据本发明的另一个方面，提供的是本发明的ST突变体、核酸或载体在制造用于治疗或预防由ETEC或ETEC感染引起的腹泻(例如旅行者腹泻)的药剂中的用途。

附图说明

图1. STp和STh毒素及其与尿鸟苷素和鸟苷素的序列相似性。

图1B. 用于天然STh的化学缀合的方法(改编自

图2：通过使用不同的SATP/LTB比制备的LTB至

图3：

图4：SDS page分析在4-15%的聚丙烯酰胺凝胶(Biorad 456-8084)上执行。

图5：关于TRIS缓冲液中的LTB (A)，PBSE缓冲液中的LTB (B)，PBS缓冲液中的STh-(C)、A14T- (D)和AcL9K-A14T (E) LTB缀合物的动态光散射(DLS)分析。4.0-4.9 nm半径与100-120 kDa种类一致。对于可溶性聚集物观察到18-25 nm半径。

图6：

图7-9：天然(N)与拓扑(T)异构体比强烈依赖于半胱氨酸桥形成的次序。在对于STh合成测试的六个可能组合的三个中，7-15

图10. 抗LTB、抗STh和抗BSA-马来酰亚胺抗体滴度。使用由以下包被的ELISA板执行血清的滴定：(A) LTB；(B) STh和(C) BSA-马来酰亚胺。滴度定义为信号背景比≥2.1的最高稀释度。实线指示了每组的中值滴度。虚线指示了所测试的最低血清稀释度，其为1:1000。将没有可测量滴度的血清设定为10

图11. HEK-hGCC和T84细胞测定法中的STh中和。使用具有技术重复的HEK-hGCC细胞测定法(A)、以及在具有技术重复的两个独立的T84细胞测定法实验(B和C)中，分析每种血清。条代表相对于仅肽对照(无血清；实线)，对于每种血清-STh肽混合物测量的平均cGMP浓度。灰色阴影区域代表仅肽对照的标准差。误差条代表血清的标准差。虚线代表阳性对照的中和能力：ST:G8抗STh单克隆抗体(A)、抗STh兔血清(B)和小鼠抗STh血清(C)。L9K/A14T/dmLT血清#1和A14T/dmLT血清#3并未在T84细胞测定法中进行测试(B和C)。

图12. 抗LTB和抗STh抗体滴度。使用由以下包被的ELISA执行血清的滴定：A，LTB和B，STh。滴度定义为信号背景比≥2.1的最高稀释度。实线指示了每组的中值滴度。测试的最低血清稀释度为1:1000，并且将没有可测量滴度的血清设定为10

图13. HEK-hGCC和T84细胞测定法中的STh中和。使用HEK-hGCC细胞测定法(A)和T84细胞测定法(B) (两者均具有技术重复)，来分析每种血清。包括首次用于实验的血清，即来自未免疫小鼠的血清，作为阴性对照。条代表相对于仅肽对照(无血清；实线)，对于每种血清-STh肽混合物的平均cGMP浓度。灰色阴影区域代表仅肽对照的标准差。误差条代表血清的标准差。虚线代表阳性对照的中和能力：ST:G8抗STh单克隆抗体(A)和小鼠抗STh血清(B)。

图14. 使用竞争性ELISA评价中和性抗STh血清的免疫学交叉反应。对于免疫学交叉反应，评价了来自中和天然STh的小鼠免疫实验2的四种L9K/A14T/dmLT血清：(A)血清#1，(B)血清#2，(C)血清#3和(D)血清#6。所有四种GC-C受体配体都以系列稀释物使用，以竞争与STh包被的结合：STh (蓝色)、STp (红色)、尿鸟苷素(绿色)和鸟苷素(紫色)。纵轴显示了与ELISA包被的最大结合的抑制百分比，并且横轴显示了在对数标度上的肽浓度。每个数据点代表三个技术重复的平均值，且误差条描述标准差。线是来自四参数逻辑回归分析的回归曲线。

图15. 抗STh IgG抗体滴度。使用包被有STh肽的ELISA板执行血清的滴定。滴度定义为信号背景比≥2.1的最高稀释度。实线指示了每组的平均滴度。测试的最低血清稀释度为1:1,000，且虚线指示了最高稀释度，其为1:2,040,000。将没有可测量滴度的血清设定为10

图16. STh的中和(T84细胞测定法)。在具有技术重复的两个T84细胞测定法实验(A和B)中分析了每种血清。条代表对于每种血清-STh肽混合物(仅肽；实线)测量的平均cGMP浓度。灰色阴影区域代表仅肽对照的标准差。误差条代表标准差。

图17. 使用竞争性ELISA评价的中和性抗STh血清的免疫学交叉反应。就针对STp、尿鸟苷素和鸟苷素的免疫交叉反应，评价了来自所有小鼠的血清，除了LTB-15 #2之外。该图显示了在STh的90%抑制浓度(IC

具体实施方式

现在将通过非限制性实施例，来描述本发明的各种优选特征和实施方案。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在本领域普通技术人员的能力内。此类技术在文献中得到说明。参见例如，J. Sambrook，E. F. Fritsch和T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual，第二版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F. M.等人(1995和定期增刊) Current Protocols in Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley & Sons，New York，NY；B. Roe，J. Crabtree和A. Kahn (1996) DNAIsolation and Sequencing: Essential Techniques，John Wiley & Sons；J. M. Polak和James O’D. McGee (1990) In Situ Hybridization: Principles and Practice；Oxford University Press；M. J. Gait (编辑) (1984) Oligonucleotide Synthesis: APractical Approach，IRL Press；以及D. M. J. Lilley和J. E. Dahlberg (1992)Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysisof DNA Methods in Enzymology，Academic Press。SPPS在Fmoc Solid Phase PeptideSynthesis，a practical approach，由W.C. Chan和P.D. White编辑，Series editor:B.D. Hames，Oxford university press，2000中进行讨论。这些一般教科书各自引入本文作为参考。

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)毒素

ETEC分泌两种重要的毒力因子，热不稳定和/或热稳定肠毒素。两种毒素均通过刺激离子和水经由肠上皮细胞的净分泌来起作用。这引起水样腹泻，其在最极端的情况下可以导致霍乱样状况。

热不稳定毒素

ETEC热不稳定毒素(LT)是84 kDa的寡毒素，其在结构和机制方面与霍乱毒素有关。LT具有AB5结构，其包含与五聚体B亚基(由五个11.5kDa LTB单体组成)非共价结合的酶促活性的A亚基(LTA，28 kDa)。单独的LTB五聚体是无毒的和高度免疫原性的，且因此适合作为疫苗蛋白载体。LT的无毒双重突变型变体(dmLT: R192G/L211A) (其中LTA是无酶促活性的)是极佳的粘膜佐剂(Clements JD，Norton EB. The Mucosal Vaccine Adjuvant LT(R192G/L211A)或dmLT. mSphere. 2018 Jul 25；3(4). pii: e00215-18. doi: 10.1128/mSphere.00215-18. Review. PubMed PMID: 30045966；PubMed Central PMCID:PMC6060342.)。LT刺激肠上皮细胞中的cAMP浓度增加。这导致氯离子和水的净分泌，导致水样腹泻。

本发明人有利地发现，LTB的五聚体性质在缀合后可以得到维持。

热稳定毒素

已鉴定了两种不同的ETEC热稳定毒素：STa/STI和STb/STII。这些蛋白质是结构、功能和免疫学无关的。STa/STI毒素是本发明的主题，并且在本文中被称为ST。

流行病学研究强烈指示了，与仅产生LT的ETEC菌株相比，分泌ST的ETEC菌株更多地促成发展中国家中的儿童的腹泻病负担。

编码ETEC ST蛋白的基因位于可传播的质粒上。ST蛋白作为72氨基酸的未成熟前原肽表达。前原肽的残基1-19构成信号肽，其靶向未成熟蛋白质，用于经由Sec机制跨越内膜分泌。然后将原肽加工为成熟形式，伴随跨越外膜的易位。

成熟的ST是大约2 kDa的多肽。已知两种ST变体：

1. STh (也称为STIb和STa II)：从感染人的ETEC菌株中分离的19氨基酸的多肽；

2. STp (也称为STIa和STa I)：从感染人和动物两者的ETEC菌株中分离的18氨基酸的多肽。

成熟的STh多肽(对应于未成熟的前原肽的残基54-72)具有下述氨基酸序列：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

成熟的STp多肽(对应于未成熟的前原肽的残基55-72)具有下述氨基酸序列：

NTFYCCELCCNPACAGCY

如本文使用的，术语“ST”可以指“STh”和“STp”。

为了本发明的目的，除非另有说明，否则ST氨基酸残基和突变体将根据有关的成熟多肽序列进行编号。

两种ST变体以其天然形式均为非免疫原性的。

成熟的STh和STp含有以1-4/2-5/3-6模式排列的三个分子内二硫键(此处编号对应于成熟多肽中的半胱氨酸残基次序)。对于二硫键形成需要周质二硫键异构酶(DsbA)。

ST通过模拟内源性配体鸟苷素和尿鸟苷素，来结合并激活鸟苷酸环化酶C (GC-C)受体。ST结合导致细胞内信使环状GMP (cGMP)的浓度增加。这导致钠和氯离子的吸收减少、以及碳酸氢根和氯离子的分泌增加，其最终导致腹泻。

ETEC ST多肽在结构上类似于鸟苷素和尿鸟苷素两者。鸟苷素和尿鸟苷素均仅含有两个二硫键，并且在两种不同的拓扑异构体之间互变。三个ST二硫键似乎将ST多肽锁定为类似鸟苷素和尿鸟苷素的活性拓扑结构的拓扑结构。鸟苷素和尿鸟苷素共有的两个ST二硫键对于活性是必需的。对应于这些二硫键之一的任何ST半胱氨酸的突变都取消或急剧降低毒性。

从第一个半胱氨酸到最后一个半胱氨酸的ST段被称为毒性结构域。

可以通过本领域众所周知的方法来获得本文所述的ST。关于肽的化学合成的各种技术由Borgia和Fields，2000，TibTech 18: 243-251进行综述，并且在其中含有的参考文献中得到详细描述。

在一个实施方案中，通过固相肽合成(SPPS)在固体支持物上合成ST。

在一些实施方案中，合成的多肽通过氧化折叠(例如直接空气氧化)进行折叠。在其它实施方案中，合成的多肽通过位点选择性半胱氨酸配对进行折叠。这种位点选择性半胱氨酸配对可以被称为“正交侧链保护”，也称为正交化学合成。在一些实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对可以按任何次序发生。在其它实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体的位置7和15、位置10和18、以及最后的位置6和11；或按以下次序发生：关于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体的位置6和14、位置9和17、以及最后的位置5和10。通常，在氧化折叠之前，从固体支持物中切割合成的多肽，并且从氨基酸中去除侧链保护基团。可替代地，从固体支持物中切割合成的多肽，并且从半胱氨酸对中序贯地去除侧链保护基团，伴随并存或后续的位点选择性的半胱氨酸配对。

在一个广泛方面，提供了用于生产具有如SEQ ID NO: 1所示的序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成ST的多肽序列(优选地，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(

在一个广泛方面，提供了用于生产具有如SEQ ID NO: 2所示的序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成ST的多肽序列(优选地，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(

在一个进一步方面，提供了通过本文所述的方法产生的大肠杆菌热稳定毒素(ST)，其具有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的序列。

在另一个实施方案中，将具有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的序列的ST偶联至载体，例如CRM197或LT-B。

在一个进一步实施方案中，将具有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2所示的序列的ST偶联至CRM197。

在一个实施方案中，ST是乙酰化的。

在一个实施方案中，ST是在其N末端处乙酰化的。

在一个实施方案中，ST的至少一个氨基酸具有二甲基环丙基甲基(Dmcp)。

在一个实施方案中，Dmcp用作化学合成的Asn侧链保护基团。

ETEC热稳定毒素突变体

本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 1)

其中所述突变体包含在位置L9处的突变。

本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY (SEQ ID NO: 2)

其中所述突变体包含在位置L8处的突变。

在一个实施方案中，ST突变体可以仅具有一个突变。这种ST突变体可以被称为单一ST突变体。单一突变体的实例包括但不限于：L9K和L8K。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 1)

其中所述突变体具有在位置L9处的突变。

在另一个实施方案中，本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY (SEQ ID NO: 2)

其中所述突变体具有在位置L8处的突变。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY (SEQ ID NO: 1)

其中所述突变体由在位置L9处的突变组成。

在另一个实施方案中，本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY (SEQ ID NO: 2)

其中所述突变体由在位置L8处的突变组成。

在一个实施方案中，本发明提供了具有序列NSSNYCCEKCCNPACTGCY的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体。

在另一个实施方案中，本发明提供了具有序列NTFYCCEKCCNPACAGCY的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体。

在另一个实施方案中，ST突变体具有至少2个突变，其中至少一个突变在位置L9或位置L8处。

本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14T。

本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13T。

本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14K。

本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13K。

在一个实施方案中，ST突变体可以仅具有两个突变。这种ST突变体可以被称为双重ST突变体。双重突变体的实例包括但不限于：L9K A14T；L8K A13T；L9N A14T；L8N A13T；L9T A14T；L8T A13T；L9G A14K；和L8G A13K。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14T。

在另一个实施方案中，本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13T。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14K。

在另一个实施方案中，本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体具有两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13K。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体由两个突变组成，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14T。

在另一个实施方案中，本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体由两个突变组成，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13T。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体由两个突变组成，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14K。

在一个实施方案中，本发明进一步提供了具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体由两个突变组成，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13K。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCEKCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCENCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCETCCNPTCTGCY。

在一些实施方案中，本发明提供了具有序列NSSNYCCEKCCNPTCTGCY的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEGCCNPTCTGCY。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCEKCCNPTCAGCY；或

NTFYCCENCCNPTCAGCY；或

NTFYCCETCCNPTCAGCY。

在一些实施方案中，本发明提供了具有序列NTFYCCEKCCNPTCAGCY的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体。

在一个实施方案中，本发明提供了具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCESCCNPTCAGCY；或

NTFYCCEACCNPTCAGCY；或

NTFYCCEGCCNPTCAGCY。

在另一个实施方案中，ST突变体可以包含多于两个突变。

设想可以在本发明的突变体中制备另外的突变，以产生例如三重或四重突变体。例如，通过降低毒性和/或增加ST特异性抗原性或免疫原性和/或降低交叉反应性，此类另外的突变可以进一步改善本发明的ST突变体的特性。

在一个实施方案中，ST突变体是乙酰化的。

在一个实施方案中，ST突变体是在其N末端处乙酰化的。

在一个实施方案中，ST突变体的至少一个氨基酸具有二甲基环丙基甲基(Dmcp)。

在一个实施方案中，Dmcp用作化学合成的Asn侧链保护基团。

在一些实施方案中，具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

具有在位置1和/或4和/或12处掺入的二甲基环丙基甲基保护的Asn(Dmcp)。

在一些实施方案中，具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCEKCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCENCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCETCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEGCCNPTCTGCY；

具有在位置1和/或4和/或12处掺入的二甲基环丙基甲基保护的Asn(Dmcp)。

在一些实施方案中，具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

具有在位置1和/或11处掺入的二甲基环丙基甲基保护的Asn(Dmcp)。

在一些实施方案中，具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCEKCCNPTCAGCY；或

NTFYCCENCCNPTCAGCY；或

NTFYCCETCCNPTCAGCY；或

NTFYCCESCCNPTCAGCY；或

NTFYCCEACCNPTCAGCY；或

NTFYCCEGCCNPTCAGCY，

具有在位置1和/或11处掺入的二甲基环丙基甲基保护的Asn(Dmcp)。

可以通过本领域众所周知的方法来获得本发明的突变体。关于肽的化学合成的各种技术由Borgia和Fields，2000，TibTech 18: 243-251进行综述，并且在其中含有的参考文献中得到详细描述。

在一个实施方案中，通过固相肽合成(SPPS)在固体支持物上合成突变体。

在一些实施方案中，合成的多肽通过氧化折叠(例如直接空气氧化)进行折叠。在其它实施方案中，合成的多肽通过位点选择性半胱氨酸配对进行折叠。这种位点选择性半胱氨酸配对可以被称为“正交侧链保护”，也称为正交化学合成。在一些实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对可以按任何次序发生。在其它实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体的位置7和15、位置10和18、以及最后的位置6和11；或按以下次序发生：关于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体的位置6和14、位置9和17、以及最后的位置5和10。通常，在氧化折叠之前，从固体支持物中切割合成的多肽，并且从氨基酸中去除侧链保护基团。可替代地，从固体支持物中切割合成的多肽，并且从半胱氨酸对中序贯地去除侧链保护基团，伴随并存或后续的位点选择性的半胱氨酸配对。

在一个实施方案中，如本文所述的突变体通过位点选择性半胱氨酸配对进行折叠。

在一个实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体的位置7和15、位置10和18、以及最后的位置6和11。

在另一个实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体的位置6和14、位置9和17、以及最后的位置5和10。

在一些实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体的位置7和15、位置10和18、以及最后的位置6和11：

NSSNYCCEKCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCENCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCETCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEGCCNPTCTGCY。

在一些实施方案中，位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体的位置6和14、位置9和17、以及最后的位置5和10：

NTFYCCEKCCNPTCAGCY；或

NTFYCCENCCNPTCAGCY；或

NTFYCCETCCNPTCAGCY；或

NTFYCCESCCNPTCAGCY；或

NTFYCCEACCNPTCAGCY；或

NTFYCCEGCCNPTCAGCY。

在一个实施方案中，ST突变体具有三个分子内二硫键，其排列在野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体的位置7至15、以及位置10至18、以及位置6至11之间。

在一个实施方案中，ST突变体具有三个分子内二硫键，其排列在具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体的位置7至15、以及位置10至18、以及位置6至11之间：

NSSNYCCEKCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCENCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCETCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEGCCNPTCTGCY。

在一个实施方案中，ST突变体具有三个分子内二硫键，其排列在野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体的位置6至14、位置9至17、以及位置5至10之间。

在一个实施方案中，ST突变体具有三个分子内二硫键，其排列在具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体的位置6至14、位置9至17、以及位置5至10之间：

NTFYCCEKCCNPTCAGCY；或

NTFYCCENCCNPTCAGCY；或

NTFYCCETCCNPTCAGCY；或

NTFYCCESCCNPTCAGCY；或

NTFYCCEACCNPTCAGCY；或

NTFYCCEGCCNPTCAGCY。

通常，在氧化折叠之前，从固体支持物中切割合成的多肽，并且从氨基酸中去除侧链保护基团。可替代地，从固体支持物中切割合成的多肽，并且从半胱氨酸对中序贯地去除侧链保护基团，伴随并存或后续的位点选择性的半胱氨酸配对。

缀合物/载体

本发明还提供了其中本发明的突变体与载体偶联的缀合物。术语“偶联的”、“连接的”、“共价结合的”、“附着的”或“交联的”可以互换使用。

本说明书的载体可以用于增加ST的抗原性或免疫原性。众多载体是本领域已知的。

合适的载体包括但不限于热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)、CRM197、破伤风类毒素(TT)、来自铜绿假单胞菌(

与某些载体例如CRM197、LT-B和CT-B的缀合可以有利地提供针对ETEC ST和LT两者的免疫保护。

在一个实施方案中，载体是热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)。

在一个优选的实施方案中，载体是CRM197。

设想可以通过本领域已知的一系列技术进行偶联，所述技术包括化学缀合、遗传融合或直接蛋白质合成。

化学缀合方法包括通过使用交联剂来偶联预形成的蛋白质。

在一些实施方案中，化学缀合包括通过使用交联剂来偶联预折叠的蛋白质。

在一些实施方案中，化学缀合包括通过使用交联剂来偶联包含接头和/或选择性反应性部分的蛋白质。

图1B示出了用于天然STh的化学缀合的方法(改编自

在一个实施方案中，化学缀合涉及作为交联剂的戊二醛。

在一个实施方案中，化学缀合涉及硫醇-马来酰亚胺。

在一个实施方案中，化学缀合涉及铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成。

在一个实施方案中，化学缀合涉及无铜点击化学。

在一个实施方案中，载体在ST突变体的N末端处进行偶联。在一个替代实施方案中，载体与ST突变体的多肽序列内的氨基酸(即内部氨基酸)进行偶联。

在另一个实施方案中，载体在ST突变体的N末端处进行偶联，和/或载体与ST突变体的多肽序列内的氨基酸(即内部氨基酸)进行偶联。

在一个实施方案中，载体在具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的ST突变体中的氨基酸位置9处进行偶联：NSSNYCCELCCNPACTGCY。优选地，ST突变体在氨基酸位置9处具有氨基酸K。在另一个实施方案中，载体在具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的ST突变体的氨基酸位置8处进行偶联：NTFYCCELCCNPACAGCY。优选地，ST突变体在氨基酸位置8处具有氨基酸K。优选地，偶联经由与内部氨基酸例如赖氨酸(K)的氨基侧链的交联而发生。在一个实施方案中，肽的N末端可以通过封闭剂进行封闭，以确保内部氨基酸(例如赖氨酸残基)与载体的独特交联。在一些实施方案中，一旦已实现了交联，就可以去除封闭剂。

在一个实施方案中，载体在具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的ST突变体的氨基酸位置9处进行偶联：

NSSNYCCEKCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCENCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCETCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或

NSSNYCCEGCCNPTCTGCY。

在另一个实施方案中，载体在具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的ST突变体的氨基酸位置8处进行偶联：

NTFYCCEKCCNPTCAGCY；或

NTFYCCENCCNPTCAGCY；或

NTFYCCETCCNPTCAGCY；或

NTFYCCESCCNPTCAGCY；或

NTFYCCEACCNPTCAGCY；或

NTFYCCEGCCNPTCAGCY。

在一个实施方案中，化学缀合是单位点选择性附着。

在一个实施方案中，化学缀合利用硫醇-马来酰亚胺反应。

在其中突变体在其N末端处与载体连接的一些实施方案中，通过使在其N末端处包含马来酰亚胺部分(mal)的ST突变体，与在其至少一个且直到全部可接近的游离氨基基团处，用硫代乙酰基部分进行修饰的载体反应，来引入硫醇-马来酰亚胺键合。

在其中突变体在内部氨基酸(例如赖氨酸)的侧链N末端处与载体连接的一些实施方案中，通过使(i)在其N末端处乙酰化、且在内部氨基酸(例如赖氨酸)的侧链处包含马来酰亚胺部分的ST突变体，与(ii)在其至少一个且直到全部可接近的游离氨基基团处，用硫代乙酰基部分进行修饰的载体反应，来引入硫醇-马来酰亚胺键合。

在其中突变体在其N末端处与载体连接的一些实施方案中，通过使(i)在其N末端处包含叠氮基部分的ST突变体，与(ii)在其至少一个且直到全部可接近的游离氨基基团处，用炔基(特别是炔丙基)部分进行修饰的载体反应，来引入三唑型键合。

在其中突变体在内部氨基酸(例如赖氨酸)的侧链N末端处与载体连接的一些实施方案中，通过使(i)在其N末端处乙酰化、且在内部氨基酸(例如赖氨酸)的侧链处包含叠氮化物部分的ST突变体，与(ii)在其至少一个且直到全部可接近的游离氨基基团处，用炔丙基部分进行修饰的载体反应，来引入三唑键合。

有利地，将突变体在内部氨基酸(例如赖氨酸)处与载体连接，提供了缀合物，由此该肽暴露于免疫系统的方式不同于其在其N末端处连接时的暴露。这可以降低诱导与鸟苷素和尿鸟苷素交叉反应的抗体的风险，同时提供保留高免疫原性的缀合物，如通过其诱导高抗ST抗体滴度的能力来测量的。

遗传融合包括通过每种蛋白质的多肽主链，将本发明的突变体与载体连接，以产生融合蛋白的方法。这可以通过表达编码此类融合蛋白的基因来实现。蛋白质可以在任一蛋白质的N末端或C末端处进行偶联。可替代地，一种蛋白质可以以这样的方式插入另一种蛋白质内，所述方式基本上不改变两种蛋白质的结构和功能，例如通过掺入环区域内。蛋白质可以直接地或经由多肽接头进行偶联。

最后，可以通过活疫苗载体，例如减毒志贺氏菌属(

在一些实施方案中，ST突变体是突变体的混合物。

ST突变体的混合物的一个实例是包含具有不同氨基酸序列的至少2类ST突变体的混合物。例如其中第一类ST突变体具有其中突变为L9K和A14T的氨基酸序列，而第二类ST突变体具有其中突变为L9N和A14T的不同氨基酸序列；或例如其中第一类ST突变体具有其中突变为L9K和A14T的氨基酸序列，而第二类ST突变体具有其中突变为L9T和A14T的不同氨基酸序列；或例如其中第一类ST突变体具有其中突变为L9N和A14T的氨基酸序列，而第二类ST突变体具有其中突变为L9T和A14T的不同氨基酸序列。

ST突变体的混合物的另一个实例是包含至少3类ST突变体的混合物。例如其中第一类ST突变体具有其中突变为L9K和A14T的氨基酸序列，第二类ST突变体具有其中突变为L9N和A14T的不同氨基酸序列，而第三类ST突变体具有其中突变为L9T和A14T的不同氨基酸序列。

ST突变体的混合物的另一个实例是包含至少2类ST突变体的混合物，其中载体在不同的位置处进行偶联。例如，ST突变体的混合物包含其中载体在ST突变体的N末端处进行偶联的第一类ST突变体，以及其中载体偶联到ST突变体的多肽序列内的氨基酸的第二类ST突变体；ST突变体可以具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列。在进一步的说明中，ST突变体的混合物包含其中载体在ST突变体的一个内部氨基酸处偶联的第一类ST突变体，以及其中载体在ST突变体的多肽序列内的不同内部氨基酸处偶联的第二类ST突变；ST突变体可以具有相同的氨基酸序列。

不希望受理论的束缚，有利地，缀合致使大肠杆菌热稳定毒素(ST)的多于一种突变体能够与单个载体偶联。

在一些实施方案中，大肠杆菌热稳定毒素(ST)的多于一种突变体与载体(例如CRM197)偶联。

在一些实施方案中，大肠杆菌热稳定毒素(ST)的多于一种单一类型的突变体与载体(例如CRM197)偶联。

ST突变体与载体的比率取决于载体的大小、以及载体上的可接近反应性化学基团的数目。

在一些实施方案中，大肠杆菌热稳定毒素(ST)的约2至约100、约2至约50、约2至约40、约2至约30、约2至约25、约2至约20、约2至约18、约2至约15、约2至约10、约2至约5、或约2至约4种突变体、或约2至约3种突变体与单个载体(例如CRM197)偶联。

在一些实施方案中，大肠杆菌热稳定毒素(ST)的约100、约50、约40、约30、约25、约20、约18、约15、约10、约5、约4、约3、或约2种突变体与单个载体(例如CRM197)偶联。

在一些实施方案中，ST突变体与载体的比率在以下范围内：约2:1至约100:1、约2:1至约50:1、约2:1至约40:1、约2: 1至约30: 1、约2:1至约5:1、约2:1至约20:1、约2:1至约18:1、约2:1至约15:1、约2:1至约10:1、约2:1至约5:1、约2:1至约4:1、或约2:1至约3:1。

在一些实施方案中，ST突变体与载体的比率为约100:1、约50:1、约40:1、约30:1、约25:1、约20:1、约18:1、约15:1、约10:1、约5:1、约4:1、约3:1或约2:1。

在一个实施方案中，与单个载体偶联的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的多于一种突变体具有相同类型(即，它们具有相同的氨基酸序列 - 例如NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或NSSNYCCEGCCNPTCTGCY)。在一个替代实施方案中，与载体偶联的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的多于一种突变体是具有不同氨基酸序列的至少2类ST突变体。例如，第一类ST突变体具有其中突变为L9K和A14T的氨基酸序列，而第二类ST突变体具有其中突变为L9N和A14T的不同氨基酸序列；或第一类ST突变体具有其中突变为L9K和A14T的氨基酸序列，而第二类ST突变体具有其中突变为L9T和A14T的氨基酸序列；或第一类ST突变体具有其中突变为L9N和A14T的氨基酸序列，而第二类ST突变体具有其中突变为L9T和A14T的不同氨基酸序列；或第一类ST突变体具有其中突变为L9K和A14T的氨基酸序列，第二类ST突变体具有其中突变为L9N和A14T的不同氨基酸序列，而第三类ST突变体具有其中突变为L9T和A14T的不同氨基酸序列。

在一些实施方案中，疫苗是如本文所述的不同ST突变体的混合物。

在一些实施方案中，疫苗是如本文所述的不同ST突变体-载体缀合物的混合物。

在一个实施方案中，疫苗是与不同类型的载体(例如CRM197和LT-B)偶联的一类ST突变体(例如NSSNYCCESCCNPTCTGCY；或NSSNYCCEACCNPTCTGCY；或NSSNYCCEGCCNPTCTGCY)的混合物。另外地或可替代地，在一些实施方案中，不同的ST突变体与单个载体(例如，CRM197)进行偶联。另外地或可替代地，在一些实施方案中，不同的ST突变体与不同的载体进行偶联；这些载体可以具有相同的类型(例如CRM197)或不同的类型(例如CRM197和LT-B)。

肽变体、衍生物、突变体、类似物和片段

本发明还包括本文公开的ST突变蛋白的变体、类似物和衍生物。

术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”和“氨基酸序列”在本文中可以互换使用。

关于本发明的氨基酸序列的术语“变体”或“衍生物”包括从该序列或向该序列的一个(或多个)氨基酸的任何取代、变动、修饰、替换、缺失或添加，条件是所得的氨基酸序列优选具有基本上相同的治疗活性。

如本文使用的，术语“STh变体”与术语“ST突变体”或“STh突变体”可以互换。

氨基酸取代可以包括非天然存在的类似物的使用，例如以增加治疗上施用的多肽的血浆半衰期。

可以例如根据下表进行保守取代。在第二列的相同区块中并且优选在第三列的相同行中的氨基酸可以彼此取代。

多核苷酸、载体和宿主细胞

本发明还提供了编码本发明的大肠杆菌热稳定毒素突变体的多核苷酸。

如本文使用的，术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”和“核酸”可以互换。

本领域技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，众多不同的多核苷酸可以编码相同的多肽。另外，应理解，技术人员可以使用常规技术进行核苷酸取代，其不影响由本发明的多核苷酸编码的多肽序列，以反映本发明的多肽待在其中表达的任何特定宿主生物的密码子使用。

本发明的多核苷酸可以包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。它们也可以是在其内包括合成或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的许多不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括甲基膦酸酯和硫代磷酸酯主链，在分子的3'和/或5'端处添加吖啶或聚赖氨酸链。为了本发明的目的，应理解，本文所述的多核苷酸可以通过本发明的领域中可获得的任何方法进行修饰。

可以进行此类修饰以便增强多核苷酸的体内活性或寿命。

本发明的多核苷酸可以掺入重组可复制载体内。载体可以用于在相容的宿主细胞中复制核酸。

优选地，载体中的本发明的多核苷酸与控制序列可操作地连接，所述控制序列能够提供通过宿主细胞的编码序列表达，即载体是表达载体。术语“可操作地连接的”意指所述的组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作地连接的”调控序列以这样的方式进行连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

与编码本发明的突变体的序列可操作连接的控制序列包括启动子/增强子和其它表达调控信号。可以选择这些控制序列，以与表达载体设计为待在其中使用的宿主细胞相容。术语“启动子”是本领域众所周知的，并且包括在大小和复杂性方面范围从最小启动子到包括上游元件和增强子的启动子的核酸区域。

可以将本发明的载体转化或转染到合适的宿主细胞内，以便提供本发明的ST突变体的表达。该过程可以包括在条件下培养用如上所述的表达载体转化的宿主细胞，以提供通过载体的编码突变体的编码序列的表达，并且任选地回收表达的蛋白质。

本发明的多核苷酸或载体可以这样施用于受试者，使得突变型ST肽在体内表达。此类载体的例子包括例如质粒和病毒载体。

病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、鼠白血病病毒(MLV)载体、腺病毒载体、痘病毒载体和牛痘病毒载体。逆转录病毒载体的实例包括鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、藤浪(Fujinami)肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBRMSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、阿贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒29型(MC29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)、以及所有其它逆转录病毒科(

抗体

本发明还提供了对于本文公开的ST突变体免疫特异性的多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方案中，对于ST突变体免疫特异性的多克隆抗体或单克隆抗体也能够结合天然ST。

根据本发明的另一个方面，提供的是其为抗ST突变体的多克隆抗体或单克隆抗体。在一些实施方案中，其为抗ST突变体的多克隆抗体或单克隆抗体也是抗天然ST。

如本文使用的，术语“抗体”指由一种或多种多肽组成的蛋白质，所述一种或多种多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。抗体可以作为完整的免疫球蛋白或许多片段存在，所述片段包括通过用各种肽酶消化产生的特征明确的片段。尽管各种抗体片段就完整抗体的消化而言进行限定，但本领域的技术人员将了解，抗体片段可以以化学方法或通过利用重组DNA方法从头合成。因此，如本文使用的，术语“抗体”还包括保留其对于靶抗原的结合活性的抗体片段，该抗体片段或通过完整抗体的修饰而产生，或使用重组DNA方法从头合成。通过术语“抗体”的使用所包括的抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F (ab')2、Fv、scFv、dsFv双抗体和Fd片段。此外，抗体及其片段可以是人源化抗体。

根据本发明的ST突变体可以直接用作免疫原，以生成抗血清和单克隆抗体。因此，本发明提供了用于诱导抗原特异性免疫球蛋白产生的方法，其包括以下步骤：

a)用根据本发明的突变体对动物或人进行免疫；和

b)从动物的血清中回收对于突变体的区域特异性的免疫球蛋白。

用于抗体产生的动物可以是通常用于该目的的任何动物，特别是哺乳动物。尤其指示的是小鼠、大鼠、豚鼠、兔和美洲驼。

在一些实施方案中，抗体可以是单链抗体(参见Simon Krah，Christian Schröter，Stefan Zielonka，Martin Empting，Bernhard Valldorf & Harald Kolmar (2016)Single-domain antibodies for biomedical applications，Immunopharmacology andImmunotoxicology，38:1，21-28，DOI: 10.3109/08923973.2015.1102934.)。单链抗体可以基于重链可变结构域或轻链。基于轻链的单链抗体可以被称为nanobodies®。单链抗体可以通过用所需抗原免疫单峰骆驼、骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼来获得。

免疫根据已建立的技术来进行(参见通过E. Harlow和D. Lane (1988) ColdSpring Harbor，U.S.A.的“Antibodies，A Laboratory Manual”)。

更特别地，本发明的突变体及其缀合物可以用于产生多克隆抗体和单克隆抗体两者。

如果需要多克隆抗体，则对选择的哺乳动物(例如小鼠、兔、山羊、马等)进行免疫。收集来自免疫动物的血清，并且根据已知程序进行处理。如果血清含有针对其它抗原的多克隆抗体，则可以通过免疫亲和层析来纯化多克隆抗体。用于产生和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。

针对本发明中使用的抗原的单克隆抗体也可以通过本领域技术人员容易地产生。用于通过杂交瘤制备单克隆抗体的一般方法是众所周知的。可以通过细胞融合以及其它技术，例如用致癌性DNA直接转化B淋巴细胞或用EB病毒转染，来产生永生的产生抗体的细胞系。针对抗原产生的单克隆抗体组可以就各种特性进行筛选，例如同种型和表位亲和力以及表位作图。

一种替代技术涉及筛选噬菌体展示文库，其中例如，噬菌体在其外壳的表面上表达具有各种各样的互补决定区(CDR)的scFv片段。这种技术是本领域众所周知的。

针对抗原的单克隆抗体和多克隆抗体两者在诊断中是特别有用的，而中和抗体在被动免疫疗法中是有用的。单克隆抗体特别地可以用于产生抗独特型抗体。抗独特型抗体是免疫球蛋白，其携带需要针对其的防护的传染原抗原的“内影像”。

用于产生抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗以及阐明抗原的免疫原性区域。

疫苗组合物

如本文使用的，术语“疫苗组合物”与术语“疫苗”可以互换使用。

本发明提供了疫苗组合物，其包含本发明的ST突变体或核酸、以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明还提供了疫苗组合物，其包含本发明的载体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明进一步提供了疫苗组合物，其包含本发明的宿主细胞和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明还提供了疫苗组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的抗体和药学上可接受的载体和/或赋形剂。

含有免疫原性多肽/多核苷酸作为活性成分的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。通常，将这类疫苗制备为作为液体溶液或悬浮液的注射剂；还可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的，或者将蛋白质包封在脂质体中。活性免疫原性成分经常与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并与活性成分相容的。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等及其组合。

另外，需要时，疫苗可以含有少量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗的有效性的佐剂。

佐剂是增强对抗原或变应原的免疫应答的任何药理学上可接受的物质。因此，T

佐剂的实例包括粘膜多肽。

可能有效的佐剂的实例是dmLT(双重突变型热不稳定毒素(参见近期综述：Clements JD，Norton EB. The Mucosal Vaccine Adjuvant LT(R192G/L211A)或dmLT. -mSphere. 2018 Jul 25；3(4). pii: e00215-18. doi: 10.1128/mSphere.00215-18.Review. PubMed PMID: 30045966；PubMed Central PMCID: PMC6060342.)。

可能有效的佐剂的其它实例包括但不限于氢氧化铝、酪氨酸及其衍生物、N-乙酰-胞壁酰-l-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(Thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺(CGP 11637，也称为正MDP)、N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酰-d-异谷氨酰胺-l-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，其含有在2%角鲨烯/Tween 80乳剂中的从细菌中提取的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。

佐剂和其它试剂的进一步实例包括磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、二氧化硅、高岭土、碳、油包水乳剂、水包油乳剂、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂质X、短小棒状杆菌(

通常，使用佐剂，例如Amphigen (水包油)、Alhydrogel (氢氧化铝)、Amphigen和Alhydrogel的混合物、酪氨酸及其衍生物和磷酸钙。

可以使用与吞噬细胞、以及内细胞和/或抗原呈递细胞上的toll样受体相互作用的佐剂，所述toll样受体例如但不限于toll样受体2和/或4和/或9。这些佐剂的实例是但不限于T

免疫原和佐剂的比例可以在宽泛的范围内变化，只要两者均以有效量存在。例如，氢氧化铝可以以约0.5%的疫苗混合物(以Al

佐剂的有效性可以通过测量针对免疫原性试剂的抗体的量来确定，所述抗体起因于在还包含各种佐剂的疫苗中的该试剂的施用。

在一个实施方案中，佐剂是dmLT。

疫苗通过例如皮内、皮下或肌内注射，照常规肠胃外施用。适合于其它施用模式的另外制剂包括栓剂和经口制剂。

对于栓剂，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯。

经口制剂包括此类通常采用的赋形剂，如例如药用级别的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸氢钠、碳酸镁等等。这些组合物采取溶液剂、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末的形式，并且可以含有例如10%至95%，优选25%至70%的活性成分。当疫苗组合物被冻干时，冻干的材料可以在施用之前例如作为悬浮液进行重构。重构优选在缓冲液中实现。

疫苗的剂量和施用

疫苗以与剂型相容的方式，以及如预防和/或治疗上有效的此类量施用。

预防性疫苗是预防疾病的疫苗。待施用的量可能取决于待治疗的受试者、以及受试者的免疫系统产生抗体的能力。

需要施用的活性成分的精确量可能取决于从业者的判断，并且可能是每个受试者所特有的。

在一些实施方案中，受试者是人。在其它实施方案中，受试者是猪。

疫苗可以按单剂量时间表或多剂量时间表给予。多剂量时间表是这样的时间表，其中主要的疫苗接种过程可以是1-10次分开的剂量，随后为以维持和/或加强免疫应答所需的后续时间间隔给予的其它剂量，例如在第一个剂量后2至4周，以及需要时，在几个月后的后续剂量。剂量方案也至少部分地由个体的需要决定，并且取决于从业者的判断。

在一些实施方案中，疫苗可以按剂量时间表给予，其中在剂量时间表中的如本文所述的肽的量在下述范围内：约0.2µg至约500µg、约0.2µg至约200µg、约0.2µg至约100µg、约0.2µg至约50µg、约0.2µg至约20µg、约0.2µg至约17µg、约0.2µg至约15µg、约0.2µg至约10µg、约0.2µg至约5µg、或约0.2µg至约3µg。

在一些实施方案中，如本文所述的肽是大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体。在其它实施方案中，如本文所述的肽是大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体，其中多肽载体(例如LTB或CRM)与突变体偶联。

在一些实施方案中，疫苗可以按剂量时间表给予，其中在剂量时间表中的如本文所述的肽的量为约500µg、约200µg、约100µg、约50µg、约20µg、约17µg、约15µg、约10µg、约5µg、约3µg、约2µg、约1µg、约0.5µg、约0.4µg、约0.3µg或约0.2µg。

在一些实施方案中，如本文所述的肽按以下剂量施用：约0.2µg至约500µg、约0.2µg至约200µg、约0.2µg至约100µg、约0.2µg至约50µg、约0.2µg至约20µg、约0.2µg至约17µg、约0.2µg至约15µg、约0.2µg至约10µg、约0.2µg至约5µg、或约0.2µg至约3µg。

在一些实施方案中，如本文所述的肽按以下剂量施用：约500µg、约200µg、约100µg、约50µg、约20µg、约17µg、约15µg、约10µg、约5µg、约3µg、约2µg、约1µg、约0.5µg、约0.4µg、约0.3µg或约0.2µg。

在一个实施方案中，将疫苗配制为提供以下剂量的如本文所述的肽：约0.2µg至约500µg、约0.2µg至约200µg、约0.2µg至约100µg、约0.2µg至约50µg、约0.2µg至约20µg、约0.2µg至约17µg、约0.2µg至约15µg、约0.2µg至约10µg、约0.2µg至约5µg、或约0.2µg至约3µg。

在一个实施方案中，将疫苗配制为提供以下剂量的如本文所述的肽：约500µg、约200µg、约100µg、约50µg、约20µg、约17µg、约15µg、约10µg、约5µg、约3µg、约2µg、约1µg、约0.5µg、约0.4µg、约0.3µg或约0.2µg。

在一个实施方案中，疫苗是皮下施用的。

在一个实施方案中，将疫苗配制用于皮下施用。

在一个实施方案中，将疫苗皮下施用于人。

在一个实施方案中，将疫苗配制用于皮下施用于人。

在一个实施方案中，将疫苗皮下施用于猪。

在一个实施方案中，将疫苗配制用于皮下施用于猪。

另外，含有抗原的疫苗可以与其它免疫调节剂，例如免疫球蛋白结合施用。

具有推定表位的原始暴露的类毒素、以及在ST的内部位点处的位点选择性ST附着缀合物的获得方法，对于满足基于ETEC ST的疫苗的要求是重要的。

应了解，在本文中对治疗的所有提及都包括治愈性、姑息性和预防性治疗。哺乳动物的治疗是特别优选的。人和兽医治疗两者均在本发明的范围内。

实施例

通过在37℃下，将在DMSO中预溶解的RP-HPLC纯化的肽(1.2%最终浓度)在0.2 M水性碳酸氢铵，pH 8 (0.2 mg/mL的最终肽浓度)中搅拌5小时，来完成折叠。通过冷冻干燥消除碳酸氢铵。将粗制材料溶解于甲酸中，然后用水稀释以达到1:1的混合物，并且通过经过60分钟，施加在溶剂A (0.08%的水性TFA)中的0–60%溶剂B (MeCN:溶剂A，8/2 v/v)的线性梯度，通过RP-MPLC进行纯化，以得到具有7.2%总产率的主要异构体。

ESI-MS：对于C

Rt (HPLC)：11.1分钟

使在0.2 M碳酸氢铵，pH 8 (0.2mg/mL)中的受Acm、Mob保护的肽在37℃下温育过夜，随后为冷冻干燥。在STh2和STh3的情况下，执行在DMSO (1至2 mL)中的预溶解。

将0.5 M甲醇碘(8当量)加入0.1%水性TFA/50% MeCN (2.0 mg/mL)中的

受Mob保护的肽以15 (STh1)、25 (STh2)或33 (STh3) mg/mL的浓度，溶解在TFA/三氟甲磺酸(TFMSA)/对甲酚，8/1/1中。在0℃下搅拌10分钟后，将粗产物在冷乙醚中沉淀，干燥，溶解于1/1水/MeCN中，并且在转变成TFA盐之前，与AG1-X8阴离子交换树脂一起搅拌1小时。在过滤后，将粗产物在1/1

主要异构体对于STh1、STh2和STh3分别以2.8%、4.2%和1.4%的总产率进行分离。

STh1，ESI-MS：对于C

STh2，ESI-MS：对于C

STh3，ESI-MS：对于C

所有三种肽都具有Rt (HPLC)：11.1分钟。表1中收集了关于分离肽的其它代表性数据(Sth1 = ortho1，STh2 = orho2，STh3 = ortho3)。

六个半胱氨酸残基如下被成对地正交侧保护：在位置7和15中的单甲氧基三苯甲基Fmoc-Cys(Mmt)-OH，在位置10和18中的Fmoc-Cys(Acm)-OH，以及在位置6和11中的Fmoc-Cys(Mob)-OH。另外，在位置1、2、12处掺入受二甲基环丙基甲基保护的Asn(Dmcp)。在80%水性TFA中处理1小时50分钟得到线性肽。将粗产物溶解在50%水性甲酸中，并且通过RP-MPLC进行纯化，经过60分钟，施加在溶剂A (50 mM乙酸铵)中的0-70%溶剂B (MeCN:溶剂A，8/2v/v)的线性梯度。将合适的级分合并，以得到以50%产率的7-15桥连的肽。后者被直接氧化。简言之，在调节后，伴随磁力搅拌，将clear-ox

ESI-MS：对于C

Rt (HPLC)：如对于STh、STh1、STh2和STh3发现的11.1分钟。

表1中收集了关于分离肽的其它代表性数据。

表1：关于通过使用不同途径合成的STh的产率和纯度

Sth突变体的合成、切割和纯化根据用于STh合成的一般方法进行。通过用乙酸酐处理树脂30分钟，将L9KA14T和L9GA14K双重突变体在其N末端处进行乙酰化，以分别得到

L9GA14T ESI-MS：对于C

表2：关于合成突变体各自的产率和纯度

如上所述，根据用于STh正交合成的非优化方法进行合成。通过分别在位置7和15处引入Fmoc-Cys(Trt)-OH、在位置10和18处引入Fmoc-Cys(Acm)-OH、以及在位置6和11处引入Fmoc-Cys(Mob)-OH，六个半胱氨酸被成对地正交侧保护。因此，最后形成了在鸟苷素和尿鸟苷素中不存在的STh特异性6-11二硫键。表3中收集了关于每种单一突变体或双重突变体的具体数据。

A14T ESI-MS：对于C

L9KA14T ESI-MS：对于C

L9GA14T ESI-MS：对于C

表3：关于合成突变体各自的产率和纯度

I. 借助于巯基-马来酰亚胺化学的肽-LTB缀合物

STh、A14T和

化学合成的STh、A14T和

如本文使用的，术语“

表4：关于肽至

硫代乙酰化的LTB和BSA (

使LTB (5 mg，在50 mM TRIS、200 mM NaCl、1 mM EDTA、3 mM NaN

经由硫醇马来酰亚胺化学的STh-、A14T-和

向

表5：关于LTB-肽缀合物合成的数据概览

经由硫醇马来酰亚胺化学的STh-BSA缀合物

通过使用对于获得LTB-肽缀合物所述的方案(参见上文)，来获得STh-LTB。

表6：关于LTB、

表6

II. 借助于铜(I)催化的叠氮化物-炔烃环加成(CuAAC)化学的肽-LTB缀合物

STh叠氮基衍生物(

化学合成的STh以2.0 mg/mL溶解于20 mM磷酸钠缓冲液pH 7中。将配备接头的叠氮基(NHS-PEG

ESI-MS：对于C

炔丙基LTB (

使LTB (370 μg，在50 mM TRIS、200 mM NaCl、1 mM EDTA、3 mM NaN

经由CuAAC化学的STh-LTB缀合物(方案改编自Prelosolski等人

所有溶剂都进行氦吹扫。向

STh-LTB缀合物：借助于戊二醛化学获得

戊二醛缀合方案在Lockwood DE，Robertson DC. Development of acompetitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for Escherichia coliheat-stable enterotoxin (STa). J Immunol Methods. 1984 Dec 31；75(2):295-307.PubMed PMID: 6520401中进行描述。

参考：10:1 (STh-LTB)、30:1 (STh-LTB)、40:1 (STh-LTB)。40:1 (STh-LTB)的AAA给出18 STh/LTB比，但当通过LC-MC分析进行控制时，发现游离和聚合的STh，导致不可靠的STh:LTB比。关于其它2种缀合物的AAA的材料不足。

硫醇/马来酰亚胺缀合物展示低毒性/无毒性(图6B)。相比之下，如通过LCMS分析(图6)鉴定的，对于40:1 STh-LTB缀合物观察到的相当高的毒性(条4)，可以通过缀合物中存在的游离STh来解释。

这些数据支持了在肽和缀合物合成自始至终仔细地建立分析对照的重要性。

在正交化学合成的情况下，在第二个二硫键的形成过程中生成了拓扑异构体，其比率(通过相对HPLC峰面积估计的)保持稳定，直到毒素和类毒素合成完成。天然STh的正交合成形式在结构上等同于通过直接氧化折叠获得的合成肽和重组肽两者，如通过HPLC保留时间和生物活性的一致性所显示的。另外，无论二硫键形成的次序如何，STh正交合成均导致另外的拓扑异构体(异构体C)的分离，所述拓扑异构体通过其它方法并未形成或仅轻微形成。

在正交合成的情况下，天然(N)与拓扑(T)异构体比(N/T比)强烈取决于半胱氨酸桥形成的次序。在对于STh合成测试的六个可能组合的三个中，7-15

进一步的改善旨在取消TFA切割过程中Mob的过早丧失，并且优化保护基团的正交性。因此，将Dmcp保护基团用于在位置1、2和12处的天冬酰胺，并且将Mmt保护基团用于在位置7和15处的半胱氨酸，分别代替Asn(Trt)和Cys(Trt)。这允许完全的天冬酰胺侧链脱保护，而不伴随半胱氨酸6-11 Mob保护基团的丧失。令我们满意的是，达到了STh的7.5%总产率，远高于原始合成的2.8%产率。

分离的STh突变体满足了预计的半胱氨酸配对和STh天然结构相似性两者的第一个指示在于，比较重组体(rSTh)和化学合成分子的RP-HPLC行为。比较了保留时间，并且在必要时执行共注射。作为第一个输入，证实了无论化学途径(直接氧化折叠或受控合成)如何，化学合成的STh (sSTh)的主要异构体与重组STh (rSTh)共洗脱，所述重组STh先前显示为等同于从ETEC培养物中分离的天然毒素。

相应地实现了在重组和合成的A14T、L9KA14T、L9GA14T和L9GA14K突变体之间的RP-HPLC比较。由于rL9KA14T和rL9GA14K在其N末端处是非乙酰化的，而相应的化学合成的

相比之下，对于G9突变肽出乎意料地观察到分歧的结果。对于L9GA14T和

尽管在RP-HPLC分析条件下，主要的rL9GA14T异构体与次要异构体共洗脱，为化学和折叠同一性提供了强烈支持，但它们的抗原特性不同。虽然rL9GA14K和

相比之下，通过正交化学合成分离的L9GA14T和

尽管RP-HPLC控制可能是关于单一突变体A14T和双重突变体L9KA14T的正确折叠的指示物，但如对于在位置9处包括甘氨酸残基的双重突变体(L9GA14T和L9GA14K)所例证的，情况并非总是如此。此外，在不存在定义明确的受控分析参考的情况下，RP-HPLC分析是误导性的，如对于rL9GA14T和rL9GA14K所例证的。这些原始数据证实了，在不存在任何结构信息的情况下，如果没有正确半胱氨酸配对的逐步控制，就不能保证所制备的新型STh突变体的STh折叠拓扑结构。

在不存在任何天然参考和结构信息的情况下，这些原始数据支持了以下事实：对于类毒素的制备应该实施受控折叠策略，例如通过正交化学合成提供的那种，以确保其正确的半胱氨酸配对。另外，由于这种生产策略导致形成两种拓扑异构体，因此需要查明抗原模拟，以鉴定两种折叠体(foldamer)中的哪一种反映了天然STh支架。这可以通过使用ELISA测定法来实现，所述ELISA测定法使用一组合适的抗STh和/或抗STa单克隆IgG抗体。

有趣且出乎意料的是，对于异构体“C”还发现了次要抗原活性，所述异构体“C”是从天然STh的正交合成中分离的副产物。在单一突变体A14T和双重突变体L9KA14T的情况下，与重组肽的HPLC共洗脱是第二个指示物，但对于在位置9中具有甘氨酸的双重突变体(L9GA14T和L9GA14K)中观察到趋异的异构体。

实施例2

用ST疫苗候选物的免疫

概述

携带化学合成的无毒STh突变型变体的两种缀合物免疫原，LTB-STh-A14T和LTB-STh-L9K/A14T，就其在小鼠中引发中和抗体的能力进行评价。在第一个实验中，将两种疫苗候选物与携带天然STh的对照免疫原LTB-STh进行比较。实验证实了，LTB-STh-L9K/A14T能够引发中和STh的抗体。这在后续免疫实验中得到确认，在所述实验中仅比较了两种免疫原。尽管具有与LTB-STh-L9K/A14T接近等同的半抗原-载体比，LTB-STh-A14T免疫原看起来始终引发比LTB-STh-L9K/A14T更低的抗STh滴度，并且没有可辨别的中和活性。关于这点最直接的解释是，与LTB-STh-A14T免疫原中使用的N末端锚相比，通过LTB-STh-L9K/A14T中引入的赖氨酸残基提供的内部缀合锚以更有利的方式暴露STh。在第二个免疫实验中，中和血清就针对尿鸟苷素和鸟苷素的交叉反应性进行评价。没有观察到或观察到低水平的不需要的交叉反应性。

材料与方法

肽合成。

这在实施例1中进行描述。

化学缀合。

制备和表征已经在实施例1中进行描述。表2.1中给出了该研究中使用的免疫原的概览。

表2.1. 研究中使用的免疫原。

小鼠免疫实验1. 对于每种免疫原(表2.1)，使用10 μg缀合物的剂量，对C57BL/6小鼠(雌性小鼠；6周龄)进行免疫。dmLT以1 µg/小鼠/注射用作佐剂。在磷酸盐缓冲盐水(100 µl)中制备注射剂。在第1天时施用初次剂量，并且在第21天和第42天时施用加强剂量。在第66天时处死小鼠并收集血清。表2.2中给出了免疫原、佐剂和免疫途径的组合的概览。

表2.2. 免疫实验1中的小鼠组。

小鼠免疫实验2. 对于每种免疫原(表2.1)，使用10 μg缀合物的剂量，以及在每次注射中1 μg的dmLT作为佐剂，以100 μl/小鼠/注射的总体积，对C57BL/6小鼠(雌性小鼠；6周龄)进行免疫。在第1天时施用初次剂量，并且在第21天、第42天和第63天时施用加强剂量。在第77天时处死小鼠并收集血清。表2.3中给出了免疫原、佐剂和免疫途径的组合的概览。

表2.3. 免疫实验2中的小鼠组。

抗体滴度的估计。分别使用包被有40 ng STh肽、40 ng LTB或40 ng BSA-马来酰亚胺的ELISA板，对来自每只免疫小鼠的血清进行抗STh、抗LTB或抗BSA-马来酰亚胺抗体滴定。在测定法中使用血清的两倍稀释系列(关于细节参见图例)，并且滴度定义为每个系列中具有≥2.1的信号背景比的最后一个稀释度。ELISA如下进行。Nunc Immobilizer AminoPlates (Thermo Fisher Scientific，Waltham，UK)在4℃下用100 µl PBS缓冲液中的有关包被肽/蛋白质包被过夜。将孔排空，随后通过加入180 μl 1% (w/v)卵清蛋白(Sigma-Aldrich)的PBS-T (PBS，0.05%Tween-20)溶液进行封闭。所有后续温育都在室温下伴随温和振荡执行60分钟，随后为用PBS-T的三次洗涤。将血清在PBS-T中稀释至所需浓度，然后向每个孔中加入120 µl。在温育和洗涤之后，加入100 µl 1:4,000稀释的碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG二抗(Abcam，Cambridge，UK)。在温育和洗涤后，加入100 µl底物(250 mM二乙醇胺、0.5 mM MgCl

确定免疫交叉反应的竞争性ELISA。使用竞争性ELISA评价了抗STh抗体与STp、鸟苷素和尿鸟苷素之间的免疫交叉反应性。如对于滴度估计所述的进行ELISA，除了使用4 ngSTh天然肽包被，并且将STp、鸟苷素或尿鸟苷素肽连同血清一起以120 µl的总体积加入，以允许竞争与STh肽包被的结合之外。在这些测定法中，将STh、STp、鸟苷素(Bachem，Bubendorf，瑞士)或尿鸟苷素(Bachem)的10 μM原液3倍稀释12次，并且将60 μl每种肽稀释物加入ELISA板孔中，随后立即为60 µl抗体稀释物。起初对于每种血清执行抗体滴定，以鉴定竞争性ELISA的最佳抗体稀释度。小鼠血清如下进行稀释：L9K/A14T/dmLT #1，1:2700；#2，1:2700；#3，1:8100；以及#6，1:300，并且竞争在室温下伴随温和振荡执行2小时。

HEK-hGCC中和测定法。

在逆转录病毒转导以及在嘌呤霉素中的选择之后，在HEK293E细胞中生成了表达人GC-C的稳定细胞系(HEK-hGCC)。在含有10%胎牛血清的DMEM培养基(Thermo FisherScientific)中培养细胞系。通过蛋白质印迹和放射性配体结合确认了受体表达。这种细胞系可在实验室中获得，并且用于此处所述的实验。使STh (10

T84细胞中和测定法。小鼠血清就其中和STh的能力进行分析。将T84细胞(ATCC®CCL-248™；ATCC，Rockville，MD)在Nunc 48孔板(Thermo Fisher Scientific)中接种且生长至汇合，所述Nunc 48孔板含有Gibco™达尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(DMEM/F-12，Thermo Fisher Scientific)，其补充有10%的胎牛血清(Sigma-Aldrich)和0.2%的庆大霉素(LONZA，Basel，瑞士)。将细胞用200 µl DMEM/F-12培养基洗涤三次，并且在37℃下，与含有1 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma-Aldrich)的100 µl DMEM/F12一起预温育10分钟。我们使10 nM STh在4℃下与小鼠血清一起预温育过夜，所述小鼠血清在DMEM/F-12培养基(总体积80 µl)中进行1:10稀释。将血清-肽混合物与等体积的含有1 mMIBMX的DMEM-F12培养基一起加入每个孔中，并且在37℃下温育30分钟，随后为培养基的吸出，以及通过与400 µl 0.1 M HCl一起在室温下温育20分钟进行细胞裂解。将裂解产物以16,000 × g离心10分钟，并且通过使用Direct cGMP ELISA试剂盒(Enzo Life Sciences，Inc，Farmingdale，NY)，来测量cGMP水平。

结果与讨论

小鼠免疫实验1。

使用ELISA来估计针对STh、载体(LTB)和化学接头(马来酰亚胺)的抗体滴度(图10)。

抗LTB滴度显示了在滴度方面很小至中等的组内变动(图10A)。STh/FCA组具有最高的中值滴度，不含佐剂的组具有最低的中值滴度，而dmLT组具有等同的中值滴度。在组内和组之间，抗STh滴度比抗LTB滴度更可变(图10B)。STh/FCA组具有最高的中值滴度，L9K/A14T/dmLT组具有第二高的中值滴度，随后为非佐剂组。与上述相比，STh/dmLT和A14T/dmLT组具有更多的滴度低于最低测试稀释度(1:1000)的血清，其指示了这两组具有最弱的免疫应答。仅在5个STh/FCA血清中的4个以及9个L9K/A14T/dmLT血清中的1个中，观察到抗马来酰亚胺抗体(图10C)。这提示了对接头的应答可能取决于所使用的佐剂。

在HEK-hGCC和两个T84细胞中和实验中(图11)，仅三个血清显示了一致的中和活性，即STh/FCA血清#2、L9K/A14T/dmLT血清#4和L9K/A14T/dmLT血清# 8。有趣的是，两个L9K/A14T/dmLT血清是具有最高滴度的血清：分别为10

这些结果证实了双重突变体免疫原，LTB-STh-L9K/A14T，能够引发中和天然STh的抗体。

小鼠免疫实验2。

第二个免疫实验集中于两组，即A14T/dmLT和L9K/A14T/dmLT (表2.1)。它如第一个实验进行，但具有另外的加强剂量。使用ELISA来估计针对STh和载体(LTB)的抗体滴度(图12)。

与来自第一个免疫实验的结果一致(图10)，抗LTB滴度显示了在滴度方面很小至中等的组内变动 (图12A)，而抗STh滴度的组内和组间变动均为显著的(图12B)。与免疫实验1一样，在L9K/A14T/dmLT组中观察到最高的抗STh滴度。

在HEK-hGCC和T84细胞中和实验中(图13)，四个血清显示了中和活性，即L9K/A14T/dmLT血清#1、#2、#3和#6。与第一个免疫实验一样，中和血清是具有最高滴度的血清：分别为10

这些结果确认了双重突变体免疫原，LTB-STh-L9K/A14T，能够引发中和天然STh的抗体。

通过使用竞争性ELISA，来测量四个中和性L9K/A14T/dmLT血清的免疫交叉反应性，其中所有四种GC-C受体配体就其竞争与固定的STh结合的能力进行测试(图14)。所有血清都与STp强烈交叉反应，如通过与STh相比在亲和力方面的中等至无差异所证实的。相比之下，观察到针对尿鸟苷素或鸟苷素的很少交叉反应至无交叉反应。

结论

两个小鼠免疫实验证实了，合成的疫苗候选物LTB-STh-L9K/A14T能够引发中和STh的抗体，而不具有不需要的交叉反应性或具有低水平的不需要的交叉反应性。相比之下，尽管具有与LTB-STh-L9K/A14T接近等同的半抗原-载体比，但合成疫苗候选物LTB-STh-A14T和对照免疫原LTB-STh看起来引发更低的抗STh滴度，而没有可辨别的中和活性。关于这点最直接的解释是，与LTB-STh-A14T免疫原中使用的N末端锚相比，通过LTB-STh-L9K/A14T中引入的赖氨酸残基提供的内部缀合锚以更有利的方式暴露STh。结论是LTB-STh-L9K/A14T是非常有希望的ST疫苗候选物。

实施例3

用ST疫苗候选物的免疫

概述

携带STh N-ter乙酰化的无毒双重突变型变体的两种化学合成的STh类毒素-蛋白质缀合物免疫原，LTB-STh-L9K/A14T和CRM-STh-L9K/A14T，就其在小鼠中引发中和抗体的能力进行评价。该实验旨在研究载体(LTB相对于CRM197)和剂量(低相对于高)对无毒STh双重突变体的免疫原性的影响。CRM-STh-L9K/A14T (1:4的平均CRM:肽比)始终引发STh中和抗体，无论剂量如何，不具有不需要的免疫交叉反应性或具有低水平的不需要的免疫交叉反应性。相比之下，LTB-STh-L9K/A14T (1:15的平均LTB:肽比)引发更可变的抗STh免疫应答，其中仅具有高滴度的血清才具有中和活性。较高剂量的LTB-STh-L9K/A14T看起来改善中和抗体的引发。结论是无毒的STh-L9K/A14T肽是有希望的STh类毒素，C RM197缀合物在诱导功能性抗STh应答方面可能优于LTB缀合物，并且其中无毒的STh-L9K/A14T肽仅通过其内部K9氨基酸与载体连接的CRM-STh-L9K/A14T，是非常有前途的ST疫苗候选物。

材料与方法

肽合成。

这在实施例1中进行描述。

化学缀合。

缀合物的制备和表征如已经在实施例1中描述的执行。表2.1中给出了该研究中使用的免疫原的概览。应注意，此处使用的LTB缀合物(半抗原-载体比15:1)来自与前两个实验(半抗原-载体比20:1)中使用的不同的批次。

CRM-STh-L9K/A14T缀合物

使CRM (5 mg，在100 mM NaCl、20 Mm HEPES、10%甘油，pH 8.0中的5.0 mg/mL，来自Provepharm)经受100 mM磷酸钠，5 mM EDTA，pH 7.5 (NaPiE)缓冲液交换，并且通过超滤(Amicon Ultra-15，10 kDa)浓缩至5 mg/mL。将SATP (10当量，200 µg)的DMSO (50 µL)溶液加入蛋白质溶液中，并且将反应混合物在rt (室温)下搅拌90分钟。使用NaPiE缓冲液，如上通过超滤去除未反应的试剂。

将硫代乙酰化的CRM (

表3.1. 研究中使用的免疫原。

小鼠免疫实验3. 使用等价于3和15 μg肽的两个剂量(‘低’剂量和‘高’剂量)，用两种免疫原(表2.1)的每一种，对C57BL/6小鼠(雌性小鼠；6周龄)进行免疫。dmLT以1 µg/小鼠/注射用作佐剂。在100 µl磷酸盐缓冲盐水(PBS)中制备注射剂。在第1天时施用初次剂量，并且在第21天和第42天时施用加强剂量。在第66天时处死小鼠并收集血清。表2.2中给出了免疫原、佐剂和免疫途径的组合的概览。

表3.2. 小鼠组。

IgG抗体滴度的估计。使用包被有40 ng STh肽的ELISA板，对来自每只免疫小鼠的血清进行抗STh IgG滴度滴定。在测定法中使用血清的两倍稀释系列(关于细节参见图例)，并且滴度定义为每个系列中具有≥ 2.1的信号背景比的最后一个稀释度。ELISA如下进行。Nunc Immobilizer Amino板(Thermo Fisher Scientific，Waltham，UK)在4℃下用100 µlPBS缓冲液中的STh包被过夜。将孔排空，随后通过加入180 μl 1% (w/v)卵清蛋白(Sigma-Aldrich)的PBS-T缓冲液(PBS，0.05%Tween-20)溶液进行封闭。所有后续温育都在室温下伴随温和振荡执行60分钟，随后为用PBS-T的三次洗涤。将血清在PBS-T中稀释至所需浓度，然后向每个孔中加入120 µl。在温育和洗涤之后，加入100 µl 1:4,000稀释的碱性磷酸酶缀合的兔抗小鼠IgG二抗(Abcam，Cambridge，UK)。在温育和洗涤后，加入100 µl底物(250 mM二乙醇胺、0.5 mM MgCl2、0.5 mg/ml磷酸4-硝基苯酯二钠盐，pH 9.8)，并且使用HidexSense微板阅读器(Hidex，Turku，芬兰)，在30分钟内测量在405 nm处的吸光度。

使用普通的单因素ANOVA和Tukey的多重比较检验(GraphPad Prism8)，通过多重检验分析了组间的统计学差异。

确定免疫交叉反应的竞争性ELISA。使用竞争性ELISA评价了抗STh抗体与STp、鸟苷素和尿鸟苷素之间的免疫交叉反应性。如对于滴度估计所述的进行ELISA，除了使用4 ngSTh天然肽包被，并且将STp、鸟苷素或尿鸟苷素肽连同血清一起以120 µl的总体积加入，以允许竞争与STh肽包被的结合之外。在这些测定法中，我们将STh、STp、鸟苷素(Bachem，Bubendorf，瑞士)或尿鸟苷素(Bachem)的10 μM原液3倍稀释12次，并且将60 μl每种肽稀释物加入ELISA板孔中，随后立即加入60 µl抗体稀释物。起初对于每种血清执行抗体滴定，以鉴定竞争性ELISA的最佳抗体稀释度。竞争在室温下伴随温和振荡执行2小时。

为了估计交叉反应分数，我们使用以下约束条件，在R (drc R程序包)中生成了四参数对数逻辑回归模型：底部参数设定为由所有肽共享的，且具有最小值0，并且顶部参数设定为最大值100。基于拟合的模型，我们计算了每种同源肽的90%抑制浓度(IC

T84细胞中和测定法。小鼠血清就其中和STh的能力进行分析。将T84细胞(ATCC®CCL-248™；ATCC，Rockville，MD)在Nunc 48孔板(Thermo Fisher Scientific)中接种且生长至汇合，所述Nunc 48孔板含有Gibco™达尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物F-12(DMEM/F-12，Thermo Fisher Scientific)，其补充有10%的胎牛血清(Sigma-Aldrich)和0.2%的庆大霉素(LONZA，Basel，瑞士)。将细胞用200 µl DMEM/F-12培养基洗涤三次，并且在37℃下，与含有1 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma-Aldrich)的100 µl DMEM/F12一起预温育10分钟。我们使10 nM STh在4℃下与小鼠血清一起预温育过夜，所述小鼠血清在DMEM/F-12培养基(总体积80 µl)中进行1:10稀释。将血清-肽混合物与等体积的含有1 mMIBMX的DMEM-F12培养基一起加入每个孔中，并且在37℃下温育30分钟，随后为培养基的吸出，以及通过与400 µl 0.1 M HCl一起在室温下温育20分钟的细胞裂解。将裂解产物以16,000 × g离心10分钟，并且通过使用Direct cGMP ELISA试剂盒(Enzo Life Sciences，Inc，Farmingdale，NY)，来测量cGMP水平。

结果与讨论

小鼠免疫实验3

使用ELISA来估计针对STh的抗体滴度(图15)。

LTB-缀合物组的抗STh滴度具有最低的中值滴度，并且在每个组内具有最高的个体间变动(图15)。在用LTB-STh-L9K/A14T缀合物的两个先前的免疫实验(1和2)中也观察到所观察到的可变性，其中个别小鼠明显并未发展免疫应答。看起来较高剂量(15μg)对LTB-STh-L9K/A14T缀合物的免疫原性没有明显影响。与LTB-缀合物组相比，CRM-缀合物组的抗STh滴度具有更高的中值滴度，伴随更少的组内变动。另外，高剂量CRM-15组具有比低剂量CRM-3组更高的滴度。这些结果提示了，CRM197是比LTB更合适的用于STh双重突变体的载体。

在T84细胞测定法中，所有12个CRM197-缀合物组血清都能够中和天然STh，而LTB-3组的6个血清中的3个和LTB-15组的5个血清中的4个显示了中和活性(图16)。并不中和STh的血清在具有最低抗STh滴度的血清中。这些结果确认了，双重突变体免疫原，LTB-STh-L9K/A14T，能够引发中和天然STh的抗体，条件是滴度足够高，并且证实了用载体例如CRM197，可获得对无毒STh双重突变体的一致中和免疫应答。

使用竞争性ELISA，来测量除了LTB-15血清#2之外的所有血清的免疫交叉反应性，其中所有四种GC-C受体配体就其与固定的STh竞争结合抗体的能力进行测试(图14)。所有血清都与STp强烈交叉反应，但显示了针对尿鸟苷素或鸟苷素的很少交叉反应至无交叉反应。

结论

这个小鼠免疫实验证实了，疫苗候选物CRM-STh-L9K/A14T在两种不同剂量下始终引发STh中和抗体，而不具有不需要的交叉反应性或具有低水平的不需要的交叉反应性。

当以相似的肽当量剂量施用时，疫苗候选物LTB-STh-L9K/A14T引发更可变的抗STh免疫应答，其中仅具有高滴度的血清具有中和活性。较高剂量的LTB-STh-L9K/A14T看起来改善中和抗体的引发。

结论是，CRM197缀合物在诱导功能性抗STh应答方面可优于LTB缀合物，并且CRM-STh-L9K/A14T是非常有希望的ST疫苗候选物。

上文说明书中提到的所有出版物都引入本文作为参考。本发明的所述方法和系统的各种修改和变动对于本领域技术人员将是显而易见的，而不脱离本发明的范围和精神。尽管本发明已与具体的优选实施方案结合进行描述，但应当理解，如请求保护的本发明不应不适当地限制于此类具体实施方案。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的，用于进行本发明的所述模式的各种修改预期在所附权利要求的范围内。

序列表

SEQ ID NO: 1 (STh野生型序列)：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含突变L9K。

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N、L9T、L9S、L9A和L9G，且第二突变为A14T。

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含与在位置A14处的突变组合的在位置L9处的突变。

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含与突变A14T组合的在位置L9处的突变。

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含与突变A14T组合的突变L9K。

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含与突变A14K组合的在位置L9处的突变。

SEQ ID NO: 1的ST突变体可以包含与突变A14K组合的突变L9G。

SEQ ID NO: 2 (STp野生型序列)：

NTFYCCELCCNPACAGCY

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含突变L8K。

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N、L8T、L8S、L8A和L8G，且第二突变为A13T。

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含与在位置A13处的突变组合的在位置L8处的突变。

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含与突变A13T组合的在位置L8处的突变。

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含与突变A13T组合的突变L8K。

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含与突变A13K组合的在位置L8处的突变。

SEQ ID NO: 2的ST突变体可以包含与突变A13K组合的突变L8G。

概述段落

1. 一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L9K、L9N和L9T，且第二突变为A14T。

2. 根据段落1的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L9K和A14T。

3. 根据段落1的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L9N和A14T。

4. 根据段落1的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L9T和A14T。

5. 一种大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体，其具有下述序列：

NSSNYCCEKCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCENCCNPTCTGCY；或

NSSNYCCETCCNPTCTGCY。

6. 一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NSSNYCCELCCNPACTGCY

其中所述突变体包含突变L9K。

7. 一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体包含至少两个突变，其中第一突变选自L8K、L8N和L8T，且第二突变为A13T。

8. 根据段落7的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L8K和A13T。

9. 根据段落7的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L8N和A13T。

10. 根据段落7的突变体，其中所述突变体具有下述突变：L8T和A13T。

11. 一种大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体，其具有下述序列：

NTFYCCEKCCNPTCAGCY；或

NTFYCCENCCNPTCAGCY；或

NTFYCCETCCNPTCAGCY。

12. 一种具有下述野生型序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体：

NTFYCCELCCNPACAGCY

其中所述突变体包含L8K。

13. 一种用于产生根据段落1至6中任一项的大肠杆菌热稳定毒素(ST)突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(

14. 一种用于产生根据段落7至12中任一项的大肠杆菌热稳定毒素(ST)突变体的方法，其中所述方法包括使用氟甲氧基羰基氨基酸(Fmoc-AA)，来合成突变体的多肽序列，其中对于E、S、T和Y使用叔丁基(

15. 一种大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体，其通过根据段落13或14的方法产生。

16. 根据段落1至12或15中任一项的突变体，其中所述突变体与载体偶联。

17. 根据段落16的突变体，其中所述载体是LT-B或CRM197。

18. 根据段落1至12或15中任一项的突变体，其中所述突变体是在其N末端处乙酰化的。

19. 根据段落1至12、15或16中任一项的突变体，其中至少一种载体与所述突变体偶联。

20. 根据段落19的突变体，其中所述载体是LT-B或CRM197。

21. 根据段落1至12、15、19或20中任一项的突变体，其中载体在内部氨基酸(例如对于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体在位置9处的氨基酸、或者对于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体在位置8处的氨基酸)处与所述突变体偶联，和/或其中载体在N末端处与所述突变体偶联。

22. 根据段落1至12、15或19至21中任一项的突变体，其中所述突变体是在其N末端处乙酰化的。

23. 根据段落1至12或15至22中任一项的突变体，其中所述突变体通过位点选择性半胱氨酸配对进行折叠。

24. 根据段落23的突变体，其中位点选择性半胱氨酸配对按以下次序发生：关于野生型序列NSSNYCCELCCNPACTGCY的突变体的位置7和15、位置10和18、以及最后的位置6和11；按以下次序发生：关于野生型序列NTFYCCELCCNPACAGCY的突变体的位置6和14、位置9和17、以及最后的位置5和10；按以下次序发生：关于具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体的位置7和15、位置10和18、以及最后的位置6和11：NSSNYCCEKCCNPTCTGCY、或NSSNYCCENCCNPTCTGCY、或NSSNYCCETCCNPTCTGCY；或按以下次序发生：关于具有下述序列的大肠杆菌热稳定毒素(ST)的突变体的的位置6和14、位置9和17、以及最后的位置5和10：NTFYCCEKCCNPTCAGCY、或NTFYCCENCCNPTCAGCY、或NTFYCCETCCNPTCAGCY。

25. 一种分离的核酸，其编码根据段落1至12或15至24中任一项的突变体。

26. 一种载体，其包含根据段落25的核酸。

27. 一种宿主细胞，其包含根据段落26的载体。

28. 一种抗体，其对于根据段落1至12和15至24中任一项的大肠杆菌热稳定毒素的突变体是免疫特异性的。

29. 一种疫苗组合物，其包含根据段落1至12和15至24中任一项的突变体、根据段落25的核酸、或根据段落26的载体以及药学上可接受的载体或赋形剂。

30. 根据段落1至12和15至24中任一项的突变体、根据段落25的核酸、根据段落26的载体，其用于治疗或预防大肠杆菌感染。

31. 一种用于治疗或预防大肠杆菌感染的方法，其包括向有此需要的患者施用根据段落1至12和15至24中任一项的突变体、根据段落25的核酸或根据段落26的载体。

32. 根据权利要求31的方法，其中所述患者是人。