一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法

摘要

本发明公开了一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基，包括MS基本培养基和植物生长调节剂2，4‑D，所述2，4‑D的浓度为2μg/L，其配制方法包括如下步骤：S1：取2ml 2μg/L 2，4‑D，与4.74g MS粉末和30g蔗糖一同溶于1L去离子水中，搅拌均匀，用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调整PH至5.8，添加4.5g琼脂；S2：121℃高温灭菌20min；S3：灭菌完成后取出培养基，待培养基冷却后摇匀，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，封口后常温保存，本发明打破了种皮障碍，通过外界的物理刺激，辅以植物生长调节剂的协同作用，能够有效诱导愈伤组织形成，缩短愈伤组织诱导时间，为植物再生和遗传转化研究奠定了基础，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法。

背景技术

植物组织培养是研究植物基因功能的有效途径。目前，植物组织培养技术在植物再生工作中得到了广泛应用，但针对如何快速且有效诱导良好的愈伤组织形成及如何缩短植物再生的时间等方面的研究还不够深入。

萱草属多年生宿根草本，其种类繁多，花色丰富艳丽，适应性强，一次栽植，可供多年观赏，在城市绿化中常作为首选观赏性植物引进栽培。萱草繁殖主要以分株繁殖和种子繁殖为主，其种子为不规则三棱或四棱形，棱面一般呈一面凸起，其余各面凹陷或基本平直。成熟种子黑色，有光泽。光学显微镜下种皮表面近于光滑，在扫描电镜下表面纹饰为网纹或负网纹，在不同种间具有一定区别。

萱草种子一般被认为存在休眠现象，在种子充分成熟前含水量很高的萱草种皮随着成熟度提高含水量逐渐降低，从而种皮逐渐硬化而不能透水，即由于种皮障碍引起的种子休眠。因此，急需开发一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法以打破种皮障碍，促进愈伤组织形成。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法，打破了种皮障碍，通过外界的物理刺激，辅以植物生长调节剂的协同作用，能够有效诱导愈伤组织形成，缩短愈伤组织诱导时间，为植物再生和遗传转化研究奠定了基础，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。

为了实现上述目的，本发明提供的一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基，包括MS基本培养基和植物生长调节剂2，4-D，所述2，4-D的浓度为2μg/L。

一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基的配制方法，包括如下步骤：

S1：取2ml 2μg/L 2，4-D，与4.74g MS粉末和30g蔗糖一同溶于1L去离子水中，搅拌均匀，用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调整PH至5.8，添加4.5g琼脂；

S2：121℃高温灭菌20min；

S3：灭菌完成后取出培养基，待培养基冷却后摇匀，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，封口后常温保存。

优选地，在S1中，2μg/L 2，4-D的配制方法为：取50mg 2，4-D粉末溶于5ml 1mol/LNaOH溶液中，震荡完全溶解后，用蒸馏水定容至50ml，得到1mg/L 2，4-D母液；取2000ul的1mg/L 2，4-D母液加到1L培养基中，得到2μg/L 2，4-D。

优选地，在S1中，1mol/L NaOH的配制方法为：将40g NaOH固体溶于400ml去离子水中，得到1mol/L NaOH溶液。

优选地，在S1中，1mol/L HCl的配制方法为：将43ml 36％浓盐酸溶于467ml去离子水中，得到1mol/L HCl溶液。

一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的方法，包括如下步骤：

S1：超净工作台上，取适量萱草种子置于50ml离心管中，用20ml 75％乙醇将种子表面灭菌60s，无菌去离子水冲洗，再加入20ml 6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒20min，用无菌水冲洗5次，得到灭菌后的萱草种子；

S2：将灭菌后的萱草种子用外科手术刀切开取其成熟胚，将成熟胚置于无菌滤纸上吸去表面水分；

S3：将吸干表面水分的成熟胚放置于权利要求1所述的培养基上，胚朝上，培养皿用封口膜包裹，置于黑暗条件下进行组织培养，培养三天后即出现愈伤组织。

优选地，在S1中，6.25％次氯酸钠溶液的配制方法为：吸取12.5ml次氯酸钠溶于180ml蒸馏水中，用蒸馏水定容至200ml得到6.25％次氯酸钠溶液。

优选地，在S1中，所述萱草种子为中等成熟度。

优选地，在S3中，组织培养条件为：温度25±2℃，湿度50％-70％，光强2500lx，光照时间16h/d。

本发明提供的一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基及方法，具有如下有益效果。

1.本发明利用外科手术刀切割萱草种子，打破其由于种皮障碍引起的种子休眠，并通过加入适量植物生长调节剂2，4-D，在不影响其正常生长发育的情况下，快速且有效诱导萱草成熟胚形成愈伤组织。

2.本发明为促进萱草愈伤组织形成的研究积累了宝贵材料，有利于萱草植物组织培养技术和转基因育种工作的研究。

附图说明

图1为切割后成熟胚和未切割种子的愈伤组织诱导结果图；

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。

本发明提供的一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基，包括MS基本培养基和植物生长调节剂2，4-D，所述2，4-D的浓度为2μg/L。

本发明提供的一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的培养基的配制方法，包括如下步骤：

S1：取2ml 2μg/L 2，4-D，与4.74g MS粉末和30g蔗糖一同溶于1L去离子水中，搅拌均匀，用1mol/L NaOH和1mol/L HCl调整PH至5.8，添加4.5g琼脂；

其中，2μg/L 2，4-D的配制方法为：取50mg 2，4-D粉末溶于5ml 1mol/L NaOH溶液中，震荡完全溶解后，用蒸馏水定容至50ml，得到1mg/L 2，4-D母液；取2000ul的1mg/L 2，4-D母液加到1L培养基中，得到2μg/L 2，4-D。

1mol/L NaOH的配制方法为：将40g NaOH固体溶于400ml去离子水中，得到1mol/LNaOH溶液。

1mol/L HCl的配制方法为：将43ml 36％浓盐酸溶于467ml去离子水中，得到1mol/L HCl溶液。

S2：121℃高温灭菌20min；

S3：灭菌完成后取出培养基，待培养基冷却后摇匀，无菌条件下分装培养基至培养皿中，每个培养皿25ml培养基，封口后常温保存。

本发明提供的一种通过诱导成熟胚获得萱草愈伤组织的方法，包括如下步骤：

S1：超净工作台上，取适量中等成熟度的萱草种子置于50ml离心管中，用20ml75％乙醇将种子表面灭菌60s，无菌去离子水冲洗，再加入20ml 6.25％次氯酸钠溶液，上下颠倒混匀，消毒20min，用无菌水冲洗5次，得到灭菌后的萱草种子；

其中，6.25％次氯酸钠溶液的配制方法为：吸取12.5ml次氯酸钠溶于180ml蒸馏水中，用蒸馏水定容至200ml得到6.25％次氯酸钠溶液。

S2：将灭菌后的萱草种子用外科手术刀切开取其成熟胚，将成熟胚置于无菌滤纸上吸去表面水分；

S3：将吸干表面水分的成熟胚放置于权利要求1所述的培养基上，胚朝上，培养皿用封口膜包裹，置于黑暗条件下进行组织培养，培养三天后即出现愈伤组织。组织培养条件为：温度25±2℃，湿度50％-70％，光强2500lx，光照时间16h/d。

如图1所示，为切割后成熟胚和未切割种子的愈伤组织诱导结果图；其中，对照组采用萱草未切割种子、MS基本培养基；处理组采用萱草成熟胚、MS基本培养基+2μg/L 2，4-D。由图1可知：处理组切割过的萱草成熟胚在转到愈伤诱导培养基5天后就开始出现小的愈伤组织，而对照组中未切割的种子要到15天时才会出现少量的愈伤组织，由此表明：本发明可以促进萱草愈伤组织的形成。

由于萱草种子明显具有因种皮障碍引起的休眠特性，不仅影响萱草的产量和品质，也会影响种子作为外植体的生理状态，进而影响愈伤组织的诱导。本发明利用外科手术刀对萱草种子进行切割处理，取其成熟胚，在含有适宜浓度2，4-D的愈伤组织诱导培养基上培养可以显著促进愈伤组织形成，证明了该方法是真实有效的。

本发明打破了种皮障碍，通过外界的物理刺激，辅以植物生长调节剂的协同作用，能够有效诱导愈伤组织形成，缩短愈伤组织诱导时间，为植物再生和遗传转化研究奠定了基础，具有广阔的应用前景，有利于推广应用。本发明利用外科手术刀切割萱草种子，打破其由于种皮障碍引起的种子休眠，并通过加入适量植物生长调节剂2，4-D，在不影响其正常生长发育的情况下，快速且有效诱导萱草成熟胚形成愈伤组织。本发明为促进萱草愈伤组织形成的研究积累了宝贵材料，有利于萱草植物组织培养技术和转基因育种工作的研究。

本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。