公开/公告号CN113171448A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-27
原文格式PDF
申请/专利权人 固安鼎泰海规生物科技有限公司;
申请/专利号CN202110399431.X
申请日2015-11-11
分类号A61K39/00(20060101);A61K39/39(20060101);A61K48/00(20060101);A61P35/00(20060101);C12N15/12(20060101);C12N15/63(20060101);C12N15/85(20060101);
代理机构11322 北京尚诚知识产权代理有限公司;
代理人叶占洋;鲁兵
地址 065000 河北省廊坊市固安肽谷生物医药产业园(科技大道与江山路交口处)
入库时间 2023-06-19 12:02:28
本申请为申请日2015年11月11日、申请号201510765091.2、发明名称“一种前列腺癌核酸疫苗”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种核酸疫苗,特别涉及一种前列腺癌核酸疫苗。
背景技术
前列腺癌发病率在全世界范围内呈现增长趋势,成为人类健康的一大威胁。未发生转移的前列腺癌通过化疗与放疗等治疗可以较为有效地抑制肿瘤发展,病人可以获得比较理想的生存率。但对于复发和转移性前列腺癌,在经过传统的治疗方法后,绝大多数会发展成为去势难治性前列腺癌(CRPC),此时,现有的治疗手段无法有效地控制肿瘤发展,因而患者的生存率非常低。因此,临床上急需要一种全新有效的治疗手段来治疗CRPC。
在过去的十几年里,免疫治疗作为肿瘤治疗的新手段受到了越来越多的关注。其中抗肿瘤DNA疫苗由于其独特的优势发展迅速,多种针对人类肿瘤的DNA疫苗已经进入了临床试验阶段,有的已经被批准应用于动物肿瘤的治疗。前列腺癌的免疫治疗方法研究进展相对缓慢,前列腺癌表达多种肿瘤相关抗原(TAA),如前列腺特异性抗原PSA、前列腺特异性膜抗原PSMA、前列腺酸性磷酸酶PAP、前列腺干细胞抗原PSCA等。这些肿瘤相关抗原有可能为免疫治疗提供多种靶点。另外,前列腺癌患者血清中PSA浓度在早期便会发生变化,这使得早期治疗成为可能。同时,循环血液中可以检测到与前列腺TAA发生反应的T细胞,这说明对这些抗原的自我耐受是可以克服的。肿瘤DNA疫苗的要达到的关键目标就是引发机体的细胞介导的免疫反应,主要是激活肿瘤相关抗原(TAA)特异性的杀伤性T淋巴细胞(CTL),然后这些抗原特异性的淋巴细胞通过杀伤表达肿瘤相关抗原(TAA)的细胞而达到治疗作用。这意味着如果DNA疫苗如果能引发机体足够强的免疫反应,攻克去势难治性的前列腺癌将成为可能。要使DNA疫苗起到较好的效果,抗原的选择尤为重要。
前列腺特异性抗原PSCA、PAP、PSMA、PSA都含有前列腺癌免疫治疗的良好靶点(表位)。但是,其各有优缺点,单独使用都能起到一定的作用,但效果不明显。专利文献CN1696293A(以下称文献1)公开一种基因重组趋化抗原疫苗,其中涉及一种基因重组前列腺癌疫苗,其核苷酸序列是一种人工拼接的SLC-PSM-mPAP-PSA-Fc(简称SLC-3P-Fc)的基因序列。然而,该文献1提供的基因重组前列腺癌疫苗必须依赖其上下游分别融合的趋化因子SLC和IgG的Fc片段的协同作用,才能诱发特异性抗肿瘤细胞免疫和体液免疫反应,而在3P表达基因上游仅融合有趋化因子SLC分泌肽基因的表达质粒的核酸疫苗(psig-3P)却完全无法诱导特异性抗肿瘤反应(参见文献1的图13和图14),表明前列腺癌特异性抗原PSM、PAP和PSA经融合后(3P)的特异性抗肿瘤反应效果也不明显。目前尚不知PSCA、PAP、PSMA、PSA所含有的具体有功能的表位及其融合(4P)表达效果。
如今,前列腺癌DNA疫苗已经从实验室实验进入了临床试验阶段,并且已经取得了一定的进展,但是,目前的前列腺癌DNA疫苗应用于临床效果不明显,甚至只存在理论上的效果,没有实际使用效果。
发明内容
本发明是为了克服上述现有技术中缺陷,通过将表达前列腺癌抗原PSCA,PAP,PSMA,PSA相关表位的基因序列融合制成一种前列腺癌核酸疫苗。
一种前列腺癌核酸疫苗,所述核酸疫苗由表达前列腺癌抗原PSCA,PAP,PSMA,PSA的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域的基因序列融合而成,其上游融合有表达FLT3L的信号肽及胞外区的基因序列,其下游融合有表达CD40L的基因序列;
所述前列腺癌抗原PAP的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示;
所述前列腺癌抗原PSA的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示;
所述前列腺癌抗原PSCA的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示;
所述前列腺癌抗原PSMA的能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
所述前列腺癌核酸疫苗的基因序列如核苷酸序列表SEQ ID NO:1所示。
包含上述的前列腺癌核酸疫苗的质粒载体。
所述质粒载体的原始质粒载体为pSVK1。
包含上述的质粒载体的真核表达细胞。
所述真核表达细胞的原始细胞为293T细胞。
上述前列腺癌核酸疫苗在制备抗前列腺癌的药物中的应用。
所述药物包括上述前列腺癌核酸疫苗和共刺激佐剂,所述共刺激佐剂包括细胞因子,趋化因子和细菌毒素。
优选的,所述细胞因子为细胞因子GM-CSF和B7.1。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明设计了一种新型的将前列腺癌4种常见抗原进行融合表达的核酸疫苗,同时辅以各种共刺激分子和分子内佐剂,提高了该核酸疫苗的免疫原性,增强其抗肿瘤免疫效果。通过实验结果可以看出,该融合表达模式的核酸疫苗,免疫后的小鼠能够同时诱导抗体反应和细胞免疫,并且单从数据来看,疫苗组免疫后诱导的免疫反应非常强烈,尤其是能够诱导强烈的细胞免疫反应,这对于疫苗的抗肿瘤效果是至关重要的。
附图说明
图1是pUC57-FL+4P+CD40L质粒双酶切鉴定图;
图中,M:5000DNA marke;1:pUC57-FL+4P+CD40L质粒;2:pUC57-FL+4P+CD40L质粒BamHⅠ和Mfe I双酶切。
图2是pVAX-GB质粒酶切线性化鉴定图;
图中,M:5000DNA marke;1:pVAX-GB质粒;2:pVAX-GB质粒BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切。
图3是过渡疫苗质粒的酶切鉴定;
图中,M:15000DNA marker;1:疫苗质粒;2:疫苗质粒PmeⅠ+BamHⅠ双酶切。
图4疫苗质粒在293T细胞中瞬时表达的流式细胞术分析;
图中,A:对照组(FITC+PE);B:实验组(CD154 PE+CD80 FITC)。
图5是疫苗质粒免疫小鼠肌肉组织免疫组化结果;
图中,A:生理盐水组小鼠;B:疫苗组小鼠(PSCA);C:疫苗组小鼠(PAP);D:疫苗组小鼠(PSA);E:疫苗组小鼠(PSMA)。
图6是ELISA检测各组小鼠血清中特异性抗体OD450nm值。
图7是ELISPOT斑点图。
图8是免疫后小鼠IFN-γ的ELISPOT检测结果。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1疫苗融合抗原的设计及表达质粒构建与制备
实验材料:
含有佐剂分子GM-CSF(Genbank号:M11220.1),B7.1(Genbank号:NM_005191.3)和内部核糖体进入位点IRES序列的质粒pVAX-IRES-(GM-CSF+B7),如序列表SEQ ID NO:20所示,(简称pVAX-GB)质粒为前期构建,在疫苗构建过程中作为过渡载体(该载体的构建是将IRES,GM-CSF和B7.1序列融合后全基因合成,然后通过BamH I和EcoR I酶切位点将融合基因克隆入Invitrogen公司的pVAX1所构成);用于疫苗构建的pSVK1空载体为前期构建和保存(该载体是以Invitrogen公司的pSFV1质粒为基础改造,具体就是用CMV启动子替换了SP6启动子,以卡那霉素抗性替换了原先的氨苄西林抗性,改造后其全序列如序列表SEQ IDNO:21所示);大肠杆菌E.coli DH5α为本公司保存。
连接酶试剂盒solutionⅠ为Takara公司产品;DNA限制性内切酶均购自NEB公司;片段胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司;DNA电泳用琼脂糖购自Promega公司;转染试剂EntransterTM-H为北京英格恩生物科技有限公司产品;PE标记的抗人CD154(CD40L)单克隆抗体和FITC标记的抗人CD80(B7-1)单克隆抗体为Santa Cruz公司产品;
实验方法及结果:
1.FL-4P-CD40L融合基因的获得
通过查阅文献,选择四个前列腺癌抗原:PSCA、PAP、PSMA、PSA,并进一步确定了这四种抗原能够诱发CD8+T细胞免疫应答的覆盖HLA-A2表位的区域,从中选择了10条表位(表1),在设计靶抗原时我们依据这四种抗原天然蛋白在细胞中的空间定位,设计出了4P抗原(表2)。
表1覆盖HLA-A2表位的区域
表2 4P抗原的设计
同时,为了增强疫苗的免疫原性,在4P抗原的上游融合表达FLT3L的信号肽及胞外区,在4P抗原的下游融合表达CD40L,融合基因的全序列由金唯智公司合成,全序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
2.获取FL-4P-CD40L融合抗原基因片段
将由基因公司合成的质粒pUC57-FL+4P+CD40L用BamH I和Mfe I双切后,切胶回收2.3kb片段,即得到FL-4P-CD40L融合基因,其双酶切鉴定结果如图1所示。
3.中间过渡DNA载体pVAX-GB的双酶切线性化
将质粒pVAX-GB用BamH I和EcoR I双切将载体线性化然后切胶回收,酶切鉴定图如图1所示。
4.过渡疫苗质粒pVAX-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7(简称过渡疫苗质粒)的构建与酶切鉴定
连接反应:在10μl反应体系中,加入5μl的solutionⅠ,所得FL-4P-CD40L片段4μl,所得线性化的pVAX-GB片段1μl,16℃反应30min。
连接产物转化:取100μl感受态细胞置于冰浴中,待感受态细胞融化后,向感受态细胞悬液中加入10μl连接产物,轻轻混匀,冰浴30min,立即转移到42℃水浴锅中热击60s,迅速转移到冰浴中2min。向感受态细胞中加入500μl无菌的不含抗生素的LB培养基,混匀后置于37℃中,200rpm震荡培养40min。取200μl已转化的感受态细胞均匀涂布于含有氨苄青霉素(100μg/mL)的固体培养基上,37℃倒置培养12-16小时。从平板中挑取单一菌落约6个,分别接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中(5mL/管),37℃,200rpm震荡培养过夜。
根据质粒提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)的说明提取重组质粒,用BamHI和PmeI双切鉴定过渡疫苗质粒pVAX-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7,鉴定结果如图3所示,凝胶电泳均得到与预期大小相符的目的片段,大小约为4200bp和3000bp。
5.疫苗质粒pSVK1-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7的构建和鉴定(以下简称疫苗质粒)
酶切空载体pSVK1:用Sma I酶切pSVK1,将质粒pSVK1线性化,此时其酶切后其具有两个平末端。
FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7融合基因片段的获得:首先用BamH I对过渡疫苗质粒pVAX-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7进行单酶切,纯化回收后补平,然后用Pme I对前一步得到的载体进行再次单酶切,经过该步操作即可获得两端均为平末端的FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7融合基因片段。
载体pSVK1与FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7融合基因的连接与鉴定:
将上述步骤中得到的分别具有两个平末端的pSVK1载体FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7融合基因进行连接,然后转化E.coli.DH5α感受态,在含30μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上培养过夜,挑取单克隆在LB液体培养基中扩增培养。
由于两个平末端的连接具有正反方向性问题,因此设计一对引物对连接的方向性进行鉴定,引物分别选自于载体和融合基因片段上。利用菌液PCR的方法筛选出的阳性克隆,即为治疗性前列腺癌核酸疫苗的质粒pSVK1-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7(简称疫苗质粒)。
6.疫苗质粒的真核表达
采用常规实验方法将疫苗质粒瞬时转染293T细胞,然后采用流式细胞术检测疫苗质粒在293T细胞的表达。收集转染48h后的293T细胞,用PE标记的抗人CD154(CD40L)单克隆抗体和FITC标记的抗人CD80(B7-1)单克隆抗体进行避光孵育后,进行流式细胞术检测,检测结果如图4所示。
将疫苗质粒注射入BALB/c小鼠肌肉组织(股四头肌),然后用ECM830型电脉冲导入仪进行刺激,36h后颈椎脱臼法处死免疫小鼠,手术分离小鼠免疫部位的肌肉组织,经过固定、包埋、切片、抗体孵育、染色等步骤,观察重组质粒注射部位肌肉组织外源基因的表达情况。应用兔抗人PSCA、PAP、PSA、PSMA单克隆抗体分别进行免疫组化试验后,均可在免疫小鼠的肌肉组织中观察到数量不同的棕褐色颗粒,而用生理盐水免疫的小鼠的肌肉组织中则没有检测到目的蛋白的表达(图5)。以上结果表明,疫苗质粒经过肌肉注射加电脉冲刺激后其融合基因可以在小鼠体内有效表达。
实施例2治疗性前列腺癌核酸疫苗免疫原性检测
实验材料
疫苗质粒pSVK1-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7为本部分第一节构建;感受态大肠杆菌E.coli.DH5α为本公司制作;6-8周龄雌性BALB/c小鼠,购自北京维通利华实验动物有限公司。合成肽是用于免疫学检测中ELISPOT和细胞因子分泌实验的刺激物合成肽由北京赛百盛生物技术有限公司完成。去内毒素质粒大量提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司,RPMI 1640培养基为Gibco BRL公司产品,小鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品科技有限公司,Murine IFN-γELISPOT预包被试剂盒购自深圳达科为公司,其它试剂均为国产分析纯。
实验方法
1.大量提取与纯化免疫用质粒DNA
动物实验所需无内毒素质粒pSVK1空载体、佐剂质粒pSVK1-GB以及疫苗质粒pSVK1-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7均参照天根生化科技(北京)有限公司“无内毒素质粒大提试剂盒”说明书操作。
2.实验动物分组
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分为5组,每组8只。A组为空白对照组;B组为生理盐水注射组;C组为pSVK1空载体组;D组为pSVK1-GB佐剂组;E组为pSVK1-FL-4P-CD40L-IRES-GM-CSF+B7疫苗组。
3.免疫策略
实验小鼠每隔7天,进行3次疫苗免疫,免疫采用股四头肌肌肉注射并同时进行电脉冲刺激的方式进行,A组为空白对照组,无需注射,B组注射生理盐水100μL,C、D、E组分别注射相应质粒50μg/100μL/只,在注射后立即用活体基因电转仪在注射部位进行多点电脉冲刺激,电脉冲刺激的条件为:电压60V,脉冲时间50ms,脉冲次数为1Hz×6次。
4.ELISA法检测免疫小鼠血清中的特异抗体
末次免疫后的第2周取各组免疫小鼠血并分离血清。分别用PSCA,PSMA,PSA和PAP融合蛋白包被ELISA板,检测疫苗免疫后诱导的特异性抗体水平。经过测量各组血清ELISA后的OD值,结果可以看出疫苗组诱导产生的4种抗体水平均高于各个对照组(图6),表明该疫苗能够诱导产生高滴度的抗体。
5.ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞特异IFN-γ的分泌
5.1分离免疫小鼠脾脏淋巴细胞悬液:
在末次免疫后第2周,断颈处死各组免疫后小鼠,浸泡于75%乙醇中5min后放入紫外线照射消毒过的超净台内;
无菌条件下手术取出小鼠脾脏,将脾脏剪碎后置入200目细胞筛中,接着将细胞筛放入无血清的1640培养基的平皿中,用研磨棒尽量将脾研磨均匀;
用无血清的1640培养基轻轻将细胞筛中的淋巴细胞冲出;
将5mL小鼠淋巴细胞分离液加入到离心管中,将步骤c所得到的脾细胞悬液沿管壁缓慢滴加在淋巴细胞分离液上方(注意不要将两者混合),室温下2500rpm离心30min;
离心后取液体分为三层,取中层白膜,加入10mL无血清的1640培养基清洗淋巴细胞2次(1500rpm/min,10min);重悬于10mL无血清培养基中并计数。
5.2ELISPOT法检测免疫小鼠脾细胞IFN-γ分泌
按照达科为生物技术有限公司的Mouse IFN-γprecoated ELISPOT试剂盒进行操作,具体如下:
第一天:接种细胞,加入刺激物,培养(严格注意无菌操作)
1.预包被板的活化:每孔加入200μL EZ-CultureTM无血清培养基或者RPMI-1640培养基,室温静置5-10min后将其扣出。
2.加入细胞悬液:将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔,100μL/well。
正对照孔:细胞浓度可采用1×10
3.加入刺激物:10μL/well,具体如下:正对照孔:加入阳性刺激剂工作液。
负对照孔【含背景负对照孔】:加入EZ-CultureTM无血清培养基(或重悬细胞用培养基);实验孔:加入实验者自己的刺激物(用EZ-CultureTM无血清培养基或者RPMI 1640配制成10×终浓度)。
4.孵育:所有样品和刺激物加完后,盖好板盖。放入37℃,5%CO
第二天:培养后操作(不再需要无菌操作)
1.裂解细胞:倾倒孔内细胞及培养基。加冰冷的去离子水,200μL/well,4℃冰箱放置10min低渗裂解细胞。
2.洗板:倾倒孔内液体,1×Washing buffer,200μL/well,洗涤5-7次。每次停留30-60s。最后一次,在吸水纸上扣干。
3.检测抗体孵育:将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔,100μL/well。37℃孵育1hr。
4.洗板:倾倒孔内液体,1×Washing buffer,200μL/well,洗涤5次。每次停留30-60s。最后一次,在吸水纸上扣干。
5.酶联亲和素孵育:将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔,100μL/well。37℃孵育1hr。
6.洗板:倾倒孔内液体,1×Washing buffer,200μL/well,洗涤5次。每次停留30-60s。最后一次,在吸水纸上扣干。
7.显色:将现配的AEC显色液工作液加入各实验孔,100μL/well。室温避光静置15-45min(在20-25℃,显色25min较合适)。若室温低于20℃,建议在37℃孵箱做显色,每隔5-10min检查一次。
8.终止显色:倾倒孔内液体,揭开板底座,用去离子水/自来水洗涤正反面及底座3-5遍,终止显色。将板放置在室温阴凉处,待其自然晾干后合上底座。
9.ELISPOT板斑点计数,并记录斑点的各种参数,做统计分析。
分别以4种抗原的peptides pool为刺激原,加入到实验孔,浓度为1μg/孔。ELISPOT的实验结果如图7、图8所示:疫苗质粒组免疫组小鼠能检测到特异性淋巴细胞的IFN-γ分泌,佐剂组能检测到非常低的非特异性的IFN-γ分泌,其他对照组均为阴性。经过统计学分析,比较分别经过4种peptides pool刺激的不同各组小鼠ELISPOT实验后产生的斑点数,免疫后的疫苗质粒组较生理盐水组存在显著性差异(P<0.001)。实验结果表明,疫苗质粒能够诱导强烈的细胞免疫反应。
以上公开的仅为本发明的具体实施例,但是,本发明并非局限于此,任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 固安鼎泰海规生物科技有限公司
<120> 一种前列腺癌核酸疫苗
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2310
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgacagtgc tggcgccagc ctggagccca acaacctatc tcctcctgct gctgctgctg 60
agctcgggac tcagtgggac ccaggactgc tccttccaac acagccccat ctcctccgac 120
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gtaaccctgg aaaatgggaa acagctgacc gttaaaagac aaggactcta ttatatctat 2040
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Leu Leu Gly Cys Val Ala Leu His Val
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<212> PRT
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<400> 6
Pro Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Cys Val
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<211> 10
<212> PRT
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<400> 7
Val Ile Ser Ala Ala Val Cys Ala Gly Val
1 5 10
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<211> 10
<212> PRT
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<400> 8
Thr Ile Ser Ala Ala Val Cys Ala Gly Val
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Ala Leu Gly Pro Gly Thr Ala Leu Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Ala Ile Leu Ala Leu Leu Pro Ala Leu
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ala Leu Leu Met Ala Gly Leu Ala Leu
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Leu Leu Cys Thr Ser Cys Leu Ala Gly Val
1 5 10
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Leu Leu His Gly Thr Ala Ser Ala Val
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Val Leu Ala Gly Gly Pro Pro Leu Leu
1 5
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Leu Leu Gly Gly Ala Gly Val Ala Thr Ile
1 5 10
<210> 16
<211> 198
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Thr Leu Met Ser Ala Met Thr Ala Leu Ala Ala Leu Pro Pro Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ile Ser Ile Thr Ala Pro Ile Leu Leu Thr Gly Pro Ile Pro Val
20 25 30
His Thr Val Ser Leu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Thr Leu Pro Pro Ala
35 40 45
Ala Cys Pro Ala Pro Gly Gly Leu Leu Ser Gly Thr Leu Gly Ser Gly
50 55 60
Gly Pro Leu Leu Ala Leu His Pro Thr Leu Ser Pro Leu Ala Thr Leu
65 70 75 80
Ser Ser Leu Ser Gly Pro Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ile Thr Ser
85 90 95
Leu Val Thr Ala Pro Leu Thr Cys Gly Ser Val His Ala Pro Thr Leu
100 105 110
Pro Ser Thr Ala Thr Gly Ala Ala Met Ile Leu Leu Leu Gly Leu Ser
115 120 125
Gly Leu Ser Leu Leu Ser Leu Thr Gly Ile His Leu Gly Leu Gly Leu
130 135 140
Ser Ala Leu Gly Gly Gly Val Leu Val Ala Gly Ile Leu Leu Ala Met
145 150 155 160
Leu Leu Ala Thr Gly Pro Gly Leu Thr Leu Leu Leu Val Met Thr Ser
165 170 175
Ala His Ala Thr Thr Val Ser Gly Leu Gly Met Ala Leu Ala Val Thr
180 185 190
Ala Gly Leu Leu Leu Leu
195
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
His Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Cys Val Ala Leu His Ile Ile Ser
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Ala Ala Val Cys Ala Gly Val Ala Ala Thr
20 25
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<211> 65
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Leu Leu Cys Thr Ser Cys Leu Ala Gly Val Ser Ala Gly Ala Cys Leu
1 5 10 15
Gly Val Gly Ala Cys Thr Gly Leu Gly Gly Gly Cys Thr Thr Ala Ala
20 25 30
Ile Ala Ala Val Gly Leu Leu Thr Val Ile Ser Leu Gly Cys Ser Leu
35 40 45
Ala Cys Val Ala Ala Ser Gly Ala Thr Thr Val Gly Leu Leu Ala Ile
50 55 60
Gly
65
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Leu Leu His Gly Thr Ala Ser Ala Val Ala Thr Ala Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Thr Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Pro Pro Leu Leu
20 25 30
<210> 20
<211> 4833
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gactcttcgc gatgtacggg ccagatatac gcgttgacat tgattattga ctagttatta 60
atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 120
acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 180
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ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 300
ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 360
atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 420
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tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 540
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tttgtctata tgtgattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa 900
cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg 960
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ccaatgcata tggcacccgc ccgctcgccc agccccagca cgcagccctg ggagcatgtg 1440
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aagaaccgga ccatctttga tatcactaat aacctctcca ttgtgatcct ggctctgcgc 2040
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tttccagagc ctcacctctc ctggttggaa aatggagaag aattaaatgc catcaacaca 2280
acagtttccc aagatcctga aactgagctc tatgctgtta gcagcaaact ggatttcaat 2340
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taaacccgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 2700
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tctatggctt ctactgggcg gttttatgga cagcaagcga accggaattg ccagctgggg 2940
cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg gatggctttc tcgccgccaa 3000
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aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg cgttccttgc gcagctgtgc 3300
tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt gggcgaagtg ccggggcagg 3360
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tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg cgaatgggct gaccgcttcc 3780
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ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc 4020
ctgataaatg cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 4080
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ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 4200
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 4260
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gggcttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctt 4833
<210> 21
<211> 10913
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atggcggatg tgtgacatac acgacgccaa aagattttgt tccagctcct gccacctccg 60
ctacgcgaga gattaaccac ccacgatggc cgccaaagtg catgttgata ttgaggctga 120
cagcccattc atcaagtctt tgcagaaggc atttccgtcg ttcgaggtgg agtcattgca 180
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taccttttgc ctgcatacag acgtcacgtg tcgtacggca gccgaagtgg ccgtatacca 540
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catcccgagc ctatggtcta caggcctcgc aatcccagtc agatcacgca ttaagatgct 1500
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tattaagagc ctcgtgacca aacacgatct ggtcaccagc ggcaagaagg agaactgcca 2340
ggaaatagtt aacgacgtga agaagcaccg cgggaagggg acaagtaggg aaaacagtga 2400
ctccatcctg ctaaacgggt gtcgtcgtgc cgtggacatc ctatatgtgg acgaggcttt 2460
cgctagccat tccggtactc tgctggccct aattgctctt gttaaacctc ggagcaaagt 2520
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ttctgccccg aaggtgtccc tgtattacga gaacaaccac tgggataaca gacctggtgg 3360
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ttctgtgctg gacaatgtaa ttcctatcaa ccgcaggctg ccgcacgccc tggtggctga 3540
gtacaagacg gttaaaggca gtagggttga gtggctggtc aataaagtaa gagggtacca 3600
cgtcctgctg gtgagtgagt acaacctggc tttgcctcga cgcagggtca cttggttgtc 3660
accgctgaat gtcacaggcg ccgataggtg ctacgaccta agtttaggac tgccggctga 3720
cgccggcagg ttcgacttgg tctttgtgaa cattcacacg gaattcagaa tccaccacta 3780
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agtggcgtcg taccagataa cagatgaata cgacgcatac ttggacatgg ttgacgggtc 6000
ggatagttgc ttggacagag cgacattctg cccggcgaag ctccggtgct acccgaaaca 6060
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acagaacgtg ctagcggccg ccaccaagag aaactgcaac gtcacgcaaa tgcgagaact 6180
acccaccatg gactcggcag tgttcaacgt ggagtgcttc aagcgctatg cctgctccgg 6240
agaatattgg gaagaatatg ctaaacaacc tatccggata accactgaga acatcactac 6300
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ggagccattg gcgaccgctt acctgtgcgg catccacagg gaattagtaa ggagactaaa 6540
tgctgtgtta cgccctaacg tgcacacatt gtttgatatg tcggccgaag actttgacgc 6600
gatcatcgcc tctcacttcc acccaggaga cccggttcta gagacggaca ttgcatcatt 6660
cgacaaaagc caggacgact ccttggctct tacaggttta atgatcctcg aagatctagg 6720
ggtggatcag tacctgctgg acttgatcga ggcagccttt ggggaaatat ccagctgtca 6780
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cgctgtcatg ggcgaaaaac ccccatattt ttgtggggga ttcatagttt ttgacagcgt 7080
cacacagacc gcctgccgtg tttcagaccc acttaagcgc ctgttcaagt tgggtaagcc 7140
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acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 10620
ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 10680
gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 10740
gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 10800
tacggtggga ggtctatata agcagagctc tctggctaac tagagaaccc actgcttaac 10860
tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccg gaagcttgaa ttc 10913
机译: “前列腺和前列腺癌干细胞,分离前列腺干细胞和选择前列腺癌患者的方法以及抑制前列腺干细胞增殖的方法,以预防前列腺癌复发,治疗前列腺癌,提供佐剂治疗,以促进前列腺组织的生长或修复,促进前列腺的生长,功能性前列腺的输送,以及选择一种化合物
机译: ccr5拮抗剂,用于确定患有前列腺癌的人是否患有转移瘤或处于转移危险中的方法,以鉴定ccr5拮抗剂,用于确定患有前列腺癌的人的个体患有转移瘤或处于转移危险中的方法,以鉴定一种候选化合物,用于产生体外原代上皮细胞,诊断前列腺癌,为患有前列腺癌/肿瘤,细胞系和动物模型的个体选择治疗方法
机译: 诊断和监测前列腺癌个体或体外使用的至少一种含有转录因子的前列腺癌生物体的前列腺癌的诊断或监测方法