一种AGC1抑制剂在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用

摘要

本发明涉及一种AGC1抑制剂在制备治疗慢性心力衰竭的药物中的应用，通过调节线粒体分裂关键蛋白Drp1途径抑制线粒体过度分裂，进而调控线粒体动态改变过程，并最终介导了慢性心力衰竭心肌细胞功能和结构。与现有技术相比，本发明将AGC1抑制剂应用在治疗CHF的药物制备中，同时检测鉴定CHF患者血清AGC1水平用于诊断目的，帮助预测CHF患者远期心脏事件及预后，在临床上有巨大的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及药学领域，尤其是涉及一种AGC1抑制剂在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用。

背景技术

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是由于心脏的结构或/和功能异常所导致心室收缩或/和舒张功能受损的一组复杂临床综合征，为各种严重心脏疾病的终末阶段，也是导致患者死亡的最主要原因。多年来各国学者在治疗CHF领域进行了不懈探索，取得了一些进展，但总体疗效依然不尽人意、未见根本性改观，治疗手段仍然有限、患者预后还是较差。CHF发病机制较为复杂，多由高血压病、糖尿病等系统性疾病和扩张型心肌病、肥厚型心肌病、线粒体心肌病等心脏肌肉疾病引发。目前针对CHF的治疗策略主要基于抑制神经体液机制，具体治疗方案主要包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂、β受体拮抗剂、醛固酮受体拮抗剂、正性肌力药物、利尿剂和机械辅助装置等。尽管如此,多数患者的病情仍是继续进展。除心脏移植外，目前尚未发现有可以完全治愈的方法。据不完全统计，我国目前CHF患者大约有1000万，每位患者平均每年住院2.4次，半数以上患者会在1年内再次入院，给社会带来了沉重的经济负担。因此，研究CHF的发生发展机制，发现参与CHF特异性因子及信号转导通路，探索针对这些新治疗靶点的药物具有重要的理论与实践意义。

尽管不同原发病引起CHF的机制存在差异，但心肌代谢异常、能量利用障碍是它们共同的机制途径。而线粒体的主要功能是调节能量代谢、氧自由基、维持钙的稳态和介导细胞凋亡，线粒体通过不断融合与分裂动态过程维系着细胞生理功能，但过度融合或过度分裂均破坏线粒体质量控制平衡机制，影响细胞能量代谢和功能。有研究发现CHF患者心肌细胞存在线粒体过度分裂现象、主要控制线粒体分裂的动力相关蛋白1(dynamin relatedprotein 1，Drp1)明显上调；在CHF动物模型中，应用药物干预下调Drp1表达能明显改善心功能。目前常用的药物为Mdivi-1，Mdivi-1是Drp1的一种特异性抑制剂，是喹唑酮衍生物，其可以通过阻断Drp1在线粒体外膜的成环来抑制其GTP酶活性，可以快速的、可逆地影响线粒体分裂状态，常作为Drp1抑制剂应用于实验研究当中。但是Mdivi-1还存在一些缺点，包括细胞毒性、抑制细胞增殖以及致心律失常的风险。细胞毒性作用不依赖于Drp1，而是通过激活Noxa介导的细胞凋亡起作用；其抑制细胞增殖，可以通过诱导G2/M细胞周期阻滞对增殖细胞有丝分裂产生抑制作用，此外，一些研究证实，Mdivi-1可以抑制钾离子通道，使得动作电位的时限延长以及增加放电频率，从而诱发心律失常，因此，Mdivi-1转化到临床应用实践之中还需要很长的时间。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种AGC1抑制剂在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种AGC1抑制剂在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用。

所述的AGC1抑制剂为钙离子依赖性线粒体内膜蛋白抑制剂。

所述的AGC1抑制剂在制备治疗由线粒体异常动态改变所介导的慢性心力衰竭的药物中的应用，所述线粒体异常动态改变是线粒体分裂关键蛋白Drp1上调引起，所述AGC1抑制剂为干预下调Drp1表达的物质。

所述的AGC1抑制剂为通过调节线粒体分裂关键蛋白Drp1途径抑制线粒体过度分裂，进而调控线粒体动态改变过程，并最终介导了慢性心力衰竭心肌细胞功能和结构的抑制剂。所述的AGC1抑制剂为能够使AGC1蛋白活性降低或者丧失，或下调AGC1表达水平或抑制其活性的物质，包括拮抗剂、下调剂、阻滞剂或阻断剂。

所述的慢性心力衰竭包括先天性心脏病、冠心病、急性心肌梗死、风心病、高血压、心律失常、各种病因导致的心肌炎、心肌病导致的慢性心力衰竭。

一种AGC1在制备对慢性心力衰竭进行诊断、治疗和/或预后评估的试剂或试剂盒中的应用。

通过检测患者离体血清中AGC1水平，预测CHF患者远期心脏事件及预后。

通过免疫印迹方法检测患者离体血清中AGC1和Drp1的表达量，预测CHF患者远期心脏事件及预后。

本发明还提供定量检测AGC1含量或表达水平的试剂在制备慢性心力衰竭检测和/或预后评估试剂中的应用。

定量检测AGC1含量或表达水平的试剂能够检测患者离体血清中AGC1水平。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明通过应用蛋白质组学和免疫共沉淀法证实Drp1和天冬氨酸/谷氨酸载体1(aspartate glutamate carrier 1，AGC1)之间存在相互作用。AGC1为钙离子依赖性线粒体内膜蛋白，既参与天冬氨酸与谷氨酸在线粒体内膜上的交换、为胞质提供天冬氨酸；又调控细胞内第二信使钙离子浓度。研究发现在多种肿瘤组织中均有AGC1表达上调现象，而通过措施下调AGC1后就可以阻断胞质中天冬氨酸的合成、继而降低核酸生物合成，最终抑制肿瘤细胞增殖、同时增加肿瘤细胞凋亡，从而发挥抑制肿瘤生长的有益作用。此外，AGC1对钙离子信号的调控也有着重要作用，钙离子是细胞内重要的第二信使，胞浆内游离钙离子浓度异常升高可诱发线粒体功能障碍等一系列病理生理过程。钙循环障碍亦被公认为是CHF的重要机制之一。AGC1作为钙离子依赖性线粒体内膜蛋白，所以本发明将AGC1抑制剂应用在治疗CHF的药物制备中，同时检测鉴定CHF患者血清AGC1水平用于诊断目的，帮助预测CHF患者远期心脏事件及预后。

2.本发明通过免疫印迹方法检测在CHF患者心肌组织中Drp1和AGC1的表达量，证实当AGC1表达增加时，Drp1表达也增加，心脏功能受损增加，通过AGC1抑制剂，抑制AGC1的表达量，调节线粒体分裂关键蛋白Drp1途径抑制线粒体过度分裂，进而调控线粒体动态改变过程，并最终介导了CHF心肌细胞功能和结构，对慢性心力衰竭有良好的治疗效果。

3.与现有药物相比，本发明采用的AGC1是苹果酸/天冬氨酸NADH穿梭途径中一种重要的转运载体蛋白，每个谷氨酸携带一个质子通过AGC1由线粒体进入胞质并与线粒体基质中的天冬氨酸进行转换，AGC1对ATP的可持续供给起关键性作用。既往研究已经明确AGC1为钙离子依赖性线粒体内膜蛋白，胞内游离钙浓度异常升高所致细胞内钙超载是心肌细胞从可逆性到不可逆损伤的关键因素。在CHF中存在明显的钙超载现象。因此，AGC1可以从抑制Drp1表达以及调节钙离子两个方面治疗CHF。

附图说明

图1A为CHF患者心肌组织中Drp1和AGC1表达量检测图；

图1B为Drp1与AGC1直接关系图；

图2A为NC小鼠代表性心脏彩超图；

图2B为心肌特异性过表达AGC1小鼠代表性心脏彩超图；

图2C为OE-AGC1+Drp1-/-小鼠代表性心脏彩超图；

图2D为Drp1-/-小鼠代表性心脏彩超图；

图2E为Western Blot法测定NC、OE-AGC1、OE-AGC1+Drp1-/-、Drp1-/-4组小鼠心脏组织的Drp1、AGC1表达图；

图3为H9c2细胞KO-AGC1组和对照组中Drp1、Ser616 Drp1的表达图；

图4A为JC-1荧光探针检测各组MMP水平图；

图4B为各组线粒体形态图；

图4C为DHE荧光探针检测各组ROS水平图；

图4D为各组ATP含量图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

本发明涉及的小动物心脏超声检测、透射电镜、免疫荧光以及ATP含量检测等方法均是已经被证实成熟且被广泛应用可靠的方法。

实施例

一、CHF患者心肌组织中Drp1和AGC1表达量关系

1)免疫印迹方法检测

实验开始前，准备相关试剂：

5×电泳液缓冲液

Tris-Base 15.1g

甘氨酸 94g

10％SDS 5g

DD水1000ml

湿转液

Tris-Base 3.03g

甘氨酸 14.4g

甲醇 200ml

DD水800ml

1.1按制胶试剂盒上说明配制12％SDS聚丙烯酰胺凝胶。

1.2电泳：用双蒸水把5×电泳液缓冲液稀释成1×电泳液。使用60V恒压电压进行浓缩胶电泳30min，待各样品均压到一个水平线上，改用90V恒压电压区别分离胶一直到电泳结束。

1.3转膜：将剪好的尺寸大小合适的PVDF膜置于放有甲醇的药碗中，浸泡5min进行激活，后转入放有双蒸水的药碗中洗1min。将电泳结束的胶拆下放入转膜液中。然后按照海绵垫-3层滤纸-胶-PVDF膜-3层滤纸组装，按照胶对于负极，膜对应正极的方向装入转膜槽，将转膜槽置于冰盒中，上方压上冰袋，以保持低温转膜。调节为恒流转膜200mA、时间2h。

1.4封闭：转膜结束后，将PVDF膜取出，放入5％BSA-TBST中室温摇床封闭1h。

1.5按照说明书使用3％BSA-TBST配制相应的一抗稀释液(1:1000)，按照不同分子量将PVDF膜进行裁剪，加入相应的一抗孵育，4度摇床过夜。

1.6结束一抗孵育后，使用TBST洗膜3次，每次10min。

1.7加入使用TBST稀释好的二抗(1:2000)以及HRP标记的内参抗体，孵育2h。

1.8结束二抗孵育后，使用TBST洗膜3次，每次10min。

1.9避光配制显影液进行显影，使用Bio-Rad Laboratories化学发光成像系统。

1.10显影结束使用Quantity One软件进行定量分析。

2)CO-IP实验

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)原理简述如下：如果用蛋白质A的抗体对细胞裂解液免疫沉淀蛋白A，那么与A结合的蛋白质B同样也可以被沉淀下来，再用经过处理可以结合抗体的beads将复合体沉淀下来。这种方法常用于检测两种目标蛋白质是否在体内结合。

步骤：

(1)根据实验目的处理细胞。

(2)吸弃培液，预冷PBS轻轻冲洗培养皿2次，加500μl/10cm皿裂解液(事先加入PMSF+PIC)。

(3)冰上裂解10min，4℃离心，12000rpm/min，10min。吸取上清至新的EP管并标记。

(4)BCA法测蛋白浓度并制样800μg(内源性1200ug)。

(5)取出样品，根据不同处理和实验目的加抗体，比如HA抗体，Flag抗体或Bach1抗体。4℃摇床4-6h。

(6)向每管样品中加30μl Beads，4℃摇床过夜，充分混匀。

(7)把混匀的样品从4℃取出，3000rpm/min，2min，吸上清至新的1.5EP管中，保留沉淀。

(8)加1ml预冷PBS重悬Beads，再离心，吸弃上清，保留沉淀。重复此步骤5次。

(9)向沉淀下来的Beads加30μl 2×SDS Loading Buffer，100℃金属浴煮10min。12000rpm/min10 min离心，用微量上样针把上清转移至新的1.5ml EP管，进行SDS-PAGE电泳。

(10)后续步骤同Western blot(方法见实施1)。

3)CHF患者心肌组织中Drp1和AGC1表达量明显升高

通过免疫印迹方法检测到Drp1和AGC1的表达量在扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy,DCM)患者(DCM为CHF中常见的一种类型)心肌组织中明显升高(见图1A)，进一步验证Drp1与AGC1的作用关系，随后进行了CO-IP实验证明了Drp1与AGC1有直接关系(见图1B)。

二、原位注射法构建心脏特异性过表达AGC1模式小鼠

1)心脏特异性敲除Drp1模式小鼠的心脏功能检测

采用现有心脏特异性敲除Drp1模式小鼠。

小鼠心脏彩超：使用30MHz高频探头进行检测，步骤如下：

1.1将实验小鼠左前胸部脱毛后，放入1％异氟烷麻醉诱导箱，待实验动物进入麻醉状后取出固定于超声操作板上并改为面罩麻醉，同时观察小鼠呼吸状态，维持心率在450-550次/分。

1.2将适量超声胶涂抹于小鼠心前区，使用心超探头采集数据。

1.3采集胸骨旁左室长轴切面。在二尖瓣腱索处行M-Mode检测。

1.4按照标准通过软件测量指标：左室射血分数(left ventricular ejectionfraction，LVEF)、左室舒张末内径(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收缩末内径(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、收缩期室间隔厚度(interventricular septum systolic，IVSs)、左室舒张期后壁厚度(left ventricularposterior wall in the diastolic，LVPWd)和左室收缩期后壁厚度(left ventricularposterior wall in the systolic，LVPWs)。

2)免疫印迹方法检测同实施1

原位注射法构建心脏特异性过表达AGC1模式小鼠

本发明构建了心肌特异性过表达(over expression，OE)AGC1的腺相关病毒，通过原位注射法给小鼠心肌点注射AGC1病毒,并通过Western Blot验证了AGC1的过表达，同时发现当AGC1表达增加时，Drp1表达也增加(图2E)。此外，注射AGC1病毒4周后小鼠心脏心腔扩大、心脏功能明显受损(图2B)。以此为基础，给他莫昔芬诱导型DRP1条件敲除小鼠注射OE-AGC1病毒4周后行心脏彩超检测，发现小鼠心功能得到明显改善(见图2C)。因此，可推测AGC1作为上游靶点，通过正调控Drp1的表达影响线粒体动力学，损伤心功能。

三、敲低(knock out,KO)-AGC1的腺病毒感染H9C2

1.1待H9C2细胞(大鼠心肌细胞，购自中国科学院细胞库)密度长至80％时，将病毒混合液加入孔板中。

1.2每天换液。

1.3腺病毒感染48小时后收取细胞用于下一步实验。

敲低(knock out,KO)-AGC1的腺病毒，在KO-AGC1组中，Drp1的蛋白表达降低，特别是Ser616 Drp1的表达(见图3)。

基于以上实验结果，证明苹果酸/天冬氨酸穿梭系统重要载AGC1通过调节线粒体分裂关键蛋白Drp1途径抑制线粒体过度分裂，进而调控线粒体动态改变过程，并最终介导了CHF心肌细胞功能和结构。

四、线粒体膜电位检测

1.1吸弃培液，预冷PBS轻轻冲洗培养皿2次，加入1ml细胞培养液。

1.2加入1ml JC-1染色工作液，充分混匀。细胞培养箱中37℃孵育20分钟。

1.3在孵育期间，按照每1ml JC-1染色缓冲液(5X)加入4ml蒸馏水的比例，配制适量的JC-1染色缓冲液(1X)，并放置于冰浴。

1.4 37℃孵育结束后，吸除上清，用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤2次。

1.5加入2ml细胞培养液。

1.6激光共聚焦显微镜下观察。

超氧化物阴离子检测

1.1吸弃培液，预冷PBS轻轻冲洗培养皿2次。

1.2加入5μM的Dihydroethidium染色工作液，和细胞一起在37℃孵育30分钟左右进行荧光探针装载。

1.3适当洗涤后激光共聚焦显微镜下观察。

(3)ATP含量检测

1.1吸除培养液，6孔板每孔加入200微升裂解液裂解细胞，使用移液器进行反复吹打或晃动培养板使裂解液充分接触并裂解细胞。

1.2将裂解液在4℃12000g离心30分钟，将上清转移到新的EP管中，置于冰上备用。

1.3冰上溶解待测试剂后，使用ATP检测裂解液将ATP标准溶液稀释到0.01μmol/L、0.03μmol/L、0.1μmol/L、0.3μmol/L、1μmol/L、3μmol/L和10μmol/L。

1.4取96孔板，每孔加入100μl检测工作液，室温放置5分钟，消耗掉本底性ATP。在检测和标准孔里各加20μl标本或标准品，迅速用微量移液枪混匀。

1.5间隔2秒后，使用luminometer检测，同时使用BCA方法测量蛋白浓度。

1.6根据标准曲线计算出ATP的含量，然后与蛋白含量相比，转换成noml/μg。

(3)Mitochondrion染色

1.1弃培养液，预热的Hanks Buffer(含钙镁)/培养基/PBS洗1次；

1.2加染色液(150nm)，37℃-30min(用培养基配置后，37℃预热)；

1.3弃染液，用预热的Hanks Buffer(含钙镁)/培养基/PBS洗3次(3-5min)；

1.4甲醇固定5min；

1.5PBS洗3次(3-5min)；

1.6DAPI(1:5000碧云天)染色5min；

1.7PBS洗3次(3-5min)；

1.8 50％甘油封片。

阿霉素(Doxorubicin，Dox)是一种在临床上广泛应用的广谱抗癌药物，属于蒽环类药物的一种。Dox能有效治疗多种类型肿瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺癌等。Dox剂量相关性的毒性反应会导致造血系统抑制、恶心呕吐、脱发等。但最严重并发症与心脏相关，会引起心肌病、心包炎乃至心衰或者死亡。由Dox引起的扩张型心肌病在临床上大概有10-20％的发生率。因此，基础研究中常利用Dox的心脏毒性作用制作扩张型心肌病动物模型。本发明应用Dox处理相关细胞，通过JC-1荧光探针染色后，使用荧光显微镜观察线粒体膜电位变化(mitochondrial membrane potential，MMP)，JC-1荧光滤片上观察为红色染料聚集明显，是膜电位正常时的荧光图像；与正常对照组(control，Ctrl)组比较，Dox组明显表现为红色荧光下仅有极少量染料聚集呈现亮红色，反映膜电位明显下降；而以线粒体分裂抑制剂Mdivi-1作为阳性对照药，Dox+Mdivi-1组以及Dox+AGC1-KO组荧光图像差异不明显，反映膜电位下降少于Dox组(见图4A)。

正常对照组线粒体呈有规律的网状排列；Dox组干预条件下线粒体表现为颗粒状并且有集中趋势；而AGC1-KO组和Dox+Mdivi-1组线粒体形态呈线状分布的线粒体增多、线粒体碎片减少(图4B)。Dox处理的细胞通过DHE荧光探针染色后，使用荧光显微镜观察可以看到明显的ROS产生；而AGC1-KO组以及Mdivi-1药物预处理后的H9c2细胞中ROS水平有所下降(图4C)。线粒体是ATP的主要合成场所，分析得出Dox组产生ATP含量明显减少，而Dox+Mdivi-1及Dox+AGC1-KO组ATP含量有所增加，两组间比较具有明显统计学差异(图4D)。

本发明AGC1抑制剂，包括拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要是能够使AGC1蛋白活性降低或者丧失，或下调AGC1表达水平或抑制其活性。