聚集诱导发光分子—噬菌体生物偶联物

摘要

本发明涉及聚集诱导发光分子—噬菌体生物偶联物、包含它的药物组合物，以及它们的制备和使用方法，所述生物偶联物包含经由任选的接头共价键合到至少一种聚集诱导发光分子的噬菌体。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年1月24日提交的美国临时专利申请号62/995,297的优先权，该美国临时专利申请以引用方式整体并入本文中。

技术领域

本公开一般涉及可将荧光监测、选择性细菌靶向和基于聚集诱导发光(AIE)的光动力学疗法整合在一起针对细菌的聚集诱导发光(AIE)分子—噬菌体生物偶联物，以及这些材料作为体外和体内抗细菌剂的用途。

背景技术

病原性细菌引起的感染性疾病已成为全球面临的最大挑战之一，严重威胁着人类的健康和文明的发展。越来越多的证据表明，病原性细菌还可间接地促进其他多种恶性疾病(诸如癌症)的发生和发展。另一方面，细菌菌落稳态对人体健康来说是不可或缺的，诸如健康的肠道菌群对于食物消化和营养吸收便是不可或缺的，应当免受抗生素的危害并始终受到保护。因此，抗细菌药物的研发一直着眼于追求靶向性和杀灭效率等方面的进步。其中自从发现青霉素以来，廉价的抗生素便成为治疗细菌感染的主流药物。然而，使用抗生素，即使是窄谱抗生素，都可以同时杀灭有害细菌和有益微生物，从而导致诸如腹泻、便秘和肠道发炎等副作用。全球性的抗生素滥用和过度使用导致了病原菌的不断进化并加剧了细菌耐药性的产生。随着新型抗生素的研发难度和生产成本的不断提高，细菌耐药性的状况正在不断恶化。因此，开发具有精准靶向性的抗菌药物来杀灭特定种类的有害病原菌便成为迟滞细菌耐药性产生的有效方式。其中，具有抗菌功能的天然噬菌体已被验证对它们的宿主细菌具有特殊的靶向性，并且其可同步进化以适应细菌感染及其耐药性的产生。因此，在抗生素被发现之前便普遍使用的噬菌体疗法，正经历一场由抗生素耐药性危机所推动的复兴。然而，单独的噬菌体通常显示出有限的抗菌疗效，阻碍了对感染性疾病、尤其是急性感染的治疗。同时由于缺乏成像功能，不能对其与靶标病原菌之间的识别、结合和抗菌途径在内的治疗过程进行实时监测，从而难以对噬菌体疗法进行即时评价。因此，引入具有灵敏探测功能的成像“雷达”，将促进噬菌体疗法这一强大的靶向性“武器”进化到更高级的阶段，即既能可视化跟踪观测其感染过程，又能同时靶向性地消灭有害病原菌。

荧光成像技术以其高灵敏度、低成本、快速响应等优点，已成为用于生物靶标物可视化分析检测的快速、简便和有力工具。超越具有严重光漂白和有限信噪比的传统有机荧光染料，新型的具有聚集诱导发光特性的发光分子(luminogen)(AIEgen)已成为极具潜力的高级生物传感和成像应用的候选物。AIEgen在溶液中表现出微弱的发光，但经由分子内运动的限制，在聚集态时发光得到显著的增强。其极低的背景噪声和超强的光稳定性等优势以及点亮(light-up)型发光方式使AIEgen广泛应用于动态生物学过程监测和长时程生物成像等领域。此外，通过智能分子设计，基于AIE的材料在治疗恶性肿瘤和杀伤病原菌方面展示出优异的光动力学活性。然而，对于特定种类有害病原菌的精准靶向区分尚未被AIEgen证实，使得它们不适于精确地杀灭特定种类的靶细菌。尽管生物正交法尝试应用于细菌的靶向标记，但将外源性反应基团向细菌中进行输送的策略不适合于大规模的生产应用。这些局限性促使我们设计具有精准靶向性的AIEgen，以实现对特定种类细菌的识别，成像和杀灭。

发明内容

本文提供AIE—噬菌体生物偶联物，其将一种或多种AIEgen与噬菌体共价偶合以形成一类新的抗微生物生物偶联物(示例为TVP-PAP)，用于特定种类细菌的成像和杀灭。选择能够靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的噬菌体作为原型。示例性的AIE分子(TVP-S)被设计成具有优异的荧光性质和高效的光动力学杀伤(PDI)活性。通过简单的氨基—羧基反应，AIEgen可直接共价键合到噬菌体的表面。所生成的TVP-PAP有效地保留了AIEgen和噬菌体两者原有的性质，可以实时监测噬菌体—细菌相互作用和对细菌进行靶向识别的功能。此外，通过整合AIEgen的PDI活性和噬菌体本身的对宿主细菌的感染能力，相比于生物偶联物中的两个单独个体抗菌功效相加之后的效果，发光分子—噬菌体生物偶联物实现了效率更高的协同抗菌作用。在由野生型铜绿假单胞菌和多药耐药型(MDR)铜绿假单胞菌两者引起的动物感染性伤口的治疗中，也证实了生物偶联物的优异抗细菌性能。

在第一方面，本文提供一种聚集诱导发光(AIE)分子—噬菌体生物偶联物，其包含经由任选的接头共价键合到至少一种聚集诱导发光分子(AIEgen)的噬菌体。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen是光敏剂。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式1：

或为其药学上可接受的盐，其中

Ar

X是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或共价键；

Y是任选取代的杂芳基或共价键；并且

R

其中m是选自1-4的整数；

R

R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且

Z是药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头共价键合到Ar

在某些实施方案中，Ar

在某些实施方案中，其中所述至少一种AIEgen具有式2：

或为其药学上可接受的盐，其中

p和t中的每一个均独立地为选自1-5的整数；

u是选自1-4的整数；

R

其中m是选自1-4的整数；

R

R

R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；

R

其中w在每种情况下均独立地选自1-5的整数；并且

R

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R、R

在某些实施方案中，m、p、t、u和w的每一个独立地为1或2。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式3：

或为其药学上可接受的盐，其中

R

R

R

其中R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R

在某些实施方案中，所述任选的接头由下式表示：*-(CR

在某些实施方案中，所述任选的接头由下式表示：*-(CH

在某些实施方案中，所述任选的接头由下式表示：*-(CR

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式4：

或为其药学上可接受的盐，其中

R

R

R

其中R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。

在某些实施方案中，生物偶联物包含1,000-20,000个所述至少一种AIEgen。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen和接头是选自由以下组成的组的部分：

或其药学上可接受的盐，其中

n是选自0-4的整数；

R

R

其中R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen和接头由以下表示：

或为其药学上可接受的盐，其中Z是药学上可接受的阴离子；并且

在某些实施方案中，噬菌体是丝状噬菌体或二十面体噬菌体。

在某些实施方案中，噬菌体是肠杆菌噬菌体P7(PAP)。

在第二方面，本文提供一种药物组合物，其包含本文所述的生物偶联物和至少一种药学上可接受的辅料。

在第三方面，本文提供一种式5化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

n是选自1-10的整数；

LG是离去基团；

R

R

其中R

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。

在第四方面，本文提供一种制备生物偶联物的方法，所述方法包括：使式5化合物或其药学上可接受的盐与噬菌体接触，由此形成所述生物偶联物：

其中

n是选自1-10的整数；

LG是离去基团；

R

R

其中R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。

在第五方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的生物偶联物，以及在氧存在下用可见光照射所述细菌感染的部位。

在第六方面，本文提供一种使细菌标记和成像的方法，所述方法包括使本文所述的生物偶联物与所述细菌接触；用可见光照射所述细菌；以及检测来自所述生物偶联物的荧光发光。

附图说明

附图包含某些实施方案的图，以进一步说明和阐明本公开的上述和其他方面、优点和特征，其中相同的附图标记是指相同或功能相似的元件。应当了解，这些附图描绘了本发明的示例性实施方案，因此并不旨在限制其范围。将通过使用附图以附加的特性和细节来描述和解释本发明。

图1描绘TVP-S的示例性合成。

图2描绘(a)AIEgen(TVP-S)的分子结构。(b)分别溶解于水、DMSO和氯仿中的TVP-S的归一化UV–vis谱。(c)具有不同体积分数的在DMSO和CHCl

图3是分别溶解于(a)水、(b)DMSO和(c)氯仿中的TVP-S的DLS测量。

图4描绘总ROS生成的化学捕获。含TVP-S的DCFH(a)、玫瑰红(Rose Bengal)(b)和DCFH对照(c)的光活化。在1×PBS缓冲液中在白光辐照下进行这些测量。(d)在白光照射下的DCFH在524nm处荧光强度指示的活化速率。

图5描绘

图6描绘经由监测含TVP-S的ABDA的光降解确定的被不同浓度的NaN

图7描绘OH

图8描绘O2

图9描绘TVP-S的三重态和单态氧发射测量。(a)77K下延迟1ms后的荧光和磷光发射谱。内部图片在365nm紫外光分别开启和关闭后拍摄。(b)650nm处发射光谱的衰变时间，计算寿命为31.3μs。

图10描绘以下的水溶液的UV–vis谱：(a)TVP-PAP(9.375×10

图11描绘生物偶联物所生成的总ROS的化学捕获。含TVP-PAP的DCFH(a)、DCFH对照(b)和无DCFH指示剂的TVP-S(c)的光活化。在1×PBS缓冲液中在白光照射下进行这些测量。(d)在不同条件下，在光照射下在524nm处荧光强度所指示的DCFH的活化速率。

图12描绘与TVP-PAP培育30min的铜绿假单胞菌的荧光成像。所有比例尺均为10μm。在488nm处激发TVP-PAP，并在580-680nm处收集发射。

图13描绘与核染料(Hoechst 33342)、膜染料(DiO)和TVP-PAP(AIEgen标记)共培育的铜绿假单胞菌的荧光成像。Hoechst 33342、DiO和TVP-PAP的激发分别为350/50、480/40和546/10nm；并且分别在460/50、527/30和585/40nm处收集发射。所有比例尺均为10μm。

图14描绘通过与TVP-PAP培育的鲍曼不动杆菌(A.baumanni)的荧光成像对TVP-PAP的特异性测试。使用具有蓝色荧光的Hoechst 33342对鲍曼不动杆菌的核进行染色。Hoechst：激发：350/50nm，发射：460/50nm；AIEgen：激发：546/10nm，发射：585/40nm。

图15描绘通过与TVP-PAP培育的金黄色葡萄球菌的荧光成像对TVP-PAP的特异性测试。使用具有蓝色荧光的Hoechst 33342对金黄色葡萄球菌的核进行染色。Hoechst：激发：405nm，发射：420-470nm；AIEgen：激发：488nm，发射：550-680nm。

图16描绘经由在黑暗下与铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌共培育对TVP-PAP的特异性测试。箭头指示未被标记红色荧光染色的鲍曼不动杆菌。

图17描绘(a)在用TVP-PAP处理后的铜绿假单胞菌的细菌存活率。将细菌与TVP-PAP在黑暗中培育0(I-0)、10(I-10)和30(I-30)min，然后通过白光照射将细菌悬浮液分别处理2(L-2)、10(L-10)、30(L-30)和60(L-60)min。(b)基于CFU计数测定的对铜绿假单胞菌的细菌杀灭作用。对照组不添加TVP-PAP或没有白光照射。

图18描绘基于CFU计数测定的TVP-PAP分别对(a)野生型铜绿假单胞菌和(b)MDR型铜绿假单胞菌的细菌杀灭作用。

图19描绘抗细菌评价。(a)野生型(左)和MDR型铜绿假单胞菌(右)在各种处理后的存活率。(b)与TVP-PAP一起培育的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌，(c)与TVP-PAP一起培育的相同浓度的铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。(b)和(c)中的内部图片是有I-30和L-30处理的相应CFU计数测定。箭头指示经由另一36h培育的菌落形态和菌落颜色鉴定的铜绿假单胞菌(I：培育；L：光照)。

图20描绘各种处理顺序后的细菌存活率。

图21描绘TVP-PAP感染铜绿假单胞菌和PDI作用的实时监测。首先将细菌与TVP-PAP共培育30min，然后在白光下再照射50min。

图22描绘TVP-PAP感染MDR铜绿假单胞菌和PDI作用的实时监测。首先将细菌与TVP-PAP共培育30min，然后在白光下再照射50min。

图23描绘细菌杀灭作用的扫描电子显微术(SEM)图像。(a)无任何处理的铜绿假单胞菌。(b)与TVP-PAP且在白光照射下培育的铜绿假单胞菌。

图24描绘(a)无任何处理的MDR铜绿假单胞菌、(b)与TVP-PAP在黑暗中培育的MDR铜绿假单胞菌和(c)与TVP-PAP且在白光照射下培育的MDR铜绿假单胞菌的SEM图像。

图25描绘在与不同浓度的TVP-PAP培育30min后、然后在黑暗中或在白光照射30min后HaCaT细胞的存活力。

图26描绘与TVP-PAP培育的HaCaT细胞的共焦图像。

图27描绘TVP-PAP在治疗野生铜绿假单胞菌和MDR铜绿假单胞菌感染的小鼠伤口方面的体内评价。(a)随时间变化的治疗过程示意图。(b)通过TVP-PAP+白光照射不同时段治疗的伤口的照片。(c)不同治疗8天后的相对伤口大小分析。(d)通过TVP-PAP+白光照射不同时段治疗的伤口的照片。(e)不同治疗8天后的相对伤口大小分析。

图28描绘显示(I)噬菌体引导靶向、(II)区别成像和(III)AIE-生物偶联物对细菌的协同杀灭的示意图。

具体实施方式

在本申请通篇中，当组合物被描述为具有、包含特定组分时，或者当方法被描述为具有、包括特定方法步骤时，预期本教导的组合物还可基本上由或者由所叙述的组分组成，并且本教导的方法还可基本上由或者由所叙述的方法步骤组成。

在本申请中，当认为要素或组分被包括于和/或选自所叙述的要素或组分的列表中时，应当理解所述要素或组分可以是任何一种所叙述的要素或组分，或者所述要素或组分可选自由两种或更多种所叙述的要素或组分组成的组。此外，应当理解，不论在本文中是明确的还是隐含的，本文所述的组合物、设备或方法的要素和/或特征都可以多种方式组合而不脱离本教导的精神和范围。

除非另有明确说明，否则术语“包括(include,includes,including)”、“具有(has或having)”的使用通常应当理解为开放式的和非限制性的。

除非另有明确说明，否则本文中使用的单数包括复数(且反之亦然)。另外，除非另有明确说明，否则当在数值前使用术语“约”时，本教导还包括特定数值本身。如本文所用，除非另外指明或推断，否则术语“约”是指与标称值有±10％、±7％、±5％、±3％、±1％或±0％变化。

应当理解，只要本教导仍可操作，则步骤的顺序或进行某些操作的顺序是不重要的。此外，可同时进行两个或更多个步骤或动作。

如本文所用，“卤代”、“卤基”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

如本文所用，“烷基”是指直链或支链饱和烃基。烷基的示例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)、丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)、戊基(例如，1-甲基丁基、2-甲基丁基、异戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、新戊基和1-乙基丙基)、己基等。在各种实施方案中，烷基可具有1到40个碳原子(即，C1-40烷基)，例如，1-30个碳原子(即，C1-30烷基)。在某些实施方案中，烷基可具有1到6个碳原子，并且可被称为“低级烷基”。低级烷基的示例包括甲基、乙基、丙基(例如，正丙基和异丙基)和丁基(例如，正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基)。在某些实施方案中，烷基可如本文所述任选地被取代。烷基通常不被另一烷基、烯基或炔基取代。

术语“芳烷基”是本领域公认的，并且是指被芳基(例如，芳族或杂芳族基团)取代的烷基。

如本文所用，除非另有说明，否则“环烷基”本身或作为另一取代基的一部分意指在环系中具有3-12个碳原子的单环烃，并且包括氢、直链、支链和/或环状取代基。示例性环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基等。

如本文所用，“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烷基。烯基的示例包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、丁二烯基、戊二烯基、己二烯基等。一个或多个碳-碳双键可以是内部的(诸如在2-丁烯中)或末端的(诸如在1-丁烯中)。在各种实施方案中，烯基可具有2到40个碳原子(即，C

如本文所用，“稠环”或“稠环部分”是指具有至少两个环的多环环系，其中至少一个环是芳族的，并且此类芳族环(碳环或杂环)具有与至少一个其他环共用的键，所述其他环可以是芳族或非芳族的，以及碳环或杂环的。这些多环环系可以是高度p-共轭的，并且如本文所述任选地被取代。

如本文所用，“杂原子”是指除碳或氢之外的任何元素的原子，并且包括例如氮、氧、硅、硫、磷和硒。

如本文所用，“芳基”是指芳族单环烃环系或多环环系，其中两个或更多个芳族烃环稠合(即，具有共用的键)在一起，或至少一个芳族单环烃环稠合到一个或多个环烷基和/或环杂烷基环。芳基在其环系中可具有6到24个碳原子(例如，C

如本文所用，“杂芳基”是指含有至少一个选自氧(O)、氮(N)、硫(S)、硅(Si)和硒(Se)的环杂原子的芳族单环环系、或其中环系中存在的至少一个环为芳族并且含有至少一个环杂原子的多环环系。多环杂芳基包括具有两个或更多个稠合在一起的杂芳基环的那些，以及具有至少一个与一个或多个芳族碳环、非芳族碳环和/或非芳族环杂烷基环稠合的单环杂芳基环的那些。杂芳基整体上可具有例如5到24个环原子并且含有1-5个环杂原子(即5-20元杂芳基)。杂芳基可在任何杂原子或碳原子处连接到所限定的化学结构，从而产生稳定的结构。通常，杂芳基环不含有O-O、S-S或S-O键。然而，杂芳基中的一个或多个N或S原子可被氧化(例如，吡啶N-氧化物、噻吩S-氧化物、噻吩S,S-二氧化物)。杂芳基的示例包括例如以下所示的5-或6-元单环和5-6二环环系：其中T为O、S、NH、N-烷基、N-芳基、N-(芳基烷基)(例如，N-苄基)、SiH

术语“任选取代的”是指诸如烷基、环烷基、芳基、杂芳基等的化学基团，其中一个或多个氢可被如本文所述的取代基替代，所述取代例如卤素、叠氮基、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯基、次膦酸酯基、羰基、羧基、甲硅烷基、醚基、烷硫基、磺酰基、磺酰氨基、酮基、醛基、酯基、杂环基、芳族或杂芳族部分、-CF

其中Ar’在每种情况下均独立地为任选取代的苯基。

如本文关于化学基团或部分所用的表示“

如本文所用的短语“聚集诱导发光”或“AIE”是指荧光化合物在以无定形或结晶(固体)状态聚集时或经由荧光化合物的共价或非共价相互作用(静电吸引、疏水-疏水相互作用、氢键合等，同时抑制其分子运动)结合到较大的大分子或粒子的表面或内腔时发光增强，而当AIE分子彼此分离时，荧光化合物展现出弱的发光或基本上没有发光。

如本文所用的术语“λ

如本文所用的术语“λ

术语“噬菌体(bacteriophage)”和“噬菌体(phage)”在本文中可互换使用以指示细菌病毒，其形成包含蛋白质外壳的包装，所述蛋白质外壳含有所述细菌病毒复制所需的核酸。核酸可以是双链或单链、线性或环状的DNA或RNA。

如本文所用，“受试者”意指个体。因此，“受试者”可包括驯养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。“受试者”还可包括哺乳动物，诸如灵长类动物或人。

“预防(prevent)”或该词的其他形式，诸如“预防(preventing)”或“预防(prevention)”，意指阻止特定事件或特征，稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或使特定事件或特征将发生的几率最小化。预防无需与控制进行比较，因为它通常比例如减少更为绝对。如本文所用，有些东西可以减少，但不能预防，但减少的东西也可预防。同样，有些东西可以预防，但不能减少，但预防的东西也可减少。应理解，除非另有特别指明，否则在使用减少或预防时，也明确公开了另一个词的使用。

“治疗(treat)”或该词的其他形式，诸如“治疗(treated)”或“治疗(treatment)”，意指施用组合物或进行方法以减少、预防、抑制或消除特定特征或事件(例如，肿瘤生长或存活)。术语“控制”与术语“治疗”同义使用。

术语“治疗有效”意指所用组合物的量足以改善疾病或病症的一种或多种原因或症状。此类改善只需要减少或改变，不一定是消除。

如本文所用，术语药学上可接受的盐是指本发明化合物的任何盐，所述盐保留了所述化合物的生物学性质，并且没有毒性或在其他方面对于药物用途不是不期望的。此类盐可衍生自本领域众所周知的各种有机和无机抗衡离子，并且包括它们。此类盐包括：(1)与诸如以下的有机酸或无机酸形成的酸加成盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、羟乙酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基二环[2.2.2]辛-2-烯-1-羧酸、葡糖庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸和类似酸；或(2)当存在于母体化合物中的酸性质子发生以下情况时形成的盐：(a)被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)、或碱金属或碱土金属的氢氧化物(例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化锌和氢氧化钡)、氨置换，或与诸如以下的有机碱配位：脂族、脂环族或芳族有机胺，诸如氨、甲胺、二甲胺、二乙胺、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、二乙醇胺、普鲁卡因(procaine)、N-苄基苯乙胺、N-甲基葡糖胺哌嗪、三(羟甲基)-氨基甲烷、氢氧化四甲铵等。另外，盐的示例包括钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵等，并且当化合物含有碱性官能团时，包括无毒的有机酸或无机酸的盐，诸如卤化物(例如、氯化物、溴化物和碘化物)、硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、羟乙酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐；富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、月桂酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate,mesylate)、乙磺酸盐、1,2-乙烷-二磺酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate,besylate)、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔丁基乙酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟基萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎尼酸盐、粘康酸盐等。

当本文使用商品名时，申请人旨在独立地包括商品名产品制剂、仿制药(genericdrug)和商品名产品的活性药物成分。

本公开提供一种AIE-噬菌体生物偶联物，其包含经由任选的接头共价键合到至少一种AIEgen的噬菌体。

所述至少一个AIEgen可经由与蛋白质外壳中适合的官能团(诸如一个或多个选自由赖氨酸侧链、半胱氨酸侧链和N末端氨组成的组的官能团)连接而共价键合到噬菌体的蛋白质外壳表面。

可存在1-100,000个经由任选的接头共价键合到噬菌体的AIEgen。在某些实施方案中，生物偶联物包含1-50,000个、1-40,000个、1-30,000个、1-20,000个、1,000-20,000个、1,000-10,000个、1-10,000个、5,000-10,000个或7,000-10,000个经由任选的接头共价键合到噬菌体的AIEgen。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen是或包含光敏剂。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式1：

或为其药学上可接受的盐，其中

Ar

X是任选取代的芳基、任选取代的杂芳基或共价键；

Y是任选取代的杂芳基或共价键；并且

R

其中m是选自1-4的整数；

R

R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；并且Z是阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头共价键合到Ar

在某些实施方案中，Ar

在某些实施方案中，R

其中m、R

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的盐，其中

A是O或S；

R

R

R

其中R

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式2：

或为其药学上可接受的盐，其中

p和t中的每一个均独立地为选自1-5的整数；

u是选自1-4的整数；

R

其中m是选自1-4的整数；

R

R

R

R在每次出现时均独立地选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、烯基、炔基、任选取代的芳基、任选取代的芳烷基、杂环烷基和任选取代的杂芳基；或两个R与它们所共价键合的一个或多个原子一起形成3-7元环烷基或3-7元杂环烷基；

R

其中w在每种情况下均独立地选自1-5的整数；并且

R

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R、R

在某些实施方案中，t和p各自为1并且R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，R

Z可选自由以下组成的组：卤基(例如，氯基、溴基和碘基)、硫酸根、磷酸根、氨基磺酸根、硝酸根、乙酸根、三氟乙酸根、三氯乙酸根、丙酸根、己酸根、环戊基丙酸根、羟乙酸根、戊二酸根、丙酮酸根、乳酸根、丙二酸根、琥珀酸根、山梨酸根、抗坏血酸根、苹果酸根、马来酸根；富马酸根、酒石酸根、柠檬酸根、苯甲酸根、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸根、苦味酸根、肉桂酸根、扁桃酸根、邻苯二甲酸根、月桂酸根、甲磺酸根(methanesulfonate,mesylate)、乙磺酸根、1,2-乙烷-二磺酸根、2-羟基乙烷磺酸根、苯磺酸根(benzenesulfonate,besylate)、4-氯苯磺酸根、2-萘磺酸根、4-甲苯磺酸根、樟脑酸根、樟脑磺酸根、4-甲基二环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸根、葡庚糖酸根、3-苯基丙酸根、三甲基乙酸根、叔丁基乙酸根、月桂基硫酸根、葡萄糖酸根、苯甲酸根、谷氨酸根、羟基萘甲酸根、水杨酸根、硬脂酸根、环己基氨基磺酸根、奎尼酸根和粘康酸根。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式3：

或为其药学上可接受的盐，其中

R

R

R

其中R

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子，其中所述噬菌体经由任选的接头在R

任选的接头可以是本领域已知的任何接头。任选的接头可以是不稳定接头或非不稳定接头。示例性的不稳定接头包括在生理条件下不稳定的接头，诸如酸不稳定接头、碱不稳定接头、酶不稳定接头。接头可具有线性、环状、支链结构。任选的接头可在接头中包含一个或多个选自由以下组成的组的官能团：醚基、硫化物基团、二硫化物基团、酰胺基、胺基、酮基、碳酸酸基、氨基甲酸酯基、脲基、烷氧基胺基、亚胺基、烷氧基、亚胺基等。

在某些实施方案中，所述接头由下式表示：*-(CR

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen具有式4：

或为其药学上可接受的盐，其中

R

R

R

其中R

Z在每次出现时均独立地为药学上可接受的阴离子。

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的盐，其中A是O或S；R

取决于存在于所述至少一种AIEgen中的反应性官能团，可使用任何数目的官能团使所述至少一种AIEgen与噬菌体偶联。例如，在所述至少一种AIEgen包含反应性胺的情况下，所述至少一种AIEgen可与C末端羧酸或包含羧酸的氨基酸侧链(例如，谷氨酸、天门冬氨酸等)偶联；在所述至少一种AIEgen包含反应性羧基的情况下，所述至少一种AIEgen可与N末端胺或包含胺的氨基酸侧链(例如，赖氨酸)偶联；在所述至少一种AIEgen包含反应性硫醇的情况下，所述至少一种AIEgen可与包含硫醇的氨基酸侧链(例如半胱氨酸)偶联；在所述至少一种AIEgen包含反应性双键(例如，马来酰亚胺部分)的情况下，所述至少一种AIEgen可与包含硫醇的氨基酸侧链(例如，半胱氨酸)偶联；并且在所述至少一种AIEgen包含反应性酚羟基的情况下，所述至少一种AIEgen可与包含苯酚的氨基酸侧链(例如，酪氨酸)偶联。因此，在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen选自由以下组成的组：

或其药学上可接受的盐，其中n、Z、R

在某些实施方案中，所述至少一种AIEgen是：

或其药学上可接受的盐，其中Z是药学上可接受的阴离子；并且

在某些实施方案中，噬菌体是选自由以下组成的组的病毒科的成员：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、瓶状噬菌体科(Ampullaviridae)、双尾病毒科(Bicaudaviridae)、棒状病毒科(Clavaviridae)、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、微小纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、球状病毒科(Globuloviridae)、微滴形噬菌体属(Guttavirus)、丝杆噬菌体科(Inoviridae)、光滑丝杆噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、原质噬菌体科(Plasmaviridae)和复层噬菌体科(Tectiviridae)。在某些实施方案中，噬菌体对细菌细胞是裂解性的并且选自由以下组成的组：弯曲杆菌属(Campylobacter)、克洛诺菌属(Cronobacter)、大肠杆菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、乳球菌属(Lactococcus)、弧菌属(Vibrio)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、志贺氏菌属(Shigella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、梭菌属(Clostridium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)和杆菌属(Bacilli)。

在某些实施方案中，噬菌体选自由以下组成的组：噬菌体PAP1、PAP2、PAP3、PAP7、噬菌体SWHAb1、SWHAb2、Bφ-C62、

噬菌体的选择部分基于噬菌体的细菌特异性。例如，λ噬菌体、噬菌体T2和T4可用于靶向和感染大肠杆菌(Escherichia coli)(革兰氏阴性细菌)；phi-104可用于靶向和感染枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；噬菌体PAP1、PAP2、PAP3、PAP7可用于靶向和感染铜绿假单胞菌；噬菌体SWHAb1、SWHAb2、Bφ-C62、

本发明还提供一种药物组合物，其包含本文所述的生物偶联物和至少一种药学上可接受的辅料。

本文所述的生物偶联物和它们的药学上可接受的盐可单独或与药学上可接受的辅料、载体和/或稀释剂在药物组合物中根据标准药学实践施用于受试者。生物偶联物可经口或胃肠外施用。胃肠外施用包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下和局部，优选的方法是静脉内和局部施用。

因此，本公开提供药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的辅料、可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的一种或多种本文所述的生物偶联物。本公开的药物组合物可特别配制成以固体或液体形式施用，包括适于以下的那些：(1)胃肠外施用，例如作为无菌溶液或悬浮液、或持续释放的制剂通过皮下、肌内、静脉内或硬膜外注射；和(2)口服施用，例如，用于冲服剂(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂(例如，旨在用于颊、舌下和全身吸收的那些)、大丸剂、粉剂、颗粒剂、施加到舌的糊剂。

如本文所述，本文所述的生物偶联物的某些实施方案可含有碱性官能团，诸如氨基，因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒的无机酸加成盐和有机酸加成盐。这些盐可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使呈游离碱形式的本发明纯化的生物偶联物与适合的有机酸或无机酸反应并且在随后的纯化期间分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。

本公开的生物偶联物的药学上可接受的盐包括例如来自无毒有机酸或无机酸的化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，此类常规的无毒盐包括衍生自诸如以下的无机酸的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由诸如以下的有机酸制备的盐：乙酸、丙酸、琥珀酸、羟乙酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、对氨基苯磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、2-羟乙基磺酸(isothionic)等。

在其他情况下，本文所述的生物偶联物可含有一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本公开化合物的相对无毒的无机碱加成盐和有机碱加成盐。这些盐同样可在施用媒介物或剂型制造过程中原位制备，或者通过单独地使呈游离酸形式的纯化化合物与适合的碱(诸如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。

在组合物中还可存在润湿剂、乳化剂和润滑剂(诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁)，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂以及抗氧化剂。

制备这些制剂的方法包括使本文所述的生物偶联物与载体或辅料以及任选的一种或多种辅助成分缔合的步骤。通常，通过如下方式制备所述制剂：均匀地且紧密地使本公开的生物偶联物与液体载体(液体制剂)缔合、之后冻干(粉末制剂，用于用无菌水等复原)或微细的固体载体或两者，然后如有必要，使产品成形或包装产品。

适于胃肠外施用的本公开的药物组合物包含一种或多种本文所述的生物偶联物与以下中的一种或多种的组合：药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液、在使用之前即可被重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末，它们可含有糖、醇、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、螯合剂、使所述制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。

本公开的药物组合物中可采用的适合的水性和非水性载体的示例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)和其适合的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯(诸如油酸乙酯)。可例如通过使用例如卵磷脂的包衣材料、在分散液的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。

这些组合物还可含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可通过包含各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)来确保防止微生物对本公开的生物偶联物的作用。还可能期望在组合物中包含等渗剂，诸如糖、氯化钠等。另外，可注射药物形式的延长吸收可通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)来实现。

可使用本领域技术人员已知的任何方法使至少一种AIEgen与噬菌体偶联。本领域普通技术人员可根据至少一种AIEgen中存在的反应性官能团容易地选择适当的合成方法以实现至少一种AIEgen与噬菌体的偶联。

在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：

其中

其中n、Z、R

在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：

其中

其中n、Z、R

在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：

其中

其中n、Z、R

在至少一种AIEgen由下式表示或为其药学上可接受的盐的情况下：

生物偶联物可通过由下式表示的化合物或其药学上可接受的盐和噬菌体，通过酶介导的氧化偶合(例如，辣根过氧化物酶或髓过氧化物酶)反应来制备：

其中n、Z、R

本文还提供制备生物偶联物的方法，其中所述至少一种AIEgen具有式5，所述方法包括：使式5化合物或其药学上可接受的盐与噬菌体接触，由此形成所述生物偶联物：

其中

n是选自1-10的整数；

LG是离去基团；

R

R

其中R

示例性离去基团包括但不限于Cl、Br、I、3,5-二溴水杨酸根、水杨酸根等。

在某些实施方案中，离去基团选自由以下组成的组：

式5化合物可原位预成形或形成，例如通过相应的酸与羰基活化剂和任选的偶合添加剂的反应。

示例性羰基活化剂包括但不限于碳化二亚胺，诸如DCC、DIC、EDC、CIC、BMC、CPC、BDDC、PIC、PEC和BEM、脲鎓/胺鎓盐，诸如HATU、HBTU、TATU、TBTU、HAPyU、TAPipU、HAPipU、HBPipU、HAMBU、HBMDU、HAMTU、5,6-B(HATU)、4,5-B(HATU)、HCTU、TCTU和ACTU，鏻盐，诸如AOP、BOP、PyAOP、PyBOP、PyOxm、PyNOP、PyFOP、NOP和PyClock，亚胺鎓盐，诸如BOMI、BDMP、BMMP、BPMP和AOMP。

示例性的偶合添加剂包括但不限于HOBt、6-NO

式5化合物的制备，包括试剂和反应条件的适当选择，完全在本领域普通技术人员的技能范围内。

可用于制备本文所述的生物偶联物的中间体是式5化合物：

或其药学上可接受的盐，其中

n是选自1-10的整数；

LG是离去基团；

R

R

其中R

本文还提供使用本文所述的生物偶联物作为细菌成像剂和/或抗细菌剂的方法。

在某些实施方案中，治疗细菌感染的方法包括向细菌感染施用治疗有效量的本文所述的生物偶联物，以及在氧存在下用可见光照射细菌感染。细菌细胞可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性。在某些实施方案中，细菌是多重耐药型的。在某些实施方案中，细菌选自由以下组成的组：铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠道拟杆菌、猪链球菌、化脓性链球菌和具核梭杆菌。

所述方法可在体内或体外进行。可见光照射可以是白光。存在的氧可以是内源性氧、外源性氧或其组合。

在某些实施方案中，本文提供了预防性地治疗有此需要的受试者的潜在细菌感染的方法，所述方法包括：使所述潜在细菌感染的部位与治疗有效量的本文所述的生物偶联物接触；以及用可见光照射所述部位。潜在细菌感染的部位可以是极易受细菌感染的损伤，诸如破坏皮肤的外真皮层的划口、动物咬伤、皮肤烧伤、或外科伤口或切口。

本文还提供用本文所述的生物偶联物处理水溶液的方法，使得存在于溶液中的至少一些或所有细菌被杀灭。在某些实施方案中，所述方法包括使怀疑含有细菌的水溶液与治疗有效量的本文所述的生物偶联物接触，以及用可见光照射所述水溶液。对水溶液的处理可降低因水溶液消耗所致细菌感染的几率。在某些实施方案中，水溶液是受到细菌污染的溶液，例如鱼缸中的水或废水，诸如污水。

在治疗细菌感染的方法在体内进行的情况下，本文提供了治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的生物偶联物；以及用可见光照射细菌感染的部位。

受试者可以是猫、狗、牛、马、猪、小鼠、大鼠、灵长类动物或人。

还提供了使细菌细胞成像的方法，所述方法包括使本文所述的生物偶联物与所述细菌细胞接触；用可见光照射所述细菌；以及检测来自所述生物偶联物的发光。可见光可具有250-700nm、400-600nm、400-650nm、450-600nm、450-550nm或475-525nm的激发波长。发光可具有300-750nm、425-700nm、475-650nm、300-500nm、300-450nm或350-450nm或375-425nm的发射波长。可使用任何适合的用于检测发光的装置，诸如光谱仪。

已经描述了本发明，给出以下实施例以说明本发明的具体应用，包括现在已知的进行本发明的最佳模式。这些具体实施例并不旨在限制本申请中所述的本发明的范围。

材料和表征

叠氮化钠(NaN

使用Horiba FluoroLog-3荧光分光光度计记录荧光谱和固体绝对量子产率。在装配有氙弧灯(Xe900)和微秒闪光灯(uF900)的Edinburgh FLSP 980荧光分光光度计上测量延迟的PL谱和磷光寿命。使用Hamamatsu绝对PL量子产率光谱仪C11347 Quantaurus_QY测量绝对PL量子产率。用Shimadzu UV-2550分光光度计(Shimadzu公司，Kyoto,Japan)测量UV-vis谱。用3.0mg干粉末样品在PANalytical X’pert PRO Multiple Crystals(粉末)X射线衍射仪上进行X射线衍射(XRD)测量。在Zetasizer Nano ZS90(Malvern)上以90°散射角和He-Ne激光测量水和粒径大小。通过研究TVP-S在具有不同体积比的DMSO与氯仿的混合物中的荧光光谱，证实TVP-S的AIE性质。每组含有10μM AIEgen并且在460nm激发下采集FL谱。

将DCFH用于测量生成的总ROS。将DCFH母液(1.0mM,10μL)加到于1×PBS缓冲液中的含有AIEgen的悬浮液(5.0μM,2.0mL)中，并且将白光(4.2mW/cm

通常，将4.0μL悬浮于DMSO中的TVP-S溶液(1.0mM)与996μL PAP溶液(8.48×10

在LB培养基中在37℃以180rpm的振荡速度培养铜绿假单胞菌、MDR铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌。在TSB(胰蛋白酶大豆培养液，OXO)培养基中在37℃培养金黄色葡萄球菌。然后经由离心(5000rpm，6min)以完全去除培养基来收获细菌，并将其再悬浮于PBS缓冲液中，为以下实验做好准备。经由使用细胞密度计(Amersham Bioscience,Ultrospec 10)对600nm波长处吸光度的光密度测量来确定细菌悬浮液的浓度。对于用细胞膜和细胞核染料的共染色实验，首先将1.0mL细菌悬浮液(1.0×10

通过传统的平铺方法分别评价PAP、TVP-S和TVP-PAP的抗细菌活性。对于处于黑暗中的TVP-PAP组，用不同浓度的TVP-PAP(分别对于铜绿假单胞菌，为3.18×10

对于培育辐照组，分别将不同浓度的TVP-PAP(9.54×10

将100μL(2.0×10

在带通气盖(vent cap)的25cm

所有动物实验程序均经重庆医科大学动物护理与使用委员会(Animal Care andUse committee of Chongqing Medical University)批准，并符合所有相关伦理规定。雌性BALB/c小鼠(6-8周)购自重庆医科大学实验动物中心(Experimental Animal Centralof Chongqing Medical University)。将BALB/c小鼠随机分为3组：(1)用TVP-PAP处理和白光辐照的细菌感染组；(2)用单独TVP-PAP处理的细菌感染组；(3)无任何处理的细菌感染组(每组中n＝5)。通过注射1.5％戊巴比妥钠将小鼠麻醉。然后在每只小鼠上造成两处全层损伤(直径约6mm)。通过在伤口表面上接种20μL细菌悬浮液(1.0×10

根据图1合成化合物TVP-S

化合物1的合成.将DMF溶剂(10mL)加到4-甲基吡啶(800μL,8.1mmol)和叔丁醇钾(200mg,1.78mmol)中并且在室温下搅拌30min。然后向混合物中加入4-(N,N-二苯基氨基)苯甲醛(1.1g,4.02mmol)，并在室温下搅拌过夜。然后向反应物中加入过30mL盐水进行猝灭，并且用乙酸乙酯(EA)萃取化合物。将收集的有机层通过无水硫酸钠干燥，并旋转蒸发干燥。使用EA和正己烷的混合物(1:6,v/v)作为洗脱剂对残余物进行柱色谱分离纯化，得到呈黄色的化合物1固体(1.29g,3.71mmol)，产率为92.3％。

化合物2的合成.将THF溶剂(50mL)加到4-溴丁酸(2.0g,12.0mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(1.44g,12.5mmol)和N,N'-二环己基碳化二亚胺(2.97g,14.4mmol)中并且在室温下搅拌12小时。将收集的有机层旋转蒸发干燥。并且使用EA和正己烷的混合物(1:4,v/v)作为洗脱剂对残余物进行柱色谱分离纯化，得到黄色化合物2粗产物，用于下一步骤反应。

TVP-S的合成.将乙腈溶剂(10mL)加到化合物1(200mg,0.58mmol)和化合物2(226mg,0.86mmol)中并且在室温下搅拌24小时。通过旋转蒸发干燥，沉淀出产物。使用DCM和甲醇的混合物(95:5,v/v)作为洗脱剂对残余物进行柱色谱分离纯化，得到呈红色的TVP-S固体(299.5g,0.49mmol)，产率为84.5％。

由于结构中存在带正电荷的吡啶鎓基团和亲水性羧基，TVP-S可很好地溶解于包括水在内的极性溶剂中。更重要的是，TVP-S结构中的活化羧基使其能够与生物有机体中广泛存在的氨基直接进行共价偶联反应。TVP-S在400-600nm范围内的明显吸光度(最大值在457nm处)显示出其强的可见光吸收能力(图2b)。由于TVP-S可很好地溶解于大极性的溶剂中，因此我们经由改变CHCl

TVP-S在可见光区中的强吸收可导致利用白光作为用于基于PDI的抗细菌应用的光源。最初通过使用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH)作为指示剂确定TVP-S的ROS生成效率，该指示剂可通过ROS触发的“开启”过程发射荧光。如图4中所示，单独的DCFH是非发射性的，并且在10min的白光照射(约4.2mW·cm

TVP-S的分子结构中带有活化的羧基，TVP-S可容易地与噬菌体外部蛋白质中的氨基反应，并形成具有AIE特征的噬菌体生物偶联物(TVP-PAP)。如图10a中所示，在AIEgen修饰后，PAP噬菌体在400-500nm范围内所增强的吸光度证明了TVP-S和PAP之间成功的生物偶联反应。根据浓度滴定，计算出TVP-S和PAP的摩尔消光系数分别为1.94×10

利用噬菌体的特异性识别特征和来自TVP-S的独特AIE性质，首先使用TVP-PAP对其靶细菌(铜绿假单胞菌，缩写为P.a.)进行了细菌成像标记。如图12中所示，在与TVP-PAP培育30min后，铜绿假单胞菌可被亮荧光染色，并且标记效率可达到100％。与商业细胞膜染色染料(DiO)相比，铜绿假单胞菌可被TVP-PAP探针以更高的效率进行荧光点亮标记(图13)。为了测试TVP-PAP中源于噬菌体固有识别能力的特定靶向性，两种类型的细菌，即G

基于此，TVP-PAP对混合微生物(包括鲍曼不动杆菌(G

在PAP优异的细菌靶向能力和AIEgen的高效

接下来，通过与相同摩尔浓度的单个AIEgen和PAP实体进行比较，测试TVP-PAP的协同抗细菌作用。如图19a中所示，对于野生铜绿假单胞菌来说，在黑暗中培育(对照I-30、对照I-60)与进一步白光辐照(对照I-30和L-30)均不能对细菌存活率构成明显影响。同样，无论有无光照射，单独的TVP-S在所测试的浓度范围(4.33～21.65pM，根据3.18:1～15.9:1摩尔比)内均不能抑制细菌生长。非特异性AIEgen和其在细菌表面上相对低的浓度可能削弱其对细菌的破坏作用。相比之下，在PAP处理后，当其浓度在黑暗下升高到9.54×10

靶向杀灭是抗菌测试中所需考虑的另一关键因素。在本文中，引入PAP的特性，用于细菌区分和靶向杀灭。在双组分系统中，通过分别培养宿主细菌(铜绿假单胞菌(G

AIEgen独特的荧光性质也被用于实时监测这一靶向和杀灭过程。如图21中所示，首先通过与TVP-PAP生物偶联物培育实现对铜绿假单胞菌的成功染色，并发出强烈的荧光信号。从30min的时间点开始暴露于白光之后，细菌形态随着光照时间的持续而逐渐变得模糊，在明场中可明显观察到细菌碎片的出现。在荧光场中，在10min照射后，大部分细菌中的荧光信号消失，并且细菌细胞形态呈现明显聚集。细菌形貌和流动性的变化证实了靶细菌遭受的破坏。对于MDR铜绿假单胞菌，在与较高浓度的TVP-PAP(6.36×10

为了更深入地研究TVP-PAP的抗菌作用，采用SEM成像来监测野生铜绿假单胞菌和MDR铜绿假单胞菌的形态变化。如图23a中所示，未经TVP-PAP处理，铜绿假单胞菌具有光滑表面、完整的细胞壁和健康的三维形态。相比之下，经TVP-PAP和白光辐照后，铜绿假单胞菌的细胞壁明显变得粗糙，甚至破裂，原有的三维形态消失。此外，细菌表面上出现了大量孔道。这些被噬菌体刺穿的孔将加速

受TVP-PAP高效的体外细菌靶向和消除活性启发，我们进一步将抗菌试验扩展到有野生铜绿假单胞菌或MDR铜绿假单胞菌感染性皮肤伤口的小鼠模型上。首先检查TVP-PAP在正常细胞上的生物相容性。如图25中所示，对于黑暗组和白光照射组，即使TVP-PAP浓度上升到8.45×10

在建立模型后，将野生铜绿假单胞菌感染小鼠和MDR铜绿假单胞菌感染小鼠随机分为3组进行不同处理(如图27a中所示)。伤口的愈合过程清晰表明用TVP-PAP处理的小鼠在处理后第8天伤口接近痊愈(图27b和图27d)。并且野生铜绿假单胞菌和MDR铜绿假单胞菌感染的伤口相对大小都降低到10％以下，并且均显著小于PBS对照组或单独的TVP-PAP组(图27c和图27e)。在G