一种代谢组学和脂质组学研究用微量样本的前处理方法及其检测方法

摘要

本发明属于组学分析方法技术领域，涉及一种代谢组学和脂质组学研究用微量样本的前处理方法及其检测方法。具体而言，该前处理方法包括对微量样本进行单相提取而得到代谢组学样本，然后进行双相提取而得到脂质组学样本；该检测方法包括配制代谢组学和脂质组学内标混合溶液，与微量样本同时进行前处理，然后进行代谢组学和脂质组学分析。该方法先后引入代谢组学内标和脂质组学内标，通过鉴定得到的物质种类来遴选同性质或同类型的内标作为参比基础，利用内标物质的峰面积和浓度分别计算样本中目标物质的浓度，能够同时获取代谢物和脂质的定性结果。

说明书

技术领域

本发明属于组学分析方法技术领域，涉及一种代谢组学和脂质组学研究用微量样本的前处理方法，以及基于该前处理方法构建的微量样本的检测方法。

背景技术

代谢组学(metabolomics)是系统生物学的重要组成部分之一，以极性代谢物(即亲水性物质，通常为极性小分子化合物)为主要研究对象，大致可分为氨基酸类、能量代谢类、核苷酸类、碳水化合物类、辅酶因子类等。脂质组学(lipidomics)则是从代谢物组学衍生出来的独立学科，关注于脂质(即亲脂性物质)的研究，一般包括脂肪酸类、甘油脂类、甘油磷脂类、鞘脂类、固醇类(或称甾体类)、多聚异戊二烯醇类、糖脂类和聚酮类等8大类

由于极性代谢物和脂质的化学性质差异较大，因而在组学研究的样本前处理过程中，代谢组学和脂质组学对于样本的提取试剂和提取方法也有所不同。比如，极性代谢物的提取溶剂以甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)和水(H

然而，从微量样本(比如，肿瘤组织、大脑皮层、海马体、拟南芥组培的植物样本、菌体、蚕血或虾血、外泌体等)中获得目标物质一直是组学研究的瓶颈和难点。由于生物样本自身存在取样限制，难以获得令人满意的样本(例如，较为丰富的样本量，以及足够的样本重量或体积)，因此传统做法大多通过同组样本的物理混合来增加样本量，但如此操作将无法观测到单个样本间的生物学差异。而且，本已有限的微量样本还需满足代谢组学和脂质组学同时研究的需要就显得更加困难。

基于极性代谢物和脂质在提取溶剂中的分配系数差异，通过合适的提取方法或步骤，可以分别得到极性代谢物和脂质的提取部位，有效实现利用同一份样本来开展两种组学研究。比如，中国发明专利申请CN108593821A公开了一种用于组织样本代谢组学和脂质组学研究的样品提取方法，首先向组织样本中加入甲醇-水混合溶剂，提取后取走全部上清液(亲水性提取物)用于代谢组学研究，再向提取残渣中加入甲基叔丁基醚来提取脂质，作为亲脂性提取物用于脂质组学研究。该方法通过分步使用两种不同极性的溶剂来完成提取，既能满足极性代谢物和脂质的全覆盖，也能避免使用单一混合溶剂提取时极性代谢物被分配到脂质提取层的问题。Joran Villaret-Cazadamont等人公开了一种用于同时和准确分析极性代谢物和脂质的双相提取方法，该方法在单个生物样本中实施，但却与上述分步提取方法的具体步骤不同，其提取溶剂体系为乙腈/甲醇/0.1％甲酸水(2/2/1；v/v/v)和二氯甲烷混合溶液，取上层，浓缩后用于代谢组学研究，取下层，浓缩后用于脂质组学研究，打破了样本量不足的限制，并且有利于功能代谢组研究

虽然上述各种方法(无论是先后采用两种单相溶剂的分步提取，还是采用双相溶剂的同步提取)能够使微量样本满足代谢组学和脂质组学同时研究的基本需要，但由于这些方法忽视了极性代谢物与脂质在化学性质上的细微差异以及提取溶剂(尤其是大多数方法中用到的甲醇)在两相提取中的重要作用，导致目标物质的提取效率受到极大影响。

目前，存在的问题主要有以下几个方面：

(1)在极性代谢物和脂质的提取过程中，甲醇除了具有蛋白沉淀功能以外，还能溶解绝大多数的极性代谢物，甚至是一些稍偏极性的脂质，因此全部取走甲醇上清液的做法(例如CN108593821A中的方法)势必会影响偏极性脂质在脂质组学样本中的覆盖；

(2)尽管采用双相混合溶剂的同步提取方法可以有效简化流程，但某些极性代谢物或脂质会同时分散在水相和有机相中，导致各自检测时目标物质的含量均有损失(例如Joran Villaret-Cazadamont等人的方法)；

(3)在脂质提取过程中，提取溶剂的酸碱性和提取温度等因素也会影响某些脂质的提取效率，比如磷脂酸(Phosphatidic acid，PA)和磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)在甲醇-氯仿溶剂系统中的溶解性较差，提取效率不高。

另外，目前尚未实现代谢组学和脂质组学的同时检测，检测方法仅限于单一代谢组学或单一脂质组学的研究范围。

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发明内容

针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种代谢组学和脂质组学研究用微量样本的前处理方法。另外，在样品前处理方法的基础上，本发明还提供一种代谢组学和脂质组学检测方法，以弥补现有技术的空白。

一方面，本发明提供了一种代谢组学和脂质组学研究用微量样本的前处理方法，其包括下列步骤：

1)向微量样本中加入单相提取溶剂，振荡并于室温进行单相提取，低温离心，取出部分上清液，即为代谢组学样本；

2)向剩余的上清液和残渣中加入双相提取溶剂，振荡并于冰浴中进行双相提取，低温离心，取出有机相，真空浓缩干燥，向浓缩物中加入复溶溶剂，涡旋混匀，低温离心，取出上清液，即为脂质组学样本。

进一步地，步骤1)中微量为低于常规方法样本量的检测要求的1/2的样本量。

进一步地，步骤1)中单相提取溶剂为C

进一步地，步骤1)中微量样本与单相提取溶剂的用量比为1mg:4μL～1mg:10μL，优选1mg:5μL～1mg:8μL，更优选1mg:6μL。

进一步地，步骤1)中部分上清液与单相提取溶剂的体积比为1:1.5～1:10，优选1:2～1:5，更优选1:3。

进一步地，步骤2)中双相提取溶剂由C

进一步地，步骤2)中微量样本与双相提取溶剂的用量比为1mg:10μL～1mg:20μL，优选1mg:15μL～1mg:18μL，更优选1mg:16μL。

进一步地，步骤2)中复溶溶剂为C

进一步地，步骤2)中微量样本与复溶溶剂的用量比为1mg:1μL～1mg:5μL，优选1mg:1.5μL～1mg:3μL，更优选1mg:2μL。

优选地，步骤2)还包括在取出有机相和真空浓缩干燥之间进行的补充双相提取，包括：向取出有机相后剩余的残渣中加入补充双相提取溶剂，涡旋混匀，于冰浴中提取，低温离心，取出有机相，与双相提取后取出的有机相合并。

进一步地，步骤2)中补充双相提取溶剂由C

进一步地，步骤2)中微量样本与补充双相提取溶剂的用量比为1mg:5μL～1mg:15μL，优选1mg:8μL～1mg:12μL，更优选1mg:10μL。

另一方面，本发明提供了一种微量样本的代谢组学和脂质组学检测方法，其包括下列步骤：

1)取适量的多种代谢组学内标，分别加入水或C

2)向微量样本中加入代谢组学内标混合溶液和C

3)将代谢组学样本和脂质组学样本分别进行代谢组学和脂质组学分析，并分别基于代谢组学内标和脂质组学内标来完成微量样本中极性代谢物和脂质的检测。

进一步地，步骤1)中多种代谢组学内标包括琥珀酸-2,2,3,3-d4、胆酸-2,2,3,4,4-d5、L-苯丙氨酸-d5、DL-甲硫氨酸-3,3,4,4-d4、DL-色氨酸-2,3,3-d3和氯化胆碱-三甲基-d9；单一代谢组学内标母液中代谢组学内标的浓度为1～15mg/mL，优选1～5mg/mL，更优选1～2mg/mL；代谢组学内标混合溶液中各种代谢组学内标的浓度均为5～50μg/mL，优选5～30μg/mL，更优选5～15μg/mL。

进一步地，步骤1)中多种脂质组学内标包括磷脂酰胆碱16:0-d31-18:1、磷脂酰乙醇胺14:0-14:0、磷脂酰甘油16:0-d31-18:1、磷脂酰丝氨酸14:0-14:0和磷脂酸17:0-17:0；单一脂质组学内标母液中脂质组学内标的浓度为1～5mg/mL，优选1～3mg/mL，更优选1～2mg/mL；脂质组学内标混合溶液中各种脂质组学内标的浓度均为10～50μg/mL，优选10～30μg/mL，更优选20～30μg/mL。

进一步地，步骤2)中微量为低于常规方法样本量的检测要求的1/2的样本量。

进一步地，步骤2)中由代谢组学内标混合溶液以及C

进一步地，步骤2)中部分上清液与单相提取溶剂的体积比为1:1.5～1:10，优选1:2～1:5，更优选1:3。

进一步地，步骤2)中由脂质组学内标混合溶液、酸水溶液、C

进一步地，步骤2)中复溶溶剂为C

优选地，步骤2)还包括在取出有机相和真空浓缩干燥之间进行的补充双相提取，包括：向取出有机相后剩余的残渣中加入补充双相提取溶剂，涡旋混匀，于冰浴中提取，低温离心，取出有机相，与双相提取后取出的有机相合并。

进一步地，步骤2)中由C

进一步地，上述检测方法中C

本发明的前处理方法可以从同一份微量生物样本中同时获取亲水性的代谢物和亲脂性的脂质，相较于需要两份样本分别获取极性代谢物和脂质的传统方法，更加适合于取样难度大和/或取样量受限的微量生物样本。

首先，与采用混合提取溶剂的单次双相提取方式相比，本发明的前处理方法采用分成两步的提取方式，第一步使用单相溶剂提取极性代谢物，第二步采用混合提取溶剂提取脂质，提取效率显著提高，避免了单次提取过程中亲水性/亲脂性物质在双相中的分配不同而损失浓度。

其次，本发明的前处理方法所采用的两步提取方式也不同于常规方法中的两步提取。在提取亲水性的代谢物时，常规方法需要全部取出包含极性代谢物的提取液(上清液)，而本发明的前处理方法仅取走一部分，剩余部分连同样本残渣一起进行脂质的双相提取。既能满足代谢物的检测需求，也能满足脂质中极性较强物质的有效提取，因此检出的脂质数量会高于常规的两步提取。

最后，本发明的前处理方法还在脂质提取时向双相提取溶剂中添加酸性溶质，从检测结果来看，这一操作有利于酸性脂类从样本中溶出和/或被有机溶剂提取，尤其适合于磷脂酸等脂质的高效提取。

此外，基于上述前处理方法，本发明还开发出适用于微量生物样本同时进行代谢组学和脂质组学研究的检测方法。该方法先后引入代谢组学内标和脂质组学内标，通过鉴定得到的物质种类来遴选同性质或同类型的内标作为参比基础，利用内标物质的峰面积和浓度分别计算样本中目标物质的浓度，能够同时获取代谢物和脂质的定性结果。

附图说明

图1示出了多种代谢组学和脂质组学研究用样本的前处理方法(A：利用两份生物样本分别提取；B：利用一份生物样本单次双相提取；C：利用一份生物样本分步提取，其中包含极性代谢物的提取液被全部取出；D：利用一份生物样本分步提取，其中包含极性代谢物的提取液被部分取出，且提取脂质时提取溶剂中添加有酸)。

图2示出了大鼠大脑皮层经双相溶剂单次提取和本发明的分步提取的前处理方法后的UPLC-MS脂质组基峰色谱图(A：正离子模式下，双相溶剂单次提取的基峰色谱图；B：正离子模式下，本发明的分步提取的基峰色谱图；C：负离子模式下，双相溶剂单次提取的基峰色谱图；D：负离子模式下，本发明的分步提取的基峰色谱图)。

图3示出了小鼠脑组织经全部和部分取出代谢物提取液的前处理方法后的UPLC-MS脂质组基峰色谱图(A：正离子模式下，全部取出的基峰色谱图；B：正离子模式下，部分取出的基峰色谱图；C：负离子模式下，全部取出的基峰色谱图；D：负离子模式下，部分取出的基峰色谱图)。

图4示出了大鼠大脑皮层经加酸和无酸提取脂质的前处理方法后的UPLC-MS脂质组基峰色谱图(A：正离子模式下，无酸提取脂质的基峰色谱图；B：正离子模式下，加酸提取脂质的基峰色谱图；C：负离子模式下，无酸提取脂质的基峰色谱图；D：负离子模式下，加酸提取脂质的基峰色谱图)。

图5示出了大鼠大脑皮层和小鼠脑组织经不同前处理方法后的脂质数量比较结果(A：Parent模式下一级注释结果；B：Product模式下二级注释结果)。

图6示出了小鼠脑组织经使用不同种类的酸以及不同浓度的盐酸的前处理方法后的脂质数量比较结果(A：Parent模式下一级注释结果；B：Product模式下二级注释结果)。

具体实施方式

[术语定义]

除非另有说明，本文中所使用的术语“样本”是指用于组学研究的生物样本，包括但不限于动物样本(如人或动物的血液、尿液、粪便、唾液、毛发、细胞、组织、器官等)、植物样本(如植物的根、茎、叶、花、果实、种子等)、微生物样本(如微生物的细胞、孢子、发酵液、培养液等)、亚细胞结构样本(如细胞器的线粒体、外泌体、囊泡等)等。本文中所使用的术语“微量”是指低于常规方法样本量的检测要求的1/2的样本量。例如，当常规方法为分别采集代谢组学和脂质组学研究用样本，并且对于样本量的检测要求为100mg(实际总共需要200mg样本)时，此时的“微量”是指低于50mg的样本量。本文中所使用的术语“微量样本”是指用于组学研究且样本量属于微量级的生物样本，例如样本量普遍较少，但又是实验中常见的脑组织。

除非另有说明，本文中所使用的术语“提取溶剂”是指用于从样本中提取所需的物质成分的溶剂，“单相提取溶剂”是指用作提取溶剂的单一一种溶剂或者以均相形式存在的两种或多种溶剂的组合，“双相提取溶剂”是指用作提取溶剂的、以部分互溶或完全不互溶的两相形式存在的两种或多种溶剂的组合。

除非另有说明，本文中所使用的术语“C

除非另有说明，本文中所使用的术语“酸”是指将其溶于水中能够释放质子形成H

除非另有说明，本文中所使用的术语“C

除非另有说明，本文中所使用的术语“内标”(或“内部标准”)是指一种在分析过程中添加于供试样品内的适当的纯品，用于计算待测组分的含量。

除非另有说明，本文中所使用的术语“同位素”是指隶属同一元素的、具有相同质子数和不同中子数的不同核素之间的互称。例如，氢元素包含氕(H或

除非另有说明，本文中所使用的术语“同位素内标”是指结构中包含的至少一种丰度较大的同位素被替换为丰度较小的同位素之后形成的稳定的内标物质。例如，在作为内标的氯化胆碱的分子结构中，若三个甲基所包含的九个氢原子(或氕原子)全部被氘原子替换，则可得到相应的同位素内标—氯化胆碱-三甲基-d9。

[样品前处理方法]

本发明提供了一种代谢组学和脂质组学研究用微量样本的前处理方法。该方法可以包括下列步骤：

1)向微量样本中加入单相提取溶剂，振荡并于室温进行单相提取，低温离心，取出部分上清液，即为代谢组学样本；

2)向剩余的上清液和残渣中加入双相提取溶剂，振荡并于冰浴中进行双相提取，低温离心，取出有机相，真空浓缩干燥，向浓缩物中加入复溶溶剂，涡旋混匀，低温离心，取出上清液，即为脂质组学样本。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中微量可以为低于常规方法样本量的检测要求的1/2的样本量。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中微量样本可以为用于组学研究且样本量属于微量级的生物样本，例如脑组织。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中使用单相提取溶剂来提取样本中的目标物质(例如，极性代谢物)，该单相提取溶剂可以为C

在本发明的一项优选实施方案中，步骤1)中单相提取溶剂可以为甲醇，或者可以为甲醇水溶液。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤1)中单相提取溶剂可以为甲醇。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中单相提取溶剂的体积需要基于微量样本的重量来确定，微量样本与单相提取溶剂的用量比可以为1mg:4μL～1mg:10μL。

在本发明的一项优选实施方案中，步骤1)中微量样本与单相提取溶剂的用量比可以为1mg:5μL～1mg:8μL。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤1)中微量样本与单相提取溶剂的用量比可以为1mg:6μL。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中单相提取在振荡条件下进行，振荡频率可以为40Hz，振荡时间可以为30min。

步骤1)中单相提取后获得的上清液中既包含作为代谢组学研究目标物质的极性代谢物，又包含作为脂质组学研究目标物质的稍偏极性的脂类，全部取走上清液，则会影响脂质组学样本的覆盖情况，因此在满足代谢组学样本量要求的前提上，可以只取走部分上清液。例如，在本发明的一项实施方案中，步骤1)取走的部分上清液与之前加入的单相提取溶剂的体积比可以为1:1.5～1:10。

在本发明的一项优选实施方案中，步骤1)中取走的部分上清液与单相提取溶剂的体积比可以为1:2～1:5。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤1)中取走的部分上清液与单相提取溶剂的体积比可以为1:3。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中使用双相提取溶剂来提取样本中的目标物质(例如，脂质)，该双相提取溶剂可以由一种或多种亲水性溶剂以及一种或多种亲脂性溶剂组成，其中：亲水性溶剂可以是水、酸水溶液或低级/中级脂肪醇，亲脂性溶剂可以是脂肪醚或卤代烃。从溶剂密度的角度来看，既可以是亲水性溶剂大于亲脂性溶剂，也可以是亲脂性溶剂大于亲水性溶剂。例如，步骤2)中双相提取溶剂可以由C

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)中双相提取溶剂可以由甲醇、盐酸(优选0.1～1M盐酸，更优选0.5～1M盐酸，最优选1M盐酸)和氯仿组成。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤2)中双相提取溶剂可以由体积比为5:1:10的甲醇、盐酸(优选0.1～1M盐酸，更优选0.5～1M盐酸，最优选1M盐酸)和氯仿组成。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中双相提取溶剂的体积也需要基于微量样本的重量来确定，微量样本与双相提取溶剂的用量比可以为1mg:10μL～1mg:20μL。

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)中微量样本与双相提取溶剂的用量比可以为1mg:15μL～1mg:18μL。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤2)中微量样本与双相提取溶剂的用量比可以为1mg:16μL。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中双相提取的时间可以为40min。

在本发明的一项实施方案中，除了利用双相提取步骤来获得样本中的目标物质(例如，脂类)以外，步骤2)还可以包括补充双相提取步骤。该补充双相提取步骤可以在完成双相提取并取出有机相之后，并且在将取出的有机相真空浓缩干燥之前进行，具体操作可以如下：向取出有机相后剩余的残渣中加入补充双相提取溶剂，涡旋混匀，于冰浴中提取，低温离心，取出有机相，与双相提取后取出的有机相合并。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中补充双相提取溶剂与双相提取溶剂的组成既可以基本一致，也可以有所区别。例如，当双相提取溶剂由C

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)中，当双相提取溶剂由甲醇、盐酸和氯仿组成时，补充双相提取溶剂可以由甲醇和氯仿组成。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤2)中，当双相提取溶剂由体积比为2:1:4的甲醇、盐酸和氯仿组成时，补充双相提取溶剂可以由体积比为1:2的甲醇和氯仿组成。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中补充双相提取溶剂的体积也需要基于微量样本的重量来确定，微量样本与补充双相提取溶剂的用量比可以为1mg:5μL～1mg:15μL。

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)中微量样本与补充双相提取溶剂的用量比可以为1mg:8μL～1mg:12μL。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤2)中微量样本与补充双相提取溶剂的用量比可以为1mg:10μL。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中补充双相提取的时间可以为10min。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中，无论是只经历双相提取而获得的有机相，还是先后经历双相提取和补充双相提取而获得的合并有机相，后续都要进行真空浓缩干燥，并用适宜的复溶溶剂进行复溶，才能最终获得脂质组学样本。例如，复溶溶剂可以为C

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)中复溶溶剂可以为甲醇和/或异丙醇。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤2)中复溶溶剂可以为体积比为1:4的甲醇/异丙醇混合溶剂。

在本发明中，步骤2)中复溶溶剂的体积可以根据具体需要进行调整。例如，在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量样本与复溶溶剂的用量比可以为1mg:1μL～1mg:5μL。

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)中微量样本与复溶溶剂的用量比可以为1mg:1.5μL～1mg:3μL。

在本发明的一项更优选实施方案中，步骤2)中微量样本与复溶溶剂的用量比可以为1mg:2μL。

在本发明的一项实施方案中，低温离心可以在温度为4℃，转速为12000rpm，时间为10min的条件下进行。

[代谢组学和脂质组学检测方法]

本发明提供了一种微量样本的代谢组学和脂质组学检测方法。该方法可以包括下列步骤：

1)取适量的多种代谢组学内标，分别加入水或C

2)向微量样本中加入代谢组学内标混合溶液和C

3)将代谢组学样本和脂质组学样本分别进行代谢组学和脂质组学分析，并分别基于代谢组学内标和脂质组学内标来完成微量样本中极性代谢物和脂质的检测。

在代谢组学和脂质组学检测方法中，内标的引入是至关重要的，其不仅可用于校正待测样本中各组分所对应的色谱峰的保留时间，还可用于对峰面积进行归一化和计算各组分的相对含量。

在本发明中，内标的选择主要依据下列条件：

1.当使用多种内标时，各内标成分对应的色谱峰需要较为均匀地分布在色谱图中，换言之，各内标成分对应的保留时间需要较为均匀地分布在洗脱时间中；

2.待测物的检测不能被对应内标干扰，换言之，待测物与对应内标的色谱分离度需要满足检测要求；

3.内标的种类尽可能多样化，以便适用于不同待测物的校正需求(包括正负离子模式)；

4.内标需要耐受样本的前处理方法，特别是提取过程，在样本提取后需要保持性质稳定。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中多种代谢组学内标可以包括羧酸类、甾体类、氨基酸类、生物碱(特别是季铵碱型生物碱)类等极性小分子化合物和/或其同位素标记物，例如，琥珀酸-2,2,3,3-d4(succinic acid-2,2,3,3-d4)、胆酸-2,2,3,4,4-d5(cholicacid-2,2,3,4,4-d5)、L-苯丙氨酸-d5(L-phenylalanine-d5)、DL-甲硫氨酸-3,3,4,4-d4(DL-methionine-3,3,4,4-d4)、DL-色氨酸-2,3,3-d3(DL-tryptophan-2,3,3-d3)和氯化胆碱-三甲基-d9(choline chloride-trimethyl-d9)。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中单一代谢组学内标母液需要保持一定的浓度，例如，以代谢组学内标计，其浓度可以为1～15mg/mL，优选1～5mg/mL，更优选1～2mg/mL。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中代谢组学内标混合溶液也需要保持一定的浓度，例如，以各种代谢组学内标计，其浓度可以均为5～50μg/mL，优选5～30μg/mL，更优选5～15μg/mL。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中多种脂质组学内标可以包括生物碱(特别是季铵碱型生物碱)类、醇胺类、多元醇类、氨基酸类等极性小分子化合物的磷脂化衍生物和/或其同位素标记物，例如，磷脂酰胆碱16:0-d31-18:1(PC 16:0-d31-18:1)、磷脂酰乙醇胺14:0-14:0(PE 14:0-14:0)、磷脂酰甘油16:0-d31-18:1(PG 16:0-d31-18:1)、磷脂酰丝氨酸14:0-14:0(PS 14:0-14:0)和磷脂酸17:0-17:0(PA 17:0-17:0)。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中单一脂质组学内标母液需要保持一定的浓度，例如，以脂质组学内标计，其浓度可以为1～5mg/mL，优选1～3mg/mL，更优选1～2mg/mL。

在本发明的一项实施方案中，步骤1)中脂质组学内标混合溶液需要保持一定的浓度，例如，以各种脂质组学内标计，其浓度可以均为10～50μg/mL，优选10～30μg/mL，更优选20～30μg/mL。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量可以为低于常规方法样本量的检测要求的1/2的样本量。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量样本可以为用于组学研究且样本量属于微量级的生物样本，例如脑组织。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中可以由代谢组学内标混合溶液和C

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量样本与单相提取溶剂的用量比可以为1mg:4μL～1mg:10μL，优选1mg:5μL～1mg:8μL，更优选1mg:6μL。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中部分上清液与单相提取溶剂的体积比可以为1:1.5～1:10，优选1:2～1:5，更优选1:3。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中可以由脂质组学内标混合溶液、酸水溶液、C

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量样本与双相提取溶剂的用量比可以为1mg:10μL～1mg:20μL，优选1mg:15μL～1mg:18μL，更优选1mg:16μL。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中复溶溶剂可以为C

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量样本与复溶溶剂的用量比可以为1mg:1μL～1mg:5μL，优选1mg:1.5μL～1mg:3μL，更优选1mg:2μL。

在本发明的一项优选实施方案中，步骤2)还可以包括补充双相提取步骤。该补充双相提取步骤可以包括：向取出有机相后剩余的残渣中加入补充双相提取溶剂，涡旋混匀，于冰浴中提取，低温离心，取出有机相，与双相提取后取出的有机相合并。

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中可以由C

在本发明的一项实施方案中，步骤2)中微量样本与补充双相提取溶剂的用量比可以为1mg:5μL～1mg:15μL，优选1mg:8μL～1mg:12μL，更优选1mg:10μL。

在本发明的一项实施方案中，C

以下将通过附图和具体实施例来进一步说明本发明。除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器、软件等均可通过常规商业手段获得。

实施例一：大鼠大脑皮层样本经过双相溶剂单次提取的前处理方法和本发明的前处理方法的结果比对

1.制备代谢组学内标混合溶液和脂质组学内标混合溶液：

1.1制备代谢组学内标混合溶液：

取适量的琥珀酸-2,2,3,3-d4、胆酸-2,2,3,4,4-d5、L-苯丙氨酸-d5、DL-甲硫氨酸-3,3,4,4-d4、DL-色氨酸-2,3,3-d3和氯化胆碱-三甲基-d9等6种代谢组学内标(均为同位素标记物内标)，分别加入水或甲醇配制成6种单一代谢组学内标母液(其中，DL-甲硫氨酸-3,3,4,4-d4和DL-色氨酸-2,3,3-d3用水溶解，其余用甲醇溶解，6种内标的浓度均约为1mg/mL)，再分别取适量的6种单一代谢组学内标母液，混合并对应加入适量的水(或甲醇)，配制成代谢组学内标混合溶液(其中，6种内标的浓度如下：胆酸-2,2,3,4,4-d5约为15μg/mL，琥珀酸-2,2,3,3-d4和DL-甲硫氨酸-3,3,4,4-d4约为10μg/mL，L-苯丙氨酸-d5、DL-色氨酸-2,3,3-d3和氯化胆碱-三甲基-d9约为5μg/mL)。

1.2制备脂质组学内标混合溶液：

取适量的磷脂酰胆碱16:0-d31-18:1、磷脂酰乙醇胺14:0-14:0、磷脂酰甘油16:0-d31-18:1、磷脂酰丝氨酸14:0-14:0和磷脂酸17:0-17:0等5种脂质组学内标(包含3种原型化合物内标和2种同位素标记物内标)，分别加入甲醇(或异丙醇)配制成5种单一脂质组学内标母液(其中：5种内标的浓度如下：磷脂酰胆碱16:0-d31-18:1和磷脂酰乙醇胺14:0-14:0约为2mg/mL，磷脂酰甘油16:0-d31-18:1、磷脂酰丝氨酸14:0-14:0和磷脂酸17:0-17:0约为1mg/mL)，再分别取适量的5种单一脂质组学内标母液，混合并对应加入适量的甲醇(或异丙醇)，配制成脂质组学内标混合溶液(其中，5种内标的浓度如下：磷脂酰甘油16:0-d31-18:1、磷脂酰丝氨酸14:0-14:0和磷脂酸17:0-17:0约为30μg/mL，磷脂酰胆碱16:0-d31-18:1和磷脂酰乙醇胺14:0-14:0约为20μg/mL)。

2.通过不同前处理方法提取微量生物样本：

2.1双相溶剂单次提取的前处理方法(样本编号为6号)：

称取大鼠大脑皮层约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL，再加入氯仿200μL和氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，再次振荡5min，放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出全部上清液400μL，真空浓缩干燥，向残渣中加入甲醇100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液用于代谢组学研究。

将取出全部上清液后留下的下层有机相500μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入1M盐酸50μL和氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液用于脂质组学研究。

本方法的流程类似于图1中的B法。

2.2本发明的前处理方法(样本编号为3号)：

称取大鼠大脑皮层约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出部分上清液(约100μL)，用于代谢组学研究。

向残余上清液和残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、1M盐酸50μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相500μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究。

本方法的流程类似于图1中的D法。

3.选定仪器及分析条件：

3.1选定仪器：

Thermo Scientific vanquish液相色谱仪串联Thermo Scientific Q-Exactive质谱仪，代谢组学和脂质组学均采用同一套设备。

3.2选定液相色谱条件：

3.2.1代谢组学的液相色谱条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(150mm×2.1mm,1.8μm)；

流动相：在正离子模式下，以0.1％甲酸水溶液(每1L水溶液中含1mL甲酸)作为流动相A，以0.1％甲酸乙腈溶液(每1L乙腈溶液中含1mL甲酸)作为流动相B；在负离子模式下，以5mM甲酸铵水溶液(每1L水溶液中含5mmol甲酸铵)作为流动相A，以乙腈作为流动相B；

洗脱方式：采用梯度洗脱，具体程序如下：0～1min，2％流动相A；1～9min，2％～50％流动相A；9～12min，50％～98％流动相A；12～13.5min，98％流动相A；13.5～14min，98％～2％流动相A；14～20min，2％流动相A；

流速：0.25mL/min；

进样量：2μL；

柱温：40℃。

3.2.2脂质组学的液相色谱条件：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100mm×2.1mm,1.7μm)；

流动相：在正离子模式下，以乙腈/水混合溶剂(64:40，v:v)作为流动相A，其中含0.1％甲酸和10mM甲酸铵(即每1L乙腈/水混合溶剂中含1mL甲酸和10mmol甲酸铵)，以异丙醇/乙腈混合溶剂(90:10，v:v)作为流动相B，其中含0.1％甲酸和10mM甲酸铵(即每1L异丙醇/乙腈混合溶剂中含1mL甲酸和10mM甲酸铵)；

洗脱方式：采用梯度洗脱，具体程序如下：0～2min，85％～70％流动相A；2～2.5min，70％～52％流动相A；2.5～11min，52％～18％流动相A；11～11.5min，18％～1％流动相A；11.5～12min，1％流动相A；12～12.1min，1％～85％；12.1～15min，85％流动相A；

流速：0.35mL/min；

进样量：2μL；

柱温：50℃。

3.3选定质谱条件：

3.3.1代谢组学的质谱条件：

数据采集方式：采用一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描(full MS-ddMS2)模式测定，同时获得一级和二级质谱数据；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

喷雾电压：在正离子模式下为3.5kV，在负离子模式下为2.5kV；

鞘气压力：30arb；

辅助气压力：10arb；

毛细管温度：325℃；

全扫描分辨率为70000，二级分辨率为17500，质谱扫描范围为m/z 81～1000；

采用高能诱导裂解技术(HCD)进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时动态排除无必要的二级质谱信息。

3.3.2脂质组学的质谱条件：

数据采集方式：采用一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描(full MS-ddMS2)模式测定，同时获得一级和二级质谱数据；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；

喷雾电压：在正离子模式下为3.5kV，在负离子模式下为2.5kV；

鞘气压力：30arb；

辅助气压力：10arb；

毛细管温度：325℃；

全扫描分辨率为35000，二级分辨率为17500，质谱扫描范围为m/z 150～2000；

采用高能诱导裂解技术(HCD)进行二级裂解，碰撞电压为30eV，同时动态排除无必要的二级质谱信息。

4.代谢组学和脂质组学数据处理：

4.1代谢组学数据处理：

原始数据转置：将6号样本和3号样本分别在正、负离子模式下获得原始数据文件4个*.raw，经ProteoWizard软件(开源软件，可以通过http://proteowizard.sourceforge.net/获取)进行数据转置，形成分别包括在正、负离子模式下的一级质谱转置数据和二级质谱转置数据的*.mzXML文件。

转置后数据解卷积：正、负离子模式下的一级质谱转置数据的*.mzXML文件借助biodeep云平台(也可以通过http://www.bioconductor.org/下载相应的开源软件和脚本)进行解卷积，6号样本在正离子模式下得到7297个一级变量，在负离子模式下得到5505个一级变量；3号样本在正离子模式下得到9602个一级变量，在负离子模式下得到7721个一级变量，对应输出作为一级解卷积结果的peaktable_pos.xlsx和peaktable_neg.xlsx文件，两个文件中均包括xc_ms id(一级变量编号)、mz(母离子质荷比)、rt(保留时间)、intensity(峰面积)等一级变量信息。

二级质谱数据分析-代谢物鉴定：解卷积后的一级变量和二级质谱转置数据结合，进行代谢物鉴定，6号样本在正离子模式下获得481个代谢物，在负离子模式下获得184个代谢物；而3号样本在正离子模式下获得470个代谢物，在负离子模式下获得181个代谢物。如表1所示，两种方法得到代谢组学的物质数量相差不大。

表1. 6号样本和3号样本经非靶向代谢组学检测得到的代谢物数量

4.2脂质组学数据处理：

将6号样本和3号样本在正、负离子模式下获得脂质组学原始数据文件4个*.raw，两个样本的基峰离子色谱图如图2所示。较为直观地，正离子模式下，比较3号样本和6号样本在5min-7.7min时间段内的色谱峰可知，3号样本获得的峰色谱个数要多于6号样本；负离子模式下，比较3.61min时间点处色谱峰可知，3号样本中的色谱响应要高于6号样本。

经Thermo lipidsearch 4.2商用软件进行注释，一级注释中选定的参数主要有ParentSearch_QEX模式，ExpType(实验类型)为LC-MS模式，Parent tolerance(母离子偏差)为3ppm，Merge Range(合并范围)为0.1min，一级注释中脂质以脂肪酰和其他脂质为主，加和正离子模式选择+H，+NH

5.两种前处理方法的结果比对：

如图5所示，在Parent模式下，3号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为1018和888个，6号样本对应为983和839个；在Product模式下，3号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为622和536个，6号样本对应为614和522个。上述结果表明，3号样本中鉴定到的脂质数量明显优于6号样本(尤其是在Parent模式下)，说明3号样本的前处理方法(即本发明的前处理方法)能够使微量样本中脂质成分的提取效率显著提高。

实施例二：小鼠脑组织样本经过取出全部代谢物提取液的前处理方法和本发明的前处理方法的结果比对

1.制备代谢组学内标混合溶液和脂质组学内标混合溶液：

同实施例一。

2.通过不同前处理方法提取微量生物样本：

2.1本发明的前处理方法(样本编号为A1号)：

称取小鼠脑组织约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出部分上清液(约150μL)，用于代谢组学研究。

向残余上清液和残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、1M盐酸50μL、水150μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相550μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究。

本方法的流程类似于图1中的D法。

2.2全部取走上清液的前处理方法(样本编号为A2号)：

称取小鼠脑组织约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取走全部上清液，用于代谢组学研究。

向残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、1M盐酸50μL、水150μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相550μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究。

本方法的流程类似于图1中的C法。

3.选定仪器及分析条件：

同实施例一。

4.代谢组学和脂质组学数据处理：

4.1代谢组学数据处理：

代谢组学原始数据转置后解卷积结果：正、负离子模式下的一级质谱转置数据的*.mzXML文件借助biodeep云平台(也可以通过http://www.bioconductor.org/下载相应的开源软件和脚本)进行解卷积，A1号样本在正离子模式下得到10648个一级变量，在负离子模式下得到13919个一级变量；A2号样本在正离子模式下得到10673个一级变量，在负离子模式下得到14002个一级变量，对应输出作为一级解卷积结果的peaktable_pos.xlsx和peaktable_neg.xlsx文件，两个文件中均包括xc_ms id(一级变量编号)、mz(母离子质荷比)、rt(保留时间)、intensity(峰面积)等一级变量信息。

二级质谱数据分析-代谢物鉴定：解卷积后的一级变量和二级质谱转置数据结合，进行代谢物鉴定，A1号样本在正离子模式下获得478个代谢物，在负离子模式下获得187个代谢物；而A2号样本在正离子模式下获得504个代谢物，在负离子模式下获得166个代谢物。如表2所示，两种方法得到代谢组学的物质数量相差不大。

表2.A1号样本和A2号样本经非靶向代谢组学检测得到的代谢物数量

4.2脂质组学数据处理：

参考实施例一，其基峰离子色谱图如图3所示，由于高信号响应脂质会覆盖一些低信号响应脂质的信息，所以在基峰离子色谱图中A1号样本与A2号样本正、负离子模式的谱图较为类似。

5.两种前处理方法的结果比对：

如图5所示，在Parent模式下，A1号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为1713和1022个，A2号样本对应为1683和1002个；在Product模式下，A1号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为843和627个，A2号样本对应为811和596个。上述结果表明，A2号样本中鉴定到的脂质数量明显优于A1号样本，说明A1号样本的前处理方法(即本发明的前处理方法)能够使微量样本中脂质成分的提取效率显著提高，也反映出在提取脂质之前保留一部分提取极性代谢物后的上清液将有助于后续脂质提取的高覆盖。

实施例三：大鼠大脑皮层样本经过水相中未加酸的前处理方法和本发明的前处理方法的结果比对

1.制备代谢组学内标混合溶液和脂质组学内标混合溶液：

同实施例一。

2.通过不同前处理方法提取微量生物样本：

2.1水相中未加酸的前处理方法(样本编号为D-M-1号)：

称取大鼠大脑皮层约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出部分上清液(约150μL)，用于代谢组学研究。

向残余上清液和残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、水200μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相550μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究。

本方法的流程类似于图1中的D法，仅用水替代酸水。

2.2本发明的前处理方法(样本编号为D-M-2号)：

称取大鼠大脑皮层约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出部分上清液(约150μL)，用于代谢组学研究。

向残余上清液和残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、1M盐酸50μL、水150μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相550μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究。

本方法的流程类似于图1中的D法。

3.选定仪器及分析条件：

同实施例一。

4.代谢组学和脂质组学数据处理：

4.1代谢组学数据处理：

代谢组学原始数据转置后解卷积结果：正、负离子模式下的一级质谱转置数据的*.mzXML文件借助biodeep云平台(也可以通过http://www.bioconductor.org/下载相应的开源软件和脚本)进行解卷积，D-M-1号样本在正离子模式下得到10011个一级变量，在负离子模式下得到11700个一级变量；D-M-2号样本在正离子模式下得到9960个一级变量，在负离子模式下得到11970个一级变量，对应输出作为一级解卷积结果的peaktable_pos.xlsx和peaktable_neg.xlsx文件，两个文件中均包括xc_ms id(一级变量编号)、mz(母离子质荷比)、rt(保留时间)、intensity(峰面积)等一级变量信息。

二级质谱数据分析-代谢物鉴定：解卷积后的一级变量和二级质谱转置数据结合，进行代谢物鉴定，D-M-1号样本在正离子模式下获得419个代谢物，在负离子模式下获得171个代谢物；而D-M-2号样本在正离子模式下获得451个代谢物，在负离子模式下获得171个代谢物。如表3所示，D-M-2号样本中鉴定到的代谢物数量要稍多于D-M-1号样本，但理论上两者的数量应相差不大。

表3.D-M-1号样本和D-M-2号样本经非靶向代谢组学检测得到的代谢物数量

4.2脂质组学数据处理：

参考实施例一，其基峰离子色谱图如图4所示，正离子模式下，在1min-5min时间段内，加酸提取获得的物质峰数量(B)要多于未加酸提取的物质峰数量(A)；负离子模式下，在2min-5min时间段内，加酸提取获得的物质峰数量(D)要多于未加酸提取的物质峰数量(C)，且D中整个离子流图的信号响应为1.73×10

5.两种前处理方法的结果比对：

如图5所示，在Parent模式下，D-M-1号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为1098和782个，D-M-2号样本对应为1283和942个；在Product模式下，D-M-1号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为778和450个，D-M-2号样本对应为852和576个。上述结果表明，D-M-2号样本中鉴定到的脂质数量明显优于D-M-1号样本，说明D-M-2号样本的前处理方法(即本发明的前处理方法)能够使微量样本中脂质成分的提取效率显著提高，也反映出在脂质提取过程中引入酸能够更好地提取某些脂质。

实施例四：小鼠脑组织样本经过不同酸种类和不同盐酸浓度的前处理方法的结果比对

1.制备代谢组学内标混合溶液和脂质组学内标混合溶液：

同实施例一。

2.通过不同前处理方法提取微量生物样本：

2.1本发明的前处理方法(样本编号为T1号)：

称取小鼠脑组织约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出部分上清液(约150μL)，用于代谢组学研究。

向残余上清液和残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、1M盐酸50μL、水150μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相550μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究。

2.2脂质提取中使用不同种类的酸提取的前处理方法(样本编号为T2号和T3号)：

称取小鼠脑组织约50mg，放置于干净离心管(2mL)中，加入1.1项下制备的代谢组学内标混合溶液200μL和甲醇100μL，放入2颗钢珠，40Hz频率振荡30s，振荡2次；样本破碎后，保持室温环境提取振荡30min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出部分上清液(约150μL)，用于代谢组学研究。

向残余上清液和残渣中加入1.2项下制备的脂质组学内标混合溶液100μL、3％甲酸(质量浓度，m/v，下同)50μL、水150μL和氯仿200μL，再加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)450μL，40Hz频率振荡10s，振荡2次；再放置于冰上继续提取40min；提取结束后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm；取出下层有机相550μL放置于另外的干净离心管(2mL)中，再向残渣中加入氯仿/甲醇混合溶剂(2:1，v/v)500μL，涡旋混匀后，放置于冰上继续提取10min，取出全部下层有机相，与之前取出的下层有机相合并，真空浓缩干燥，向残渣中加入异丙醇/甲醇混合溶剂(4:1，v/v)100μL进行复溶，涡旋混匀后，于4℃离心机中离心10min，12000rpm，取出上清液，用于脂质组学研究，标为样本T2。

另一种前处理操作同2.2项中的方法，加入的酸为乙酸，质量浓度为3％(m/v)，标为样本T3(备注：当盐酸的摩尔浓度为1M(mol/L)时，对应的盐酸质量浓度约为3％，m/v)。

2.3不同盐酸浓度的前处理方法(样本编号T4和T5)

前处理操作同2.1项中的方法，加入盐酸的浓度分别为0.1M和0.5M，标为样本T4和T5。

3.选定仪器及分析条件：

同实施例一。

4.代谢组学和脂质组学数据处理：

4.1代谢组学数据处理：

代谢组学原始数据转置后解卷积结果：正、负离子模式下的一级质谱转置数据的*.mzXML文件借助biodeep云平台(也可以通过http://www.bioconductor.org/下载相应的开源软件和脚本)进行解卷积，各样本的注释结果如表4所示。由于代谢组学实验操作方法相同，代谢物鉴定结果平行性较好。

表4.T1～T5样本经非靶向代谢组学检测得到的代谢物数量

4.2脂质数据处理结果：

如图6所示，在Parent模式下，T1号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为1244和868个，T2号样本对应为1048和772个，T3号样本对应为1152和814个，T4号样本对应为921和669个，T5号样本对应为1158和779个；在Product模式下，T1号样本在正离子(pos)和负离子(neg)模式下的脂质数量分别为546和600个，T2号样本对应为511和530个，T3号样本对应为597和548个，T4号样本对应为413和420个，T5号样本对应为529和554个。上述结果表明，从Product模式看，盐酸和乙酸总体的提取效率差不多，脂质总数约1145个；但根据Parent模式看，盐酸的提取效率要优于乙酸和其他的几种处理方法。结合Parent和Product综合结果，可知盐酸用于提取脂质的效率要优于其他酸(甲酸或乙酸)，且提取时的最优盐酸浓度是1M。