一种GP73抑制剂在制备治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中的应用

摘要

本发明实施例涉及一种GP73抑制剂在制备治疗SARS‑CoV‑2肺炎及其并发症的药物中的应用。本发明实施例中发明人发现胆固醇能促进ACE2在细胞膜表面富集，同时GP73参与胆固醇促进的ACE2在细胞膜的富集以及参与胆固醇促进的SARS‑CoV‑2病毒入侵。发明人还通过细胞实验证明了：GP73抑制剂能够降低ACE2在细胞膜的富集并阻止SARS‑CoV‑2病毒入侵，从而可以达到治疗SARS‑CoV‑2肺炎及其并发症的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，进一步涉及一种GP73抑制剂在制备治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中的应用。

背景技术

SARS-CoV-2是已知的冠状病毒家族中第7个能够感染人类的成员，属于冠状病毒家族的β属冠状病毒，目前，尚无针对SARS-CoV-2的特异性抗病毒药物。

SARS-CoV-2基因组为不分节段的单股正链RNA，是位于病毒颗粒中央的不规则核酸部分。SARS-CoV-2病毒颗粒包括刺突蛋白S、包膜蛋白E、膜蛋白M和核衣壳蛋白N 这4种结构性蛋白。SARS-CoV-2S蛋白与其受体结合后,诱导病毒的蛋白发生结构上的 变化，暴露穿膜有效结构域，介导病毒与宿主细胞膜融合，进而侵入细胞引起感染。血 管紧张素转化酶2(ACE2)是SARS-CoV入侵细胞的主要功能性受体，它也是 SARS-CoV-2的主要受体。

胆固醇不仅是细胞膜的重要组成部分，还是胆汁酸、维生素D及固醇类激素等很多具有重要生理功能的生物活性物质的前体，因此，胆固醇稳态对维持细胞和生命体正常 的功能至关重要，系统水平的胆固醇稳态需要不同组织的协调。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当 被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为解决现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种GP73抑制剂在制备治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中的应用。本发明实施例中发明人发现胆固醇能促 进ACE2在细胞膜表面富集，同时GP73参与胆固醇促进的ACE2在细胞膜的富集以及参 与胆固醇促进的SARS-CoV-2病毒入侵。发明人还通过细胞实验证明了：GP73抑制剂能 够降低ACE2在细胞膜的富集并阻止SARS-CoV-2病毒入侵，从而可以达到治疗 SARS-CoV-2肺炎及其并发症的效果。

本发明提供了以下技术方案：

本发明的第一方面在于，提供了一种GP73抑制剂在制备治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中的应用。

本发明的第二方面在于，提供了一种用于治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物， 所述药物包括GP73抑制剂。

本发明的第三方面在于，提供了一种用于治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的方法， 包括以下步骤：向患有SARS-CoV-2肺炎的受试者施用有效剂量的GP73抑制剂。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述GP73抑制剂选自以下的一种或多种：下调GP73水平、活性、功能和/或稳定性的多肽、蛋白质、核酸序列或小分 子化合物；可选地，所述下调GP73水平、活性、功能和/或稳定性的多肽、蛋白质、核 酸序列或小分子化合物具有以下性质中的一种或多种：(1)能抑制编码GP73的基因转 录、正确剪切和/或翻译；(2)抑制或阻碍GP73与机体内的受体和/或配体结合；(3) 抑制或阻碍GP73与机体内的特异性相互作用分子的相互作用；(4)缩短GP73在机体 内的半衰期。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述GP73选自全长GP73或不包括1-55位氨基酸的GP73。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，GP73抑制剂选自以下的一种或多种：抗GP73单克隆抗体或包含其抗原结合部位的抗体片段，抗GP73单克隆抗体或包 含其抗原结合部位的抗体片段的融合蛋白，特异性抑制GP73的核酸序列。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述抗GP73单克隆抗体选自： 杂交瘤细胞生产的单克隆抗体、抗体库筛选的单克隆抗体、单细胞PCR生产的单克隆抗 体、基因工程改造的单克隆抗体、异源性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体、 纳米抗体(Nanobody)、重链抗体(Heavy chain antibody)中的一种或多种。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述抗体片段的种类选自：Fab、Fab-SH、Fv、scFv、F(ab′)

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述特异性抑制GP73的核酸选自：siRNA、shRNA、microRNA、反义寡核苷酸、miRNA、核酸适配体中的一种或多 种；可选地，特异性抑制GP73的siRNA选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9所示的核苷酸序 列中的一条或多条；可选地，特异性抑制GP73的siRNA选自SEQ ID NO:4所示的核苷酸 序列。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症为以下的一种或多种：(1)降低ACE2在细胞膜的富集程度；(2)降低SARS-CoV-2 病毒对细胞的入侵。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中还包括治疗SARS-CoV-2肺炎的其他药物，治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发 症的方法中联合使用GP73抑制剂和治疗SARS-CoV-2肺炎的其他药物。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述治疗SARS-CoV-2肺炎的其他药物选自氯喹、羟氯喹、瑞德西韦中的一种或多种。

上述应用、药物在一种可能的实现方式中，所述药物还包括至少一种药学上可接受 的辅料。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述药物的使用方式为静脉注射、 肌肉注射、皮下注射、口服给药中的一种或多种。即药物为静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射机、口服剂中的一种或多种。

上述方法在一种可能的实现方式中，所述受试者选自人、小鼠、大鼠、猴、兔子、猪、狗中的一种或多种。

本发明的第四方面在于，提供了一种特异性抑制GP73的siRNA在制备治疗 SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中的应用。

本发明的第五方面在于，提供了一种用于治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物， 所述药物选自：特异性抑制GP73的siRNA。

本发明的第六方面在于，提供了一种用于治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的方法， 包括以下步骤：向患有SARS-CoV-2肺炎及其并发症的受试者施用有效剂量的、特异性抑制GP73的siRNA。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述GP73选自全长GP73或不包括1-55位氨基酸的GP73。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述特异性抑制GP73的siRNA 选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列中的一条或多条；可选地，特异性抑 制GP73的siRNA选自SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症为以下的一种或多种：(1)降低ACE2在细胞膜的富集程度；(2)降低SARS-CoV-2 病毒对细胞的入侵。

上述应用、药物在一种可能的实现方式中，所述药物还包括至少一种药学上可接受 的辅料。

上述应用、药物、方法在一种可能的实现方式中，所述药物的使用方式为静脉注射、 肌肉注射、皮下注射、口服给药中的一种或多种。即药物为静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射机、口服剂中的一种或多种。

上述方法在一种可能的实现方式中，所述受试者选自人、小鼠、大鼠、猴、兔子、猪、狗中的一种或多种。

本发明实施例中发明人发现胆固醇能促进ACE2在细胞膜表面富集，并进一步发现GP73参与胆固醇促进的ACE2在细胞膜富集以及参与胆固醇促进的SARS-CoV-2病毒入 侵。在此基础上，发明人发现：应用GP73抑制剂能够降低ACE2在细胞膜表面富集，并 降低SARS-CoV-2病毒对细胞的入侵，从而对SARS-CoV-2肺炎及其并发症达到治疗作 用。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明 并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。

这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1A显示的是本发明实施例1中通过流式细胞术的方法，检测在胆固醇刺激的条件下，细胞表面ACE2的富集程度。从左到右依次是胆固醇(上图)或干扰素(下图) 刺激细胞0h、2h、4h、8h、12h后的细胞表面ACE2的富集程度。图1B显示的是本发明 实施例1中通过流式细胞术方法检测细胞表面ACE2的MFI值。*,P<0.05；**,P<0.01； ***,P<0.001。

图2A显示的是本发明实施例2中通过免疫印迹方法，检测GP73在Huh-7细胞的敲低效率。图2B显示的是本发明实施例2中通过流式细胞术方法，检测胆固醇促进ACE2 在细胞膜表面的富集程度是否依赖GP73。图2C显示的是本发明实施例2中通过流式细 胞术方法检测细胞表面ACE2的MFI值。*，P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

图3A显示的是本发明实施例3中通过免疫印迹方法，检测GP73在Huh-7细胞的敲低效率。图3B显示的是本发明实施例3中不同胆固醇浓度对SARS-CoV-2假病毒入侵 Huh-7细胞的影响，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。图3C显示的是本发明实施例 3中胆固醇刺激不同时间对SARS-CoV-2假病毒入侵Huh-7细胞的影响。图3D显示的是 本发明实施例3中改变GP73表达量的情况下，胆固醇对SARS-CoV-2假病毒入侵Huh-7 细胞的影响，*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

图4A显示的是本发明实施例4中GP73敲低，对SARS-CoV-2真病毒感染能力的影响；图4B显示的是本发明实施例4中用不同的细胞系验证GP73对真病毒感染的影响； *,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中 的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技 术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范 围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实例中， 对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换 如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元 件或其它组成部分。

本发明中，“GP73”一词是指高尔基体跨膜糖蛋白73(GP73，其序列如SEQ ID NO:11所示)，又叫GOLM1(Golgi membrane protein 1)或者GOLPH2(Golgi phosphorprotein 2)，其是2000年Kladney发现的一种新的高尔基体膜蛋白。GP73的第55位氨基酸附 近有一个前蛋白转化酶(Proprotein convertase,PC)的切割位点，全长GP73被PC切割后 可以从高尔基体释放，分泌进入血液循环系统。本发明中，所述GP73选自全长GP73或 不包括1-55位氨基酸的GP73。当“GP73”一词与其他词语搭配时，其同样具有此处定义 的含义，如：GP73抑制剂、抗GP73抗体、抗GP73单克隆抗体中的GP73均具有此处定 义的含义。

本发明中，“GP73抑制剂”一词是指任何可以下调GP73水平(包括基因水平或蛋白质水平)、活性、功能和/或稳定性的多肽、蛋白质、核酸序列或小分子化合物。GP73 抑制剂包括但不限于抗GP73抗体(包括抗GP73单克隆抗体)，特异性抑制GP73的siRNA， 特异性抑制GP73的shRNA、特异性抑制GP73的microRNA、特异性抑制GP73的反义寡 核苷酸，特异性抑制GP73的核酸适配体。

本发明中，“抗体”一词指由四条多肽链组成的免疫球蛋白分子，四条多肽链指通过 二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。

本发明中，“单克隆抗体”一词指高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，其可以通过已知的例如杂交瘤技术、抗体库技术、转基因小鼠技术或单细胞PCR技术来制备。

本发明中，“嵌合抗体”一词指利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达 的抗体分子中轻重链的可变区是异源的，而恒定区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3 部分都是人源的。这样产生的抗体，减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗 体特异性结合抗原的能力。

本发明中，“人源化抗体”一词指由于嵌合抗体的可变区中的FR仍残留一定的免疫原 性，为减少异源成分，利用基因工程技术在嵌合抗体的基础上，用人FR替代异源FR， 形成人源化程度更高的抗体，即除了CDR是异源的外，其余全是人源结构，使人源化抗 体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性；或通过表面重塑等技术将异源 性抗体的大部分氨基酸序列用人源序列取代，同时基本保留亲本异源单克隆抗体的亲和 力和特异性，又降低了其异源性，有利于应用于人体的单克隆抗体。

本发明中，“全人源抗体”一词指通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基 因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源的目的；或通过人抗体库筛选获得的单克隆抗体，或通过单细胞PCR技术获得的人 单克隆抗体。

本文中，“抗体的抗原结合片段”一词指全长抗体的一部分，通常是靶结合区或可变 区。

本文中，纳米抗体、重链抗体、Fab、Fab-SH、Fv、scFv、F(ab′)

本文中，“治疗”一词指能产生有益或期望的结果，包括但不限于：一种或多种症状的预防、减轻、改善或治愈，病症程度的减轻，与预期存活期相比存活期延长。

本文中，“有效剂量”一词指当通过本发明实施例的方法给予所述有效成分时，足以 有效传递用于治疗疾病的活性成分的量，也可以是有效成分经单次或多次施用于患者而 给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效剂量可由所参与的临床医师作 为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施 用有效成分的有效量或剂量时，所参与的临床医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程 度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物 利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本文中，“药学上可接受的辅料”可以是常规制剂用的药用载体、赋形剂及其它添加 剂，如常见的抗体药物的辅料。

实施例1、胆固醇能促进ACE2在细胞膜表面富集

检测ACE2阳性率的实验方法：为研究胆固醇对细胞膜ACE2的影响，我们采取流 式细胞术的方法对受胆固醇刺激后的细胞表面ACE2的量进行检测。流式细胞术的检测 方法如下：Huh-7细胞在60mm的培养皿中37℃培养至汇合度达到70％左右，PBS洗涤 一遍，用0.25％胰酶消化细胞后，用DMEM终止胰酶消化，分别用100μM胆固醇(实 验组)和1000UIFN-β(对照组)孵育0、2、4、8、12h后，收集细胞至1.5mL EP管中， 1500rpm离心3分钟，去除上清后加入1mL PBS洗涤细胞，再次离心，去除上清，用含 1％anti-ACE2抗体(购自proteintech)的0.5％BSA溶液100μL孵育半小时，PBS洗涤 1遍，用含1％Alexa

实验结果：随着胆固醇刺激时间的增加，实验组的细胞表面ACE2阳性的细胞比例逐渐增加；对照组用IFN-β处理细胞后，细胞表面ACE2阳性的细胞比例无明显变化(图 1A)。随着胆固醇刺激时间的增加，细胞表面ACE2的平均荧光强度MFI的值逐渐增 加；对照组用IFN-β处理细胞后，细胞表面ACE2的平均荧光强度MFI的值无明显变化 (图1B)。

实施例2、GP73参与胆固醇促进ACE2在细胞膜的富集

实验方法：

1、特异性RNAi oligos敲低GP73：我们拟用GP73特异性RNAi oligos敲低的方式，研究GP73是否参与胆固醇促进ACE2在细胞膜富集，为此我们合成了针对GP73不同位 点共9条RNAi oligos(表1，SEQ ID NO.1-9)，其中：SEQ ID No.4RNAi oligos序列对细 胞内源GP73具有较好的敲低效率。随后，我们在吉玛基因公司合成了3’端胆固醇修饰、 两端硫代骨架修饰以及全链甲氧基修饰的SEQ ID No.4GP73 RNAi oligos(GP73 siRNA)， 这种化学修饰后的siRNA在体内的稳定性为3-6天，序列被打乱的RNAi oligos作为对照 (siCtrl；表1)。

表1：GP73 siRNA的序列

将Huh-7细胞分为两组，一组为siCtrl，一组为siGP73，首先在转染前30min半量换液，取两只RNase-Free EP管做好标记，分别加jetPRIME Buffer 0.4ml，然后向EP管 中分别加4μL Negative Control(siCtrl组)和4μL针对gp73-mRNA的siRNA oligo(吉 玛基因公司合成的3’端胆固醇修饰、两端硫代骨架修饰以及全链甲氧基修饰的SEQ ID No.4 GP73RNAi oligos)，混匀后瞬离并静置5min，然后加8μL jetPRIME transfection reagent，混匀后瞬离并静置15min后加到细胞中摇匀，6h后更换为新鲜培养基，12h后 再重复一次敲低即可。

2、本发明中，Western Blot检测敲低效率的实验方法如下：将细胞离心后加100μLPBS重悬，再加100μL 4％SDS细胞裂解液，煮样10min后，12000rpm/10min即可，用 8％预制胶上样，上样量为10μL，80V跑出浓缩胶后电压调至120V，跑至溴酚蓝距离下 端1cm时停止电泳，18V转膜70min后将PVDF膜于快速封闭液(购自Biosharp公司) 中封闭5min，于室温孵育anti-GP73抗体(抗体：5％脱脂奶粉＝1：1000，购自Santa Cruz 公司)或anti-α-Tubulin抗体(抗体：5％脱脂奶粉＝1:5000，购自sigma公司)2h后，TBST 洗三次，再于室温孵育相应种属的二抗(抗体：5％脱脂奶粉＝1:7000，购自中杉金桥公 司)1h，随后TBST洗三次，再将PVDF膜吸干水后，加化学发光液(购自PerkinElmer 公司)，涂匀后，于成像仪(购自Tanon公司)下显影。

实验结果：GP73的敲低效率大约有60％左右(图2A)，在对照组siCtrl中，随着 胆固醇刺激时间的增加，细胞表面ACE2阳性的细胞比例及MFI的值呈逐渐上升的趋势， 而敲低GP73的细胞，随着胆固醇刺激时间的延长，细胞表面ACE2阳性的细胞比例及 MFI的值无明显变化(图2B、2C)。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

实施例3、GP73参与胆固醇促进假病毒入侵的过程

实验方法：

本发明中，假病毒的构建方法如下：将293T细胞在10cm的培养皿上培养至70％ 左右，将带有荧光素酶报告基因的12μg pNL4-3.Luc.E-R质粒(购自Addgene)和6μg的pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S质粒(我们首先将分离株的S基因NCBI Reference Sequence: NC_045512.2通过全合成获得，并将其构建在真核表达载体pcDNA3.1上，获得 pcDNA3.1-SARS-CoV-2-S表达载体)共转染，48h后收取上清，用20％蔗糖溶液50000g 离心90分钟纯化后，获得表达SARS-CoV-2S蛋白的假病毒。

1、胆固醇浓度梯度对假病毒感染活性的影响实验方法如下：用含0.1％FBS的DMEM培养基将Huh-7细胞接种于96孔板，每孔细胞量为5000个；随后用上述含 0.1％FBS的DMEM分别配制胆固醇终浓度为25μM、50μM、75μM、100μM、150μM、 200μM的培养基；待细胞贴壁后，培养基更换成上述含胆固醇的培养基，刺激12h后， 再换成不含胆固醇的培养基，然后向各个孔中加15μL假病毒，72h后于酶标仪检测荧 光素酶强度。

2、胆固醇时间梯度对假病毒感染活性的影响实验方法如下：用含0.1％FBS的DMEM培养基将Huh-7细胞接种于96孔板，每孔细胞量为5000个；随后用上述含 0.1％FBS的DMEM配制胆固醇终浓度100μM的培养基；待细胞贴壁后，分别在加病毒 前的0、4、8、12h将原培养基更换成上述含100μM胆固醇的培养基，然后将培养基更 换成不含胆固醇的培养基，向每个孔中加15μL假病毒，72h后于酶标仪检测荧光素酶 强度。

4、敲低GP73对假病毒感染活性的影响实验方法如下：Huh-7细胞分为两组，一组为siCtrl，一组为siGP73，首先在转染前30min半量换液，取两只RNase-Free EP管做 好标记，分别加jetPRIME Buffer 0.4mL，然后向EP管中分别加4μL Negative Control (siCtrl组)和4μL针对gp73-mRNA的siRNA oligo(由吉玛基因公司合成的3’端胆固 醇修饰、两端硫代骨架修饰以及全链甲氧基修饰的SEQ ID No.4GP73 RNAi oligos)， 混匀后瞬离并静置5min，然后加8μL jetPRIME transfection reagent，混匀后瞬离并静置 15min后加到细胞中摇匀，6h后更换培养基，12h后再重复一次敲低即可。按照实施例 2中Western Blot检测敲低效率的实验方法进行检测。Huh-7细胞用siRNA-Negative Control和敲低GP73的siRNA处理后，将细胞传至96孔板，细胞量为每孔5000个， 待细胞贴壁后，更换含100μM胆固醇的培养基刺激12h后再换成无胆固醇的培养基， 然后向对应的孔中加15μL假病毒，72h后于酶标仪检测荧光素酶强度。

实验结果：GP73的敲低效率大约为50％左右(图3A)；随着胆固醇浓度的增加， 假病毒进入的量呈明显上升的趋势(图3B)；随着胆固醇刺激时间的增加，假病毒进 入的量呈明显上升的趋势(图3C)；敲低GP73后，胆固醇对假病毒的侵入的促进作用 明显降低(图3D)*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

实施例4、GP73参与胆固醇促进真病毒入侵的过程

实验方法：

1、敲低GP73对真病毒感染活性的影响实验方法如下：Huh-7细胞分为两组，一组为siCtrl，一组为siGP73，首先在转染前30min半量换液，取两只RNase-Free EP管做 好标记，分别加jetPRIME Buffer 0.4ml，然后向EP管中分别加4μL Negative Control(siCtrl组)和4μL针对gp73-mRNA的siRNA oligo(由吉玛基因公司合成)，混匀后瞬离并静 置5min，然后加8μL jetPRIME transfection reagent，混匀后瞬离并静置15min后加到细 胞中摇匀，6h后更换培养基，12h后再重复一次敲低即可。Huh-7细胞用siRNA-Negative Control和敲低GP73的siRNA处理后，将细胞传至96孔板，细胞量为每孔5000个， 待细胞贴壁后更换含100μM胆固醇的培养基刺激12h后再换成无胆固醇的培养基，每 孔中按MOI＝0.1的量加入真病毒(该真病毒为SARS-CoV-2株 BetaCoV/Beijing/IME-BJ01/2020(131)，从一例新冠感染病人的肺液中分离获得，参见A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19,Zhanget al.,2020,Cell 182,1271–1283)， 37℃孵育30min后撤掉病毒，裂解细胞，用QIAampViral RNA Mini试剂盒(购自Qiagen 公司)提取病毒RNA，qRT-PCR测病毒RNA的拷贝数。

2、Huh-7/Vero E6 cells用siRNA-Negative Control和敲低GP73的siRNA处理后，加SARS-CoV-2真病毒(MOI＝0.1)，37℃孵育30min后撤掉病毒，裂解细胞，用QIAamp ViralRNA Mini试剂盒提取病毒RNA，qRT-PCR测病毒RNA的拷贝数。

实验结果：与对照组相比，在GP73敲低细胞中，胆固醇对真病毒入侵的增强作用明显降低(图4A)；用不同的细胞系验证，无论是Vero E6细胞或者Huh-7细胞，敲低 GP73都能明显降低真病毒感染(图4B)。*,P<0.05；**,P<0.01；***,P<0.001。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种GP73抑制剂在制备治疗SARS-CoV-2肺炎及其并发症的药物中的应用

<130> 1048-210002F

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

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ccaacaggca uccauccaat t 21

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<211> 401

<212> PRT

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Met Met Gly Leu Gly Asn Gly Arg Arg Ser Met Lys Ser Pro Pro Leu

1 5 10 15

Val Leu Ala Ala Leu Val Ala Cys Ile Ile Val Leu Gly Phe Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Ala Ser Ser Arg Ser Val Asp Leu Gln Thr Arg Ile Met Glu

35 40 45

Leu Glu Gly Arg Val Arg Arg Ala Ala Ala Glu Arg Gly Ala Val Glu

50 55 60

Leu Lys Lys Asn Glu Phe Gln Gly Glu Leu Glu Lys Gln Arg Glu Gln

65 70 75 80

Leu Asp Lys Ile Gln Ser Ser His Asn Phe Gln Leu Glu Ser Val Asn

85 90 95

Lys Leu Tyr Gln Asp Glu Lys Ala Val Leu Val Asn Asn Ile Thr Thr

100 105 110

Gly Glu Arg Leu Ile Arg Val Leu Gln Asp Gln Leu Lys Thr Leu Gln

115 120 125

Arg Asn Tyr Gly Arg Leu Gln Gln Asp Val Leu Gln Phe Gln Lys Asn

130 135 140

Gln Thr Asn Leu Glu Arg Lys Phe Ser Tyr Asp Leu Ser Gln Cys Ile

145 150 155 160

Asn Gln Met Lys Glu Val Lys Glu Gln Cys Glu Glu Arg Ile Glu Glu

165 170 175

Val Thr Lys Lys Gly Asn Glu Ala Val Ala Ser Arg Asp Leu Ser Glu

180 185 190

Asn Asn Asp Gln Arg Gln Gln Leu Gln Ala Leu Ser Glu Pro Gln Pro

195 200 205

Arg Leu Gln Ala Ala Gly Leu Pro His Thr Glu Val Pro Gln Gly Lys

210 215 220

Gly Asn Val Leu Gly Asn Ser Lys Ser Gln Thr Pro Ala Pro Ser Ser

225 230 235 240

Glu Val Val Leu Asp Ser Lys Arg Gln Val Glu Lys Glu Glu Thr Asn

245 250 255

Glu Ile Gln Val Val Asn Glu Glu Pro Gln Arg Asp Arg Leu Pro Gln

260 265 270

Glu Pro Gly Arg Glu Gln Val Val Glu Asp Arg Pro Val Gly Gly Arg

275 280 285

Gly Phe Gly Gly Ala Gly Glu Leu Gly Gln Thr Pro Gln Val Gln Ala

290 295 300

Ala Leu Ser Val Ser Gln Glu Asn Pro Glu Met Glu Gly Pro Glu Arg

305 310 315 320

Asp Gln Leu Val Ile Pro Asp Gly Gln Glu Glu Glu Gln Glu Ala Ala

325 330 335

Gly Glu Gly Arg Asn Gln Gln Lys Leu Arg Gly Glu Asp Asp Tyr Asn

340 345 350

Met Asp Glu Asn Glu Ala Glu Ser Glu Thr Asp Lys Gln Ala Ala Leu

355 360 365

Ala Gly Asn Asp Arg Asn Ile Asp Val Phe Asn Val Glu Asp Gln Lys

370 375 380

Arg Asp Thr Ile Asn Leu Leu Asp Gln Arg Glu Lys Arg Asn His Thr

385 390 395 400

Leu