一种絮凝脱色、膜处理和两相萃取纯化皂荚皂苷方法

摘要

本发明属于植物有效成分纯化技术领域，具体涉及一种絮凝脱色、两相萃取和膜处理纯化皂荚皂苷方法。以皂荚为原料制备出45%皂荚皂苷粗品（LY/T 3104—2019中华人民共和国林业行业标准），通过化学絮凝法与膜分离技术对其进行脱色和纯化，使皂苷脱色率达到60%，含量从45%提高到78%‑89%，再通过两相萃取使其纯度达到95%。该研究将化学絮凝、膜分离与两相萃取结合用于皂荚皂苷的纯化和脱色，可为企业制备较高标准的皂荚皂苷产品提供参考。本发明不仅工艺简洁并且脱色效果显著，利于扩大皂荚皂苷产品的生产规模和市场应用。

说明书

技术领域

本发明涉及中草药有效成分制备纯化领域，具体的说是涉及一种絮凝脱色、膜处理和两相萃取纯化皂荚皂苷方法有效成分的方法。

背景技术：

皂荚果皮中的皂苷是天然洗涤品，含有15％～30％三帖皂苷，在食品、医药、农药等多个领域有着广泛应用。几乎所有皂苷都是无定形粉末，仅可溶于水、甲醇、稀乙醇(热)。粗提物纯度较低时时，含有较多的多糖、色素、大分子蛋白等杂质，使得产品色深、易于受潮，则使得应用范围受到了很大限制。皂苷的提取方法主要有水提法、醇提法、超声波和微波辅助提取法等方法。皂苷纯化有树脂吸附、结晶、两相分配和膜分离技术。化学絮凝是一种分离纯化中草药有效成分的固液分离技术，可以除去提取液中的蛋白质、果胶、色素、糖类等杂质。史劲松等“絮凝-膜法制备皂荚皂苷工艺研究”指出提取液中的皂苷与多糖、蛋白等杂质结合紧密,而阳离子瓜儿胶对杂质具有良好的选择性,因而絮凝处理是保证膜法分离过程的关键。如：四川小叶本草生物科技有限公司2017年申请的发明专利“一种滇皂荚总皂苷提取纯化的方法”(申请公布号CN10106309540A)，使用膜处理纯化皂苷。芜湖欧标农业发展有限公司2017年申请的发明专利“一种高纯度皂荚总皂苷提取方法”(申请公布CN107099388A)，用离子膜过滤提高纯度。山东省中医药研究院2009年申请的发明专利“一种皂荚皂昔提取物及其制备方法与应用”(申请公布CN101537036A)采用了大孔树脂纯化。江口县苗药生物科技有限公司2016年申请的发明专利“种皂树皮总皂普的提取工艺,”(申请公布号CN105213471A)，是提取罐中用乙醇提取,提取液浓缩后,加入试剂石油醚,循环萃取两次,上清液放入浓缩罐中,减压浓缩回收溶剂石油醚下层液用乙酸乙酯萃取两次,取上清液,减压回收溶剂乙酸乙酯,冷冻,抽滤,真空干燥,得到产品。本文将化学絮凝与膜分离结合应用于迷迭香酸的纯化和脱色，可为迷迭香酸的分离纯化研究工作奠定基础，为企业利于扩大迷迭香酸产品的生产规模和市场应用提供参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种絮凝脱色、膜处理和两相萃取纯化皂荚皂苷方法。本发明不仅工艺简洁且针对粗提物纯度低时，含有较多的多糖、色素、大分子蛋白等杂质，使得产品色深、易于受潮，等问题进行设计，能够高效从皂荚皂苷粗提取液中去除大分子多糖、蛋白质、色素等杂质，提取高皂荚皂苷纯度，降低色度，扩大皂荚皂苷的市场应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种絮凝脱色、膜处理和两相萃取纯化皂荚皂苷方法，其特征在于所述方法步骤如下：

(1)皂荚皂苷粗品制备：皂荚果皮以1:8的料液比加入酒精溶液，回流提取，套提一次，合并提取液，在闪蒸上浓缩得浓缩液备用；

(2)絮凝脱色除杂：步骤1)所得样液加入絮凝剂进行脱色、絮凝和过滤，除去沉淀得絮凝脱色除杂后样液；

(3)膜处理：步骤2)所得除杂后样液样液通管式膜过滤，透过液通过卷式膜过滤，得浓缩液备用；

(4)两相萃取：步骤3)所得浓缩液：加入有机溶剂萃取，回收有机溶剂，得皂荚皂苷产品。

优选的，所述皂荚皂苷粗品制备步骤如下：

取1200g皂荚果皮以1:8的料液比加入25％的酒精溶液(9600mL)，装入20升提取罐中，回流提取1h，放出萃取液，再按1:5加入6000mL 25％的酒精溶液套提一次，回流提取1h，放出萃取液,合并提取液，4层纱布过滤，在闪蒸上浓缩得浓缩液5000ml；

优选的，所述皂荚絮凝脱色除杂步骤如下：所得皂荚皂苷粗品浓缩液加入总体积(5000ml)为1.5％的双氰胺-双氰胺甲醛或双氰胺-双氰胺铵盐搅拌进行絮凝脱色，静止半小时，离心或过滤，除去沉淀得絮凝脱色除杂后样液4500ml；

优选的，所述膜处理步骤如下步骤如下：

所得絮凝脱色除杂后样液过800nm管式膜(，透过液透过(2/3)，在浓缩液中加入适量水继续浓缩，合并透过液通过截留分子量1000卷式膜过滤，透过液通过截留分子量300卷式膜过滤，得浓缩液备用；

优选的，所述两相萃取步骤如下：

按1:2(体积比)加入有机溶剂萃取，蒸馏回收出正丁醇，得高含量皂荚皂苷产品。

优选的，所述双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂的制备：

在装有搅拌器、温度计、冷凝管的500mL三口瓶中加入100mL 37％甲醛，搅拌下加入50-52g双氰胺，温度会自然上升至38℃左右；在40℃加入氯化铝10g催化剂，反应30min左右时溶液变清澈；加入改性剂氯化铵30-33g。温度控制在40℃左右，反应过程中会升温，搅拌至溶液透明后约1h加入100mL水升温至65-70℃，反应2-2.5h，观察粘度，冷却前再加入100mL水，搅拌30min。

作为首次采用絮凝脱色、膜处理和两相萃取组合纯化皂荚皂苷方法，相关工艺参数需要根据皂荚皂苷理化特性进行创造性的试验选择，实验结果见下：

1.无机及有机絮凝剂种类选择

配制1mg/mL皂苷粗提液，选取13种不同的絮凝剂处理醇提皂苷粗提液，测定其在352nm处的吸光值(稀释2倍)，初步比对不同絮凝剂脱色效果，对脱色溶液离心后测定含量(465nm)结果如表1：

表1无机及有机絮凝剂在465nm处的吸光值一览表

注：皂苷原液A＝0.463，色度906

双氰胺甲醛-双氰胺甲醛、双氰胺甲醛铵盐、改性瓜尔胶为自制。

由表1可以看出高锰酸钾、聚铁脱色差，聚丙烯酰胺阳离子和聚丙烯酰胺阴离子无效。因为高锰酸钾、聚铁自身就带有一定的颜色，从而影响到吸光值的检测。脱色率由高到低为：活性炭＞双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐＞双氰胺甲醛-双氰胺甲醛＞次氯酸钙＞氯化铁＞氧化钙＞聚铝＞改性瓜尔胶＞高锰酸钾。脱色率最高为活性炭、双氰胺甲醛-双氰胺甲醛和双氰胺甲醛铵盐。含量损失最少是双氰胺甲醛-双氰胺甲醛和双氰胺甲醛铵盐。结合脱色率最后选择双氰胺甲醛-双氰胺甲醛和双氰胺甲醛铵盐。

2.絮凝剂加量选择

根据絮凝剂种类选择实验的现象，选取几组不同加量的双氰胺甲醛铵盐、双氰胺甲醛和聚铝三种絮凝剂处理皂苷粗提液，测定上清液中皂苷的含量，结果如表2：

表2絮凝剂色度及吸光值一览表

注：所用皂苷粗提液含量56.88％。

结果表明：絮凝剂加量影响脱色率和含量，25mL皂荚皂苷样液经0.25mL双氰胺甲醛铵盐絮凝剂、0.15mL双氰胺双氰胺甲醛絮凝剂、0.45mL聚铝絮凝剂处理后，脱色效果最佳。结合脱色率，最终选定双氰胺甲醛铵盐絮凝剂为最佳絮凝剂，加量为1.4％。

3.正交试验优化脱色工艺

设计L

表3絮凝剂脱色的正交实验结果及分析

综合指标(％)＝脱色率(％)*0.3+含量(％)*0.7。

对正交试验结果进行方差分析，结果如下：

表4正交的方差分析表

经方差分析知，对脱色率絮凝剂A因素为显著水平。对含量影响，加量A和B因素都达到显著水平。综合指标A因素和B因素达到显著水平，应控制在最优水平，C因素不显著，可以在任意水平。选择的最佳水平组合为A1B2C1，或A2B2C1即：絮凝剂为双氰胺-双氰胺甲醛或双氰胺-双氰胺铵盐，加量为1.5％。

4、膜分离处理实验

选用双氰胺甲醛絮凝剂处理一批提取液原液分五份，经过卷式膜处理后，浓缩成约含固形物10％后，喷雾干燥，得皂苷产品，取一定样品进行液相色谱检测，结果如下表：

表5粗品絮凝膜处理后结果

由表5数据可得经过双氰胺甲醛絮凝剂以及10000分子量、1000分子量两种卷式膜处理后,含量从43％提高到78-89％。

5、两相萃取实验：

确定萃取次数、萃取量、溶剂为研究因素，采用正交表L

表6正交实验结果及极差分析

表7正交实验的方差分析

方差分析表明，C因素显著，A、B因素不显著。C因素优水平为C3。最优组合为C

附图说明

图1本发明工艺流程示意图。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1)工艺简洁，能够高效从皂荚提取纯化皂苷，利于扩大皂荚皂苷的生产规模和市场应用。

2)针对粗提物纯度较低时时，含有较多的多糖、色素、大分子蛋白等杂质，使得产品色深、易于受潮，则使得应用范围受到了很大限制。根据理化特性进行设计，摒弃现有技术中的一般脱色方法，采用絮凝脱色，并配合膜处理脱色除杂和浓缩，最好用有机溶剂萃取把皂苷萃取到正丁醇相，去除水相杂质最终制得高纯度的皂荚皂苷。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

1)皂荚皂苷粗品制备：皂荚果皮以1:8的料液比加入25％酒精溶液，回流提取，套提一次，合并提取液，在闪蒸上浓缩得浓缩液；

2)絮凝脱色除杂：所得样液加入1.5％双氰胺-双氰胺铵盐絮凝剂进行脱色、絮凝和过滤，除去沉淀得絮凝脱色除杂后样液；所述双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂的制备：

在装有搅拌器、温度计、冷凝管的500mL三口瓶中加入100mL 37％甲醛，搅拌下加入50-52g双氰胺，温度会自然上升至38℃左右；在40℃加入氯化铝10g催化剂，反应30min左右时溶液变清澈；加入改性剂氯化铵30-33g。温度控制在40℃左右，反应过程中会升温，搅拌至溶液透明后约1h加入100mL水升温至65-70℃，反应2-2.5h，观察粘度，冷却前再加入100mL水，搅拌30min。

3)膜处理：所得除杂后样液样液通过管式膜过滤除去大颗粒物质，透过液通过卷式膜过滤浓缩，得浓缩液；

4)两相萃取：所得浓缩液：加入2倍有机溶剂正丁醇萃取，回收有机溶剂，得皂荚皂苷产品。

实施例2

1)取1200g皂荚果皮以1:8的料液比加入25％的酒精溶液(9600mL)，装入提取罐中，回流提取1-1.5h，放出萃取液，再按1:5加入6000mL25％的酒精溶液套提一次，回流提取1h，放出萃取液,合并提取液，4层纱布过滤，在闪蒸上浓缩得浓缩液；

2)所得皂荚皂苷粗品浓缩液加入总体积(5000ml)为1.5％的双氰胺-双氰胺甲醛搅拌进行絮凝脱色，静止半小时，离心或过滤，除去沉淀得絮凝脱色除杂后样液4500ml；所述双氰胺甲醛-双氰胺甲醛铵盐絮凝剂的制备：在装有搅拌器、温度计、冷凝管的500mL三口瓶中加入100mL 37％甲醛，搅拌下加入50-52g双氰胺，温度会自然上升至38℃左右；在40℃加入氯化铝10g催化剂，反应30min左右时溶液变清澈；加入改性剂氯化铵30-33g。温度控制在40℃左右，反应过程中会升温，搅拌至溶液透明后约1h加入100mL水升温至65-70℃，反应2-2.5h，观察粘度，冷却前再加入100mL水，搅拌30min。

3)所得絮凝脱色除杂后样液过800nm管式膜(陶瓷膜)，透过液透过(2/3)4000ml时，在浓缩液中加入适量水继续浓缩，合并透过液通过截留分子量1000卷式膜过滤，透过液通过截留分子量300卷式膜过滤，得浓缩液2000ml备用；

优选的，所述两相萃取步骤如下：

4)按1:2(体积比)加入有机溶剂萃取，3000ml膜浓缩液加入正丁醇4000，蒸馏出正丁醇(回收)，得高含量皂荚皂苷产品。