一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7及其编码基因与应用。本发明通过水稻谷蛋白分选突变体gpa7的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7，该相关蛋白由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成，或将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有谷蛋白分选相关的由序列SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程，将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物，因此，本发明所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7及其编码基因与应用。

背景技术

水稻作为世界上超过三分之一的人口的主粮，是世界上最重要的粮食作物之一。我国作为人口大国，虽然国内稻米总产量已经能基本满足国内稻米的总量需求，但仍需面对粮食安全问题。特别是随着人民生活水平的提高，对于稻米食味营养品质的要求也随之提高。因此除了追求高产，还应不断改善稻米品质。然而我国稻米品质遗传育种研究相对滞后，为了促进稻米产业结构性调整，增强我国稻米国际竞争力，保证我国粮食安全，急需加强稻米品质形成的分子基础研究和优质水稻新品种的选育。贮藏蛋白作为稻米中仅次于淀粉的第二大类营养物质，其含量和组成直接影响着稻米的各项品质指标和营养价值。因此，解析水稻各储藏蛋白合成、转运、加工和积累的分子机制对稻米的品质改良至关重要。

谷蛋白前体积累(57H)突变体是稻米蛋白品质改良研究的良好遗传材料。通过克隆谷蛋白合成、转运、加工和积累过程关键基因，构建谷蛋白分选网络，能为稻米蛋白品质改良奠定理论基础。目前已经初步描绘了谷蛋白分选的分子途径，但谷蛋白分选的确切机理仍知之甚少。

发明内容

本发明从籼稻品种N22的辐照诱变突变体库中筛选获得了一个新的57H突变体gpa7。OsGPA7编码了一个含有未知功能的DUF1712结构域的蛋白，目前尚无报道关于OsGPA7蛋白参与水稻储藏蛋白合成相关的研究。

本发明通过水稻谷蛋白分选突变体gpa7的表型分析和目标基因的初步定位，最终克隆得到谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7，因而本发明提供一种谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明提供的谷蛋白分选相关蛋白(OsGPA7)，来源于稻属水稻(Oryza sativavar.Kitaaake)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且仍具有所述功能由SEQ ID NO.1的衍生蛋白质。

SEQ ID NO.1所示序列由492个氨基酸残基组成。

为了使(a)中的OsGPA7便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述(b)中的OsGPA7可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的OsGPA7的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

同时，本发明还提供编码上述贮藏蛋白分选相关蛋白的基因(OsGPA7)。

所述基因OsGPA7可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)序列表中SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码谷蛋白分选相关蛋白的DNA分子。

SEQ ID NO.2由1479个核苷酸组成。

所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在pCAMBIA1305.1载体(http://www.cambia.org/daisy/cambia/585)的多克隆位点EcoR I和Nco I之间重组插入所述基因(OsGPA7)得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为pCAMBIA1305.1-OsGPA7；所述pCAMBIA1305.1-OsGPA7是将由OsGPA7基因组编码序列连同上游2282bp的启动子区和下游600bp的片段通过重组技术插入到pCAMBIA1305.1多克隆位点EcoR I和Nco I之间得到的(Clontech公司，Infusion重组试剂盒)。

将含有OsGPA7的pCAMBIA1305.1命名为pCAMBIA1305.1-OsGPA7。

含有以上任一所述基因(OsGPA7)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法。

本发明提供的培育谷蛋白分选正常的转基因植物的方法，是将所述基因导入谷蛋白分选异常的植物中，得到谷蛋白分选正常的转基因植物；所述谷蛋白分选异常植物为胚乳中谷蛋白前体剧增并伴随成熟谷蛋白含量降低的植物；所述谷蛋白分选正常的转基因植物为谷蛋白前体能被正常加工成为成熟谷蛋白的转基因植物。具体来说，所述基因通过所述重组表达载体导入谷蛋白分选异常植物中；所述谷蛋白分选异常植物可为gpa7。

所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或所述方法均可应用于水稻育种。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明的谷蛋白分选相关蛋白影响水稻胚乳中谷蛋白的分选过程。将所述蛋白的编码基因导入成熟谷蛋白含量降低的植物中，可以得到成熟谷蛋白含量正常的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1野生型N22和突变体gpa7的外观表型，其中，A为N22和gpa7干种子以及胚乳横切表型，B为N22和gpa7胚乳横切扫描电镜图片；

图2野生型N22和突变体gpa7 SDS-PAGE和Western blot分析，其中，A为N22和gpa7胚乳储藏蛋白组分SDS-PAGE图，B为N22和gpa7谷蛋白和球蛋白Western-Blot分析图；

图3野生型N22和突变体gpa7发育胚乳的半薄切片观察，其中A为N22和gpa7发育中期胚乳半薄切片考马斯亮蓝染色观察结果，B为N22和gpa7发育中期胚乳半薄切片免疫荧光显微分析；

图4野生型N22和突变体gpa7发育胚乳的免疫胶体金观察，其中，A、B为N22和gpa7发育中期胚乳中高尔基体的形态结构，C、D为N22和gpa7发育中期胚乳中致密囊泡的形态结构，E、F、G为N22和gpa7发育中期胚乳中细胞膜以及胞外空间结构，H、I、J为N22和gpa7发育中期胚乳中蛋白体II(PBII)形态结构；

图5突变基因的图位克隆，其中，A为gpa7的精细定位图，B为gpa7的突变位点，C为突变位点引物扩增检测；

图6转基因互补株系的表型分析，其中，A为N22和gpa7以及转基因互补家系胚乳横切，B为N22和gpa7以及互补家系储藏蛋白组分图，C为N22和gpa7以及互补家系发育中期胚乳半薄切片考马斯亮蓝染色观察结果；

图7 pCAMBIA1305.1载体图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：水稻中谷蛋白分选相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻谷蛋白分选突变体gpa7的表型分析

在籼稻品种N22的

发育中期胚乳半薄切片经过考马斯亮蓝染色后观察发现，野生型存在两类蛋白体，球形的蛋白体I和不规则形状的蛋白体II，蛋白体II略大于蛋白体I(见图3A，白色三角标示蛋白体I，黑色三角标示蛋白体II)。在突变体gpa7中蛋白体II相比野生型明显变小。进一步的发育中期胚乳半薄切片免疫荧光实验也验证了上述结果(见图3B，白色箭标示蛋白体I，白色三角标示蛋白体II)。有趣的是，在gpa7中除上述两种蛋白体外，在细胞壁附件还发现一类填充有大量蛋白质的壁旁体类结构(见图3B，星号标示)。上述结果表明gpa7突变体中蛋白体II发育异常，大量蛋白质填充在细胞壁附近形成的壁旁体类结构中。

为了解析壁旁体类结构的形成过程，利用透射电镜结合免疫胶体金技术观察了发育中期的胚乳(见图4)。研究表明谷蛋白的后高尔基体运输由一类称之为致密囊泡的运输工具介导完成。和野生型一样，突变体gpa7中致密囊泡可以从高尔基体正常出芽(图4A和B)，且大小形态与野生型相比没有明显差异(图4C和D)。然而，有趣的是，gpa7中大量致密囊泡错误分选到胞外体空间，逐渐积累并形成大的壁旁体类结构(图4E-4G)，因此，导致gpa7中的蛋白体II填充不完全(图4H-4J)。

综上所述，上述结果证实gpa7中负责运输谷蛋白的致密囊泡发生错误分选，进而导致大量谷蛋白前体进入胞外体空间而不能被切割为成熟的酸性亚基和碱性亚基。

二、目标基因定位

1、目标基因的初步定位

利用突变体gpa7与广亲和品种Nipponbare杂交，在gpa7/Nipponbare的F

2、目标基因的精细定位

依据初定位结果，在SSR标记O8-31和N8-27寻找公共图谱上的分子标记，并依据NCBI公布的水稻基因组序列信息在此区间自行开发InDel和SSR标记。利用144个隐性极端个体对目标基因进行了精细定位(用于精细定位的分子标记见表2)。

表2用于精细定位的分子标记

最终将目标基因OsGPA7精细定位在标记PT7和PT4之间，物理距离为106kb(图5A)。经过对该区间内基因进行测序，发现第1个ORF的第7个外显子上存在4个单碱基的缺失，使得目标蛋白错误翻译并提前终止(图5B和5C)。

三、目标基因OsGPA7的获得

提取籼稻品种N22叶片cDNA，以cDNA为模板，采用引物primer1和引物primer2进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的蛋白质如SEQ IDNO.1所示。

primer1：5'-ATGGGGCTCTCGTCGGCGGCGG-3'；

primer2：5'-CTAGTCTGTAGAGAATGCTCCT-3'。

将SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为OsGPA7蛋白，由492个氨基酸残基组成。将编码OsGPA7蛋白的基因命名为OsGPA7基因，其开放阅读框如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：OsGPA7蛋白及其编码基因的应用

一、基因组互补载体的构建

将pCAMBIA1305.1载体(参考文献：He Gao,Mingna Jin,et al.,Days to heading7,a major quantitative locus determining photoperiod sensitivity and regionaladaptation in rice.Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(46):16337-16342)的EcoR I和Nco I酶切位点之间的小片段替换为序列表中SEQ ID NO.3所示的双链DNA分子(包括OsGPA7基因上游2282bp的启动子序列和下游600bp的终止子序列)，得到pCAMBIA1305.1-OsGPA7基因组互补载体(已测序验证)，pCAMBIA1305.1载体图谱见图7。

二、过表达转基因植物的获得

1、将步骤一得到的pCAMBIA1305.1-OsGPA7过表达载体导入农杆菌EHA105菌株(美国英俊公司)，得到重组农杆菌。

2、采用步骤1得到的重组农杆菌转化粳稻品种kitaake(野生型)，具体步骤如下：

(1)取步骤1得到的重组农杆菌菌体，采用N6液体培养基(Sigma公司，C1416)重悬并调整菌液OD

(2)将培养至一个月的粳稻品种kitaake(野生型)成熟胚胚性愈伤组织在步骤(1)得到的菌液中侵染30min，滤纸吸干菌液后转入含有10g/L琼脂的固体N6培养基(Sigma公司，C1416)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)培养的愈伤组织接种在含有10g/L琼脂，100mg/L潮霉素的固体筛选N6固体培养基(Sigma公司，C1416)上培养16天(第一次筛选)；

(4)将步骤(3)培养后的健康愈伤组织接种在含有10g/L琼脂，100mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基(Sigma公司，C1416)上培养15天(第二次筛选)；

(5)将步骤(4)培养后的健康愈伤组织接种在含有10g/L琼脂，100mg/L潮霉素的固体筛选N6培养基(Sigma公司，C1416)上培养15天(第三次筛选)；

(6)将步骤(4)培养后的健康愈伤组织接种在分化培养基(PhytoTechnologyLaboratories公司，M524)上分化，得到T

3、对步骤2得到的T

primer3：5'-TCTCGTGATACTTCTCCTGG-3'；

primer4：5'-GAATGGTTATGTTCTTGTGC-3'。

三、表型鉴定

分别将T0代转pCAMBIA1305.1-OsGPA7植株，gpa7和野生型N22种植在中国农业科学院转基因试验田内。结果显示转基因株系T

序列表

<110> 南京农业大学

中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsGPA7及其编码基因与应用

<140> 2021101617009

<141> 2021-02-05

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

Met Gly Leu Ser Ser Ala Ala Ala Gly Glu Gly Pro Gln Leu Cys Val

1 5 10 15

Phe Asp Leu Arg Arg Gly Gln Gln Glu Gly Gln Glu Leu Asp Lys Ile

20 25 30

Leu Phe Phe His Pro Thr Asp Cys Pro Ile Leu Leu Gln Leu Ser Val

35 40 45

Ile Gly Leu Cys Glu Gly Ile Ile Thr Phe Ala Arg Ile Phe Ser Pro

50 55 60

Asp Asp Asp Cys Glu Val Ile Glu Ser Glu Lys His Ser His Val Phe

65 70 75 80

Tyr Gln Ala Glu Ala Asp Ile Trp Met Val Leu Val Val Glu Lys Asn

85 90 95

Lys Asp Ile Glu Ser Thr Trp Arg Cys Gly Ala Leu Gln Gly Ile Leu

100 105 110

Lys Glu Val His Ser Leu Phe Thr Met Phe His Gly Pro Ile Arg Thr

115 120 125

Leu Leu Asp Arg Gln Pro Ser Ala Glu Leu Ala Arg Gly His Leu Arg

130 135 140

Thr Phe Phe Thr Asp Tyr Leu Ser Asp Phe Asn Ala Gly Lys Lys Ile

145 150 155 160

Gln Leu Pro Thr Phe Arg Asp Cys Leu Lys Glu Arg Gly Thr Val Gln

165 170 175

Met Leu Thr Ile Ser Arg Glu Val Ala Leu Glu Val Gln Ser Leu Thr

180 185 190

Thr Val Leu Gly Ser Cys Leu Gly Asn Val Met Cys Gln Ser Leu Val

195 200 205

Leu Phe Glu Asp Leu Leu Val Ser Thr Thr Leu Pro Pro Asp Asp Thr

210 215 220

Leu Asn Leu Tyr Thr Tyr Ala Ile Leu Arg Leu Thr Pro Arg Ala Leu

225 230 235 240

Leu Ser Asn Ala Thr Ser Trp Ser Tyr Leu Arg Lys Gly Thr Ser Val

245 250 255

His Ala Gly Pro Thr Ser Ser Ser Ser Asn Gly Thr Ala Ser Val Glu

260 265 270

Arg Pro Leu Gln Arg Glu Lys Leu Tyr Lys Gly Lys Asp Gly Phe Val

275 280 285

Ala Ala Gly Ser Thr Thr Ser Glu Val Arg Gly Ala Val Ala Trp Val

290 295 300

Pro Ile Leu Trp Phe Gln Gln Ala Glu Asp Arg Met His Leu Cys Val

305 310 315 320

Tyr Gln His Lys Asn Ile Thr Ile Leu Leu Leu Ile Pro Ala Ser Ser

325 330 335

Leu Ile Asn Gly Asp Asp Gly Ile Ala His Val Lys Arg His Leu Leu

340 345 350

Glu Asn Ala Ser Gln Asn Ile Val Thr Leu Glu Leu Lys Leu Ser Arg

355 360 365

Gly Trp Gly Gly Glu Asn Ala Tyr His Val Gly Gly Tyr Arg Tyr Leu

370 375 380

Leu Val Asp Pro Asp Arg Lys Val Ser Arg Ala Ser Pro Pro Gly Lys

385 390 395 400

Val Thr Thr Leu Ser Lys Asp Ser Leu Leu Ser Leu Asn Arg Leu Arg

405 410 415

Glu Glu Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Ala Lys Arg Ser Asp Ser Cys

420 425 430

His Asp Lys Asp Phe Glu Val Cys Ile Arg Ala Lys Asn Asn Ala Trp

435 440 445

Val Ile Ala Lys Val Thr Arg Gly Arg Glu Leu Tyr Met Ala Leu Glu

450 455 460

Lys Ala Gly Glu Thr Leu Leu Tyr Ala Ser Thr Ala Ile Glu Lys Phe

465 470 475 480

Ser Asn Arg Tyr Cys Glu Gly Ala Phe Ser Thr Asp

485 490

<210> 2

<211> 1479

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

atggggctct cgtcggcggc ggcgggggag gggccgcagc tgtgcgtgtt cgacctgagg 60

cgggggcagc aggaggggca ggagctcgac aagatcctct tcttccaccc caccgactgc 120

cccatcctcc tccagctctc cgtcatcggc ctctgcgagg ggatcatcac cttcgctaga 180

atattttctc ctgatgatga ttgtgaggtg atagaatcag agaaacactc ccatgttttt 240

taccaagctg aagcagatat atggatggtt ctggtagtgg agaaaaacaa ggacattgag 300

tcaacttggc ggtgtggtgc attgcaagga attcttaaag aggttcactc gcttttcaca 360

atgttccacg gaccaattcg aactttactt gacaggcaac ccagtgcaga acttgcccgt 420

ggtcaccttc gcacattttt cacagattat ttaagtgatt ttaatgctgg taaaaagata 480

caattgccaa ccttccgtga ttgcctaaag gagcgaggaa ctgtccaaat gctaacaatc 540

tcacgagaag tggcacttga agttcagtca ctcaccacag ttcttgggtc atgtcttgga 600

aatgtcatgt gccaatcact tgtattattt gaagatctct tggtgtccac aacacttcca 660

ccggatgata cactaaacct atatacttat gctatcttga ggttaactcc tcgtgcttta 720

ttgtccaatg caacttcctg gtcctatctg cggaaaggaa cttcggttca tgctggcccc 780

acttctagtt catcaaatgg aacagcttca gtagaaaggc ctctccagcg tgagaaacta 840

tacaaaggaa aggatggttt tgttgccgct ggttccacta cttcagaagt tcgtggtgct 900

gtggcttggg ttcccatact gtggttccag caggcagaag accgcatgca tctctgtgtt 960

tatcagcaca agaacataac cattctgcta ctgattccag cttcatctct aataaatgga 1020

gatgatggca ttgctcatgt gaagagacat cttcttgaaa atgcatcaca gaacattgtg 1080

actctggagc tgaaattatc acgaggatgg ggaggagaaa atgcttatca tgttggtgga 1140

tatcgctact tacttgttga tccagataga aaagtatcaa gagcctcccc acctgggaaa 1200

gtcaccaccc tctcaaagga ttctctactt tccttgaata gactaagaga agaaatagat 1260

ttggagaagt caagggccaa gaggtctgac tcttgtcatg acaaggattt tgaagtatgc 1320

atcagagcca aaaataatgc atgggtcatt gctaaagtta cccgaggaag agaactttat 1380

atggcgttag agaaggctgg tgaaacactt ctttatgcat ctactgccat cgagaagttt 1440

agcaacaggt actgtgaagg agcattctct acagactag 1479

<210> 3

<211> 7089

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacagtgctc caccctggag cgttccttcg tcccaccacg tagacttcgt gatgtcatgg 60

tgaactccaa accacccaca aaccggcacc gggcctcctc cacaatcttc tcggagaagt 120

caccgggcaa ctcctccaga agccatctag gaggcggcaa cctccaagag taacaagcaa 180

tgacccggcg tagagatgat caatcaagtg ccacactagc tctacaaatg gaagcaatgc 240

acttgactct tggctagaac aacctcaacc actacaatgg atgaacacta agctaaaagg 300

tgtgtgagag agatgcaagg ggtgtatgca attgaattgg gtgccgaaag agagccccct 360

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ggggccggtc agaccggcca gggaccgccg gtcagaccgc cacaaggtgg ccggtctgac 780

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atcattaccc ctcttaatag tacgtcgaaa ctaaaaataa actagcaaat ttgatcgccc 960

tacacctcga ttaattcaaa acaaaagcac tagttttacc gtcttttttc cctttacttt 1020

gcgccgtcaa ttttaatcca tcgataatca tccatgcgca catatgacgt gaacctaact 1080

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aaattaacaa cgggggacta gatgcttcac atgcaggacc cgctacctcg ccacgcgcgc 1200

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ggagaagctc gccggctcga tggggaaagc gtagagaagg agaggagctc gaggtcgagg 1320

ccgcgtccga gctcgctgtt gtcgccttga tccagtgagc ctaggccaga tctggctgct 1380

tagcctggcg tcgtcgccgt cgccgctcgg gccaccgctc cgcccggctt caagaggaag 1440

acgaggtcgc gtggctcggt cgacagcgac ctccgcgagg acgaccgtgc cgccgcttgt 1500

cgtccgcgag gaagacgagg tcgcgcagcg acctccgcga ggaagacccc gccgagagtc 1560

cgtcgttgca gagggggtag ggggagggag gcgccggtgc ggcgtctgtg gcatccagcc 1620

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tgtaaagtgt ggttctttac ccggttcgtt gtctagctgg aggctttgag ctcctcatgt 1860

gcgttacccg cactgtgacc ggccttatat tagacatttt gctcacacat atacagcaga 1920

caaagcccaa gagcatcatc gattcatcgt catcccggga tacccatacg agatgggtct 1980

caaacgaccc atgggacata aatctcatcc agcccaatcc cagcccaact cgcgagcccg 2040

tcacgtcacg cttcgcaccc accagtccac ctcctcctcc tcctcctctt ccgcaccgcg 2100

ccgccccgtc gccggccgca accaccacca ccactcgccg tcgcctccgc cccccgcacg 2160

cgctcctccc ctcccctccc ctcccctccc ctctccccgg ccgcgccgct cgccggatct 2220

ctcccctcct cccttccagg aaccccagcc aagcaggtag cgtgtgacgg gggaaggggg 2280

ggatggggct ctcgtcggcg gcggcggggg aggggccgca gctgtgcgtg ttcgacctga 2340

ggcgggggca gcaggagggg caggagctcg acaagatcct cttcttccac cccaccgact 2400

gccccatcct cctccagctc tccgtcatcg gcctctgcga ggggatcatc accttcgcta 2460

ggtttgcagt tttgctccac ccccttctca ctcgcatccc cctcctgttc gtgctgctgc 2520

ttggctcctc gcgcaggttg gagctcttag cttattcggt cggagctttg ttgctcgtgg 2580

aggttagttg tttaggaacg atttgtagca cttagttgcg tggacgagcg gaattccaac 2640

gaccttgaag ctcatgggat ttcaggcgaa ggggtttata tgggaaaatt ctggcgtgtt 2700

gattgtaatc ggagttggag gtgaatgaat ttggttcatc agggtgagat ccttatgggg 2760

gataattctg gcgtgttgat tgtaattgga gtccgaggtg aatgtatttg gttcgttagg 2820

atgagatcct tcttagatcc ccatagaact taacttttat ctgcttcgag atagtatagt 2880

cagacatact acccgttctg ttcttgaatc caaattaggt gcagtttcac tgcttgttgc 2940

tccttatttc agaatccgat ttttaaatta tttcacaaaa ttgtagtata tgtaactagg 3000

ggcaaaattt gcctgttatt ttaatttttg cttttagttc caaccataag cactttctcg 3060

cgactggtgc ttctgcactt ataccttttg cttttatctg ttggcttatc tatctaaata 3120

ttattcctgt gcagaatatt ttctcctgat gatgattgtg aggtgataga atcagagaaa 3180

cactcccatg ttttttacca agctgaagca gatatatgga tggttctggt aatggctgtt 3240

cttacattaa cagttcatca ctatttgtta taaaccaaat tgttgtactc tagagcctct 3300

tcaattgggt gtagttaaaa acagcatgta acctttgtct gtcacctatt gtcattgaac 3360

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aacttgaatg attatcatac tcatttccag tgaaaacttg ttcatgcata ggtagtggag 3660

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gttcactcgc ttttcacaat gttccacgga ccaattcgaa ctttacttga caggcaaccc 3780

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ttacagaaat ataactgtag taccttttga tcttttcagg gtacatgata gttgtctctt 4140

gcttttataa ttattgcttg tgtgaaatat gttatttttc ttgctagcgg cctgttattt 4200

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tctagtagtc attttcgaag gtagctaatg atgttatagg cttaaaaacg gttgctctgt 4320

tgtacttgta ggagtatgta cttatgcaga agcctgcttt ccgaggggga gaacttttgg 4380

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catgtcttgg aaatgtcatg tgccaatcac ttgtattatt tgaagatctc ttggtgtcca 4620

caacacttcc accggtacgg ggtctccctt taatcatcac ttcttttata actttgtttt 4680

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tacactaaac ctatatactt atgctatctt gaggttaact cctcgtgctt tattgtccaa 4800

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ttgttgatcc agatagaaaa gtatcaagag cctccccacc tgggaaagtc accaccctct 5520

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aaactatagg taagatgaga ttctttggac acagtaaagc cgagtgttca gagacaaaga 7020

taggaaataa acatgttgat gaaaaaagaa tcaatacaaa ccaaaaaata gctgattgct 7080

tgaaagcgt 7089