一种小鼠肺类器官的培养方法及其专用培养液

摘要

本发明公开了一种小鼠肺类器官的培养方法及其专用培养液。所述方法包括获取新鲜的鼠源肺组织细胞、胶原酶消化为单细胞、体外三维培养条件培养鼠肺组织类器官和肺类器官的免疫荧光染色。所述培养液包括ADF+++、RPSO1条件性培养基、Noggin条件性培养基、B27添加剂、N‑乙酰基‑L‑半胱氨酸、烟酰胺、Y‑27632、A83‑01、SB202190、重组人成纤维细胞生长因子‑7和重组人成纤维细胞生长因子‑10。通过实验表明：经本发明方法建立的肺类器官可以有效的维持组织细胞特异性、干细胞特性和生物学功能，满足科学研究需要。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠肺类器官的培养方法及其专用培养液。

背景技术

类器官是利用干细胞的自我更新和分化能力，经体外三维培养形成的一种微小组织器官类似物，在很大程度上具有体内相应器官的功能。类器官的三维培养需要利用生物工程的方法来引导细胞分裂和分化。细胞因子和细胞外基质组成干细胞培养微环境，是类器官更新和分化的物质基础。通过人为调控培养系统的成分，由细胞自主的分化为特定结构，完成类器官自组装过程。目前，食道、胃、肠、肝脏、胰腺、前列腺、乳腺等结构的类器官和相应的肿瘤类器官均已面世。它们不仅可作为组织器官的替代品用于药物和临床研究，还可用于体内器官移植。开拓了体外培养的新平台。

肺实质组织包括肺内各级支气管及其终端的肺泡结构。支气管的细胞类型按形态和功能主要分为以下四类。第一类为基底细胞，标记蛋白为KRT5和P63，具有更新能力；第二类为杯状细胞，标记蛋白为MUC5AC，可分泌粘液；第三类为纤毛细胞，标记蛋白为Acetylatedα-Tubulin，可自主摆动，发挥清除作用；第四类为棒状细胞，标记蛋白为CC10。肺泡的细胞类型主要分为I型和II型上皮细胞，肺泡I型上皮细胞司气体交换的功能。此外，在病理学方面，肺组织可受外界病原体的侵染。

目前，肺组织细胞的原代培养技术主要为二维培养。二维培养的肺组织细胞无法长期传代，传代过程中会逐渐发生基因型、表型的改变；受限于二维培养条件，难以充分表现出肺组织的特性，与活体的肺组织细胞有所差异，不利于研究的进行。

发明内容

本发明的目的是提供小鼠肺类器官的培养方法及其专用培养液。

第一方面，本发明保护用于肺类器官培养的培养液。

本发明保护的用于肺类器官培养的培养液包括ADF+++、RPSO1条件性培养基、Noggin条件性培养基、B27添加剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸、烟酰胺、Y-27632、A83-01、SB202190、重组人成纤维细胞生长因子-7和重组人成纤维细胞生长因子-10；

所述Y-27632为式Ⅰ所示的化合物；所述A83-01为式Ⅱ所示的化合物；SB202190式Ⅲ所示的化合物；

上述培养液中，所述RPSO1条件性培养基的制备方法包括如下步骤：将293T-HA-Rspon1-Fc细胞系在T175细胞培养瓶中培养，待细胞在T175瓶长满后，去除上清液，然后加入ADF+++溶液进行连续培养，培养后收集上清液，再进行过滤，得到所述RPSO1条件性培养基。

所述Noggin条件性培养基的制备方法包括如下步骤：将293T-HA-Noggin-Fc细胞系在T175细胞培养瓶中培养，待细胞在T175瓶长满后，去除上清液，然后加入ADF+++溶液进行连续培养，培养后收集上清液，再进行过滤，得到所述Noggin条件性培养基。

进一步的，

所述RPSO1条件性培养基在培养液中的体积分数可为8-12％(或8-10％或10-12％)，具体可为8％或10％或12％。

所述Noggin条件性培养基在培养液中的体积分数可为8-12％(或8-10％或10-12％)，具体可为8％或10％或12％。

所述B27添加剂在培养液中的体积分数可为1-3％(或1-2％或2-3％)，具体可为1％或2％或3％。

所述N-乙酰基-L-半胱氨酸在培养液中的浓度可为1-1.5mM(或1-1.25mM或1.25-1.5mM)，具体可为1mM或1.25mM或1.5mM。

所述烟酰胺在培养液中的浓度可为4-6mM(或4-5mM或5-6mM)，具体可为4mM或5mM或6mM。

所述Y-27632在培养液中的浓度可为4-6uM(或4-5uM或5-6uM)，具体可为4uM或5uM或6uM。

所述A83-01在培养液中的浓度可为400-600nM(或400-500nM或500-600nM)，具体可为400nM或500nM或600nM。

所述SB202190在培养液中的浓度可为400-600nM(或400-500nM或500-600nM)，具体可为400nM或500nM或600nM。

所述重组人成纤维细胞生长因子-7在培养液中的浓度可为20-30ng/ml(或20-25ng/ml或25-30ng/ml)，具体可为20ng/ml或25ng/ml或30ng/ml。

所述重组人成纤维细胞生长因子-10在培养液中的浓度为80-120ng/ml(或80-100ng/ml或100-120ng/ml)，具体可为80ng/ml或100ng/ml或120ng/ml。

更进一步的，所述培养液还包括抗生素；所述抗生素具体可为Primocin

在本发明的一个具体实施例中，所述培养液由ADF+++、RPSO1条件性培养基、Noggin条件性培养基、B27添加剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸、烟酰胺、Y-27632、A83-01、SB202190、重组人成纤维细胞生长因子-7、重组人成纤维细胞生长因子-10和Primocin

第二方面，本发明保护用于肺类器官培养的试剂盒。

本发明保护的试剂盒包括上述培养液和胶原酶。

进一步的，所述试剂盒还包括如下试剂：ADF+++溶液、DF+++溶液、红细胞裂解液和基质胶。

第三方面，本发明保护上述培养液或试剂盒的新用途。

本发明保护上述培养液或试剂盒在制备肺类器官培养的产品中的应用。

本发明还保护上述培养液或试剂盒在肺类器官培养中的应用。

第四方面，本发明保护一种肺类器官的培养方法。

本发明保护的肺类器官的培养方法包括用上述培养液或上述试剂盒对肺组织细胞进行培养的步骤。

上述方法可包括如下步骤：

1)用胶原酶对肺组织细胞进行消化处理，得到消化处理后的肺组织细胞；

2)用上述培养液培养所述消化处理后的肺组织细胞，得到肺类器官。

进一步的，所述1)中，所述消化处理按照如下步骤进行：

1-1)将肺组织细胞置于胶原酶溶液中，37℃、120rpm水平摇1h，然后用枪头进行吹打，每次吹打后将上清液进行过滤，并收集至离心管中，剩下的组织加入ADF+++溶液继续吹打，吹打至肺组织碎片体积明显缩小，过滤并收集至同一离心管中；

1-2)完成步骤1-1)后，离心，弃上清，收集细胞沉淀，并向细胞沉淀中加入DF+++溶液重悬；

1-3)完成步骤1-2)后，离心，弃上清，收集细胞沉淀，并向细胞沉淀中加入红细胞裂解液室温静置；

1-4)完成步骤1-3)后，离心，弃上清，收集细胞沉淀，并向细胞沉淀中加入DF+++溶液重悬，得到细胞悬液，即为消化处理后的肺组织细胞。

所述2)中，所述培养按照如下步骤进行：

2-1)将步骤1-4)获得的细胞悬液离心，弃上清，收集细胞沉淀，并向细胞沉淀中先后加入上述培养液和基质胶重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；

2-2)完成步骤2-1)后，将细胞悬液接种在培养板上，然后将培养板置于细胞孵箱中，待胶凝固后加入上述培养液，再转移至细胞孵箱中在37℃、5％CO

更进一步的，所述离心的条件可为4℃、400g离心5min。

所述1-1)中，所述肺组织细胞为鼠源肺组织细胞。

所述胶原酶溶液(溶剂为ADF+++溶液)的浓度可为1mg/ml。

所述过滤为使用100um滤膜进行过滤。

所述2-1)中，所述培养液和所述基质胶的体积比为1:3。

所述2-2)中，所述细胞悬液按照2×10

所述培养过程中每3-4天更换肺类器官培养液。

所述方法还包括传代培养的步骤；所述传代培养按照如下步骤进行：

a)每孔加入预冷的ADF+++溶液，用枪头吹打，收集类器官和胶滴于离心管中，离心，离心后可见胶液平面，弃上清；加入cell recovery solution至离心管中，置于冰上15-30min，直至胶全部溶解；

b)向步骤a)获得的离心管中加入DF+++溶液反复吹打，离心，弃上清，用少许肺类器官培养液和基质胶重悬沉淀，按1:3的传代比例接种于培养板中，然后将培养板置于细胞孵箱中，待胶凝固后加入上述培养液，并转移至细胞孵箱中继续在37℃、5％CO

上述任一所述培养液或应用或方法中，所述ADF+++溶液由Advanced DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX-I添加剂和P/S组成，其中，Advanced DMEM/F12在ADF+++溶液中的体积分数为97％，HEPES在ADF+++溶液中的体积分数为1％，GlutaMAX-I添加剂在ADF+++溶液中的体积分数为1％，P/S在ADF+++溶液中的体积分数为1％。

所述DF+++溶液由DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX-I添加剂和P/S组成，其中，DMEM/F12在DF+++溶液中的体积分数为97％，HEPES在DF+++溶液中的体积分数为1％，GlutaMAX-I添加剂在DF+++溶液中的体积分数为1％，P/S在DF+++溶液中的体积分数为1％。

本发明的有益效果如下：

1)本发明通过模拟体内肺组织的三维结构和微环境，所建立的类器官可以有效维持细胞间的相互作用、细胞与外基质的相互作用，更能代表体内生理条件。

2)本发明培养获得的肺类器官含有干细胞，既能无限增殖，又很好的保持了细胞异质性；此外，肺类器官可以保持源组织的生物学功能，如分泌粘液，纤毛摆动清洁，气体交换等，甚至被易感病原菌侵染。

3)本发明培养获得的肺类器官是研究组织发生发展的有效工具，能用于药物疗效和药物毒理学性质的检测，有助于发展个体化治疗和再生医学，还可用于肺部感染性病变的体外研究，具有广阔的应用前景。

本发明提供了一种体外培养鼠肺组织类器官的方法及其专用培养液，所述方法包括如下步骤：获取新鲜的鼠源肺组织细胞，胶原酶消化为单细胞，体外三维培养条件培养鼠肺组织类器官和肺类器官的免疫荧光染色。经本发明方法建立的肺类器官可以有效的维持组织细胞特异性、干细胞特性和生物学功能，满足科学研究需要。

附图说明

图1为小鼠肺类器官培养流程示意图。

图2为新鲜肺组织通过胰酶解离为单细胞后第1、2、3、4、6天在Matrigel中的生长情况。比例尺为125um。

图3为通过免疫荧光检测小鼠肺类器官中KRT5、P63、Acetylizedα-Tubulin和MUC5的蛋白表达情况。比例尺为20um。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所涉及的实验材料及其来源如下：

8-12周C57BL/6J小鼠是北京斯贝福生物技术有限公司的产品。

高糖DMEM是gibco的产品，货号为12430-054。

Advanced DMEM/F12是gibco的产品，货号为12634-010。

DMEM/F12是gibco的产品，货号为C11330500BT/C11330500CP。

青霉素链霉素(P/S)是gibco的产品，货号为15140122。

DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)是gibco的产品，货号为C14190500。

PBS是Solarbio的产品，货号为P1020-500。

胎牛血清FBS(品牌名称为四季青)是浙江天杭生物科技有限公司的产品，货号为11011-8611。

HEPES缓冲液是gibco的产品，货号为15630-080。

GlutaMAX-I添加剂是gibco的产品，货号为35050-061。

B27 supplement(B27添加剂)是invivogen的产品，货号为17504-044。

N-Acetylcysteine(N-乙酰基-L-半胱氨酸)是Sigma Aldrich的产品，货号为A9165。

Nicotinamide(烟酰胺)是Sigma Aldrich的产品，货号为N0636。

Y-27632(CAS No.:146986-50-7)是Selleck的产品，货号为S1049，其结构式为

A83-01(CAS No.:909910-43-6)是Tocris的产品，货号为2939，其结构式为

SB202190(CAS No.:152121-30-7)是Sigma Aldrich的产品，货号为S7067，其结构式为

FGF-7(重组人成纤维细胞生长因子-7)是PeproTech的产品，货号为100-19。

FGF-10(重组人成纤维细胞生长因子-10)是PeproTech的产品，货号为100-26。

Primocin

红细胞裂解液ACK Lysing Buffer是gibco的产品，货号为A10492-01。

通用型组织固定液是武汉塞维尔生物科技有限公司的产品，货号为G1101。

牛血清白蛋白BSA是晶美生物工程有限公司的产品，货号为RF101-100。

曲拉通Triton X-100是北京迈瑞达科技有限公司的产品，货号为9002-93-1。

P63兔单克隆抗体(一抗)是abcam的产品，货号为ab124762。

KRT5鼠单克隆抗体(一抗)是SANTA CRUZ的产品，货号为sc-32721。

Acetylatedα-Tubulin鼠单克隆抗体(一抗)是SANTA CRUZ的产品，货号为sc-23950。

CC10鼠单克隆抗体是SANTA CRUZ(一抗)的产品，货号为sc-365992。

MUC5AC鼠单克隆抗体是SANTA CRUZ(一抗)的产品，货号为sc-21701。

红色荧光Alexa Fluor

绿色荧光Alexa Fluor

DAPI染色试剂盒是贝博生物的产品，货号为BB-4133。

鬼笔环肽是invitrogen的产品，货号为R415。

50ml离心管细胞筛网100μm是Greiner的产品，货号为542000。

15ml离心管是NEST的产品，货号为601052。

50ml离心管是NEST的产品，货号为602052。

基质胶Matrigel是corning的产品，货号为356231。

Cell recovery solution是corning的产品，货号为354253。

TrypLE Express是Invitrogen的产品，货号为12605036。

24孔悬浮培养板是Greiner的产品，货号为662102。

T175细胞培养瓶是NEST的产品，货号为709013。

激光共聚焦小皿Glass Bottom Cell Culture Dish是NEST的产品，货号为801002。

胶原酶是Sigma的产品，货号为C9407。

医用剪是苏州六六视觉科技股份有限公司的产品，货号为54010。

显微眼用镊是苏州六六视觉科技股份有限公司的产品，货号为53076。

恒温水浴摇床的型号为德国GFL1092。

二氧化碳培养箱是Thermo Fisher的产品，货号为371。

低速冷冻离心机是安徽中科中佳科学仪器有限公司的产品，货号为LC-404R。

细胞系293T-HA-Rspon1-Fc与细胞系293T-HA-Noggin-Fc均记载于文献“HuHuili,Gehart Helmuth,Artegiani Benedetta et al.Long-Term Expansion ofFunctional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.[J].Cell,2018,175:1591-1606.e19.”中，公众可从申请人(中国人民解放军军事科学院军事医学研究院)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中所涉及的溶液及其配方如下：

润洗液配方：由FBS、DPBS和P/S组成，其中，FBS在润洗液中的体积分数为10％，DPBS在润洗液中的体积分数为89％，P/S在润洗液中的体积分数为1％。

ADF+++溶液配方：由Advanced DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX-I添加剂和P/S组成，其中，Advanced DMEM/F12在ADF+++溶液中的体积分数为97％，HEPES在ADF+++溶液中的体积分数为1％，GlutaMAX-I添加剂在ADF+++溶液中的体积分数为1％，P/S在ADF+++溶液中的体积分数为1％。

DF+++溶液配方：由DMEM/F12、HEPES、GlutaMAX-I添加剂和P/S组成，其中，DMEM/F12在DF+++溶液中的体积分数为97％，HEPES在DF+++溶液中的体积分数为1％，GlutaMAX-I添加剂在DF+++溶液中的体积分数为1％，P/S在DF+++溶液中的体积分数为1％。

完全DMEM培养基配方：由高糖DMEM、胎牛血清FBS和P/S组成，其中，高糖DMEM在完全DMEM培养基中的体积分数为89％，胎牛血清FBS在完全DMEM培养基中的体积分数为10％，P/S在完全DMEM培养基中的体积分数为1％。

抗体稀释液及封闭液配方：由BSA和PBS组成，BSA在抗体稀释液及封闭液中的质量分数为5％。

透膜液PBST配方：由PBS、tween-20和Triton

实施例1、肺类器官培养液的制备及其培养方法

一、肺类器官培养液的制备

本发明的肺类器官培养液由ADF+++、RPSO1条件性培养基、Noggin条件性培养基、B27添加剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸、烟酰胺、Y-27632、A83-01、SB202190、重组人成纤维细胞生长因子-7、重组人成纤维细胞生长因子-10和Primocin

RPSO1条件性培养基的配方：将293T-HA-Rspon1-Fc细胞系培养于T175细胞培养瓶中，培养基为完全DMEM培养基，培养条件为37℃，5％CO

Noggin条件性培养基的配方：将293T-HA-Noggin-Fc细胞系培养于T175细胞培养瓶中，培养基为完全DMEM培养基，培养条件为37℃，5％CO

二、肺类器官培养方法

1、组织处理与培养

肺类器官培养方法的流程图如图1所示，具体步骤如下：

1)肺组织的获取：颈椎脱臼法处死老鼠，开胸取肺组织，PBS清洗两遍，在皿中用PBS清洗血迹，剪碎组织。

2)肺组织的消化：将步骤1)获得的肺组织置于含3ml 1mg/ml胶原酶(溶于ADF+++溶液)的5ml离心管中消化，37℃、120rpm水平摇1h。用1ml枪头进行吹打，每次吹打后将上清液通过100um滤膜进行过滤，收集至50ml离心管中，剩下的组织加入2ml ADF+++溶液继续吹打，吹打至肺组织碎片体积明显缩小，过滤并收集至同一50ml离心管中。4℃、400g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入4ml DF+++溶液重悬，再4℃、400g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入2ml红细胞裂解液室温静置5min，4℃、400g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入2ml DF+++溶液，重悬细胞沉淀并计数，按2×10

3)肺类器官的培养：将步骤2)获得的细胞悬液4℃、400g离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。向细胞沉淀中先后加入肺类器官培养液和基质胶(提前一天将冻存于-20℃的基质胶置于4℃融化)重悬细胞沉淀，肺类器官培养液和基质胶的体积比为1:3。由于管中的液体弃不尽，可少加10-15ul的肺类器官培养液。按每孔60ul的体积(3滴，每滴约20ul)接种在预热的24孔悬浮培养板上，将培养板置于细胞孵箱中20min。待胶凝固后每孔加入500ul肺类器官培养液。转移至细胞孵箱中在37℃、5％CO

2、传代培养

培养1周左右进行传代。具体传代步骤如下(以下步骤中的枪头及离心管需提前用润洗液润洗)：

1)每孔加入2ml预冷ADF+++溶液，用1ml枪头吹打。收集类器官和胶滴于15ml离心管中，4℃、400g离心5min，离心后可见胶液平面，弃上清。按每孔300-500ul的体积加入cellrecovery solution至离心管中，置于冰上15-30min，其间可晃动试管加速溶胶。直至胶全部溶解。

2)向步骤1)获得的离心管中加入2ml DF+++溶液反复吹打，然后4℃、400g离心5min，弃上清，用少许肺类器官培养液和基质胶(肺类器官培养液和基质胶的体积比为1:3)重悬沉淀，按1:3的传代比例接种于预热的24孔悬浮培养板中(细节同上)。将培养板置于细胞孵箱中20min。待胶凝固后加入500ul肺类器官培养液。转移至细胞孵箱中继续在37℃、5％CO

3、单细胞悬液的制备

1)培养1周左右，每孔加入2ml预冷ADF+++溶液，用1ml枪头吹打。收集类器官和胶滴于15ml离心管中，4℃、400g离心5min，离心后可见胶液平面，弃上清。按每孔300-500ul的体积加入cell recovery solution至离心管中，置于冰上15-30min，其间可晃动试管加速溶胶。直至胶全部溶解。

2)向步骤1)获得的离心管中加入2ml DF+++溶液反复吹打，然后4℃、400g离心5min，弃上清。用2ml TrypLE Express重悬细胞沉淀，室温孵育1-5min，然后用1ml枪头反复吹打。再加入4ml ADF+++溶液，4℃、400g离心5min，弃上清。用少许肺类器官培养液和基质胶(肺类器官培养液和基质胶的体积比为1:3)重悬细胞沉淀，得到单细胞悬液。

三、肺类器官的形态鉴定

按上述步骤二中的方法获取鼠源肺组织，用胶原酶将其消化成为单细胞，建立鼠肺类器官培养体系，在光镜下观察新鲜肺组织通过胶原酶解离为单细胞后第一、二、三、四、六天在Matrigel中的生长情况。

结果如图2所示。在一周左右的培养过程中，单细胞增殖并逐渐形成中空的囊泡样三维球体结构，最后可生长为直径约250um的囊泡，符合肺类器官的形态特点。

四、肺类器官的免疫荧光鉴定

通过免疫荧光技术检测步骤二获得的小鼠肺类器官(上述步骤二的1中获得的小鼠肺类器官)中KRT5、P63、Acetylizedα-tubulin和MUC5的蛋白表达情况，以对其进行鉴定。具体步骤如下(下述所用枪头和离心管均需用润洗液润洗)：

弃掉24孔板中原来的类器官培养基，加入1ml ADF+++溶液，吹打胶滴，使其从培养皿底部脱离，收集类器官和胶滴于15ml离心管中，4℃、400g离心，离心后可见胶液平面，弃上清。按每孔300-500ul的体积加入cell recovery solution至离心管中，置于冰上15-30min，其间可晃动试管加速溶胶。直至胶全部溶解。500g离心1min，弃上清。加入1ml通用型组织固定液，过夜，500g离心1min，弃上清；加入500ul PBS重悬(若不立即进行后续实验，可以4℃保存)。500g离心1min，弃上清；加入1ml透膜液PBST，室温摇床30min；加入1ml 5％BSA，放在摇床上封闭1h，然后500g离心1min，弃上清。加入500ul一抗，4℃摇床过夜(或常温摇床1.5h)。500g离心1min，弃上清(转速最高可达2500rpm)。加入500ul PBST置于摇床上清洗5min，然后500g离心1min，弃上清，重复3次。加入500ul二抗，室温摇床2h，然后500g离心1min，弃上清。再加入1ml PBST，室温摇床5min，500g离心1min，弃上清；重复2次。加入1mlPBS清洗5min，500g离心1min，弃上清；重复2次。加40ul鬼笔环肽稀释液，室温放置30min；500g离心1min，弃上清；加入1ml PBS清洗5min，500g离心1min，弃上清；重复2次。加20ulDAPI稀释液，4℃放置30min。将类器官重悬液转移至激光共聚焦小皿中，拍照。

肺类器官中包含多种类型的细胞，如基底细胞、纤毛细胞，棒状细胞、杯状细胞等。各种细胞类型由不同抗体标记。KRT5标记基底细胞，定位于细胞质，基底细胞应位于类器官外层。P63标记基底细胞，定位于细胞核，基底细胞应位于类器官外层。Acetylatedα-tubulin标记纤毛细胞，定位于细胞质，纤毛细胞应位于类器官内层。MUC5标记杯状细胞，定位于细胞质。经鉴定，本发明培养获得的细胞团(肺类器官)含有多个细胞类型(图3)，符合肺类器官的构成特点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。