一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用

摘要

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用，属于林业昆虫分子生物学技术领域。一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因包括RPS26基因和/或RPS15基因。本发明选择了美国白蛾的8个基因作为候选内参基因，通过4种算法评估候选内参基因的稳定性，结果表明RPS26基因和/或RPS15基因适合作为美国白蛾不同种群密度的内参基因在实时荧光定量检测中应用，本发明还设计内参基因的实时荧光定量PCR引物，具有特异性强，扩增效率高的特点。本申请提供的内参基因及其引物填补了美国白蛾不同种群密度下没有合适内参基因的空白，为美国白蛾不同种群实验条件下的相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据。

说明书

技术领域

本发明属于林业昆虫分子生物学技术领域，具体涉及一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用。

背景技术

美国白蛾(Hyphantria cunea Drury)又称美国灯蛾、秋幕毛虫和网幕毛虫等，属鳞翅目，大鳞翅亚目，灯蛾科，白蛾属，原产于北美，分布于北纬19°～55°，后传入欧洲和亚洲，严重危害林木和农作物，是一种极易暴发成灾的国际检疫害虫。美国白蛾1940年首次在欧洲的匈牙利发现，并在1945年暴发成灾，随后蔓延至多个国家，在亚洲，1945年在日本东京首次发现美国白蛾，随后传入韩国、朝鲜，1979年首次在我国辽宁丹东被发现，美国白蛾在我国由东向西扩散，截止到2020年，美国白蛾已经涉及北京、天津、河北、内蒙古、辽宁、吉林、上海、江苏、安徽、山东、湖北、陕西、河南13个省(区、市)的597个县级行政区(国家林草局2020年第3号公告)。

实时荧光定量(Reverse transcription quantitative polymerase chain reα-tubion，RT-qPCR)是功能基因表达量的一种精确的定量方法，但它依赖于合适的内参基因对功能基因的相对表达定量进行数据标准化。内参基因必须在特定的实验条件下满足稳定表达的要求。美国白蛾也是一种具有群居习性的害虫，其卵粒常集结成块，幼虫常群集为害或扩散；1～3龄群居在叶背面取食叶肉组织，使被害叶片呈透明状的“白叶”。幼虫4龄前群居于网幕内生活，随虫龄增加网幕扩展，一般50～60cm，长者可达100多cm。因此，美国白蛾在不同生长阶段以不同的种群密度下生长。

目前，还没有美国白蛾不同种群密度下表达量稳定的内参基因的研究报道，这给利用实时荧光定量方法研究美国白蛾不同种群密度下功能基因的差异表达分析造成极大阻碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用，所述荧光定量内参在美国白蛾不同种群密度条件下稳定表达，为不同种群密度下的相关功能基因的表达定量提供可靠的分析依据。

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因，所述荧光定量内参基因包括RPS26基因和/或RPS15基因；

所述RPS26基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明提供了一种用于扩增所述美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因用引物，包括扩增RPS26基因用引物和/或扩增RPS15基因用引物；

所述扩增RPS26基因用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的反向引物；

所述扩增RPS15基因用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物。

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量检测试剂盒，包括所述引物。

优选的，还包括SYBR Premix Ex Taq

本发明提供了所述美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因、所述引物或所述荧光定量检测试剂盒在荧光定量检测不同种群密度下的美国白蛾功能基因中的应用。

优选的，所述美国白蛾的种群密度包括1～15头/100ml。

优选的，所述功能基因的荧光定量检测的反应条件为95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。

优选的，所述所述功能基因的荧光定量检测的反应体系为20.0μL，包括SYBRPremix Ex-Taq

优选的，所述功能基因包括丝氨酸蛋白酶基因HcSP2。

优选的，所述丝氨酸蛋白酶基因HcSP2的扩增用引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物。

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因，所述荧光定量内参基因包括RPS26基因和/或RPS15基因；所述RPS26基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。所述RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过美国白蛾的转录组测序数据库，将8个候选内参基因通过4种算法评估候选内参基因的稳定性，获得了美国白蛾RPS26基因和/或RPS15基因在不同种群密度下均能稳定表达，符合荧光定量内参基因的要求。因此，本发明提供的荧光定量内参基因填补了美国白蛾不同种群密度下没有内参基因的空白，为美国白蛾不同种群实验条件下的相关功能基因的表达定量提供了可靠的分析依据，为功能基因的挖掘奠定必要的前期基础，同时可提高功能基因研究的重复性、稳定性和可靠性。

本发明还提供了用于扩增所述美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因用引物，针对RPS26基因和/或RPS15基因设计得到实时荧光定量PCR扩增用引物，该引物具有特异性强，扩增效率高的特点，保证了功能基因的充分研究。

附图说明

图1为RT-qPCR引物扩增的特异性图；其中第一排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因β-actin、RPL13和AK的特异性溶解曲线图；第二排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因EIF4A、α-tub和UBI的特异性溶解曲线图；第三排从左到右依次为RT-qPCR引物扩增内参基因RPS26、RPS15和HcSP2；

图2是美国白蛾不同寄主植物8种内参基因的平均C

图3是8种内参基因的RefFinder综合评价结果图；

图4是geNorm算法中的成对变异值V

图5是采用目的基因HcSP2验证不同种群密度下的美国白蛾内参基因RPS26和/或RPS15表达稳定性结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因，所述荧光定量内参基因包括RPS26基因和/或RPS15基因；

所述RPS26基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GACTCGTAAACGCCGTAATGGAGGACGCGCCAAGCACGGCCGTGGCCACGTCAAGGCTGTAAGGTGCACGAATTGCGCTCGCTGCGTCCCTAAGGACAAGGCGATCAAAAAGTTTGTAATTAGAAACATTGTCGAAGCGGCTGCCGTCAGGGACATCAACGAAGCCTCAGTATATGCGTCATTCCAGCTACCCAAGCTGTATGCTAAGCTTCATTACTGCGTATCCTGCGCTATCCACAGCAAAGTGGTAAGGAACAGATCAAAGAAAGACAGAAGGATCCGTACTCCACCCAAGAGCACCTTCCCCAGGGACATGCAGAGGCCCCAGAATGTGCAGAGGAAGTGA)所示。

所述RPS15基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(CTGTCAGGTTGACATGCACAGTTTTTGACTACTTCTTTTCTCTCGATTCTGTCATACAAATCGGAAACATGGCTGAGGTTGATGAAACTCTTAAGAAAAAACGTACCTTCAGGAAGTTTACCTTCCGAGGAGTTGATCTCGATCAACTACTGGATATGCCCAATGAACAACTCATGGAGCTCATGCACTCCCGCGCCCGTAGGCGGTTTGCCCGCGGCTTAAAGCGCAAACCAATGGCGCTGGTTAAAAAACTCAGACGCGCCAAGAAAGAAGCACCACCAAATGAGAAGCCTGAGATTGTGAAGACTCACTTGAGAAACATGATCATTGTCCCCGAAATGGTTGGCTCCATCGTCGGTATCTACAATGGAAAGACTTTTAACCAGGTTGAAATCAAGCCCGAGATGATTGGACATTACCTAGGCGAGTTTTCAGTTACATACAAGCCTGTGAAGCACGGTAGGCCCGGTATTGGTGCCACCCACAGTTCCAGGTTCATCCCACTCAAGTAG)所示。

在本发明中，将8个候选内参候选基因(β-α-tubin、RPL13、AK、EIF4A、α-tub、UBI、RPS26和RPS15)进行筛选。经过内参基因C

本发明提供了一种用于扩增所述美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因用引物，包括扩增RPS26基因用引物和/或扩增RPS15基因用引物；所述扩增RPS26基因用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(CAGGGACATCAACGAAGCCT)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(GGTGCTCTTGGGTGGAGTAC)所示的反向引物。所述扩增RPS15基因用引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5(GCGTCCTCAAGATCAGC)所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO:6(ATGGTGCAGATCCTCCAGTC)所示的反向引物。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物来源即可。在本发明实施例中，所述引物委托上海生工生物公司合成。

本发明提供了一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量检测试剂盒，包括所述引物。所述试剂盒优选还包括SYBR Premix Ex Taq

本发明提供了所述美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因、所述引物或所述荧光定量检测试剂盒在荧光定量检测不同种群密度下的美国白蛾功能基因中的应用。

在本发明中，荧光定量检测不同种群密度下的美国白蛾功能基因的方法优选包括以下步骤：

1)将待检测的美国白蛾置于不同的种群密度下生长；

2)提取步骤1)中所述美国白蛾的RNA；

3)以RPS26基因和/或RPS15基因为内参基因，对所述将步骤2)提取的RNA进行RT-qPCR检测目标基因，得到检测结果；根据检测结果判断功能基因的表达量。

在本发明中，所述荧光定量检测美国白蛾的种群密度优选包括1～15头/100ml，更优选为3头～12头/100ml，进一步优选为6～9头/100m。

本发明对提取美国白蛾的RNA的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的提取样本的RNA的方法即可，例如Trizol法或试剂盒法。

在本发明中，所述RT-qPCR检测包括将RNA逆转录得到cDNA。所述逆转录的方法优选采用逆转录试剂盒进行。所述功能基因的荧光定量检测的反应条件优选为95℃预变性30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。所述所述功能基因的荧光定量检测的反应体系优选为20.0μL，包括SYBR Premix Ex-Taq

下面结合实施例对本发明提供的一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例所采用的供试材料为：

美国白蛾幼虫被采集于江苏省淮安市楚州区古城墙遗址公园樱花上(33.62°N，119.02°E)。带回室内，采用人工饲料在温度26±1℃的温度，65％±5％的湿度，16L：8D的光周期条件下的恒温光照培养箱(RXZ型智能人工气候箱，宁波江南仪器厂)进行饲养，直至化蛹、羽化。利用室内繁殖的卵卡在室内利用110ml容量(上底径*下底径*高＝7.1*5.3*4.5)的饲养盒在2龄开始进行1头/100ml、3头/100ml、6头/100ml、9头/100ml、12头/100ml、15头/100ml种群密度分别饲养直至化蛹、羽化。

实施例1

1、美国白蛾不同种群密度总RNA提取及cDNA的合成

收集上述不同种群密度饲养下的美国白蛾4龄幼虫，每种处理均有三个生物学重复，并分别用液氮冷冻处理，处理后分别采用Trizol方法提取总RNA，并用5mL无RNase的DNase I(TakaraBio Inc.,Kusatsu,Shiga Prefecture,Japan)处理15min以去除DNA。使用Thermo Scientific NanoDrop 2000紫外可见分光光度计(Thermo Fisher ScientificInc.，Waltham，MA，USA)检测RNA的浓度和质量。利用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。使用PrimeScript

2、内参基因的选择及其引物的设计

根据其他昆虫中主要的内参基因并最终选择本实施例所需的8条候选内参基因，分别为β-α-tubin、RPL13、AK、EIF4A、α-tub、UBI、RPS26和RPS15。并根据8个候选内参基因的核苷酸序列设计了实时荧光定量PCR扩增用引物，具体为在本申请人已经获得的美国白蛾转录组测序数据库中寻找并鉴定各候选内参基因的开放阅读框open reading frames(ORFs)，根据已鉴定正确的ORFs，利用Primer Primer5.0设计引物。引物(表1)均在南京金斯瑞生物科技有限公司合成，利用普通PCR检测引物特异性，利用琼脂糖胶与凝胶成像系统观察PCR产物的条带。进一步通过RT-qPCR检测引物的特异性与扩增效率，选择单一峰，扩增效率高且阴性对照无峰的引物作为最终引物。

表1内参基因、目的基因及实时荧光定量引物

3、内参基因引物标准曲线的建立

对内参基因的每一对引物制作各自的标准曲线，并计算各自引物的扩增效率。将反转录的cDNA混合后，以10为倍数稀释成5个浓度梯度(100μg/μL、10μg/μL、1μg/μL、0.1μg/μL和0.01μg/μL)，作为标准曲线的建立模板。同时，以ddH

4、实时荧光定量PCR检测

利用SYBR Premix Ex Taq

5、稳定性评估

内参基因稳定性分析，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta Cq和RefFinder等五种算法综合分析内参基因的表达稳定性。筛选出稳定的内参基因。

6、内参基因稳定性验证

选用美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因基因HcSP2(SEQ ID NO:21)当作目的基因，验证已筛选的稳定内参基因与最不稳定的内参基因，荧光定量PCR程序同步骤4。

7、结果

(1)总RNA提取质量及引物特异性检测

各样品的OD

(2)内参基因C

C

(3)稳定性评估

应用geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta Cq等四种算法，严格按照软件使用说明对各候选内参基因稳定性进行评估分析。利用geNorm分析时，表达稳定值M小于0.5时即表示该基因为稳定表达。NormFinder与geNorm相似，在利用BestKeeper软件分析时，标准差(SD)和变异系数(CV)越小，越适合作为内参基因。Delta Cq算法对于所有候选内参基因的Ct值进行分析，通过对候选基因两两之间的ΔCt的标准偏差值进行比较。获得稳定性排序结果见表2。内参基因RPS15在geNorm和Delta C

此外，根据geNorm成对变异值V

表2 geNorm、NormFinder、BestKeeper和Delta C

(4)内参基因稳定性验证

选用美国白蛾丝氨酸蛋白酶基因HcSP2当作目的基因，来验证所筛选的2个稳定内参基因RPS26和RPS15，荧光定量PCR程序同上，同时选用最不稳定的α-tub基因进行比较，发现用稳定的2个内参基因对目的基因在不同种群密度条件下的相对表达量进行校正时，RPS26和RPS15存在相似的变化趋势，而用内参基因α-tub校正时，目的基因的相对表达量的变化趋势显著不同，说明本实施例的结果可靠，所筛选获得的内参基因RPS26和RPS15可适用于美国白蛾不同种群密度条件下功能基因的实时荧光定量分析(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种美国白蛾不同种群密度的荧光定量内参基因及其引物和应用

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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