烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS特异性分子标记及其应用

摘要

本发明属于植物基因工程领域，涉及烟草细胞质雄性不育系tab1‑CMS特异性分子标记及其应用。本发明筛选得到了烟草tab1‑CMS品种的特异性分子标记，利用其可快速、准确地鉴定烟草tab1‑CMS品种，本发明对丰富烟草不育胞质源、为烟草优异不育胞质在育种和生产上使用奠定基础。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS特异性分子标记及其应用。

背景技术

鉴定胞质雄性不育系类型的方法有形态学、细胞学和分子标记，其中分子标记是鉴定胞质雄性不育类型的主要方法，包括线粒体特异基因、线粒体/叶绿体SSR、SNP等。叶绿体是与CMS有关的一个细胞器，在叶绿体基因组的基因间区和内含子区有大量的SNP，InDel，易位，重复，点突变以及基因组结构变异，具有比核基因组更高的核苷酸替代率，可用于区分细胞质雄性不育系。叶绿体trnC-trnD约为3000bp，包括trnC、petN、psbM、trnD四个基因。该区域在多个物种中具有丰富的多态性，研究人员利用trnC-trnD序列构建了人参、山矾属等物种的系统发育树。

SK01(tab1-CMS)是2010年7月在K326的实验田中发现的一株雄性不育自然突变体，表现为完全败育。2011-2016年间在青岛和西昌两地连续8代对SK01进行K326回交，回交后代均表现雄性不育，为细胞质雄性不育。

然而，针对自然突变体的鉴定，目前尚未有相关技术报道。

发明内容

本发明主要目的在于提供烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS特异性分子标记及其应用，采用所述特异性分子标记可快速、准确鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种，为烟草优异不育胞质在育种和生产上使用奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供用于检测烟草基因组中如下特异性分子标记位点的物质在鉴定或辅助鉴定待测烟草是否为烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种中的应用；

所述特异性分子标记位点包括以下特异性位点中的一种或几种：位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s1738位点的SNP位点，所述SNP位点为GGGGGCAA；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s2321位点的InDel位点，该位点碱基缺失；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域S2696位点的InDel位点，该位点碱基为由G突变为C；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域S2696位点的InDel位点，该位点碱基由C突变为T。

进一步地，所述“用于检测烟草基因组中如下特异性分子标记的物质”为用于鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种的引物或试剂盒；

所述引物对为能够以烟草基因组为模板扩增得到包含权利要求1所述一种或几种特异性分子标记位点的DNA片段的引物对；

所述试剂盒包含有所述引物对，dNTP以及DNA聚合酶。

进一步地，所述DNA片段包括以烟草基因组DNA为模板，采用以下引物对扩增得到的任意一种DNA片段；

S1：正向引物序列：5'-GAGTGGTAAGGCAGAGGAC-3'；反向引物序列：5'-AAATCAATGAAGGAAAAGC-3'；

S2：正向引物序列：5'-TATCGCTTTTCCTTCATTG-3'；反向引物序列：

5'-ATTTTCTGCTAGATCCCGT-3'；

S3：正向引物序列：5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'；反向引物序列：5'-CGGAAAAAATGATAAATAAAT-3'。

进一步地，所述引物对包括以下引物对的任意一对：

S1：正向引物序列：5'-GAGTGGTAAGGCAGAGGAC-3'；反向引物序列：5'-AAATCAATGAAGGAAAAGC-3'；

S2：正向引物序列：5'-TATCGCTTTTCCTTCATTG-3'；反向引物序列：

5'-ATTTTCTGCTAGATCCCGT-3'；

S3：正向引物序列：5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'；反向引物序列：5'-CGGAAAAAATGATAAATAAAT-3'。

本发明还提供用于鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种的引物对，其包括以下所述引物对的任意一对：

S1：正向引物序列：5'-GAGTGGTAAGGCAGAGGAC-3'；反向引物序列：5'-AAATCAATGAAGGAAAAGC-3'；

S2：正向引物序列：5'-TATCGCTTTTCCTTCATTG-3'；反向引物序列：

5'-ATTTTCTGCTAGATCCCGT-3'；

S3：正向引物序列：5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'；反向引物序列：5'-CGGAAAAAATGATAAATAAAT-3'。

本发明还提供用于鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种的试剂盒，其包括以上所述任意一对引物对，dNTP以及DNA聚合酶。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种的方法，所述方法通过鉴定以下特异性位点中的一种或几种：位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s1738位点的SNP位点，所述SNP位点为GGGGGCAA；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s2321位点的InDel位点，该位点碱基缺失；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域S2696位点的InDel位点，该位点碱基为由G突变为C；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域S2696位点的InDel位点，该位点碱基由C突变为T；

若所得结果，与以上所述特异性位点相同，则该烟草植株为细胞质雄性不育系tab1-CMS品种。

进一步地，通过鉴定以下两种特异性位点：位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s1738位点的SNP位点，所述SNP位点为GGGGGCAA；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s2321位点的InDel位点，该位点碱基缺失；

若所得结果，与以上所述位点相同，则该烟草植株为细胞质雄性不育系tab1-CMS品种；

或者，以待测烟草基因组为模板，采用引物对S3进行PCR扩增，通过1.5％琼脂糖凝胶电泳，若可得到588bp大小的特异性条带，则该烟草植株为细胞质雄性不育系tab1-CMS品种。

本发明还提供以上所述引物对或试剂盒或以上所述方法在烟草育种中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

本发明筛选得到了烟草tab1-CMS品种的特异性分子标记，利用其可快速、准确地鉴定烟草tab1-CMS品种，本发明对丰富烟草不育胞质源、为烟草优异不育胞质在育种和生产上使用奠定基础。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为烟草tab1-CMS品种的特异性分子标记PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图，所用引物对为S3；其中：M，DNAmaker，所述条带大小由上到下依次代表2000bp、l000bp、750bp、500bp、250bp和l00bp；1、2、3为烟草sua-CMS品种PCR扩增结果：1.ms中烟100；2.中烟201；3.NC55；4、5、6为烟草tab1-CMS品种PCR扩增结果：4.SK01，5.YL-1，6.YL-6；7、8为可育烟草品种：7.中烟100，8.K326。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。引物均由上海派森诺生物科技股份有限公司合成；DNA提取试剂盒(天根生物，中国)，Taq酶、DL 2000DNA marker(诺唯赞，中国)，pMD18-T载体(TAKARA，日本)、胶回收试剂盒(诺唯赞，中国)，大肠杆菌DH5 a感受态细胞(唯地生物，中国)；下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

实施例1

选用sua-CMS，tab1-CMS两种不育类型的不育系以及可育烟草共8个品种，用试剂盒提取叶片总DNA(TIANGEN Biotech，中国)。所述8个品种类型和特性，如表1所示。

表1烟草tab1-CMS不育特异性标记鉴定的材料类型和特性

根据烟草叶绿体基因组序列(GenBank No：Z00044)，设计两对特异性引物(S1:5'-GAGTGGTAAGGCAGAGGAC-3'和5'-AAATCAATGAAGGAAAAGC-3'；S2:5'-TATCGCTTTTCCTTCATTG-3'和5'-ATTTTCTGCTAGATCCCGT-3')扩增叶绿体trnC-trnD基因间区域。PCR程序如下：94℃预变性5min，PCR扩增30个循环，每循环94℃变性30s，51℃退火30s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。用1％琼脂糖凝胶检测扩增到的PCR产物。

使用PCR纯化试剂盒(TIANGEN Biotech，中国)回收DNA片段，并将其连接到pMD18-T载体(TAKARA，日本)中。每个片段挑选5个阳性克隆进行测序，测序结果一致。表2为S1、S2两对引物在sua-CMS(MS中烟100、中烟201、NC55)、tab1-CMS(SK01、YL-1、YL-6)两种不育胞质类型的不育系和可育烟草(中烟100、K326)共8个烟草材料中扩增trnC-trnD的完整基因间区域得到的trnC-trnD基因间区的SNPs和InDels。

表2 trnC-trnD基因间区的SNPs和InDels

S1和S2的扩增区域在tab1-CMS不育系、sua-CMS不育系与可育烟草间存在25个多态性位点，含有相同细胞质的烟草材料序列具有100％的相似性。在可育烟草和tab1-CMS与sua-CMS之间存在16个差异位点，sua-CMS和可育烟草与tab1-CMS之间存在5个差异位点，tab1-CMS和sua-CMS与可育烟草之间存在3个差异位点。在三种细胞质中，trnC-trnD基因间区域的s1738位点各不相同。在s1738位点，sua-CMS不育系为TTTTATTCCAGGGGGG，tab1-CMS不育系为GGGGGCAA，可育烟草为GGGGGCAGCTTTATAA，而在s2321位点，sua-CMS不育系和可育烟草均为ATCATT，而tab1-CMS不育系该位点缺失。位于叶绿体trnC-trnD基因间区域S2696位点的InDel位点，该位点碱基为由G突变为C；位于叶绿体trnC-trnD基因间区域S2696位点的InDel位点，该位点碱基由C突变为T。

实施例2

一种鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种的方法：

采用特异性引物对S3:正向引物5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'；反向引物5'-CGGAAAAAATGATAAATAAAT-3'以扩增tab1-CMS的特异性标记：位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s1738位点的SNP位点，所述SNP位点为GGGGGCAA；

位于叶绿体trnC-trnD基因间区域s2321位点的InDel位点，该位点碱基缺失。若所得结果，与以上所述位点相同，则该烟草植株为细胞质雄性不育系tab1-CMS品种。

实施例3

一种鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种的方法：

利用S3引物对:正向引物5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'和反向引物5'-CGGAAAAAATGATAAATAAAT-3'对待测烟草进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若扩增得到588bp大小的特异性条带，则该烟草植株为细胞质雄性不育系tab1-CMS品种。

分别提取ms中烟100、中烟201、NC55、SK01、YL-1、YL-6、中烟100、K326基因组总DNA；用S3对8种烟草材料进行PCR扩增(S3:5'-AGGGGGCAGCAACTACAAT-3'和5'-CGGAAAAAATGATAAATAAAT-3')；将扩增到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，仅在tab1-CMS中能扩增出588bp大小特异性条带。因此，采用该方法可鉴定或辅助鉴定烟草细胞质雄性不育系tab1-CMS品种。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。