用于调节单核细胞和巨噬细胞发炎表型的组合物和方法以及其免疫疗法用途

摘要

本发明部分地基于鉴定用于调节单核细胞和巨噬细胞发炎表型的组合物和方法以及其免疫疗法用途。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年6月29日提交的美国临时申请第62/692,463号、2019年2月26日提交的美国临时申请第62/810,683号、2019年6月4日提交的美国临时申请第62/857,199号和2019年6月27日提交的美国临时申请第62/867,532号的权益；所述申请各自的全部内容通过引用整体并入本文。

发明背景

单核细胞和巨噬细胞是吞噬细胞的类型，它们是通过摄取有害外来颗粒、细菌和死亡细胞或濒死细胞来保护身体的细胞。除单核细胞和巨噬细胞外，吞噬细胞还包括嗜中性粒细胞、树突状细胞和肥大细胞。

巨噬细胞通常被称为大型白细胞，其巡查身体并且经由称为吞噬作用的过程来吞食并消化细胞碎片和外来物质(例如病原体、微生物和癌细胞)。另外，巨噬细胞(包括组织巨噬细胞和循环单核细胞源巨噬细胞)是先天性免疫系统和适应性免疫系统的重要介体。

巨噬细胞表型取决于经由经典或替代途径的激活(参见例如Classen等人(2009)Methods Mol.Biol.531：29-43)。经典激活的巨噬细胞是由干扰素γ(IFNγ)或脂多糖(LPS)激活并显示M1表型。这种促炎表型与增加的发炎和免疫系统刺激相关。替代激活的巨噬细胞是由细胞因子如IL-4、IL-10和IL-13激活，并显示M2表型。这种抗炎表型与降低的免疫反应、增加的伤口愈合、增加的组织修复和胚胎发育相关。

在非病理学条件下，在免疫系统中存在免疫刺激性巨噬细胞和免疫调控性巨噬细胞的平衡群体。平衡的扰动可引起各种疾病状况。在一些癌症中，例如，肿瘤分泌免疫因子(例如细胞因子和白介素)，其使巨噬细胞群体极化，有利于抗炎、促肿瘤生成M2表型，这会激活伤口愈合途径，促进新血管生长(即血管生成)，并且向肿瘤提供营养物和生长信号。这些M2巨噬细胞称为肿瘤相关巨噬细胞(TAM)或肿瘤浸润性巨噬细胞。肿瘤微环境中的TAM是癌症进展和转移的重要调控因子(Pollard(2004)Nat.Rev.Cancer 4：71-78)。已经研究了设计用于抑制巨噬细胞基因靶标(例如CSF1R和CCR2)的小分子和单克隆抗体作为巨噬细胞表型的调节剂，例如通过调节促肿瘤生成巨噬细胞(例如TAM)和可抑制肿瘤形成的促炎巨噬细胞的平衡。调节单核细胞和巨噬细胞的募集、极化、激活和/或功能以调节巨噬细胞群体的平衡的疗法称为巨噬细胞免疫疗法。尽管巨噬细胞生物学的领域已取得进展，然而，仍需要用于调节巨噬细胞发炎表型的新靶标(例如基因和/或基因产物)和用于巨噬细胞免疫疗法中的药剂。

发明内容

本发明至少部分地基于以下发现：可通过调节本文所述的一种或多种生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出的靶标)的拷贝数、量和/或活性来调控单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型，以及使用所述生物标志物和/或调节剂来用于治疗、诊断、预后和筛选目的。

例如，在一个方面，提供了生成在与至少一种药剂接触之后具有增加的发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞的方法，所述方法包括使单核细胞和/或巨噬细胞与有效量的所述至少一种药剂接触，其中所述至少一种药剂是a)下调表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂和/或b)上调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。

还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，具有增加的发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞在与一种或多种药剂接触之后表现出下列性质中的一者或多者：a)分化簇80(CD80)、CD86、MHCII、MHCI、白介素1-β(IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达和/或分泌增加；b)CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1、TGFb和/或IL-10的表达和/或分泌减少；c)至少一种选自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18、GM-CSF、CCL3、CCL4和IL-23组成的组的细胞因子或趋化因子的分泌增加；d)IL-1β、IL-6和/或TNF-α的表达对IL-10表达的比率增加；e)增加的CD8+细胞毒性T细胞活化；f)增加的CD8+细胞毒性T细胞活化的募集；g)增加的CD4+辅助T细胞活性；h)增加的CD4+辅助T细胞活性的募集；i)增加的NK细胞活性；j)增加的NK细胞募集；k)增加的嗜中性粒细胞活性；l)增加的巨噬细胞活性；和/或m)增加的纺锤形形态、外观平坦性和/或树突数量，如通过显微术所评价。在另一个实施方案中，与一种或多种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且所述药剂增加了细胞群体中的1型和/或M1巨噬细胞的数量，和/或降低了2型和/或M2巨噬细胞的数量。在再一个实施方案中，与一种或多种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且所述一种或多种药剂增加了i)对ii)的比率，其中i)是细胞群体中的1型和/或M1巨噬细胞并且ii)是2型和/或M2巨噬细胞。

在另一方面，提供了生成在与至少一种药剂接触之后具有降低的发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞的方法，所述方法包括使单核细胞和/或巨噬细胞与有效量的至少一种药剂接触，其中所述药剂是a)上调表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂和/或b)下调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，具有降低的发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞在与一种或多种药剂接触之后表现出下列性质中的一者或多者：a)分化簇80(CD80)、CD86、MHCII、MHCI、白介素1-β(IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达和/或分泌减少；b)CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1和/或IL-10的表达和/或分泌增加；c)至少一种选自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23组成的组的细胞因子的分泌减少；d)IL-1β、IL-6和/或TNF-α的表达对IL-10表达的比率降低；e)降低的CD8+细胞毒性T细胞活化；f)降低的CD4+辅助T细胞活性；g)降低的NK细胞活性；h)降低的促炎性嗜中性粒细胞活性；i)降低的巨噬细胞活性；和/或j)降低的纺锤形形态、外观平坦性和/或树突数量，如通过显微术所评价。在另一个实施方案中，与一种或多种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且所述药剂降低了细胞群体中的1型和/或M1巨噬细胞的数量，和/或增加了2型和/或M2巨噬细胞的数量。在再一个实施方案中，与一种或多种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且一种或多种药剂降低了i)对ii)的比率，其中i)是细胞群体中的1型和/或M1巨噬细胞并且ii)是2型和/或M2巨噬细胞。在又一个实施方案中，一种或多种下调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂是小分子抑制剂、CRISPR向导RNA(gRNA)、RNA干扰剂、反义寡核苷酸、单链核酸、双链核酸、适体、核酶、DNA酶、肽、肽模拟物、抗体、细胞内抗体或细胞。RNA干扰剂可包含或为例如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或piwi相互作用RNA(piRNA)。在另一个实施方案中，一种或多种下调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂包含特异性结合至表1和/或表2中列出的至少一种靶标的抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段。在再一个实施方案中，抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段是骆驼科的、鼠类的、嵌合的、人源化的、人类的、可检测地标记的，包含效应结构域，包含Fc结构域，和/或选自由以下组成的组：Fv、Fav、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双价抗体片段。在又一个实施方案中，抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性剂。在另一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：化学治疗剂、生物剂、毒素和放射性同位素。在再一个实施方案中，一种或多种上调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂是编码表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的核酸分子或其片段、表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的多肽或其片段、结合至表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的活化抗体和/或细胞内抗体，或结合至表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的小分子。在又一个实施方案中，巨噬细胞包括1型巨噬细胞、M1巨噬细胞、2型巨噬细胞、M2巨噬细胞、M2c巨噬细胞、M2d巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、CD11b+细胞、CD14+细胞和/或CD11b+/CD14+细胞，任选地其中所述细胞和/或巨噬细胞表达所述靶标。在另一个实施方案中，体外或离体接触单核细胞和/或巨噬细胞。在再一个实施方案中，单核细胞和/或巨噬细胞是原代单核细胞和/或原代巨噬细胞。在又一个实施方案中，单核细胞和/或巨噬细胞在与一种或多种药剂接触之前纯化和/或培养。在另一个实施方案中，体内接触单核细胞和/或巨噬细胞。在再一个实施方案中，通过全身性、经肿瘤周围或经肿瘤内施用药剂来体内接触单核细胞和/或巨噬细胞。在又一个实施方案中，在组织微环境中接触单核细胞和/或巨噬细胞。在另一个实施方案中，所述方法还包括使单核细胞和/或巨噬细胞与至少一种调节发炎表型的免疫治疗剂接触，任选地其中所述免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂、免疫刺激性激动剂、发炎剂、细胞、癌症疫苗和/或病毒。

在再一方面，提供了一种组合物，其包含i)根据本文所述的方法生成的单核细胞和/或巨噬细胞；和/或ii)用于下调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的量和/或活性的siRNA。

在又一方面，提供了增加在与至少一种药剂接触之后受试者中单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种药剂，其中所述至少一种药剂是a)下调单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂；和/或b)上调单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，具有增加的发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞在与一种或多种药剂接触之后表现出下列性质中的一者或多者：a)分化簇80(CD80)、CD86、MHCII、MHCI、白介素1-β(IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达和/或分泌增加；b)CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1和/或IL-10的表达和/或分泌减少；c)至少一种选自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23组成的组的细胞因子的分泌增加；d)IL-1β、IL-6和/或TNF-α的表达对IL-10表达的比率增加；e)增加的CD8+细胞毒性T细胞活化；f)增加的CD4+辅助T细胞活性；g)增加的NK细胞活性；h)增加的嗜中性粒细胞活性；i)增加的巨噬细胞活性；和/或j)增加的纺锤形形态、外观平坦性和/或树突数量，如通过显微术所评价。在另一个实施方案中，一种或多种药剂增加了1型和/或M1巨噬细胞的数量，降低了2型和/或M2巨噬细胞的数量，和/或增加了i)对ii)的比率，其中i)是受试者中的1型和/或M1巨噬细胞并且ii)是2型和/或M2巨噬细胞。在再一个实施方案中，在施用一种或多种药剂之后，受试者中的细胞毒性CD8+ T细胞的数量和/或活性有所增加。在又一个实施方案中，降低在与至少一种药剂接触之后受试者中单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型的方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种药剂，其中所述至少一种药剂是a)上调单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂；和/或b)下调单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。在另一个实施方案中，具有降低的发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞在与一种或多种药剂接触之后表现出下列性质中的一者或多者：a)分化簇80(CD80)、CD86、MHCII、MHCI、白介素1-β(IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达和/或分泌减少；b)CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1和/或IL-10的表达和/或分泌增加；c)至少一种选自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18和IL-23组成的组的细胞因子的分泌减少；d)IL-1β、IL-6和/或TNF-α的表达对IL-10表达的比率降低；e)降低的CD8+细胞毒性T细胞活化；f)降低的CD4+辅助T细胞活性；g)降低的NK细胞活性；h)降低的嗜中性粒细胞活性；i)降低的巨噬细胞活性；和/或j)降低的纺锤形形态、外观平坦性和/或树突数量，如通过显微术所评价。在再一个实施方案中，一种或多种药剂降低了1型和/或M1巨噬细胞的数量，增加了2型和/或M2巨噬细胞的数量，和/或降低了i)对ii)的比率，其中i)是受试者中的1型和/或M1巨噬细胞并且ii)是2型和/或M2巨噬细胞。在又一个实施方案中，在施用药剂之后，受试者中的细胞毒性CD8+ T细胞的数量和/或活性有所降低。在另一个实施方案中，下调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂是小分子抑制剂、CRISPR向导RNA(gRNA)、RNA干扰剂、反义寡核苷酸、肽或肽模拟物抑制剂、适体、抗体、细胞内抗体或细胞。RNA干扰剂可包含或为例如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或piwi相互作用RNA(piRNA)。在再一个实施方案中，下调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂包含特异性结合至表1和/或表2中列出的至少一种靶标的抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段是骆驼科的、鼠类的、嵌合的、人源化的、人类的、可检测地标记的，包含效应结构域，包含Fc结构域，和/或选自由以下组成的组：Fv、Fav、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双价抗体片段。在另一个实施方案中，抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性剂。在再一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：化学治疗剂、生物剂、毒素和放射性同位素。在又一个实施方案中，上调表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂是编码表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的核酸分子或其片段，表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的多肽或其片段，结合至表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的活化抗体和/或细胞内抗体，或结合至表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的小分子。在另一个实施方案中，巨噬细胞包括1型巨噬细胞、M1巨噬细胞、2型巨噬细胞、M2巨噬细胞、M2c巨噬细胞、M2d巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、CD11b+细胞、CD14+细胞和/或CD11b+/CD14+细胞，任选地其中所述细胞和/或巨噬细胞表达所述靶标。在再一个实施方案中，通过全身性、经肿瘤周围或经肿瘤内施用药剂来体内施用一种或多种药剂。在又一个实施方案中，一种或多种药剂在组织微环境中接触单核细胞和/或巨噬细胞。在另一个实施方案中，所述方法还包括使单核细胞和/或巨噬细胞与至少一种调节发炎表型的免疫治疗剂接触，任选地其中所述免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂、免疫刺激性激动剂、发炎剂、细胞、癌症疫苗和/或病毒。

在另一方面，提供了增加受试者的发炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的a)与至少一种下调表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞；和/或b)与至少一种上调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，巨噬细胞包括1型巨噬细胞、M1巨噬细胞、2型巨噬细胞、M2巨噬细胞、M2c巨噬细胞、M2d巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、CD11b+细胞、CD14+细胞和/或CD11b+/CD14+细胞，任选地其中所述细胞和/或巨噬细胞表达所述靶标。在另一个实施方案中，相对于受试者的单核细胞和/或巨噬细胞，单核细胞和/或巨噬细胞是基因工程化的、自体的、同基因的或同种异体的。在再一个实施方案中，与a)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞不同于与b)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞。在又一个实施方案中，与a)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞与同b)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞相同。在另一个实施方案中，全身性、经肿瘤周围或经肿瘤内施用一种或多种药剂。

在再一方面，提供了降低受试者的发炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的a)与至少一种上调表1中列出的至少一种靶标接触的拷贝数、量和/或活性的药剂的单核细胞和/或巨噬细胞；和/或b)与至少一种下调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，巨噬细胞包括1型巨噬细胞、M1巨噬细胞、2型巨噬细胞、M2巨噬细胞、M2c巨噬细胞、M2d巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、CD11b+细胞、CD14+细胞和/或CD11b+/CD14+细胞，任选地其中所述细胞和/或巨噬细胞表达所述靶标。在另一个实施方案中，相对于受试者的单核细胞和/或巨噬细胞，单核细胞和/或巨噬细胞是基因工程化的、自体的、同基因的或同种异体的。在再一个实施方案中，与a)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞不同于与b)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞。在又一个实施方案中，与a)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞与同b)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞相同。在另一个实施方案中，全身性、经肿瘤周围或经肿瘤内施用一种或多种药剂。

在又一方面，提供了使受试者中的癌细胞对细胞毒性CD8+ T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的a)至少一种下调单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂；和/或b)至少一种上调单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，所述方法还包括施用至少一种下调表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。在另一个实施方案中，所述药剂是小分子抑制剂、CRISPR向导RNA(gRNA)、RNA干扰剂、反义寡核苷酸、肽或肽模拟物抑制剂、适体、抗体、细胞内抗体或细胞。RNA干扰剂可包含或为例如小干扰RNA(siRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或piwi相互作用RNA(piRNA)。在再一个实施方案中，药剂包含特异性结合至表1中列出的至少一种靶标的抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段。在又一个实施方案中，抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段是骆驼科的、鼠类的、嵌合的、人源化的、人类的、可检测地标记的，包含效应结构域，包含Fc结构域，和/或选自由以下组成的组：Fv、Fav、F(ab′)2、Fab′、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双价抗体片段。在另一个实施方案中，抗体和/或细胞内抗体或其抗原结合片段缀合至细胞毒性剂。在再一个实施方案中，细胞毒性剂选自由以下组成的组：化学治疗剂、生物剂、毒素和放射性同位素。在又一个实施方案中，所述方法还包括施用至少一种上调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂。在另一个实施方案中，所述药剂是编码表2中所列出的一种或多种靶标的核酸分子或其片段，表2中所列出的一种或多种靶标的多肽或其片段，结合至表2中所列出的一种或多种靶标的活化抗体和/或细胞内抗体，或结合至表2中所列出的一种或多种靶标的小分子。

在另一方面，提供了使患有癌症的受试者中的癌细胞对细胞毒性CD8+ T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的a)与至少一种下调表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触的单核细胞细胞和/或巨噬细胞；和/或b)与至少一种上调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触的单核细胞细胞和/或巨噬细胞。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，巨噬细胞包括1型巨噬细胞、M1巨噬细胞、2型巨噬细胞、M2巨噬细胞、M2c巨噬细胞、M2d巨噬细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、CD11b+细胞、CD14+细胞和/或CD11b+/CD14+细胞，任选地其中所述细胞和/或巨噬细胞表达所述靶标。在另一个实施方案中，相对于受试者的单核细胞和/或巨噬细胞，单核细胞和/或巨噬细胞是基因工程化的、自体的、同基因的或同种异体的。在再一个实施方案中，与a)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞不同于与b)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞。在又一个实施方案中，与a)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞与同b)的至少一种药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞相同。在另一个实施方案中，全身性、经肿瘤周围或经肿瘤内施用一种或多种药剂。在再一个实施方案中，所述方法还包括通过向受试者施用至少一种免疫疗法来治疗受试者的癌症，任选地其中所述免疫疗法包括免疫检查点抑制剂、免疫刺激性激动剂、发炎剂、细胞、癌症疫苗和/或病毒。在又一个实施方案中，免疫检查点选自由以下组成的组：PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4。在另一个实施方案中，免疫检查点是PD-1。在再一个实施方案中，一种或多种药剂减少了癌症中的增殖性细胞的数量和/或减小了包含癌细胞的肿瘤的体积或大小。在又一个实施方案中，一种或多种药剂增加了浸润包含癌细胞的肿瘤的CD8+ T细胞的量和/或活性。在再一个实施方案中，一种或多种药剂a)增加了浸润包含癌细胞的肿瘤的M1巨噬细胞的量和/或活性，和/或b)降低了浸润包含癌细胞的肿瘤的M2巨噬细胞的量和/或活性。在又一个实施方案中，所述方法还包括向所述受试者施用至少一种用于治疗癌症的其他疗法或方案。在另一个实施方案中，在药剂之前、同时或之后施用所述疗法。

在再一方面，提供了鉴定可通过调节至少一种靶标来增加其发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞的方法，所述方法包括：a)测定来自单核细胞和/或巨噬细胞的表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；b)测定对照中的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；以及c)比较步骤a)和b)中所检测的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；其中相对于至少一种靶标的对照拷贝数、量和/或活性，单核细胞和/或巨噬细胞中表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低指示，单核细胞和/或巨噬细胞可通过调节至少一种靶标来增加其发炎表型。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与调节表1和/或表2中列出的至少一种靶标的药剂接触，推荐、开具或施用所述药剂。在另一个实施方案中，如果测得受试者未受益于通过调节一种或多种靶标来增加发炎表型，则所述方法还包括使细胞与除调节表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的药剂外的癌症疗法接触，推荐、开具或施用所述癌症疗法。在再一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与至少一种增加免疫反应的其他药剂接触和/或施用所述至少一种其他药剂。在又一个实施方案中，其他药剂选自由以下组成的组：靶向疗法、化学疗法、放射疗法和/或激素疗法。在另一个实施方案中，对照是来自受试者所属相同物种的成员。在再一个实施方案中，对照是包含细胞的样品。在又一个实施方案中，受试者患有癌症。在另一个实施方案中，对照是来自受试者的癌症样品。在再一个实施方案中，对照是来自受试者的非癌症样品。

在又一方面，提供了鉴定可通过调节至少一种靶标来降低其发炎表型的单核细胞和/或巨噬细胞的方法，所述方法包括：a)测定来自单核细胞和/或巨噬细胞的表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；b)测定对照中的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；以及c)比较步骤a)和b)中所检测的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；其中相对于至少一种靶标的对照拷贝数、量和/或活性，单核细胞和/或巨噬细胞中表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加指示，单核细胞和/或巨噬细胞可通过调节至少一种靶标来降低其发炎表型。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，所述方法还包括使单核细胞和/或巨噬细胞与一种或多种调节表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的药剂接触，推荐、开具或施用所述药剂。在另一个实施方案中，如果测得受试者未受益于通过调节至少一种靶标来降低发炎表型，则所述方法还包括使单核细胞和/或巨噬细胞与除一种或多种调节表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的药剂外的癌症疗法接触，推荐、开具或施用所述癌症疗法。在再一个实施方案中，所述方法还包括使单核细胞和/或巨噬细胞与至少一种降低免疫反应的其他药剂接触和/或施用所述其他药剂。在又一个实施方案中，对照是来自受试者所属相同物种的成员。在另一个实施方案中，对照是包含细胞的样品。在再一个实施方案中，受试者患有癌症。在另一个实施方案中，对照是来自受试者的癌症样品。在再一个实施方案中，对照是来自受试者的非癌症样品。

在另一方面，提供了预测患有癌症的受试者的临床结果的方法，所述方法包括：a)测定来自受试者的单核细胞和/或巨噬细胞的表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；b)测定来自具有不良临床结果的对照的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；以及c)比较受试者样品和对照受试者样品中的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；其中与对照中的拷贝数、量和/或活性相比，受试者的单核细胞和/或巨噬细胞中的表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低指示，受试者不具有不良临床结果。

在再一方面，提供了监测受试者中的单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型的方法，所述方法包括：a)检测第一受试者样品中在第一时间点来自受试者的单核细胞和/或巨噬细胞的表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；b)使用包含在后续时间点获得的单核细胞和/或巨噬细胞的后续样品重复步骤a)；以及c)比较步骤a)和b)中所检测的表1和/或表2中列出的至少一种靶标的量或活性，其中与来自第一样品的单核细胞和/或巨噬细胞的拷贝数、量和/或活性相比，来自后续样品的单核细胞和/或巨噬细胞中表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加指示，受试者的单核细胞和/或巨噬细胞具有上调的发炎表型；或者其中与来自第一样品的单核细胞和/或巨噬细胞的拷贝数、量和/或活性相比，来自后续样品的单核细胞和/或巨噬细胞中表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低指示，受试者的单核细胞和/或巨噬细胞具有下调的发炎表型。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，第一样品和/或至少一种后续样品包含在体外培养的单核细胞和/或巨噬细胞。在另一个实施方案中，第一样品和/或至少一种后续样品包含未在体外培养的单核细胞和/或巨噬细胞。在再一个实施方案中，第一样品和/或至少一种后续样品是从受试者获得的单一样品或合并样品的一部分。在又一个实施方案中，样品包含从受试者获得的血液、血清、肿瘤周围组织和/或肿瘤内组织。

在又一方面，提供了评价药剂增加受试者中的单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型的功效的方法，所述方法包括：a)在第一时间点检测包含单核细胞和/或巨噬细胞的受试者样品中的i)单核细胞和/或巨噬细胞中或其上表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性和/或ii)单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型；b)在单核细胞和/或巨噬细胞与药剂接触之后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及c)比较步骤a)和b)中所检测的i)和/或ii)的值，其中与在第一时间点样品中的拷贝数、量和/或活性相比，后续样品中表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加和/或ii)的增加指示，所述药剂增加了受试者中的单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，与药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且药剂增加了细胞群体中的1型和/或M1巨噬细胞的数量。在另一个实施方案中，与药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且药剂降低了细胞群体中的2型和/或M2巨噬细胞的数量。

在另一方面，提供了评价药剂降低单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型的功效的方法，所述方法包括：a)在第一时间点检测包含单核细胞和/或巨噬细胞的受试者样品中的i)单核细胞和/或巨噬细胞中或其上表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性和/或ii)单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型；b)在单核细胞和/或巨噬细胞与药剂接触之后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及c)比较步骤a)和b)中所检测的i)和/或ii)的值，其中与在第一时间点样品中的拷贝数、量和/或活性相比，后续样品中表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低和/或ii)的降低指示，所述药剂降低了受试者中的单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，与药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且药剂选择性降低细胞群体中的1型和/或M1巨噬细胞的数量。在另一个实施方案中，与药剂接触的单核细胞和/或巨噬细胞包含于细胞群体内并且药剂选择性增加细胞群体中的2型和/或M2巨噬细胞的数量。在再一个实施方案中，在体外或离体接触单核细胞和/或巨噬细胞。在又一个实施方案中，单核细胞和/或巨噬细胞是原代单核细胞和/或原代巨噬细胞。在另一个实施方案中，在与药剂接触之前纯化和/或培养单核细胞和/或巨噬细胞。在再一个实施方案中，在体内接触单核细胞和/或巨噬细胞。在又一个实施方案中，通过全身性、经肿瘤周围或经肿瘤内施用药剂来体内接触单核细胞和/或巨噬细胞。在另一个实施方案中，在组织微环境中接触单核细胞和/或巨噬细胞。在再一个实施方案中，本文所述的方法还包括使单核细胞和/或巨噬细胞与至少一种调节发炎表型的免疫治疗剂接触，任选地其中免疫治疗剂包括免疫检查点抑制剂、免疫刺激性激动剂、发炎剂、细胞、癌症疫苗和/或病毒。在又一个实施方案中，受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，哺乳动物是非人类动物模型或人类。

在再一方面，提供了评价药剂治疗受试者的癌症的功效的方法，所述方法包括：a)在第一时间点检测包含单核细胞和/或巨噬细胞的受试者样品中的i)单核细胞和/或巨噬细胞中或其上表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性和/或ii)单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型；b)在施用药剂之后的至少一个后续时间点期间重复步骤a)；以及c)比较步骤a)和b)中所检测的i)和/或ii)的值，其中与在第一时间点受试者样品的单核细胞和/或巨噬细胞中或其上的拷贝数、量和/或活性相比，在后续时间点受试者样品的单核细胞和/或巨噬细胞中或其上表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的不存在或降低和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的存在或增加和/或ii)的增加指示，所述药剂治疗受试者的癌症。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，在第一时间点与后续时间点之间，受试者已经受癌症治疗、完成治疗和/或有所缓解。在另一个实施方案中，第一样品和/或至少一种后续样品是选自由离体和体内样品组成的组。在再一个实施方案中，第一样品和/或至少一种后续样品是从非人类动物癌症模型所获得。

在又一个实施方案中，第一样品和/或至少一种后续样品是从受试者获得的单一样品或合并样品的一部分。在另一个实施方案中，样品包括从受试者获得的细胞、血清、肿瘤周围组织和/或肿瘤内组织。

在又一方面，提供了筛选使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂的方法，所述方法包括a)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触，所述单核细胞和/或巨噬细胞与i)至少一种降低表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂和/或ii)至少一种增加表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触；b)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在对照单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触，所述对照单核细胞和/或巨噬细胞不与至少一种药剂或多种药剂接触；以及c)通过鉴定与b)相比增加a)中的细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法功效的药剂来鉴定使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂。

在另一方面，提供了筛选使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂的方法，所述方法包括a)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触，所述单核细胞和/或巨噬细胞被工程化以降低表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性和/或ii)被工程化以增加表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；b)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在对照单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触；以及c)通过鉴定与b)相比增加a)中的细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法功效的药剂来鉴定使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂。

如上文所述，还提供了可应用于本发明的任何方面和/或与本文所述的任何其他实施方案组合的众多实施方案。例如，在一个实施方案中，体内、离体或体外发生接触步骤。在另一个实施方案中，所述方法还包括测定i)癌症中的增殖性细胞数量的减少和/或ii)包含癌细胞的肿瘤的体积或大小的减小。在再一个实施方案中，所述方法还包括测定i)增加的CD8+ T细胞数量和/或ii)增加的浸润包含癌细胞的肿瘤的1型和/或M1巨噬细胞的数量。在又一个实施方案中，所述方法还包括测定对调节表1和/或表2中列出的至少一种靶标的药剂的反应性，所述反应性是通过至少一种选自由以下组成的组的标准所测量：临床受益率、直至死亡的存活率、病理完全反应、病理反应的半定量测量、临床完全缓解、临床部分缓解、临床稳定疾病、无复发存活、无转移存活、无疾病存活、循环肿瘤细胞降低、循环标志物反应和RECIST标准。在另一个实施方案中，所述方法还包括使癌细胞与至少一种其他癌症治疗剂或方案接触。在再一个实施方案中，一种或多种药剂还包括脂质或类脂质。在又一个实施方案中，所述类脂质具有式(VI)：

其中：p是介于1与3之间的整数(包括端值)；m是介于1与3之间的整数(包括端值)；R

R

R

其中，R

x在每次出现时为介于1与10之间的整数(包括端值)；y在每次出现时为介于1与10之间的整数(包括端值)；R

附图说明

图1A-图1C显示驱动至不同分化状态的巨噬细胞的表型和形态。图1A显示在巨噬细胞分化之后经典M2生物标志物的表达。图1B显示在巨噬细胞分化之后新M2生物标志物的表达。图1C显示M1和M2c分化巨噬细胞的形态影像。

图2A-图2Y显示针对个别巨噬细胞相关靶标的siRNA的IC50曲线。

图3A-图3E显示在敲低原代人类巨噬细胞中的巨噬细胞相关靶标之后表面表型和形态的表征。这些图显示siRNA介导的靶标敲低对靶标mRNA敲低(图3A)、细胞表面靶标表达(图3B)、经典巨噬细胞表型标志物(图3C)、新巨噬细胞表型标志物(图3D)和巨噬细胞形态(图3E)的影响。

图4A-图4G显示在抑制原代人类巨噬细胞中的巨噬细胞相关靶标之后经调节巨噬细胞表型和功能的表征。这些图显示抗体介导的靶标抑制对于以下各项的影响：在M2倾斜条件存在下降低经典M2标志物(图4A)；在M2倾斜条件存在下降低新M2标志物(图4B)；在M2倾斜条件存在下增加M1促炎细胞因子(图4C)；在添加于M2倾斜条件之后时以剂量依赖性方式降低经典M2标志物(图4D)；在添加于M2倾斜条件之后时以剂量依赖性方式降低新M2标志物(图4E)；以及在添加于M2倾斜条件之后时增加M1促炎细胞因子产生(图4F和图4G)。

图5A-图5C显示葡萄球菌(Staphylococcal)肠毒素B(SEB)测定实验的结果。图5A显示在4天之后CD3+T细胞的细胞内细胞因子染色的结果。图5B和5C显示在4天之后细胞因子产生的结果。

图6A-图6B显示单因子混合淋巴细胞反应(MLR)测定实验的结果。图6A显示CD8+ T细胞的细胞内染色的结果。数据显示为相对于同种型对照的倍数变化。图6B显示细胞因子产生的结果。数据显示为相对于同种型对照的倍数变化。

图7A-图7B显示来自各种癌症类型的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上的巨噬细胞相关性靶标表达的流式细胞术分析的结果。

图8A-图8D显示来自解离肿瘤样品和肿瘤切片样品的细胞因子产生，所述样品代表6种用个别抗体或抗体组合治疗的不同肿瘤类型。

图9A-图9C显示肿瘤切片培养物的结果。数据显示为肺肿瘤切片(图9A)、GI肿瘤切片(图9B)和肾肿瘤切片(图9C)培养物相对于同种型背景(作为对照)的倍数变化。

图10A-图10C显示免疫组合物的肿瘤内分析的结果。显示了GI肿瘤(图10A)、肾肿瘤(图10B)和经抗体处理的肿瘤切片的CD45+和CD3+组合物(图10C)的数据。

图11显示含有指示TAM浸润的巨噬细胞(CD11b)印记的肿瘤的百分比。

对于任何显示条形直方图、曲线或与图例有关的其他数据的图来说，每个指示从左至右所呈现的条、曲线或其他数据直接并依序对应于图例中从上至下的盒。

具体实施方式

在本文中测得，某些靶标调控单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型、极化、活化和/或功能。因此，本发明部分地关于调节本文所述的一种或多种生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出的靶标)的拷贝数、量和/或活性的方法以及所述生物标志物和/或调节剂用于治疗、诊断、预后和筛选目的用途，如下文进一步所述。

I.

在一些实施方案中，术语“约”涵盖在所测量值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(包括所述值)或任何中间范围(例如±2％-6％)内的值。在一些实施方案中，术语“约”是指方法、测定或测量值的固有误差变化，例如存在于实验中的变化。

术语“活化受体”包括结合抗原、复合抗原(例如在主要组织相容性复合物(MHC)多肽的背景中)或结合至抗体的免疫细胞受体。这类活化受体包括T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、细胞因子受体、LPS受体、补体受体、Fc受体和其他含ITAM受体。例如，T细胞受体存在于T细胞上并与CD3多肽缔合。T细胞受体是由MHC多肽背景中的抗原(以及由多克隆T细胞活化试剂)刺激。经由TCR活化T细胞导致众多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质变化、离子通量、环状核苷酸改变、RNA转录变化、蛋白质合成变化和细胞体积变化。类似于T细胞，经由活化受体(例如细胞因子受体或模式相关分子模式(PAMP)受体)活化巨噬细胞导致例如以下变化：蛋白质磷酸化、表面受体表型改变、蛋白质合成和释放以及形态变化。

术语“施用”涉及将药剂实际性物理引入所关注生物靶标(例如宿主和/或受试者)中或其上(在适当时)。可在体外或体内将组合物施用于细胞(例如“接触”)。可在体内经由适当施用途径将组合物施用于受试者。根据本发明涵盖将组合物引入宿主中的任何和所有方法。所述方法并不依赖于任何特定引入方式并且不应如此解释。引入方式是本领域技术人员众所周知的，并且还示例于本文中。所述术语包括容许药剂实施其预期功能的施用途径。可用于治疗身体的施用途径的实例包括注射(皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内、鞘内等)、口服、吸入和透皮途径。注射可为快速浓注或可为连续输注。取决于施用途径，药剂可用所选材料涂覆或布置于其中以保护其免受可有害地影响其实施其预期功能的能力的天然条件影响。可单独或联合药学上可接受的载体来施用药剂。药剂还可作为前药来施用，前药在体内转化成其活性形式。

术语“药剂”是指化合物、超分子复合物、材料和/或它们的组合或混合物。化合物(例如分子)可由化学式、化学结构或序列代表。药剂的代表性非限制性实例包括例如小分子、多肽、蛋白质、多核苷酸(例如RNAi剂、siRNA、miRNA、piRNA、mRNA、反义多核苷酸、适体等)、脂质和多糖。一般来说，可使用本领域已知的任何合适方法来获得药剂。在一些实施方案中，药剂可为用于治疗受试者(例如人类)的疾病或病症(例如癌症)的“治疗剂”。

术语“激动剂”是指结合至靶标(例如受体)并且激活或增加靶标的生物活性的药剂。例如，“激动剂”抗体是激活或增加其所结合抗原的生物活性的抗体。

术语“改变量”或“改变水平”涵盖与对照样品中的拷贝数或表达水平相比，生物标志物核酸的增加或降低的拷贝数(例如种系和/或体细胞)或所关注样品中的增加或降低的表达水平。术语生物标志物的“改变量”还包括与正常对照样品中的相应蛋白质水平相比，样品(例如癌症样品)中生物标志物蛋白的增加或降低的蛋白质水平。另外，可通过检测可影响生物标志物蛋白的表达或活性的翻译后修饰(例如标志物的甲基化状态)来测定生物标志物蛋白的改变量。在一些实施方案中，“改变量”是指生物标志物的存在或不存在，这是因为参考基线可分别为生物标志物的不存在或存在。可根据用于测量生物标志物的给定测定的敏感性的临限值来测定生物标志物的不存在或存在。

如果生物标志物的量相比于正常水平分别大于或小于比用于评价量的测定的标准误差更大的量并且优选地大于或小于所述量至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％，则受试者中的生物标志物的量“显著”高于或低于生物标志物的正常量。或者，如果受试者中的生物标志物的量分别高于或低于生物标志物的正常量至少约两倍和优选地至少约三倍、四倍或五倍，则所述量可视为“显著”高于或低于正常量。这样的“显著性”还可适用于本文所述的任何其他测量参数，例如用于表达、抑制、细胞毒性、细胞生长等。

术语生物标志物的“改变的表达水平”是指测试样品(例如源自患有癌症的患者的样品)中生物标志物的表达水平或拷贝数大于或小于用于评价表达或拷贝数的测定的标准误差并且优选地至少两倍和更优选地三倍、四倍、五倍或十倍或更大倍数于对照样品(例如来自未患有相关疾病的健康受试者的样品)中的生物标志物的表达水平或拷贝数和优选地若干对照样品中的生物标志物的平均表达水平或拷贝数。在一些实施方案中，生物标志物的水平是指生物标志物本身的水平、经修饰生物标志物(例如磷酸化生物标志物)的水平或生物标志物相对于另一测量变量(例如对照)的水平(例如相对于未磷酸化生物标志物的磷酸化生物标志物)。术语“表达”涵盖核酸(例如DNA)被转录以产生RNA的过程，并且还可以指处理RNA转录物并翻译成多肽的过程。核酸及其多肽对应体(如果存在)的表达总和有助于生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的量。

术语生物标志物的“改变的活性”是指与正常对照样品中生物标志物的活性相比，疾病状态(例如在癌症样品中)或经处理状态中的生物标志物的活性有所增加或降低。生物标志物的改变的活性可源自例如改变的生物标志物表达、改变的生物标志物蛋白水平、改变的生物标志物结构或例如改变的与其他与生物标志物涉及相同或不同途径的蛋白质的相互作用或改变的与转录活化剂或抑制剂的相互作用。

术语生物标志物的“改变的结构”是指与正常或野生型基因或蛋白质相比在生物标志物核酸或蛋白质内存在突变或等位基因变体，例如影响生物标志物核酸或蛋白质的表达或活性的突变。例如，突变包括但不限于取代、缺失或添加突变。突变可存在于生物标志物核酸的编码区或非编码区中。

术语生物标志物的“改变的亚细胞定位”是指相对于细胞内(例如健康和/或野生型细胞内)的正常定位，生物标志物错误定位于细胞内。可通过分析由生物标志物多肽所携带的本领域已知的亚细胞定位基序来确定标志物正常定位的指示。

术语“拮抗剂”或“阻断剂”是指结合至靶标(例如受体)并且抑制或减小靶标的生物活性的药剂。例如，“拮抗剂”抗体是显著抑制或减小其所结合抗原的生物活性的抗体。

除非在本文内另外指定，否则术语“抗体”广泛涵盖天然存在形式的抗体(例如IgG、IgA、IgM、IgE)和重组抗体(例如单链抗体、嵌合和人源化抗体以及多特异性抗体)以及所有前述抗体的片段、融合蛋白和衍生物，所述片段和衍生物具有至少一个抗原性结合位点。抗体衍生物可包含与抗体缀合的蛋白质或化学部分。

另外，“细胞内抗体”是一类具有抗体特性的众所周知的抗原结合分子，但其能够表达于细胞内以结合和/或抑制所关注细胞内靶标(Chen等人(1994)Human Gene Ther.5：595-601)。改变抗体以靶向(例如抑制)细胞内部分的方法在本领域中是众所周知的，例如使用单链抗体(scFv)，修饰免疫球蛋白VL结构域以实现超稳定性，修饰抗体以抵抗还原性细胞内环境，生成增加细胞内稳定性和/或调节细胞内定位的融合蛋白等。细胞内抗体还可引入和表达于多细胞生物体的一个或多个细胞、组织或器官中以例如用于预防和/或治疗目的(例如作为基因疗法)(至少参见PCT公开第WO 08/020079号、第WO 94/02610号、第WO95/22618号和第WO 03/014960号；美国专利第7,004,940号；Cattaneo和Biocca(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications(Landes and Springer-Verlag publs.)；Kontermann(2004)Methods 34：163-170；Cohen等人(1998)Oncogene 17：2445-2456；Auf der Maur等人(2001)FEBS Lett.508：407-412；Shaki-Loewenstein等人(2005)J.Immunol.Meth.303：19-39)。

术语“生物标志物”是指作为用于调节一种或多种所关注表型(例如单核细胞和/或巨噬细胞中的所关注表型)的靶标的基因或基因产物。在上下文中，术语“生物标志物”与“靶标”同义。在一些实施方案中，然而，所述术语还涵盖经测定以指示所关注输出(例如一种或多种诊断、预后和/或治疗输出(例如用于调节发炎表型、癌症状态等))的可测量靶标实体。生物标志物可包括但不限于核酸(例如基因组核酸和/或经转录核酸)和蛋白质，特别是表1和表2中所列出者。在一个实施方案中，这些靶标是表1中所示的发炎表型、免疫反应和/或T细胞介导的细胞毒性的负性调控剂和/或表2中所示的发炎表型、免疫反应和/或T细胞介导的细胞毒性的正性调控剂。

术语“癌症”或“肿瘤”或“过度增殖性”是指存在拥有致癌细胞典型特性(例如不受控增殖、不死性、侵袭性或转移性潜力、快速生长和某些特征性形态特征)的细胞。在一些实施方案中，这类细胞表现出部分地或完全由免疫检查点蛋白(例如PD-1、PD-L1、PD-L2和/或CTLA-4)的表达和活性所致的这些特性。

癌细胞通常呈肿瘤形式，但这些细胞可单独存在于动物内，或者可为非致瘤癌细胞如白血病细胞。如本文所用，术语“癌症”包括恶变前癌症以及恶性癌症。癌症包括但不限于各种癌症/癌瘤，包括膀胱癌(包括加速膀胱癌和转移性膀胱癌)、乳腺癌、结肠癌(包括结直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞和非小细胞肺癌和肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、宫颈癌、甲状腺癌和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；淋巴样谱系的造血性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(Hodgkins lymphoma)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma)、毛细胞淋巴瘤、组织细胞性淋巴瘤和伯基特淋巴瘤(Burketts lymphoma)；骨髓样谱系的造血性肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓发育不良综合征、髓系白血病和前髓细胞性白血病；中枢和周边神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质源肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮症、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌症和畸胎癌；黑素瘤、不可切除性阶段III或IV恶性黑素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠道癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性神经胶母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌和头颈癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、骨癌、骨肿瘤、成人骨恶性纤维性组织细胞瘤；儿童期骨恶性纤维性组织细胞瘤、肉瘤、儿科肉瘤、鼻窦天然杀手肿瘤、赘瘤、浆细胞赘瘤；骨髓发育不良综合征；神经母细胞瘤；睾丸生殖细胞肿瘤、眼内黑素瘤、骨髓发育不良综合征；骨髓发育不良/骨髓增殖性疾病、滑膜肉瘤、慢性髓系白血病、急性淋巴母细胞性白血病、费城染色体(Philadelphiachromosome)阳性急性淋巴母细胞性白血病(Ph+ ALL)、多发性骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、肥大细胞增多症和与肥大细胞增多症相关的任何症状及其任何转移。另外，病症包括色素性荨麻疹、肥大细胞增多症(例如弥漫性皮肤肥大细胞增多症、人类孤立性肥大细胞瘤以及狗肥大细胞瘤和一些稀有亚型如大疱性肥大细胞增多症、红皮性肥大细胞增多症和毛细管扩张性肥大细胞增多症)、伴有相关血液学病症(例如骨髓增殖性或骨髓发育不良综合征或急性白血病)的肥大细胞增多症、与肥大细胞增多症相关的骨髓增殖性病症、肥大细胞白血病以及其他癌症。其他癌症也包括在病症范围内，包括但不限于下列：癌瘤，包括膀胱癌、尿路上皮癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、睾丸癌，特别是睾丸精原细胞瘤和皮肤癌(包括鳞状细胞癌)；胃肠道基质肿瘤(“GIST”)；淋巴样谱系的造血性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤；骨髓样谱系的造血性肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病和前髓细胞性白血病；间充质源肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；其他肿瘤，包括黑素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤和神经胶质瘤；中枢和周边神经系统的肿瘤，包括星形细胞瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；间充质源肿瘤，包括纤维肉瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤；和其他肿瘤，包括黑素瘤、着色性干皮症、角化棘皮瘤、精原细胞瘤、甲状腺滤泡性癌症、畸胎癌、化学疗法难治性非精原性生殖细胞肿瘤和卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)及其任何转移。适用于本发明所涵盖方法的癌症类型的其他非限制性实例包括人类肉瘤和癌瘤，例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、威尔姆斯瘤(Wilms′ tumor)、骨癌、脑肿瘤、肺癌(包括肺腺癌)、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突神经胶细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤；白血病，例如急性淋巴细胞性白血病和急性骨髓细胞性白血病(骨髓母细胞性、前髓细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病)；慢性白血病(慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病)；和真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病(Hodgkin′s disease)和非霍奇金病(non-Hodgkin′s disease))、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)和重链病。在一些实施方案中，癌症是上皮性并且包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、妇科癌、肾癌、喉癌、肺癌、口腔癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或皮肤癌。在一些实施方案中，上皮癌是非小细胞肺癌、非乳头状肾细胞癌、宫颈癌、卵巢癌(例如浆液性卵巢癌)或乳腺癌。可以各种其他方式来表征上皮癌，包括但不限于浆液性、子宫内膜样、粘液性、透明细胞性、布伦纳氏(Brenner)或未分化性。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：(晚期)非小细胞肺癌、黑素瘤、头颈鳞状细胞癌、(晚期)尿道上皮膀胱癌、(晚期)肾癌(RCC)、高微卫星不稳定性癌症、经典霍奇金淋巴瘤、(晚期)胃癌、(晚期)宫颈癌、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、(晚期)肝细胞癌和(晚期)默克尔细胞(merkel cell)癌。

术语“编码区”是指核苷酸序列中包含翻译成氨基酸残基的密码子的区域，而术语“非编码区”是指核苷酸序列中未翻译成氨基酸的区域(例如5′和3′非翻译区)。

术语“互补”是指两个核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。众所周知，如果与第一区域反向平行的第二核酸区域中的残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第一核酸区域的腺嘌呤残基能够与第二核酸区域中的所述残基形成特定氢键(“碱基配对”)。类似地已知，如果与第一链反向平行的第二核酸链中的残基是鸟嘌呤，则第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链中的所述残基碱基配对。如果在核酸的第一区域与相同或不同核酸的第二区域以反向平行方式排列时，第一区域的至少一个核苷酸残基能够与第二区域的残基碱基配对，则所述两个区域互补。优选地，第一区域包含第一部分并且第二区域包含第二部分，其中，在第一部分和第二部分以反向平行方式布置时，第一部分中至少约50％和优选地至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或更多核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。在一些实施方案中，互补多核苷酸可为“充分互补”或可具有“充分互补性”，即互补性足以维持双链体和/或具有期望活性。例如，在RNAi剂的情形下，所述互补性是药剂与靶标mRNA之间的互补性，其足以部分地或完全地防止mRNA翻译。例如，具有“与靶标mRNA序列充分互补以引导靶标特异性RNA干扰(RNAi)的序列”的siRNA意指，siRNA具有足以触发通过RNAi机制或过程来破坏靶标mRNA的序列。

术语“基本上互补”是指两个核酸之间的碱基配对、双链区域并且并非任何单链区域(例如两个双链区域之间的末端悬突或间隙区域)中的互补性。互补性未必是完全的；可存在任何数量的碱基对错配。在一些实施方案中，当两个序列在本文中称为“基本上互补”时，其意指所述序列彼此充分互补在所选反应条件下杂交。因此，基本上互补的序列可指在双链区域中碱基对互补性为至少100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％或更低或其间的任何数值的序列。

如本文所用的术语“联合疗法”和“组合疗法”是指施用两种或更多种治疗剂，例如表1中列出的一种以上靶标的调节剂的组合、表2中列出的一种以上靶标的调节剂的组合、表1中列出的至少一种靶标的至少一种调节剂和表2中列出的至少一种靶标的至少一种调节剂的组合、表1和/或表2中列出的至少一种靶标的至少一种调节剂和另一治疗剂(例如免疫检查点疗法等)的组合，和它们的组合。构成组合疗法的不同剂可与施用另一剂或其他剂同时、在其之前或在其之后施用。组合疗法旨在从这些治疗剂的共同作用来提供有益(加和或协同)效应。这些治疗剂的组合施用可在限定时间段(取决于所选组合，通常数分钟、数小时、数天或数周)内实施。在组合疗法中，组合治疗剂可以依序方式或通过基本上同时施加来施加。

术语“对照”是指任何适于提供与测试样品中的表达产物进行比较的参考标准物。在一个实施方案中，对照包括获得检测表达产物水平的“对照样品”并且与来自测试样品的表达产物水平进行比较。这种对照样品可包含任何合适样品，包括但不限于来自受试者(例如具有单核细胞和/或巨噬细胞的受试者和/或具有已知结果的对照癌症患者(可为储存样品或先前样品测量))的样品；从受试者(例如正常患者或癌症患者)分离的正常组织或细胞，从受试者(例如正常受试者或癌症患者)分离的经培养原代细胞/组织，从癌症患者的相同器官或身体位置获得的毗邻正常细胞/组织，从正常受试者分离的组织或细胞样品，或从保藏机构获得的原代细胞/组织。在另一个优选的实施方案中，对照可包含来自任何合适来源(包括但不限于管家基因)的参考标准表达产物水平，来自正常组织(或其他先前分析的对照样品)的表达产物水平范围、先前在来自具有某一结果(例如存活一、二、三、四年等)或接受某一治疗(例如标准护理癌症疗法)的患者群或患者组的测试样品内所测定的表达产物水平范围。本领域技术人员应理解，这些对照样品和参考标准表达产物水平可组合用作本发明所涵盖方法中的对照。在一个实施方案中，对照可包含正常或非癌性细胞/组织样品。在另一个优选的实施方案中，对照可包含患者组(例如癌症患者组或接受某一治疗的癌症患者组或具有一种结果与另一结果的患者组)的表达水平。在前一情形下，可将每一患者的具体表达产物水平指派为表达水平百分位，或表示为高于或低于参考标准表达水平的平均数或平均值。在另一个优选的实施方案中，对照可包含正常细胞、来自用组合化学疗法治疗的患者的细胞和来自患有良性癌症的患者的细胞。在另一个实施方案中，对照还可包含测量值，例如与某一群体中的管家基因的表达水平相比相同群体中的特定基因的平均表达水平。这个群体可包含正常受试者、未经受任何治疗(即未治疗)的癌症患者、经受标准护理疗法的癌症患者或患有良性癌症的患者。在另一个优选的实施方案中，对照包含表达产物水平的转变比率，包括但不限于测定测试样品中两种基因的表达产物水平的比率并且将其与参考标准物中的相同两种基因的任何合适比率进行比较；测定测试样品中的两种或更多种基因的表达产物水平并测定任何合适对照中的表达产物水平之差；以及测定测试样品中的两种或更多种基因的表达产物水平，将其表达相对于测试样品中的管家基因的表达归一化，以及与任何合适对照进行比较。在特别优选的实施方案中，对照包含与测试样品为相同谱系和/或类型的对照样品。在另一个实施方案中，对照可包含根据患者样品(例如所有癌症患者)内或基于其的百分位分组的表达产物水平。在一个实施方案中，确立对照表达产物水平，其中使用相对于例如特定百分位的较高或较低表达产物水平作为预测结果的基础。在另一个优选的实施方案中，使用来自具有已知结果的癌症对照患者的表达产物水平来确立对照表达产物水平，并且将来自测试样品的表达产物水平与作为预测结果的基础的对照表达产物水平进行比较。本发明所涵盖方法并不限于使用特定截止点来比较测试样品与对照中的表达产物水平。

生物标志物核酸的“拷贝数”是指细胞(例如种系和/或体细胞)中编码特定基因产物的DNA序列的数量。通常，对于给定基因来说，哺乳动物具有每一基因的两个拷贝。然而，拷贝数可通过基因扩增或复制来增加，或通过缺失来减小。例如，种系拷贝数变化包括一个或多个基因座处的变化，其中所述一个或多个基因座并不计及对照中的种系拷贝的正常补体中的拷贝数(例如，测定特定种系DNA和相应拷贝数的物种的相同物种的种系DNA中的正常拷贝数)。体细胞拷贝数变化包括一个或多个基因座处的变化，其中所述一个或多个基因座并不计及对照的种系DNA中的拷贝数(例如，测定体细胞DNA和相应拷贝数的受试者的相同受试者的种系DNA中的拷贝数)。

术语“细胞因子”是指由免疫系统的某些细胞分泌并且对其他细胞具有生物效应的物质。细胞因子可为多种不同物质，例如干扰素、白介素和生长因子。

术语“确定用于受试者的合适治疗方案”被认为意指，确定用于受试者的基于或基本上基于或至少部分地基于本发明所涵盖生物标志物介导的分析的结果来开始、修改和/或结束的治疗方案(即用于预防和/或治疗受试者癌症的单一疗法或不同疗法的组合)。一个实例是确定是否提供针对癌症的靶向疗法，以提供使用本发明所涵盖调节一种或多种生物标志物的药剂的疗法。另一个实例是在手术之后开始辅助疗法，其目的在于降低复发风险。再一个实例是修改特定化学疗法的剂量。除根据本发明的分析结果外，所述确定可基于待治疗受试者的个人特性。在大部分情形下，由主治医师或医生来实际确定用于受试者的合适治疗方案。

术语“无内毒素”或“基本上无内毒素”是指含有至多痕量(例如对受试者无临床不良生理学效应的量)的内毒素和优选地不可检测量的内毒素的组合物、溶剂和/或器皿。内毒素是与某些细菌、通常革兰氏阴性(gram-negative)细菌相关的毒素，但内毒素可发现于革兰氏阳性(gram-positive bacteria)细菌(例如单核细胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogene))中。最盛行内毒素是发现于各种革兰氏阴性细菌的外膜中的脂多糖(LPS)或脂寡糖(LOS)，其代表这些细菌致病能力中的主要病原性特征。人类中的少量内毒素即可产生发热、降低血压以及激活发炎和凝血以及其他不良生理学效应。因此，在药物生产中，通常期望从药品和/或药物容器去除大部分或所有痕量内毒素，这是因为极小量即可在人类中引起不良效应。除热原烘箱可用于此目的，这是因为通常需要超过300℃的温度来分解大部分内毒素。例如，基于主要包装材料(例如注射器或小瓶)，250℃玻璃温度和30分钟保持时间的组合通常足以实现内毒素水平的3log减小。涵盖去除内毒素的其他方法，包括例如如本文所述和本领域已知的色谱法和过滤方法。可使用本领域已知的常规技术来检测内毒素。例如，鲎变形细胞溶解物测定(其利用来自鲎的血液)是用于检测内毒素的存在的极敏感测定。在该测试中，极低水平的LPS即可引起鲎溶解物的可检测凝血，这是因为存在扩大该反应的强力酶促级联。还可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来量化内毒素。为实现基本上无内毒素，内毒素水平可小于约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.08、0.09、0.1、0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、9或10EU/ml或其间的任何范围(包括端值，例如0.05至10EU/ml)。通常，1ng脂多糖(LPS)对应于约1-10EU。

术语“表达印记”或“印记”是指一种或多种指示所关注状态的经表达生物标志物的组。例如，构成该印记的基因、蛋白质等可表达于特定细胞谱系、分化阶段或特定生物反应期间。生物标志物可反映表达其的肿瘤的生物方面，例如细胞的发炎状态、癌症的源细胞、活检中的非恶性细胞性质和负责癌症的致癌机制。表达数据和基因表达水平可存储于计算机可读媒体(例如与微阵列或芯片读取装置联合使用的计算机可读媒体)上。可操纵这些表达资料以生成表达印记。

术语“基因”涵盖编码具有一定功能的分子(例如RNA、蛋白质等)的核苷酸(例如DNA)序列。基因通常包含两条互补核苷酸链(即dsDNA)，即编码链和非编码链。在提及DNA转录时，编码链是碱基序列对应于所产生RNA转录物的碱基序列(但胸腺嘧啶由尿嘧啶代替)的DNA链。编码链含有密码子，而非编码链含有反密码子。在转录期间，RNA Pol II结合非编码链，读取反密码子，并且转录其序列以合成具有互补碱基的RNA转录物。在一些实施方案中，所列出的基因序列(即DNA序列)是编码链的序列。

术语“基因产物”(在本文中也称为“基因表达产物”或“表达产物”)涵盖基因表达的产物，例如从基因转录的核酸(例如mRNA)和源自所述mRNA的翻译的多肽或蛋白质。应了解，某些基因产物可例如在细胞中经受处理或修饰。例如，可在翻译之前剪接mRNA转录物，实施多聚腺苷酸化等，和/或多肽可经受共翻译或翻译后处理(例如去除分泌信号序列、去除细胞器靶向序列或例如磷酸化、糖基化、甲基化、脂肪酰化等修饰，等等)。术语“基因产物”涵盖这些经处理或修饰形式。来自各种物种(包括人类)的基因组mRNA和多肽序列在本领域中是已知的并且可在可公开访问的数据库中获得(例如可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(ncbi.nih.gov)或通用蛋白质资源(Universal Protein Resource)(uniprot.org)处获得者)。其他数据库包括例如GenBank、RefSeq、Gene、UniProtKB/SwissProt、UniProtKB/Trembl等。一般来说，可使用NCBI参考序列数据库中的序列作为所关注基因的基因产物序列。应了解，某一基因的多个等位基因可存在于相同物种的个体中。某些蛋白质可例如因替代性RNA剪接或编辑而存在多个同工型。一般来说，在本公开的方面涉及基因或基因产物的情形下，除非另外指示，否则在适当时涵盖涉及等位基因变体或同工型的实施方案。某些实施方案可涉及特定序列(例如特定等位基因或同工型)。

术语“生成”涵盖实现期望结果的任何方式，例如通过直接或间接作用。例如，可通过直接作用(例如通过与至少一种调节本文所述一种或多种生物标志物的药剂接触)和/或通过间接作用(例如通过繁殖具有期望物理、基因和/或表型属性的细胞)来生成具有本文所述的调节表型的细胞。

关于细胞生物标志物表达的术语“高”、“低”、“中等”和“阴性”是指所表达生物标志物相对于生物标志物在一种或多种参考细胞中的细胞表达的量。可根据本文所述的任何方法来测定生物标志物表达，包括但不限于分析一种或多种生物标志物基因组核酸、核糖核酸和/或多肽的细胞水平、活性、结构等。在一个实施方案中，所述术语是指分别以最高、中等或最低水平表达生物标志物的细胞群体的限定百分比。这样的百分比可定义为最高0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或更多或其间的任何范围(包括端值)的高度表达或较弱表达生物标志物的细胞群体。术语“低”不包括不可检测地表达生物标志物的细胞，因为所述细胞对于生物标志物表达来说是“阴性”。术语“中等”包括表达生物标志物但表达水平低于以“高”水平表达其的群体的细胞。在另一个实施方案中，所述术语还可指或替代地指通过定性或统计学图区鉴定的生物标志物表达的细胞群体。例如，可基于生物标志物表达水平通过基于可检测部分分析(例如基于平均荧光强度等)根据本领域中众所周知的方法鉴定不同绘图来区分使用流式细胞术分选的细胞群体。可根据数量、形状、重叠等基于本领域用于所关注生物标志物的众所周知的方法来细化这些图区。在再一个实施方案中，还可根据其他生物标志物的表达的存在或不存在来测定所述术语。

术语“基本上同一”是指核酸或氨基酸序列在例如使用下述方法最佳地比对时与第二核酸或氨基酸序列共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。“基本上同一性”可用于指各种类型和长度的序列，例如全长序列、功能结构域、编码和/或调控序列、外显子、内含子、启动子和基因组序列。以本领域技术范围内的各种方式来测定两个多肽或核酸序列之间的序列同一性百分比，例如使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；(Altschul等人(1995)J.Mol.Biol.215：403-410)、BLAST-2、BLAST-P、BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL或Megalign(DNASTAR)软件。另外，本领域技术人员可测定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的长度范围内实现最大比对所需的任何算法。应理解，出于测定序列同一性的目的，在比较DNA序列与RNA序列时，胸腺嘧啶核苷酸等效于尿嘧啶核苷酸。保守取代通常包括下列组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。

术语“免疫细胞”是指能够直接或间接参与免疫反应的细胞。免疫细胞包括但不限于T细胞、B细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、天然杀手(NK)细胞、天然杀手T(NK)细胞、淋巴因子活化的杀手(LAK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、颗粒细胞、肥大细胞、血小板、朗格汉斯细胞(Langerhan′s cell)、干细胞、外周血单核细胞、细胞毒性T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等。“抗原呈递细胞”(APC)是能够活化T细胞的细胞，并且包括但不限于单核细胞/巨噬细胞、B细胞和树突状细胞(DC)。术语“树突状细胞”或“DC”是指发现于淋巴样或非淋巴样组织中的形态上类似的细胞类型的不同群体的任何成员。这些细胞的特征在于其独特形态和高表面II类MHC表达水平。DC可分离自多种组织来源。DC能够高度敏化MHC限制性T细胞并且极有效地将抗原原位呈递至T细胞。抗原可为表达于T细胞发育和耐受期间的自身抗原和存在于正常免疫过程期间的外来抗原。术语“嗜中性粒细胞”通常是指构成先天性免疫系统的一部分的白细胞。嗜中性粒细胞通常具有含有约2-5个叶片的分段细胞核。嗜中性粒细胞通常在创伤后几分钟内迁移至损伤部位。嗜中性粒细胞通过在损伤或感染部位处释放细胞毒性化合物(包括氧化剂、蛋白酶和细胞因子)来发挥作用。术语“活化DC”是用抗原脉冲化并且能够活化免疫细胞的DC。术语“NK细胞”具有其本领域中的一般含义并且是指天然杀手(NK)细胞。本领域技术人员可容易地通过测定例如特定表型标志物(例如CD56)的表达来鉴定NK细胞并且基于例如表达不同种类细胞因子的能力或诱导细胞毒性的能力来鉴定其功能。术语“B细胞”是指源自骨髓和/或脾的免疫细胞。B细胞可发育成产生抗体的浆细胞。术语“T细胞”是指参与各种细胞介导的免疫反应的胸腺源免疫细胞，包括CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。常规T细胞(也称为Tconv或Teff)具有效应功能(例如细胞因子分泌、细胞毒性活性、抗自我识别等)以借助于表达一种或多种T细胞受体来增加免疫反应。Tconv或Teff通常定义为任何非Treg的T细胞群体并包括例如未处理T细胞、活化T细胞、记忆T细胞、静止性Tconv或分化成例如Th1或Th2谱系的Tconv。在一些实施方案中，Teff是非调控性T细胞(Treg)的子集。在一些实施方案中，Teff是CD4+ Teff或CD8+ Teff，例如CD4+辅助T淋巴细胞(例如Th0、Th1、Tfh或Th17)和CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)。如本文进一步所述，细胞毒性T细胞是CD8+ T淋巴细胞。“未处理Tconv”是已在骨髓中分化并且成功地在胸腺中经受正向和负向主要选择过程但尚未通过暴露于抗原而活化的CD4

术语“免疫调控剂”是指调控免疫反应的物质、药剂、信号通路或其组分。关于免疫反应的术语“调控”、“修饰”或“调节”是指免疫系统细胞或这种细胞的活性的任何改变。这种调控包括免疫系统(或其不同部分)的刺激或抑制，其可表现为各种细胞类型的数量的增加或减少，这些细胞的活性的增加或减少，或可在免疫系统内发生的任何其他变化。已鉴定抑制性和刺激性免疫调控剂，其中的一些在癌症微环境中可具有增强的功能。

术语“免疫反应”意指身体针对“外来物”(例如细菌、病毒和病原体)以及针对可能未必源自身体外部的靶标所产生的防御反应，包括但不限于针对天然存在于身体中的物质(例如针对自身抗原的自身免疫性)或针对经转化(例如癌症)细胞的防御反应。免疫反应特别是免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、天然杀手(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和嗜中性粒细胞)和由这些细胞中的任一者或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体(体液反应)、细胞因子和补体)的活化和/或作用，其导致选择性靶向、结合至、损害、破坏和/或从脊椎动物身体消除侵袭性病原体、感染病原体的细胞或组织、癌性或其他异常细胞，或在自身免疫性或病理性发炎的情形下的正常人类细胞或组织。抗癌免疫反应是指一种免疫监督机制，身体通过所述机制来识别异常肿瘤细胞并引发免疫系统的先天性和适应性免疫性以消除危险癌细胞。

先天性免疫系统是非特异性免疫系统，其包含保护宿主免于由其他生物体感染的细胞(例如天然杀手细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞；和吞噬细胞，包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞)和机制。先天性免疫反应可引发细胞因子产生以及活性补体级联和适应性免疫反应。适应性免疫系统是高度特殊性全身性细胞活化和过程(例如通过抗原呈递细胞的抗原呈递；抗原特异性T细胞活化和细胞毒性效应)所需要和涉及的特异性免疫系统。

术语“免疫治疗剂”可包括可刺激受试者中的宿主免疫系统以针对肿瘤或癌症生成免疫反应的任何分子、肽、抗体或其他剂。各种免疫治疗剂可用于本文所述的组合物和方法中。

术语“抑制”或“下调”包括降低、限制或阻断例如特定作用、功能或相互作用。在一些实施方案中，如果至少一种癌症症状得以缓解、终止、减缓或预防，则癌症受到“抑制”。如本文所用，如果癌症的复发或转移有所减少、减缓、延迟或预防，则癌症也受到“抑制”。类似地，如果与参考状态(例如对照，如野生型状态)相比有所降低，则生物功能(例如蛋白质功能)受到抑制。这种抑制或缺陷可例如通过在特定时间和/或地点施加药剂来诱导，或者可为组成型，例如通过可遗传突变。这种抑制或缺陷还可为部分的或完全的(例如与参考状态(例如对照，如野生型状态)相比基本上无可测量活性)。基本上完全的抑制或缺陷被称为阻断。术语“促进”或“上调”具有相反含义。

在提及两个分子之间的相互作用时，术语“相互作用”是指分子彼此的物理接触(例如结合)。通常，这种相互作用产生所述分子中的一者或两者的活性(其产生生物效应)。活性可为一或两个分子的直接活性(例如信号转导)。或者，可防止相互作用中的一或两个分子结合其配体，并且由此关于配体结合活性(例如结合其配体并触发或抑制共刺激)保持惰性。抑制这种相互作用可破坏涉及所述相互作用的一个或多个分子的活性。增强这种相互作用是延长所述物理接触或增加其可能性，以及延长所述活性或增加其可能性。

“经分离蛋白质”是指基本上不含其他蛋白质、细胞材料、分离介质和培养基(在从细胞分离或通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其他化学物质(在以化学方式合成时)的蛋白质。“经分离”或“经纯化”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自细胞或组织来源(从其衍生抗体、多肽、肽或融合蛋白)的细胞材料或其他污染蛋白或基本上不含化学前体或其他化学物质(在以化学方式合成时)。术语“基本上不含细胞材料”包括生物标志物多肽或其片段的制剂，其中蛋白质与从其分离或以重组方式产生的细胞的细胞组分分离。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞材料”包括生物标志物蛋白或其片段的制剂，其具有小于约30％(以干重计)非生物标志物蛋白(在本文中也称为“污染蛋白质”)、更优选小于约20％非生物标志物蛋白、仍更优选小于约10％非生物标志物蛋白并且最优选小于约5％非生物标志物蛋白。在抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段(例如其生物活性片段)是以重组方式产生时，其还优选地基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂的体积的小于约20％、更优选小于约10％并且最优选小于约5％。

术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM、IgG1、IgG2C等)。

术语“KD”旨在是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。可通过标准抗体-抗原测定(例如竞争性测定、饱和测定或标准免疫测定(例如ELISA或RIA))来测量或测定所公开发明的抗体的结合亲和力。

术语“微环境”通常是指所关注组织区域中的局部区域并且可例如是指“肿瘤微环境”。术语“肿瘤微环境”或“TME”是指始终与肿瘤细胞相互作用的周围微环境，其有助于容许肿瘤细胞与其环境之间的串扰。肿瘤微环境可包括肿瘤、周围血管、免疫细胞、纤维母细胞、骨髓源发炎细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质的细胞环境。肿瘤环境可包括由肿瘤微环境辅助和影响以确保生长和存活的肿瘤细胞或恶性细胞。肿瘤微环境还可包括肿瘤浸润性免疫细胞如淋巴样细胞和髓系细胞，其可刺激或抑制抗肿瘤免疫反应，和基质细胞如肿瘤相关性纤维母细胞和内皮细胞，其有助于肿瘤的结构完整性。基质细胞可包括构成肿瘤相关性血管的细胞，例如内皮细胞和外周细胞，其是有助于结构完整性的细胞(纤维母细胞)，以及肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和浸润性免疫细胞，包括单核细胞、嗜中性粒细胞(PMN)、树突状细胞(DC)、T细胞和B细胞、肥大细胞和天然杀手(NK)细胞。基质细胞构成肿瘤细胞的主体，而实体肿瘤中的主要细胞类型是巨噬细胞。

术语“调节”及其语法等效词是指增加或降低(例如沉默)，换句话说上调或下调。

生物标志物的“正常”表达水平是生物标志物在未患有癌症的受试者(例如人类患者)的细胞中的表达水平。

生物标志物的“过表达”或“显著较高表达水平”是指测试样品中的表达水平大于用于评价表达的测定的标准误差，并且优选地高于对照样品(例如来自未患有生物标志物相关疾病的健康受试者的样品)中生物标志物的表达活性或水平并且优选地若干对照样品中的平均生物标志物表达水平至少10％并且更优选地1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多倍。生物标志物的“显著较低表达水平”是指测试样品中的表达水平低于对照样品(例如来自未患有生物标志物相关疾病的健康受试者的样品)中生物标志物的表达水平并且优选地若干对照样品中的平均生物标志物表达水平至少10％并且更优选地1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍或更多倍。

这样的“显著性”水平还可适用于本文所述的任何其他测量参数，例如表达、抑制、细胞毒性、细胞生长等。

术语“外周血细胞亚型”是指通常发现于外周血中的细胞类型，包括但不限于嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、颗粒细胞和B细胞。

术语“预定”生物标志物量和/或活性测量可为用于(仅举例来说)以下用途的生物标志物量和/或活性测量：评估可选择用于特定治疗的受试者，评估对治疗(例如本文所述的一种或多种生物标志物的一种或多种调节剂)的反应，和/或评估疾病状态。预定生物标志物量和/或活性测量可在患者群体(例如患有或未患癌症者)中确定。预定生物标志物量和/或活性测量可为同等适用于每一患者的单一数值，或预定生物标志物量和/或活性测量可根据患者的特定亚群而有所变化。受试者的年龄、体重、身高和其他因素可影响个体的预定生物标志物量和/或活性测量。此外，可个别地测定每个受试者的预定生物标志物量和/或活性。在一个实施方案中，在本文所述方法中所测定和/或比较的量是基于绝对测量。在另一个实施方案中，本文所述方法中所测定和/或比较的量是基于相对测量，例如比率(例如，细胞比率或相对于管家生物标志物或另外通常恒定的生物标志物的表达归一化的血清生物标志物)。预定生物标志物量和/或活性测量可为任何合适标准。例如，可从评价患者选择的相同或不同人类获得预定生物标志物量和/或活性测量。在一个实施方案中，可从同一患者的先前评价获得预定生物标志物量和/或活性测量。以这种方式，可随时间监测患者选择的进展。另外，如果受试者是人类，则可从另一人或多人(例如所选人类组)的评价获得对照。以这种方式，可将评价选择的人类选择程度与合适的其他人(例如与所关注人类处于类似情况下的其他人，例如患有类似或相同疾患和/或属相同种族者)进行比较。

术语“预测”包括使用生物标志物核酸和/或蛋白质状态(例如肿瘤在疗法之前、期间或之后的过度活性或活性不足、出现、表达、生长、缓解、复发或抗性)来测定期望情形的可能性。生物标志物的这种预测用途可通过例如以下各项来证实：(1)增加或降低的拷贝数(例如通过FISH、FISH+SKY、单分子测序(例如如本领域至少在J.Biotechnol.，86：289-301中所述)或qPCR)，生物标志物核酸的过表达或表达不足(例如通过ISH、Northern印迹或qPCR)，增加或降低的生物标志物蛋白(例如通过IHC)，或例如在大于约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、100％或更多的所测定人类癌症类型或癌症样品中的增加或降低的活性；(2)生物样品(例如来自患有癌症的受试者(例如人类)的含有组织、全血、血清、血浆、颊部刮片、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便或骨髓的样品)中的其绝对或相对经调节存在或不存在；(3)癌症患者(例如对T细胞介导的细胞毒性的特定调节剂(单独或与免疫疗法组合)具有反应者或对其产生抗性者)的临床子集中的其绝对或相对经调节存在或不存在。

术语“预防”、“预防性治疗”等是指降低未患但具有患上疾病、病症或疾患的风险或易患疾病、病症或疾患的受试者患上疾病、病症或疾患的可能性。

术语“探针”是指任何能够选择性结合至特定预期靶分子(例如由生物标志物核酸编码或对应于其的核苷酸转录物或蛋白质)的分子。探针可由本领域技术人员合成，或衍生自适当生物制剂。出于检测靶分子的目的，探针可被特定设计以进行标记，如本文所述。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。

术语“比率”是指两个数值(例如评分、总和等)之间的关系。尽管比率可以特定顺序来表示(例如a对b或a：b)，但本领域普通技术人员将认识到，数值之间的潜在关系可以任何顺序来表示而不损失潜在关系的显著性，但是基于所述比率的观测和趋势关联可逆转。

术语“受体”是指通常存在于靶器官、组织或细胞类型的细胞表面上的天然存在的分子或分子复合物。

术语“癌症反应”、“对免疫疗法的反应”或“对T细胞介导的细胞毒性的调节剂/免疫疗法组合疗法的反应”涉及过度增殖性病症(例如癌症)对癌症药剂(例如T细胞介导的细胞毒性的调节剂和免疫疗法)的任何反应，优选地涉及在开始新辅助或辅助疗法之后肿瘤质量和/或体积的变化。可例如针对功效或在新辅助或辅助情况下来评价过度增殖性病症反应，其中可将全身性干预后的肿瘤大小与初始大小和尺寸进行比较，如通过CT、PET、乳房X光摄影片、超声波或触诊所测量。还可通过在活检或手术切除术之后肿瘤的测径器测量或病理学检查来评价反应。反应可以定量方式(如肿瘤体积的变化百分比)或以定性方式(如“病理完全反应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其他定性标准)来记录。可在开始新辅助或辅助疗法之后早期(例如在数小时、数天、数周之后或优选地在数月之后)评价过度增殖性病症反应。反应评价的典型终点是在终止新辅助化学疗法时或在手术去除残余肿瘤细胞和/或肿瘤床时。这通常是在开始新辅助疗法之后三个月。在一些实施方案中，可通过测量临床受益率(CBR)来测定本文所述治疗性治疗的临床功效。通过测定在从结束疗法起至少6个月的时间点完全缓解(CR)的患者百分比、部分缓解(PR)的患者数和患有稳定疾病(SD)的患者数的总和来测量临床受益率。该式简写为CBR＝超过6个月的CR+PR+SD。在一些实施方案中，特定癌症治疗方案的CBR为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更高。用于评估对癌症疗法的反应的其他标准与“存活”相关，其包括所有下列各项：直至死亡的存活率，也称为总体存活率(其中所述死亡可不论何原因或与肿瘤有关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部复发和远端复发)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。可通过参照所定义起点(例如诊断或开始治疗的时间)和端点(例如死亡、复发或转移)来计算所述存活的持续时间。另外，治疗功效的标准可扩展至包括对化学疗法的反应、存活机率、给定时间段内的转移机率和肿瘤复发机率。例如，为测定适当临限值，可向受试者群体施用特定癌症治疗方案并且结果可与在施用任何癌症疗法之前测得的生物标志物测量相关。结果测量可为对在新辅助设置中给予的疗法的病理学反应。或者，可在已知生物标志物测量值的癌症疗法后一定时间段内监测受试者的结果测量(例如整体存活率和无疾病存活)。在某些实施方案中，所施用剂量是本领域已知用于癌症治疗剂的标准剂量。监测受试者的时间段可有所变化。例如，可监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可使用本领域众所周知的方法(例如实施例部分中所述者)来测定与癌症疗法结果相关的生物标志物测量临限值。

术语“抗性”是指癌症样品或哺乳动物对癌症疗法的获得性或天然抗性(即对治疗性治疗无反应或具有降低或有限的反应)，例如对治疗性治疗的反应降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更高(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更高)或其间的任何范围(包括端值)。可通过以下方式来测量反应降低：与在获得抗性之前的相同癌症样品或哺乳动物进行比较，或与已知对治疗性治疗无抗性的不同癌症样品或哺乳动物进行比较。对于化学疗法的典型获得性抗性被称为“多药耐药性”。多药耐药性可由P-糖蛋白介导或可由其他机制介导，或者其可出现于在哺乳动物感染多药耐药性微生物或微生物组合时。治疗性治疗抗性的测定在本领域中是常规的并且在普通技术临床医师的技能范围内，例如可通过细胞增殖性测定和细胞死亡测定(如在本文中阐述为“敏化”)来测量。在一些实施方案中，术语“逆转抗性”意指，与仅一级癌症疗法(例如化学治疗或放射疗法)不能统计学显著性减小肿瘤体积(与未治疗肿瘤的肿瘤体积相比)的情况中未治疗肿瘤的肿瘤体积相比，使用第二剂与一级癌症疗法(例如化学治疗或放射疗法)的组合能够以统计学显著水平(例如p＜0.05)显著减小肿瘤体积。这通常适用于在未治疗肿瘤以对数节奏生长时进行的肿瘤体积测量。

术语“反应”或“反应性”是指例如在减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的意义上的癌症反应。所述术语还可指改善的预后，例如如通过增加的复发时间(其为至第一次复发的时段，其针对作为第一事件的第二原发性癌症或无复发迹象的死亡设限)或增加的总体存活率(其为从治疗至因任何原因死亡的时段)所反映。作出反应或具有反应意指，在暴露于刺激物时实现有益终点。或者，在暴露于刺激物时，最小化、减轻或减弱阴性或有害症状。应了解，评估肿瘤或受试者表现出有益反应的可能性等效于评估肿瘤或受试者不表现出有益反应(即表现出反应缺乏或为无反应性)的可能性。

“RNA干扰(RNAi)”是一种进化保守的过程，其中表达或引入序列一致或高度类似于靶标生物标志物核酸的RNA使得从所述靶向基因转录的信使RNA(mRNA)发生序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)(参见Coburn和Cullen(2002)J.Virol.76：9225)，由此抑制靶标生物标志物核酸的表达。在一个实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。该过程已描述于植物、无脊椎动物和哺乳动物的细胞中。在自然界中，RNAi是由dsRNA特异性核酸内切酶Dicer引发，其促进长dsRNA进行性裂解成称为siRNA的双链片段。将siRNA并入识别并裂解靶标mRNA的蛋白质复合物中。还可通过引入核酸分子(例如合成siRNA或RNA干扰剂)来引发RNAi，以抑制靶标生物标志物核酸的表达或使其沉默。如本文所用，“抑制靶标生物标志物核酸表达”或“抑制标志物基因表达”包括靶标生物标志物核酸或由靶标生物标志物核酸编码的蛋白质的表达或蛋白质活性或水平的任何降低。降低可为与未由RNA干扰剂靶向的靶标生物标志物核酸的表达或由所述靶标生物标志物核酸编码的蛋白质的活性或水平相比降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更多。

除RNAi外，可使用基因组编辑来调节所关注生物标志物的拷贝数或基因序列，例如所关注生物标志物的组成型或诱导型敲除或突变。例如，可使用CRISPR-Cas系统来精确编辑基因组核酸(例如用于产生非功能或无效突变)。在这些实施方案中，可表达CRISPR向导RNA和/或Cas酶。例如，可将仅含向导RNA的载体施用于Cas9酶转基因动物或细胞中。可使用类似策略(例如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或归巢大范围核酸酶(HE)，例如MegaTAL、MegaTev、Tev-mTALEN、CPF1等)。这些系统在本领域是众所周知的(参见例如美国专利第8,697,359号；Sander和Joung(2014)Nat.Biotech.32：347-355；Hale等人(2009)Cell 139：945-956；Karginov和Hannon(2010)Mol.Cell 37：7；美国专利公开第2014/0087426号和第2012/0178169号；Boch等人(2011)Nat.Biotech.29：135-136；Boch等人(2009)Science 326：1509-1512；Moscou和Bogdanove(2009)Science 326：1501；Weber等人(2011)PLoS One 6：e19722；Li等人(2011)Nucl.Acids Res.39：6315-6325；Zhang等人(2011)Nat.Biotech.29：149-153；Miller等人(2011)Nat.Biotech.29：143-148；Lin等人(2014)Nucl.Acids Res.42：e47)。这些基因策略可根据本领域众所周知的方法使用组成型表达系统或诱导型表达系统。

如本文所用的“RNA干扰剂”定义为任何通过RNA干扰(RNAi)来干扰或抑制靶标生物标志物基因的表达的剂。所述RNA干扰剂包括但不限于核酸分子(包括与本发明所涵盖的靶标生物标志物基因或其片段同源的RNA分子)、短干扰RNA(siRNA)和通过RNA干扰(RNAi)来干扰或抑制靶标生物标志物核酸的表达的小分子。

术语用于检测或测定至少一种生物标志物的存在或水平的“样品”通常是脑组织、脑脊髓液、全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便(例如大便)、眼泪和任何其他体液(例如如上文在“体液”的定义下所述)或组织样品(例如活检，例如小肠、结肠样品或手术切除术组织)。在某些情况下，本发明所涵盖的方法还包括从个体获得样品，然后检测或测定样品中的至少一种标志物的存在或水平。

术语“敏化”意指改变癌细胞或肿瘤细胞以容许更有效地使用癌症疗法(例如抗免疫检查点疗法、化学治疗疗法和/或放射疗法)治疗相关癌症。在一些实施方案中，正常细胞并不受影响至导致正常细胞由疗法过度损伤的程度。根据本领域已知用于特定治疗的方法和下文所述方法来测量关于治疗性治疗的增加的敏感性或降低的敏感性，所述方法包括但不限于细胞增殖性测定(Tanigawa等人(1982)Cancer Res.42：2159-2164)和细胞死亡测定(Weisenthal等人(1984)Cancer Res.94：161-173；Weisenthal等人(1985)Cancer TreatRep.69：615-632；Weisenthal等人，Kaspers G J L，Pieters R，Twentyman P R，Weisenthal L M，Veerman A J P编辑，Drug Resistance in Leukemia andLymphoma.Langhorne，P A：Harwood Academic Publishers，1993：415-432；Weisenthal(1994)Contrib.Gynecol.Obstet.19：82-90)。还可在动物中通过测量一定时间段(例如对于人类为6个月并且对于小鼠为4-6周)内的肿瘤大小减小来测量敏感性或抗性。如果与在不存在组合物或方法下的治疗敏感性或抗性相比治疗敏感性增加或抗性减小5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更高(例如2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍或更高)或其间的任何范围(包括端值)，则所述组合物或方法使治疗性治疗反应敏化。关于治疗性治疗的敏感性或抗性的测定在本领域中是常规的并且在普通技术临床医师的技能范围内。应理解，本文所述的增强癌症疗法的功效的任何方法可同样适用于使过度增殖性或另外癌性细胞(例如抗性细胞)对癌症疗法敏感的方法。

“短干扰RNA”(siRNA)在本文中也称为“小干扰RNA”，其定义为用于例如通过RNAi来抑制靶标生物标志物核酸的表达的剂。siRNA可以化学方式合成，可通过体外转录产生，或者可产生于宿主细胞内。在一个实施方案中，siRNA是长度为约15至约40个核苷酸、优选地长度为约15至约28个核苷酸、更优选地长度为约19至约25个核苷酸并且更优选地长度为约19、20、21或22个核苷酸的双链RNA(dsRNA)分子，并且可在每条链上含有长度为约0、1、2、3、4或5个核苷酸的3′和/或5′悬突。两条链上的悬突的长度是独立的，即，一条链上的悬突长度并不依赖于第二条链上的悬突长度。优选地，siRNA能够经由靶标信使RNA(mRNA)的降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)来促进RNA干扰。

在另一个实施方案中，siRNA是小发夹(也称为茎环)RNA(shRNA)。在一个实施方案中，这些shRNA是由短(例如17-29个核苷酸、19-25个核苷酸等区域)反义链、接着4-10核苷酸环(例如4、5、6、7、8、9或10碱基接头区域)和类似有义链构成。或者，有义链可位于核苷酸环结构前面并且反义链可位于核苷酸环结构后面。这些shRNA可含于质粒、逆转录病毒和慢病毒中并且从例如pol III U6启动子或另一启动子表达(参见例如Stewart等人(2003)RNAApr；9(4)：493-501，其通过引用并入本文)。

可将RNA干扰剂(例如siRNA分子)施用于患有癌症或处于患有癌症的风险下的患者以抑制过表达于癌症中的生物标志物基因的表达，并且由此治疗、预防或抑制受试者的癌症。

如应用于生物活性剂的术语“选择性调节剂”或“选择性调节”是指与脱靶细胞群体、信号传导活性等相比，所述药剂能够经由与靶标直接或间接相互作用来调节靶标(例如细胞群体、信号传导活性等)。例如，相较于蛋白质与另一结合伴侣间的另一相互作用和/或所关注细胞群体上的这种相互作用，选择性抑制蛋白质与一种天然结合伴侣间的相互作用的药剂将所述相互作用抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、105倍、110倍、120倍、125倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、1500倍、2000倍、2500倍、3000倍、3500倍、4000倍、4500倍、5000倍、5500倍、6000倍、6500倍、7000倍、7500倍、8000倍、8500倍、9000倍、9500倍、10000倍或更大或其间的任何范围(包括端值)(针对至少一种其他结合伴侣)。这些量度通常是以将相互作用/活性减半所需药剂的相对量的形式来表示。这些量度适用于任何其他选择性布置，例如核酸分子与一个或多个靶序列的结合。

更通常来说，术语“选择性”是指优先作用或功能。术语“选择性”可针对相对于其他靶标在所关注特定靶标中的优先效应来量化。例如，所测量变量(例如调节期望细胞中相对于其他细胞的生物标志物表达、期望细胞相对于其他细胞的富集和/或缺失等)可在所关注靶标中与非预期或不期望靶标相差10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或更大或其间的任何范围(包括端值)(例如50％至16倍)。可使用相同倍数分析来证实给定组织、细胞群体中的效应、所测量变量和/或所测量效应等(例如细胞比率、过度增殖性细胞生长速率或体积、细胞增殖速率等、细胞数量等)的量值。

与之相比，术语“特异性”是指排他性作用或功能。例如，特异性调节蛋白质与一种结合伴侣之间的相互作用是指排他性调节所述相互作用，并且并不以任何显著性调节蛋白质与另一结合伴侣之间的相互作用。在另一实例中，抗体特异性结合预定抗原是指抗体能够结合至所关注抗原而不结合至其他抗原。通常，抗体以大约小于1×10

术语“小分子”是本领域的术语并且包括小于约1000分子量或小于约500分子量的分子。在一个实施方案中，小分子不排他性地包含肽键。在另一个实施方案中，小分子并非寡聚的。可针对活性筛选的示例性小分子化合物包括但不限于肽、肽模拟物、核酸、碳水化合物、小有机分子(例如多聚乙酰)(Cane等人(1998)Science 282：63)和天然产物提取物文库。在另一个实施方案中，化合物是小有机非肽化合物。除非另外指示，否则所述术语旨在涵盖所关注化学结构的所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。

术语“受试者”是指动物、脊椎动物、哺乳动物或人类，尤其是施用药剂以例如用于实验、诊断和/或治疗目的或获得样品或实施程序者。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人类、非人类灵长类动物、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、家养动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)或其他动物(例如骆马和骆驼)。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者是患有癌症的人类受试者。术语“受试者”与“患者”可互换。

术语“存活”包括所有下列各项：直至死亡的存活率，也称为总体存活率(其中所述死亡可不论何原因或与肿瘤相关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部复发和远端复发)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。可通过参照所定义起点(例如诊断或开始治疗的时间)和端点(例如死亡、复发或转移)来计算所述存活的持续时间。另外，治疗功效的标准可扩展至包括对化学疗法的反应、存活机率、给定时间段内的转移机率和肿瘤复发机率。

术语“协同效应”是指两种或更多种药剂(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的调节剂和免疫疗法组合疗法)的组合效应，所述效应大于仅癌症药剂/疗法的单独效应的总和。

术语“靶标”是指通过本文所述的药剂、组合物和/或制剂调节、抑制或沉默的基因或基因产物。靶标基因或基因产物包括野生型形式和突变形式。本发明所涵盖靶标的非限制性、代表性列表提供于表1和表2中。类似地，用作动词的术语“靶向”是指调节靶标基因或基因产物的活性。靶向可指上调或下调靶标基因或基因产物的活性。

术语“治疗性作用”涵盖动物、特别是哺乳动物和更特别是人类中由药理学活性物质引起的局部或全身性作用。该术语由此意指旨在用于诊断、治愈、减轻、治疗或预防动物或人类的疾病或增强期望身体或精神发育和状况的任何物质。由该术语涵盖的预防性作用涵盖延迟或消除疾病或疾患的出现，延迟或消除疾病或疾患的症状的发作，减缓、终止或逆转疾病或疾患的进展，或它们的任何组合。

术语药剂(包括包含这种药剂的组合物和/或制剂)的“有效量”或“有效剂量”是指例如在根据所选施用形式、途径和/或时间表递送至细胞或生物体时足以实现期望生物和/或药理学作用的量。如本领域技术人员所了解，特定药剂或组合物的绝对有效量可取决于例如以下因素而变化：期望生物或药理学终点、待递送的药剂、靶标组织等。本领域技术人员进一步应理解，在各个实施方案中，可以“有效量”与细胞接触或以单一剂量或经由使用多个剂量施用于受试者。术语“有效量”可为“治疗有效量”。

术语“治疗有效量”是指在适用于任何医学治疗的合理益处/风险比下在动物中的至少细胞亚群中有效产生一些期望治疗作用的药剂量。可通过标准制药程序在例如用于测定LD

术语“耐受性”或“不反应性”包括细胞(例如免疫细胞)对刺激(例如经由活化受体或细胞因子的刺激)的抵抗性。不反应性可例如因暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量抗原而出现。若干独立方法可诱导耐受性。一种机制称为“无变应性”，其定义为细胞作为不反应性细胞保留于体内而非分化成具有效应功能的细胞的状态。这种抵抗性通常是抗原特异性的并且在停止暴露于耐受性抗原之后得以保留。例如，T细胞中的无变应性的特征在于缺乏细胞因子产生(例如IL-2)。T细胞无变应性出现于使T细胞暴露于抗原并且在不存在第二信号(共刺激信号)下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时。在这些条件下，将细胞再暴露于相同抗原(即使再暴露发生于在共刺激多肽存在下)不能产生细胞因子并且由此不能增殖。然而，如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，则无变应性T细胞可发生增殖。例如，还可通过缺乏通过T淋巴细胞的IL-2产生来观察T细胞无变应性，如通过ELISA或通过增殖测定使用指示细胞系所测量。或者，可使用报告基因构建体。例如，无变应性T细胞不能引发通过异源性启动子在5′IL-2基因增强子的控制下或通过可发现于增强子内的AP1序列多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等人(1992)Science 257：1134)。另一机制被称为“耗竭”。T细胞耗竭是在许多慢性感染和癌症期间产生的T细胞功能障碍状态。它是通过较差效应功能、抑制受体的持续表达和不同于功能性效应或记忆T细胞的转录状态来定义。

“经转录多核苷酸”或“核苷酸转录物”是与全部或一部分成熟mRNA互补或同源的多核苷酸(例如mRNA、hnRNA、cDNA或所述RNA或cDNA的类似物)，其是通过转录生物标志物核酸和正常转录后处理(例如剪接，如果存在)RNA转录物和逆转录RNA转录物而制得。

术语“治疗”是指所关注疾患(例如疾病或病症)的治疗性管控或改善。治疗可包括但不限于向受试者施用药剂或组合物(例如药物组合物)。通常实施治疗以试图以有益于受试者的方式改变疾病(该术语用于指示需要或可能需要疗法的任何疾病、病症、综合征或不期望疾患)的过程。治疗作用可包括逆转、缓解疾病或所述疾病的一种或多种症状或表现，降低其严重程度，延迟其发作，治愈其，抑制其进展和/或减小其发生或复发的可能性。期望治疗作用包括但不限于预防疾病发生或复发，减轻症状，减弱疾病的任何直接或间接病理结果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或缓和疾病状态，以及缓解或改善预后。可将治疗剂施用于患有疾病或相对于一般群体成员处于增加的发生疾病的风险下的受试者。在一些实施方案中，可将治疗剂施用于已患有疾病但不再显示疾病迹象的受试者。可施用药剂以例如减小明显疾病的复发可能性。可预防性施用治疗剂，即在发生疾病的任何症状或表现之前施用。“预防性治疗”是指向未发生疾病或未显示疾病迹象的受试者提供医学和/或手术管控以例如降低发生疾病的可能性或降低所发生疾病的严重程度。受试者可能已鉴定为处于发生疾病的风险下(例如相对于一般群体处于增加的风险下)或具有增加疾病发生可能性的风险因子。

术语“不反应性”包括癌细胞对疗法的抵抗性或治疗性细胞(例如免疫细胞)对刺激(例如经由活化受体或细胞因子的刺激)的抵抗性。不反应性可例如因暴露于免疫抑制剂或暴露于高剂量抗原而出现。如本文所用，术语“无变应性”或“耐受性”包括对活化受体介导的刺激的抵抗性。这种抵抗性通常是抗原特异性的并且在停止暴露于耐受性抗原之后得以保留。例如，T细胞中的无变应性(与不反应性不同)的特征在于缺乏细胞因子产生(例如IL-2)。T细胞无变应性出现于使T细胞暴露于抗原并且在不存在第二信号(共刺激信号)下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时。在这些条件下，将细胞再暴露于相同抗原(即使再暴露发生于在共刺激多肽存在下)不能产生细胞因子并且由此不能增殖。然而，如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，则无变应性T细胞可发生增殖。例如，还可通过缺乏通过T淋巴细胞的IL-2产生来观察T细胞无变应性，如通过ELISA或通过增殖测定使用指示细胞系所测量。或者，可使用报告基因构建体。例如，无变应性T细胞不能引发通过异源性启动子在5′IL-2基因增强子的控制下或通过可发现于增强子内的AP1序列多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等人(1992)Science 257：1134)。

术语“疫苗”是指用以生成用于预防和/或治疗疾病的免疫性的组合物。

另外，在特定蛋白质的氨基酸序列与可编码所述蛋白质的核苷酸序列(如由遗传密码(示于下文)所定义)之间存在已知并且确定的对应性。同样，在特定核酸的核苷酸序列与由所述核酸编码的氨基酸序列(如由遗传密码所定义)之间存在已知并且确定的对应性。

遗传密码

遗传密码的重要且众所周知的特征是其冗余性，由此，对于用于制备蛋白质的大部分氨基酸来说，可采用一种以上的编码核苷酸三联体(阐释于上文)。因此，许多不同核苷酸序列可编码给定氨基酸序列。这些核苷酸序列视为在功能上等效，这是因为它们在所有生物体中产生相同氨基酸序列(但某些生物体可相较于其他序列更有效地翻译一些序列)。此外，不时地，嘌呤或嘧啶的甲基化变体可发现于给定核苷酸序列中。这类甲基化不影响三核苷酸密码子与相应氨基酸之间的编码关系。

鉴于前述内容，可使用编码生物标志物核酸(或其任何部分)的DNA或RNA的核苷酸序列通过使用遗传密码将DNA或RNA翻译成氨基酸序列以导出多肽氨基酸序列。同样，对于多肽氨基酸序列来说，可编码多肽的相应核苷酸序列可从遗传密码推断出(由于遗传密码的冗余性，这将产生用于任何给定氨基酸序列的多个核酸序列)。因此，在本文中描述和/或公开编码多肽的核苷酸序列应视为还包括描述和/或公开由核苷酸序列编码的氨基酸序列。类似地，在本文中描述和/或公开多肽氨基酸序列应视为还包括描述和/或公开可编码氨基酸序列的所有可能核苷酸序列。

II.

单核细胞是骨髓源免疫效应细胞，其循环于血液、骨髓和脾脏中并且在稳态条件中具有有限的增殖。术语“髓系细胞”可指骨髓或脊髓中的颗粒细胞或单核细胞前体细胞，或类似于发现于骨髓或脊髓中的细胞者。所述髓系细胞谱系包括外周血中的循环单核细胞以及它们在成熟、分化和/或活化后所变成的细胞群体。这些群体包括非最终分化性髓系细胞、骨髓源抑制细胞和经分化巨噬细胞。经分化巨噬细胞包括非极化和极化巨噬细胞、静止性和活化巨噬细胞。并非限制，髓样谱系还可包括粒细胞性前体、多形核源抑制细胞、经分化多形核白细胞、嗜中性粒细胞、颗粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、小神经胶质细胞、骨髓源抑制细胞、树突状细胞和红血球。单核细胞发现于外周血单核细胞(PBMC)中，所述外周血单核细胞还包含其他造血细胞和免疫细胞(例如B细胞、T细胞、NK细胞等)。通过来自称为单核母细胞的造血干细胞前体的骨髓来产生单核细胞。单核细胞在免疫系统中具有两种主要功能：(1)它们可离开血流以在正常状态下补充驻留型巨噬细胞和树突状细胞(DC)，并且(2)它们可迅速迁移至组织中的感染部位并分裂/分化成巨噬细胞和发炎树突状细胞以响应于发炎信号诱发免疫反应。通常在染色涂片中通过大双叶核来鉴定单核细胞。单核细胞还表达在感染期间介导从血液至组织的迁移的趋化因子受体和病原体识别受体。它们产生发炎细胞因子并且吞噬细胞。在一些实施方案中，根据CD11b+表达和/或CD14+表达来鉴定所关注的单核细胞和/或巨噬细胞。

如下文所详细阐述，单核细胞可分化成巨噬细胞。单核细胞还可例如经由细胞因子颗粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)的作用分化成树突状细胞。一般来说，术语“单核细胞”涵盖未分化单核细胞以及由其分化的细胞类型(包括巨噬细胞和树突状细胞)。在一些实施方案中，术语“单核细胞”可指未分化单核细胞。

巨噬细胞是发炎和先天性免疫反应的关键免疫效应物和调控因子。巨噬细胞是异质、组织驻留型、最终分化的先天性髓系细胞，其具有显著可塑性并且可响应于来自微环境的局部因子而改变其生理学，并且可承担从宿主防御至组织稳态的多种功能需求(Ginhoux等人(2016)Nat.Immunol.17：34-40)。巨噬细胞存在于身体中的实际上所有组织中。它们是组织驻留型巨噬细胞(例如驻留于肝中的库弗氏细胞(Kupffer cell))，或源自循环单核细胞前体(即单核细胞)，所述前体主要源自骨髓和脾储集器并且在稳态下或响应于发炎或其他刺激因子而迁移至组织中。例如，可将单核细胞从血液募集至组织以补充骨、肺泡(肺)、中枢神经系统、结缔组织、胃肠道、肝脏、脾脏和腹膜的组织特异性巨噬细胞。

术语“组织驻留型巨噬细胞”是指实施组织特异性和/或显微解剖生态区位特异性功能(例如组织免疫监督、感染反应和发炎消退)和专用稳态功能的免疫细胞的异质群体。组织驻留型巨噬细胞源于胚胎的卵黄囊中并且成熟于发育中胎儿中的一个特定组织中，在此它们获得组织特异性作用并改变其基因表达特征。维持集落形成能力的组织驻留型巨噬细胞的局部增殖可直接在组织中产生成熟巨噬细胞的群体。还可根据其占据组织来鉴定组织驻留型巨噬细胞并加以命名。例如，脂肪组织巨噬细胞占据脂肪组织，库弗氏细胞占据肝组织，窦组织细胞占据淋巴结，肺泡巨噬细胞(尘细胞)占据肺泡，朗格汉斯细胞(Langerhans cell)占据皮肤和粘膜组织，产生巨细胞的组织细胞占据结缔组织，小神经胶质细胞占据中枢神经系统(CNS)组织，霍夫鲍尔细胞(Hofbauer cell)占据胎盘组织，肾小球内系膜细胞占据肾组织，破骨细胞占据骨组织，上皮样细胞占据肉芽肿，红髓巨噬细胞(窦内衬细胞)占据脾组织的红髓，腹膜腔巨噬细胞占据腹膜腔组织，lysomac细胞占据派伊尔斑(Peyer′s patch)组织，并且胰腺巨噬细胞占据胰腺组织。

除在宿主中防御传染原和其他发炎反应外，巨噬细胞还可实施不同稳态功能，包括但不限于发育、伤口愈合和组织修复和免疫反应调控。巨噬细胞首先识别为身体中经由吞噬作用来防御感染的吞噬细胞，它们是先天性免疫性的基本组分。响应于病原体和其他发炎刺激物，经活化巨噬细胞可吞食所感染细菌和其他微生物；刺激发炎并且将促炎分子的混合剂释放至这些细胞内微生物。在吞食病原体之后，巨噬细胞将病原性抗原呈递至T细胞以进一步活化用于防御的适应性免疫反应。示例性促炎分子包括细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α、趋化因子MCP-1、CXC-5和CXC-6以及CD40L。

除有助于针对感染的宿主防御外，巨噬细胞还独立于其免疫反应关联性而发挥重要稳态作用。巨噬细胞是清除红血球的巨大吞噬细胞并且所释放物质如铁和血红蛋白可再循环以供宿主再利用。这种清除过程是重要代谢贡献，宿主离开其将不能生存。

巨噬细胞还涉及去除生成于组织重塑期间的细胞碎片，并且快速并有效地清除发生细胞凋亡的细胞。据认为，巨噬细胞涉及经由清除细胞凋亡细胞来实现稳态组织动态平衡。这些稳态清除过程通常是由巨噬细胞上的表面受体(包括清除剂受体、磷脂酰丝氨酸受体、凝血酶敏感蛋白受体、整联蛋白和补体受体)来介导。介导吞噬作用的这些受体不能转导诱导细胞因子-基因转录的信号或有效产生抑制信号和/或细胞因子。巨噬细胞的稳态功能独立于其他免疫细胞。

巨噬细胞还可清除源自细胞创伤或其他细胞损害的细胞碎片/坏死细胞。巨噬细胞经由toll样受体(TLR)、细胞内模式识别受体和白介素-1受体(IL-1R)来检测存在于坏死细胞碎片中的内源性危险信号，大部分所述信号是经由衔接分子髓系分化一级反应基因88(MyD88)来传导。清除细胞碎片可显著改变巨噬细胞的生理学。清除坏死的巨噬细胞可发生显著生理学变化，包括改变表面蛋白的表达和产生细胞因子和促炎介体。巨噬细胞表面蛋白表达响应于这些刺激物的改变可潜在地用于鉴定这些经改变细胞的独特生物化学标志物。

巨噬细胞在维持许多组织(例如白色脂肪组织、褐色脂肪组织、肝脏和胰腺)中的稳态方面具有重要功能。通过释放触发使组织细胞适应的变化级联的细胞信号传导分子，组织巨噬细胞可对组织中的条件变化迅速作出反应。例如，脂肪组织中的巨噬细胞响应于饮食变化(例如白色脂肪组织中的巨噬细胞)或暴露于冷温度(例如褐色脂肪组织中的巨噬细胞)来调控新脂肪细胞的产生。肝脏中的巨噬细胞(称为库弗氏细胞)响应于饮食变化来调控葡萄糖和脂质的分解。胰腺中的巨噬细胞可响应于高脂肪饮食来调控胰岛素产生。

巨噬细胞还可有助于伤口愈合和组织修复。例如，巨噬细胞可响应于源自经损伤组织和细胞的信号而活化并且诱导组织修复反应以修复经损害组织(Minutti等人(2017)Science 356：1076-1080)。

在胚胎发育期间，巨噬细胞还在组织重塑和器官发育中发挥关键作用。例如，驻留型巨噬细胞使新生小鼠心脏中的血管发育有效成形(Leid等人(2016)Circ.Res.118：1498-1511)。脑中的小神经胶质细胞可产生在胚胎发育期间引导发育中脑中的神经元和血管的生长因子。类似地，CD95L(一种由巨噬细胞产生的蛋白质)结合至小鼠胚胎的脑中神经元和发育中血管的表面上的CD95受体并且增加神经元和血管发育(Chen等人(2017)CellRep.19：1378-1393)。在无配体下，神经元以较小频率分支，并且所得成人脑表现出较小电活性。称为破骨细胞的单核细胞源细胞涉及骨发育，并且缺乏这些细胞的小鼠产生致密硬化骨，这是被称为骨硬化症的罕见疾患。巨噬细胞也主导乳腺的发育并有助于早期产后期中的视网膜发育(Wynn等人(2013)Nature 496：445-455)。

如上所述，巨噬细胞调控免疫系统。除将抗原呈递至T细胞外，巨噬细胞还可在一些条件中向免疫细胞提供免疫抑制/抑制信号。例如，在睾丸中，巨噬细胞帮助产生保护性精子环境以免受免疫系统攻击。睾丸中的组织驻留型巨噬细胞产生防止针对精子的免疫细胞反应的免疫抑制分子(Mossadegh-Keller等人(2017)J.Exp.Med.214：10.1084/jem.20170829)。

响应于不同环境信号并且与功能需求一致的巨噬细胞可塑性已产生多种巨噬细胞活化状态，包括连续功能状态的两个极端，即“经典活化”M1和“替代活化”M2巨噬细胞。

术语“活化”是指单核细胞和/或巨噬细胞已经充分刺激以诱导可检测细胞增殖和/或已经刺激以施加其效应功能的状态，所述效应功能是例如经诱导细胞因子表达和分泌、吞噬作用、细胞信号传导、抗原处理和呈递、靶细胞杀伤和促炎功能。

术语“M1巨噬细胞”或“经典活化的巨噬细胞”是指具有促炎表型的巨噬细胞。术语“巨噬细胞活化”(也称为“经典活化”)由Mackaness在1960年代引入感染背景中以阐述在二次暴露于病原体后巨噬细胞针对BCG(卡介苗(bacillus Calmette-Guerin))和李斯特菌的抗原依赖性但非特异性增强的杀微生物活性(Mackaness(1962)J.Exp.Med.116：381-406)。后来，使所述增强与通过抗原激活免疫细胞的Th1反应和IFN-γ产生建立联系(Nathan等人(1983)J.Exp.Med.158：670-689)并且扩展至细胞毒性和抗肿瘤性质(Pace等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：3782-3786；Celada等人(1984)J.Exp.Med.160：55-74)。因此，通过细胞因子分泌、抗原呈递、吞噬作用、细胞-细胞相互作用、迁移等增强发炎的任何巨噬细胞功能性可视为促炎性。体外和体内测定可测量不同终点：一般体外测量包括促炎细胞刺激，如通过增殖、迁移、促炎Th1细胞因子/趋化因子分泌和/或迁移所测量；而一般体内测量还包括分析病原体防治、组织损伤立即反应者、其他细胞活化剂、迁移诱导剂等。对于体外和体内二者，可评价促炎抗原呈递。细菌部分如脂多糖(LPS)、某些Toll样受体(TLR)激动剂、Th1细胞因子干扰素-γ(IFNγ)(例如由响应于应激和感染的NK细胞和具有持续产生的T辅助细胞产生的IFNγ)和TNF沿M1途径极化巨噬细胞。经活化M1巨噬细胞吞噬并破坏微生物，消除经损害细胞(例如肿瘤细胞和细胞凋亡细胞)，将抗原呈递至T细胞以用于增加适应性免疫反应，并产生高水平的促炎细胞因子(例如IL-1、IL-6和IL-23)、活性氧物质(ROS)和一氧化氮(NO)，以及活化其他免疫和非免疫细胞。以表达可诱导一氧化氮合酶(iNOS)、活性氧物质(ROS)并产生Th1相关细胞因子IL-12为特征，M1巨噬细胞极适于促进强免疫反应。M1巨噬细胞代谢的特征在于增强的好氧性糖解，使葡萄糖转化成乳酸盐，增加的通过磷酸戊糖途径(PPP)的通量、脂肪酸合成和截短的三羧酸(TCA)循环，导致琥珀酸盐和柠檬酸盐的累积。

“1型”或“M1样”单核细胞和/或巨噬细胞是能够有助于促炎反应的单核细胞和/或巨噬细胞，其特征在于下列各项中的至少一者：通过分泌至少一种促炎细胞因子来产生发炎刺激物，在其表面上表达至少一种细胞表面活化分子/活化分子配体，募集/引导至少一种其他细胞(包括其他巨噬细胞和/或T细胞)/与其相互作用以刺激促炎反应，呈递促炎背景中的抗原，迁移至容许促炎反应开始的部位，或开始表达至少一种预计产生促炎功能性的基因。在一些实施方案中，所述术语包括活化细胞毒性CD8+ T细胞，介导癌细胞对免疫疗法(例如免疫检查点疗法)的增加的敏感性，和/或介导癌细胞的抗性逆转。在某些实施方案中，可以多种众所周知的方式来测量朝向促炎状态的这种调节，包括但不限于以下各项中的一者或多者：a)增加的分化簇80(CD80)、CD86、MHCII、MHCI、白介素1-β(IL-1β)、IL-6、CCL3、CCL4、CXCL10、CXCL9、GM-CSF和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)；b)CD206、CD163、CD16、CD53、VSIG4、PSGL-1、TGFb和/或IL-10的表达和/或分泌减少；c)至少一种选自由IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-18、GM-CSF、CCL3、CCL4和IL-23组成的组的细胞因子或趋化因子的分泌增加；d)IL-1β、IL-6和/或TNF-α的表达对IL-10表达的比率增加；e)增加的CD8+细胞毒性T细胞活化；f)增加的CD8+细胞毒性T细胞活化的募集；g)增加的CD4+辅助T细胞活性；h)增加的CD4+辅助T细胞活性的募集；i)增加的NK细胞活性；j)增加的NK细胞募集；k)增加的嗜中性粒细胞活性；l)增加的巨噬细胞活性；和/或m)增加的纺锤形形态、外观平坦性和/或树突数量，如通过显微术所评价。

在已是促炎性的细胞中，增加的发炎表型是指更强的促炎状态。

与之相比，术语“M2巨噬细胞”是指具有抗炎表型的巨噬细胞。Th2-和肿瘤源细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子β(TGF-β)或前列腺素E2(PGE2))可促进M2极化。M2巨噬细胞的代谢特征是由OXPHOS、FAO、降低的糖解和PPP来定义。甘露糖受体由鼠类巨噬细胞中的Th2 IL-4和IL-13选择性增强的发现以及诱导的甘露糖基化配体的胞吞清除、增加的主要组织相容性复合物(MHC)种类II抗原表达和减少的促炎细胞因子分泌促使Stein、Doyle和同事提出，IL-4和IL-13诱导替代活化表型，所述替代活化表型是完全不同于IFN-γ活化但远未去活化的状态(Martinez和Gordon(2014)F1000 Prime Reports 6：13)。体外和体内定义/测定可测量不同终点：一般体外终点包括抗炎细胞刺激(通过增殖、迁移、抗炎Th2细胞因子/趋化因子分泌和/或迁移测量)；而一般体内M2终点还包括分析病原体防治、组织损伤延迟/促纤维化反应、其他细胞Th2极化、迁移诱导剂等。对于体外和体内二者，可评价促致耐受性抗原呈递。

“2型”或“M2样”单核细胞和/或巨噬细胞是能够有助于抗炎反应的单核细胞和/或巨噬细胞，其特征在于下列各项中的至少一者：通过分泌至少一种抗炎细胞因子来产生抗炎刺激物，在其表面上表达至少一种细胞表面抑制分子/抑制分子配体，募集/引导至少一种其他细胞/与其相互作用以刺激抗炎反应，呈递促致耐受性背景中的抗原，迁移至容许致耐受性反应开始的部位，或开始表达至少一种预计产生促致耐受性/抗炎功能性的基因。在某些实施方案中，可以多种众所周知的方式(包括但不限于与上述1型促炎状态测量相反者)来测量朝向促炎状态的这种调节。

具有“增加的发炎表型”的细胞是在调节本发明的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)之后具有与以下相关的较大促炎反应能力者：a)所列出1型标准中的一者或多者的增加；和/或b)所列出2型标准中的一者或多者的降低，所述调节是例如接触调节本发明的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的药剂。

具有“降低的发炎表型”的细胞是在调节本发明的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)之后具有与以下相关的较大抗炎反应能力者：a)所列出1型标准中的一者或多者的降低；和/或b)所列出2型标准中的一者或多者的增加，所述调节是例如接触调节本发明的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的药剂。

因此，巨噬细胞可采用具有介于1型状态与2型状态之间的中间表型的替代活化状态的连续功能状态(参见例如Biswas等人(2010)Nat.Immunol.11：889-896；Mosser和Edwards(2008)Nat.Rev.Immunol.8：958-969；Mantovani等人(2009)Hum.Immunol.70：325-330)，并且可如上文所述来测定所述增加或降低的发炎表型。

如本文所用，术语“替代活化的巨噬细胞”或“替代活化状态”是指除经典活化的M1促炎巨噬细胞外的基本上所有类型的巨噬细胞群体。最初，替代活化状态仅指定为M2型抗炎巨噬细胞。所述术语扩展至包括所有其他替代活化状态的巨噬细胞，其生物化学、生理学和功能性具有显著差异。

例如，一类替代活化的巨噬细胞是涉及伤口愈合的巨噬细胞。响应于在组织损伤(例如手术伤口)期间释放的先天性和适应性信号(例如由嗜碱性粒细胞和肥大细胞产生的IL-4)，可激活组织驻留型巨噬细胞以促进伤口愈合。伤口愈合巨噬细胞并不产生高水平的促炎细胞因子，而分泌大量细胞外基质组分(例如几丁质酶和几丁质酶样蛋白YM1/CHI3L3、YM2、AMCase和Stabilin)，所有组分都表现出碳水化合物和基质结合活性并且涉及组织修复。

替代活化的巨噬细胞的另一实例涉及调控性巨噬细胞，其可通过先天性免疫反应和适应性免疫反应诱导。调控性巨噬细胞可有助于免疫调控功能。例如，巨噬细胞可对来自下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的激素(例如糖皮质激素)作出反应以采用具有经抑制宿主防御和发炎功能(例如抑制促炎细胞因子的转录)的状态。调控性巨噬细胞可产生调控性细胞因子TGF-β以减弱某些条件中(例如在适应性免疫反应晚期)的免疫反应。许多调控性巨噬细胞可表达高水平的共刺激分子(例如CD80和CD86)并因此增强至T细胞的抗原呈递。

许多刺激物/因子可诱导调控性巨噬细胞的极化。所述因子可包括但不限于TLR激动剂和免疫复合物的组合、细胞凋亡细胞、IL-10、前列腺素、GPcR配体、腺苷、多巴胺(dopamine)、组胺、神经鞘胺醇1-磷酸盐、黑皮质素、血管作用肠肽和Siglec-9。一些病原体(例如寄生虫、病毒和细菌)可特异性诱导调控性巨噬细胞的分化，从而产生缺陷性病原体杀伤以及经感染微生物的增强的存活和传播。

调控性巨噬细胞具有一些共有特征。例如，调控性巨噬细胞需要两种刺激物来诱导其抗炎活性。还观察到由不同因子/刺激物诱导的调控性巨噬细胞亚群具有差异，从而反映了其异质性。

调控性巨噬细胞也是巨噬细胞的异质群体，包括发现于代谢中、发育期间、稳态维持中的各种亚群。在一个实例中，替代活化的巨噬细胞的亚群是具有独特免疫调控性质的免疫调控性巨噬细胞，其可在M-CSF/GM-CSF、CD16配体(例如免疫球蛋白)和IFN-γ存在下诱导(PCT申请公开第WO2017/153607号)。

组织中的巨噬细胞可在体内随时间改变其活化状态。这种动态性反映了迁移中巨噬细胞至组织的恒定流入、活化巨噬细胞的动态变化和切换回静止状态的巨噬细胞。在一些条件中，环境中的不同信号可诱导巨噬细胞变成不同活化状态的混合物。例如，在具有慢性伤口的条件中，巨噬细胞可随时间包括促炎活化亚群、促伤口愈合性巨噬细胞和表现出一定促消退活性的巨噬细胞。在非病理学条件下，免疫刺激性巨噬细胞和免疫调控性巨噬细胞的平衡群体存在于免疫系统中。在一些疾病条件中，平衡被打破并且不平衡引起许多临床疾患。

巨噬细胞的表观可塑性还使得其易于对其接收于疾病条件中的环境因子具有反应。巨噬细胞可响应于各种疾病条件发生再极化，从而显示不同特性。一个实例是被吸引并且从外周血单核细胞滤液浸入肿瘤组织中的巨噬细胞，其通常称为“肿瘤相关巨噬细胞”(“TAM”)或“肿瘤浸润性巨噬细胞”(“TIM”)。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤中的最丰富的发炎细胞并且对于大部分癌症来说在高TAM密度与较差预后之间存在显著关联(Zhang等人(2012)PloS One 7：e50946.10.1371/journ al.pone.0050946)。

TAM是M1样促炎亚群和M2样抗炎亚群的混合群体。在赘瘤形成的最早期，具有促炎表型的经典活化的巨噬细胞存在于常氧肿瘤区域中，并且被认为有助于经转化肿瘤细胞的早期清除。然而，随着肿瘤生长和进展，晚期肿瘤中的大部分TAM是驻留于肿瘤的低氧区域中的M2样调控性巨噬细胞。巨噬细胞的这种表型变化受肿瘤微环境刺激物(例如肿瘤细胞外基质、缺氧环境和由肿瘤细胞分泌的细胞因子)显著影响。M2样TAM显示伤口愈合性巨噬细胞和调控性巨噬细胞的混合活化状态，从而证实具有各种独特特性，包括产生高水平IL-10但几乎不产生IL-12，产生缺陷性TNF，抑制抗原呈递细胞和有助于肿瘤血管生成。

通常，TAM的特征在于M2表型并且经由IL-10和IL-1β产生来抑制M1巨噬细胞介导的发炎。因此，TAM经由活化伤口愈合(即抗炎)途径(其提供用于增殖和侵袭的营养物和生长信号)来促进肿瘤生长和转移并且促进产生新血管(即血管生成)。另外，TAM通过分泌抗炎信号来有助于免疫抑制性肿瘤微环境，所述抗炎信号可防止免疫系统的其他组分识别并攻击肿瘤。已报道，在许多类型的癌症(例如乳腺癌、星形细胞瘤、头颈鳞状细胞癌、II型乳头状肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、直肠癌、神经胶质瘤、经典霍奇金淋巴瘤、卵巢癌和结直肠癌)中，TAM在促进癌症生长、增殖和转移方面发挥关键作用。一般来说，特征在于大群体TAM的癌症产生较差疾病预后。

如果不适当调控，则各种功能和活化状态可具有危险结果。例如，如果过度活化，则经典活化的巨噬细胞可对宿主组织引起损害，易于损害环绕组织并且影响葡萄糖代谢。

在许多疾病状况中，巨噬细胞活化状态的平衡动力学被打破并且不平衡会引起疾病。例如，肿瘤大量聚集巨噬细胞。巨噬细胞可发现于75％的癌症中。侵袭型癌症通常与巨噬细胞和其他免疫细胞的较高浸润相关。在大部分恶性肿瘤中，TAM施加若干肿瘤促进功能，包括促进癌细胞存活、增殖、侵袭、外渗和转移，刺激血管生成，重塑细胞外基质，以及抑制抗肿瘤免疫性(Qian和Pollard，2010，Cell，141(1)：39-51)。它们还可产生生长促进分子，例如鸟氨酸、VEGF、EGF和TGF-β。

TAM响应于肿瘤微环境中所遇到的CSF1和IL4/IL13而刺激肿瘤生长和存活。TAM还可经由表达蛋白酶(例如MMP、组织蛋白酶和uPA)和基质重塑酶(例如赖氨酰基氧化酶和SPARC)来重塑肿瘤微环境。

TAM在调控肿瘤组织中的显著血管增加的肿瘤血管生成中发挥重要作用，肿瘤血管生成是肿瘤的恶性状态转变所需的。这些血管生成性TAM表达血管生成素受体TIE2并且分泌许多血管生成分子(包括VEGF家族成员、TNFα、IL1β、IL8、PDGF和FGF)。

各种巨噬细胞亚群实施这些个别促肿瘤功能。这些TAM在不同肿瘤类型中具有不同的巨噬细胞浸润程度以及表型。例如，人类肝细胞癌的详细剖析显示根据解剖位置以及促肿瘤和抗肿瘤性质来定义的各种巨噬细胞亚型。已显示，M2样巨噬细胞是TAM的促肿瘤功能的主要资源。M2样TAM已显示可影响抗癌治疗功效，有助于疗法抗性，并且在常规癌症疗法后介导肿瘤复发。

III.

本发明涵盖可用于调节单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型以及相应免疫反应(例如用以增加抗癌巨噬细胞免疫疗法)的生物标志物(例如表1和表2中所列出的靶标)。

表1提供靶标的基因信息，其中其下调(例如通过下调靶标的药剂，如本文所述的抗体、siRNA等)涉及并且产生增加的发炎表型(例如1型表型)。

表2提供靶标的基因信息，其中其下调(例如通过下调靶标的药剂，如本文所述的抗体、siRNA等)涉及并且产生降低的发炎表型(例如2型表型)。

本发明所涵盖基因座和生物标志物(例如表1和表2中所列出的生物标志物)的核酸和氨基酸序列信息是本领域众所周知的并且易于在可公开获得的数据库(例如国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI))中获得。例如，下文提供源自可公开获得的序列数据库的示例性核酸和氨基酸序列。

如下文进一步所论述，调节单核细胞和/或巨噬细胞中的本发明所涵盖生物标志物的表达、翻译、降解、量、亚细胞定位和其他活性的药剂可用于调节这些细胞的发炎表型以及调节由这些细胞介导的免疫反应。

尽管下文提供人类序列的众多代表性直系同源物，但在一些实施方案中，人类生物标志物(包括其调节和调节剂)是优选的。对于一些生物标志物，据认为，人类中由这些生物标志物介导的免疫反应特别可用于考虑人类免疫系统与其他脊椎动物的免疫系统之间的差异。

术语“SIGLEC9”是指结合唾液酸的Ig样凝集素9，其为介导唾液酸依赖性细胞结合的假定粘附分子。SIGLEC9优先结合至α-2，3-或α-2，6-连接的唾液酸。唾液酸识别位点可由与相同细胞表面上的唾液酸的顺式相互作用遮蔽。相关途径是先天性免疫系统和I类MHC介导的抗原处理和呈递。在一些实施方案中，位于人类中的染色体19q上的SIGLEC9基因由12个外显子组成。已知来自黑猩猩、恒河猴和小鼠的直系同源物。生成称为Siglec

术语“SIGLEC9”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类SIGLEC9 cDNA和人类SIGLEC9蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/27180)。例如，已知至少两种不同人类SIGLEC9同工型。人类SIGLEC9同工型1(NP_001185487.1)可由转录物变体1(NM_001198558.1，其是较长转录物)编码。人类SIGLEC9同工型2(NP_055256.1)可由转录物变体2(NM_014441.2)编码，其3′UTR和3′编码区不同于同工型1。经编码同工型2较短并且具有不同于同工型1的C末端。除人类外的生物体中的SIGLEC9直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩SIGLEC9(XM_024351618.1和XP_024207386.1，以及XM_003316566.5和XP_003316614.2)、恒河猴SIGLEC9(XM_015124691.1和XP_014980177.1、XM_001114560.3和XP_001114560.2、XM_015124692.1和XP_014980178.1)以及小鼠SIGLEC9(NM_031181.2和NP_112458.2)。SIGLEC9直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测SIGLEC9蛋白的抗SIGLEC9抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体MAB1139和AF1139(R&D systems，Minneapolis，MN)，抗体MAB1139、NBP1-47969、AF1139、NBP2-27070和NBP1-85755(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab89484、ab96545和ab197981(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：CF500382和TA500382(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗SIGLEC9抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20170306014、US20190085077、US20190023786和US20180244770中者。另外，用于检测SIGLEC9表达的试剂是众所周知的。多个SIGLEC9临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“VSIG4”是指含V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白4，其是与免疫调控蛋白的B7家族结构相关的含v-set和免疫球蛋白结构域蛋白。VSIG4蛋白是T细胞反应的负性调控剂。它也是补体组分3片段C3b和iC3b的受体。VSIG4蛋白是吞噬受体以及T细胞增殖和IL2产生的强负性调控剂。它也是替代补体途径转化酶的强力抑制剂。与VSIG4相关的疾病包括富含T细胞/组织细胞的大B细胞淋巴瘤和朗格汉斯细胞肉瘤。其相关途径是补体和凝血级联。在一些实施方案中，位于人类染色体Xq上的VSIG4基因由8个外显子组成。已知来自黑猩猩、恒河猴、狗、小鼠和大鼠的直系同源物。存在基因敲除小鼠系，包括Vsig4

术语“VSIG4”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类VSIG4 cDNA和人类VSIG4蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/11326)。例如，已知至少5种不同人类VSIG4同工型。人类VSIG4同工型1(NP_009199.1)可由转录物变体1(NM_007268.2，其是最长转录物)编码。人类VSIG4同工型2(NP_001093901.1)可由转录物变体2(NM_001100431.1)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏交替框内区段。人类VSIG4同工型3(NP_001171760.1)可由转录物变体3(NM_001184831.1)编码，所述转录物变体与变体1相比具有多种差异。人类VSIG4同工型4(NP_001171759.1)可由转录物变体4(NM_001184830.1)编码，所述转录物变体与变体1的差异在于3′UTR和3′编码区。人类VSIG4同工型5(NP_001244332.1)可由转录物变体5(NM_001257403.1)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏3′编码区中的两个交替框内外显子。除人类外的生物体中的VSIG4直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩VSIG4(NM_001279873.1和NP_001266802.1)、恒河猴VSIG4(XM_015127596.1和XP_014983082.1、XM_015127593.1和XP_014983079.1、XM_015127595.1和XP_014983081.1、XM_001099264.2和XP_001099264.2，以及XM_015127594.1和XP_014983080.1)、狗VSIG4(XM_005641424.3和XP_005641481.1；XM_005641423.3和XP_005641480.1；XM_022416007.1和XP_022271715.1；XM_005641421.3和XP_005641478.1；以及XM_005641422.3和XP_005641479.1)、小鼠VSIG4(NM_177789.4和NP_808457.1)和大鼠VSIG4(NM_001025004.1和NP_001020175.1)。VSIG4直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测VSIG4蛋白的抗VSIG4抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体AF4646和AF4674(R&D systems，Minneapolis，MN)、抗体NBP1-86843、AF4646、AF4674和NBP1-69631(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab56037、ab197161和ab138594(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA346124(Origene，Rockville，MD)，抗体05和202(Sino Biological，Beijing，China)等。还已知其他抗VSIG4抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20090162356A1和US20180371095A1中者。另外，用于检测VSIG4表达的试剂是众所周知的。多个VSIG4临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“CD74”是指CD74。由该基因编码的蛋白质与II类主要组织相容性复合物(MHC)缔合并且是调控用于免疫反应的抗原呈递的重要伴护蛋白。它还用作细胞因子巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的细胞表面受体，所述因子在结合至所编码蛋白质时会引发存活途径和细胞增殖。CD74蛋白也与淀粉样前体蛋白(APP)相互作用并抑制淀粉样β(Abeta)的产生。另外，通过稳定呈复合物形式的无肽II类α/β异二聚体(在其合成之后不久)并引导所述复合物从内质网传输至胞内体/溶酶体系统(在此发生抗原处理并且抗原性肽结合至II类MHC)，CD74蛋白在II类MHC抗原处理中发挥关键作用。CD74蛋白用作细胞因子MIF的细胞表面受体。与CD74相关的疾病包括未分化多形性肉瘤和套细胞淋巴瘤。其相关途径是对升高的血小板胞质Ca

术语“CD74”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD74 cDNA和人类CD74蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/972)。例如，已知至少三种不同人类CD74同工型。人类CD74同工型A(NP_001020330.1)可由转录物变体1(NM_001025159.2，其是最长转录物)编码。人类CD74同工型B(NP_004346.1)可由转录物变体2(NM_004355.3)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏3′编码区中的框内外显子。人类CD74同工型C(NP_001020329.1)可由转录物变体3(NM_001025158.2)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏3′编码区中的三个连续外显子，从而产生框移。除人类外的生物体中的CD74直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD74(NM_001144836.1和NP_001138308.1)、恒河猴CD74(XM_015141237.1和XP_014996723.1，以及XM_015141236.1和XP_014996722.1)、狗CD74(XM_536468.7和XP_536468.5；以及XM_005619298.3和XP_005619355.1)、小鼠CD74(NM_001042605.1和NP_001036070.1；以及NM_010545.3和NP_034675.1)、大鼠CD74(NM_013069.2和NP_037201.1)、鸡CD74(XM_015293754.2和XP_015149240.1)和青蛙CD74(NM_001197110.1和NP_001184039.1)。CD74直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测CD74蛋白的抗CD74抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体AF3590和MAB35901(R&D systems，Minneapolis，MN)，抗体NBP2-29465、NBP2-66762、NBP1-33109和NBP1-85225(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab9514、ab22603和ab108393(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：CF507339和TA507339(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗CD74抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20140030273、US20170173151、US7312318和US20170253656中的那些抗体。另外，用于检测CD74表达的试剂是众所周知的。多个CD74临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“CD207”是指CD207。CD207蛋白仅表达于朗格汉斯细胞中，所述细胞是表皮和粘膜的不成熟树突状细胞。其定位于伯贝克颗粒(Birbeck granule)中，伯贝克颗粒是存在于朗格汉斯细胞的细胞质中并由叠加和拉链膜组成的细胞器。它是具有甘露糖结合特异性的C型凝集素，并且已提出，甘露糖结合CD207蛋白可使抗原内化至伯贝克颗粒中并提供进入非经典抗原处理途径。CD207突变导致伯贝克颗粒缺陷或糖结合活性损失。另外，CD207蛋白是显示甘露糖结合特异性的钙依赖性凝集素。CD207蛋白诱导形成伯贝克颗粒(BG)并且是膜叠加和拉链的强力调控剂。CD207蛋白结合至硫酸化以及甘露糖基化聚糖、硫酸角质素(KS)和β-聚糖，促进抗原摄取，并且涉及呈递至T细胞的抗原的路径选择和/或处理。CD207是念珠菌属(Candida)菌种、酵母菌属(Saccharomyces)菌种和糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)的原代朗格汉斯细胞上的主要受体。CD207抵抗人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)感染。其结合至存在于包膜糖蛋白上的高甘露糖结构，随后使病毒靶向伯贝克颗粒，从而使病毒快速降解。与CD207相关的疾病包括伯贝克颗粒缺陷和朗格汉斯细胞组织细胞增生症。其相关途径是先天性免疫系统和I类MHC介导的抗原处理和呈递。在一些实施方案中，位于人类中的染色体2p上的CD207基因由10个外显子组成。已知来自黑猩猩、恒河猴、牛、小鼠、大鼠和青蛙的直系同源物。存在基因敲除小鼠系，包括CD207

术语“CD207”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD207 cDNA和人类CD207蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/50489)。例如，人类CD207(NP_056532.4)可由转录物(NM_015717.4)编码。除人类外的生物体中的CD207直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD207(XM_016945490.2和XP_016800979.1)、恒河猴CD207(XM_001100466.3和XP_001100466.2)、牛CD207(XM_015473414.2和XP_015328900.2)和小鼠CD207(NM_144943.3和NP_659192.2)、大鼠CD207(NM_013069.2和NP_037201.1)。CD207直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测CD207的抗CD207抗体蛋白是本领域众所周知的并且包括例如抗体AF2088、BAF2088、和MAB2088(R&D systems，Minneapolis，MN)，抗体DDX0362P-100、DDX0363P-100、DDX0361P-100和NB100-56733(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab192027(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA336470和TA349377(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测CD207表达的试剂是众所周知的。多个CD207临床测试可在NIHGenetic Testing Registry

术语“LRRC25”是指富含亮氨酸重复蛋白25。LRRC25基因广泛表达于组织(包括脾脏和骨髓)中。LRRC25蛋白可参与活化具有先天性免疫性和获得性免疫性的细胞。其在CD40活化的单核细胞源树突状细胞中下调。与LRRC25相关的疾病包括暂时性完全性遗忘。在一些实施方案中，位于人类中的染色体19p上的LRRC25基因由3个外显子组成。已知来自黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠和大鼠的直系同源物。在一些实施方案中，人类LRRC25蛋白具有305个氨基酸和/或33179Da的分子质量。在一些实施方案中，LRRC25蛋白含有两个拷贝的富亮氨酸重复序列和GRB2结合适体。

术语“LRRC25”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类LRRC25 cDNA和人类LRRC25蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/126364)。例如，人类LRRC25(NP_660299.2)可由转录物(NM_145256.2)编码。除人类外的生物体中的LRRC25直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩LRRC25(XM_009435028.3和XP_009433303.1；以及XM_001173930.6和XP_001173930.1)、恒河猴LRRC25(XM_001114428.3和XP_001114428.1)、狗LRRC25(XM_847238.5和XP_852331.3；以及XM_014122405.2和XP_013977880.1)、牛LRRC25(XM_005208421.4和XP_005208478.1)、小鼠LRRC25(NM_153074.3和NP_694714.1)和大鼠LRRC25(XM_573882.6和XP_573882.1；XM_006252977.3和XP_006253039.1；XM_008771187.2和XP_008769409.1；XM_006252978.3和XP_006253040.1；以及XM_008771188.2和XP_008769410.1)。LRRC25直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测LRRC25蛋白的抗LRRC25抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX45692(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-514216(Santa Cruz Biotechnology)，抗体NBP2-03747、NBP1-83476和NBP2-45673(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab84954(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA504941和CF504941(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测LRRC25表达的试剂是众所周知的。多个LRRC25临床测试可在NIH GeneticTesting Registry

术语“SELPLG”或“PSGL1”是指选择素P配体，其是用作表达于髓系细胞和经刺激T淋巴细胞上的细胞粘附分子P-选择素、E-选择素和L-选择素的高亲和力反受体的一种糖蛋白。因此，通过使白细胞栓系至活化血小板或内皮表达选择素，SELPLG蛋白在发炎期间的白细胞输送中发挥关键作用。SELPLG蛋白具有用于其高亲和力结合活性的两种翻译后修饰，即酪氨酸硫酸化和将唾液酰基刘易斯(Lewis)x四糖(sLex)添加至其O-连接聚糖中。SELPLG的异常表达和SELPLG中的多态性与先天性免疫反应和适应性免疫反应中的缺陷相关。SELPLG是SLe(x)型蛋白多糖，其经由与E-选择素、P-选择素和L-选择素的高亲和力、钙依赖性相互作用介导在初始发炎步骤期间血管表面上的白细胞的快速滚动。SELPLG对于初始白细胞捕获至关重要。在一些实施方案中，位于人类中的染色体12q上的SELPLG基因由3个外显子组成。已知来自黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠和大鼠的直系同源物。存在基因敲除小鼠系，包括Selplg

术语“SELPLG”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类SELPLG cDNA和人类SELPLG蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/6404)。例如，已知至少两种不同人类SELPLG同工型。人类SELPLG同工型1(NP_001193538.1)可由转录物变体1(NM_001206609.1，其是较长转录物)编码。人类SELPLG同工型2(NP_002997.2)可由转录物变体2(NM_003006.4)编码，所述转录物变体与变体1的区别在于在5′UTR中缺乏5′编码区的一部分，并且在下游起始密码子处引发翻译。所编码同工型2与同工型1相比具有较短N末端。除人类外的生物体中的SELPLG直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩SELPLG(XM_016924121.2和XP_016779610.1)、恒河猴SELPLG(XM_015152715.1和XP_015008201.1；以及XM_015152716.1和XP_015008202.1)、狗SELPLG(NM_001242719.1和NP_001229648.1)、牛SELPLG(NM_001037628.2和NP_001032717.2；以及NM_001271160.1和NP_001258089.1)、小鼠SELPLG(NM_009151.3和NP_033177.3)和大鼠SELPLG(NM_001013230.1和NP_001013248.1)。SELPLG直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测SELPLG蛋白的抗SELPLG抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX19793、GTX54688和GTX34468(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-365506和sc-398402(SantaCruz Biotechnology)，抗体MAB9961、MAB996、NBP2-53344和AF3345(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab68143、ab66882和ab110096(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA349432和TA338245(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗SELPLG抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20130209449、US20170190782A1和US20070160601A1以及美国专利第US7833530B2号和第US9487585B2号中者。另外，用于检测SELPLG表达的试剂是众所周知的。多个SELPLG临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“AIF1”是指同种移植物发炎因子1，其是结合肌动蛋白和钙的一种蛋白质。AIF1基因由细胞因子和干扰素诱导并且可促进巨噬细胞活化以及血管平滑肌细胞和T淋巴细胞的生长。AIF1中的多态性可与全身性硬化相关。AIF1是增强膜边缘波动和RAC活化的肌动蛋白结合蛋白。其增强LCP1的肌动蛋白集束活性，结合钙，并且在RAC信号传导和吞噬作用中发挥作用。AIF1促进血管平滑肌细胞和T淋巴细胞的增殖，增强淋巴细胞迁移，并且在血管发炎中发挥作用。与AIF1相关的疾病包括慢性发炎性脱髓鞘型多发性神经病变和急性腹泻。其相关途径是脊髓损伤。在一些实施方案中，位于人类中的染色体6p上的AIF1基因由6个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Aif1

术语“AIF1”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类AIF1 cDNA和人类AIF1蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/199)。例如，已知至少两种不同人类AIF1同工型。人类AIF1同工型1(NP_001305899.1和NP_116573.1)可由转录物变体1(NM_032955.2)和转录物变体4(NM_001318970.1)编码。人类AIF1同工型3(NP_001614.3)可由转录物变体3(NM_001623.4，其编码最长同工型)编码。转录物变体1与变体3的区别在于在5′UTR中缺乏5′编码区的一部分，并且在下游起始密码子处引发翻译。转录物变体4与变体3相比在5′区中使用交替剪接位点并且在下游起始密码子处引发翻译。变体1和4编码相同同工型1，所述同工型的N末端短于同工型3。除人类外的生物体中的AIF1直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩AIF1(XM_009450914.2和XP_009449189.2；XM_009450910.2和XP_009449185.2；XM_001154743.5和XP_001154743.1；XM_009450908.3和XP_009449183.1；以及XM_024357095.1和XP_024212863.1)、恒河猴AIF1(NM_001047118.1和NP_001040583.1)、狗AIF1(XM_532072.6和XP_532072.2)、牛AIF1(NM_173985.2和NP_776410.1)、小鼠AIF1(NM_001361501.1和NP_001348430.1；NM_001361502.1和NP_001348431.1；NM_019467.3和NP_062340.1)和大鼠AIF1(NM_017196.3和NP_058892.1)。AIF1直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测AIF1蛋白的抗AIF1抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX100042、GTX101495和GTX632426(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-32725和sc-398406(Santa Cruz Biotechnology)，抗体NB100-1028、NBP2-19019、NBP2-16908和NB100-2833(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab5076、ab178847和ab48004(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：AP08793PU-N和AP08912PU-N(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测AIF1表达的试剂是众所周知的。多个AIF1临床测试可在NIH Genetic TestingRegistry

术语“CD84”是指CD84分子，其是作为信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM)家族的成员的膜糖蛋白。该家族形成较大CD2细胞表面受体Ig超家族的子组。所编码蛋白质是表达于众多免疫细胞类型中的嗜同性粘附分子并且参与调控那些细胞中的受体介导的信号传导。与CD84相关的疾病包括慢性淋巴细胞性白血病。其相关途径是对升高的血小板胞质ca2+的反应和血管壁处的细胞表面相互作用。在一些实施方案中，位于人类中的染色体1q上的CD84基因由9个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Cd84

术语“CD84”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD84 cDNA和人类CD84蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/8832)。例如，已知至少5种不同人类CD84同工型。人类CD84同工型1(NP_001171808.1)可由转录物变体1(NM_001184879.1，其是最长转录物)编码。人类CD84同工型2(NP_003865.1)可由转录物变体2(NM_003874.3)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏交替框内区段。人类CD84同工型3(NP_001171810.1)可由转录物变体3(NM_001184881.1)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏两个交替区段，一个交替区段可使阅读框移位。人类CD84同工型4(NP_001171811.1)可由转录物变体4(NM_001184882.1)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏两个交替区段。人类CD84同工型5(NP_001317671.1)可由转录物变体5(NM_001330742.1)编码，所述转录物变体与变体1相比使用交替框内剪接点。除人类外的生物体中的CD84直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD84(XM_016930506.2和XP_016785995.1；以及XM_001172059.4和XP_001172059.1)、恒河猴CD84(XM_001117595.3和XP_001117595.1、XM_015113569.1和XP_014969055.1，以及XM_015113561.1和XP_014969047.1)、狗CD84(XM_022415343.1和XP_022271051.1；以及XM_005640884.3和XP_005640941)、牛CD84(XM_024989885.1和XP_024845653.1；XM_024989884.1和XP_024845652.1；XM_010802802.3和XP_010801104.1；XM_010802805.3和XP_010801107.1；XM_024989882.1和XP_024845650.1；XM_024989883.1和XP_024845651.1；以及XM_024989886.1和XP_024845654.1)、小鼠CD84(NM_013489.3和NP_038517.1；NM_001252472.1和NP_001239401.1；以及NM_001289470.1和NP_001276399.1)和大鼠CD84(NM_001192006.1和NP_001178935.1)。CD84直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1和表2中，这是因为，如本文所证实，CD84可取决于背景差异性影响单核细胞和/或巨噬细胞以使其更具促炎性或更具抗炎性。

适于检测CD84蛋白的抗CD84抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX32506、GTX75849和GTX75851(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-39821和sc-70810(SantaCruz Biotechnology)，抗体MAB1855、AF1855、NBP2-49635和NB100-65929(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab131256、ab202841和ab176513(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：SM1845R和SM1845PT(Origene，Rockyille，MD)等。还已知其他抗CD84抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20140147451A1、US20170260270A1和US20180327493中者。另外，用于检测CD84表达的试剂是众所周知的。多个CD84临床测试可在NIH GeneticTesting Registry

术语“IGSF6”是指免疫球蛋白超家族成员6。与IGSF6相关的疾病包括减压性骨坏死和发炎性肠病。在一些实施方案中，位于人类中的染色体16p上的IGSF6基因由6个外显子组成。IGSF6完全编码于转录于DNA的相对链的METTL9的内含子内。IGSF6定位至与发炎性肠病相关的基因座处。在一些实施方案中，人类IGSF6蛋白质具有241个氨基酸和/或27013Da的分子质量。在一些实施方案中，IGSF6含有免疫球蛋白结构域。

术语“IGSF6”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类IGSF6 cDNA和人类IGSF6蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/10261)。例如，人类IGSF6(NP_005840.2)可由转录物变体1(NM_005849.3)编码。除人类外的生物体中的IGSF6直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩IGSF6(XM_001160217.6和XP_001160217.1；以及XM_016928690.2和XP_016784179.1)、恒河猴IGSF6(XM_001093144.3和XP_001093144.1)、狗IGSF6(XM_005621426.3和XP_005621483.1；XM_005621428.3和XP_005621485.1；以及XM_022419960.1和XP_022275668.1)、牛IGSF6(XM_002697991.6和XP_002698037.1)、小鼠IGSF6(NM_030691.1和NP_109616.1)、大鼠IGSF6(NM_133542.2和NP_598226.1)；和鸡IGSF6(NM_001277599.1和NP_001264528.1)。IGSF6直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测IGSF6蛋白质的抗IGSF6抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体sc-377053(Santa Cruz Biotechnology)，抗体DDX0220P-100、NBP1-84061、H00010261-M02和H00010261-M01(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab197659(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA322553(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测IGSF6表达的试剂是众所周知的。多个IGSF6临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“CD48”是指CD48分子，其为免疫球蛋白样受体中包括SLAM(信号传导淋巴细胞活化分子)蛋白的CD2亚家族的成员。CD48蛋白发现于淋巴细胞和其他免疫细胞、树突状细胞和内皮细胞的表面上，并且参与这些细胞中的活化和分化途径。CD48蛋白不具有跨膜结构域，然而其通过GPI锚经由可裂解以产生可溶性形式的受体的C末端结构域保持于细胞表面处。其相关途径是对升高的血小板胞质Ca2+的反应以及造血干细胞分化途径和谱系特异性标志物。在一些实施方案中，位于人类中的染色体1q上的CD48基因由5个外显子组成。在一些实施方案中，人类CD48蛋白具有243个氨基酸和/或27683Da的分子质量。存在称为CD48

术语“CD48”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD48 cDNA和人类CD48蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/962)。例如，已知至少两种不同人类CD48同工型。人类CD48同工型1(NP_001769.2)可由转录物变体1(NM_001778.3，其是较短转录物)编码。人类CD48同工型2(NP_001242959.1)可由转录物变体2(NM_001256030.1)编码，所述转录物变体与变体1相比在3′UTR和编码区中有所不同。所编码同工型2长于同工型1并且具有不同C末端。除人类外的生物体中的CD48直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD48(XM_009435717.1和XP_009433992.1；以及XM_001172145.3和XP_001172145.2)、恒河猴CD48(XM_015113628.1和XP_014969114.1；XM_015113634.1和XP_014969120.1；以及XM_015113619.1和XP_014969105.1)、狗CD48(XM_545759.6和XP_545759.2；以及XM_022415374.1和XP_022271082.1)、牛CD48(NM_001046002.1和NP_001039467.1)、小鼠CD48(NM_007649.5和NP_031675.1；以及NM_001360767.1和NP_001347696.1)、大鼠CD48(NM_139103.1和NP_620803.1)；和鸡CD48(NM_001277599.1和NP_001264528.1)。CD48直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1和表2中，这是因为，如本文所证实，CD48可取决于背景差异性影响单核细胞和/或巨噬细胞以使其更具促炎性或更具抗炎性。

适于检测CD48蛋白的抗CD48抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体sc-70719、sc-70718(Santa Cruz Biotechnology)，抗体AF3327、AF3644、MAB36441和MAB-3644(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab9185、ab134049、ab119873和ab76904(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA351055、TA320283(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗CD48抗体并且包括例如阐述于美国专利第US9097717B2号以及美国专利公开US20120076790、US20130230533和US20180092984中者。另外，用于检测CD48表达的试剂是众所周知的。多个CD48临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“CD33”是指CD33分子，其为介导唾液酸依赖性细胞结合的骨髓单核细胞性源细胞的假定粘附分子。CD33优先结合至α-2，6-连接的唾液酸。唾液酸识别位点可由与相同细胞表面上的唾液酸的顺式相互作用所遮蔽。在免疫反应中，CD33可在配体诱导性酪氨酸磷酸化时通过经由SH2结构域募集细胞质磷酸酶来用作抑制受体，所述结构域经由信号传导分子去磷酸化来阻断信号转导。CD33在体外诱导急性髓系白血病中的细胞凋亡。与CD33相关的疾病包括胆囊淋巴瘤和皮肤外肥大细胞瘤。其相关途径是造血干细胞分化途径以及谱系特异性标志物和先天性免疫系统。在一些实施方案中，位于人类中的染色体19q上的CD33基因由14个外显子组成。在一些实施方案中，人类CD33蛋白具有364个氨基酸和/或39825Da的分子质量。CD33在磷酸化时与PTPN6/SHP-1和PTPN11/SHP-2相互作用。在一些实施方案中，人类CD33蛋白含有两个拷贝的细胞质基序，其称为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。该基序参与调节细胞反应。经磷酸化ITIM基序可结合若干含SH2磷酸酶的SH2结构域。

术语“CD33”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD33 cDNA和人类CD33蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/945)。例如，已知至少三种不同人类CD33同工型。人类CD33同工型1(NP_001763.3)可由转录物变体1(NM_001772.3，其是最长转录物)编码。人类CD33同工型2(NP_001076087.1)可由转录物变体2(NM_001082618.1)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏5′编码区中的交替框内外显子，从而产生短于同工型1的蛋白质(同工型2，也称为CD33m)。人类CD33同工型3(NP_001171079.1)可由转录物变体3(NM_001177608.1)编码，其与变体1相比的不同之处在于3′UTR和编码序列。所编码同工型3与同工型1相比具有较短和不同的C末端。除人类外的生物体中的CD33直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD33(XM_512850.7和XP_512850.3；XM_009436143.3和XP_009434418.1；以及XM_016936702.2和XP_016792191.1)、恒河猴CD33(XM_015124693.1和XP_014980179.1；以及XM_001114616.3和XP_001114616.2)和狗CD33(XM_005616249.2和XP_005616306.1)。CD33直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测CD33蛋白质的抗CD33抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体sc-514119、sc-376184(Santa Cruz Biotechnology)，抗体NBP2-22377、NBP2-29619、NBP2-37388和MAB1137(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab199432、ab134115、ab30371和ab11032(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：CF806758、TA806758(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗CD33抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20150125447A1、US20160362490A1、US20170002074A1和US20190002560A1以及美国专利第US7022500B1号和第US9587019B2号中者。另外，用于检测CD33表达的试剂是众所周知的。多个CD33临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“LST1”是指白细胞特异性转录物1，其为可抑制淋巴细胞增殖的膜蛋白。LST1的表达由脂多糖、干扰素-γ和细菌来增强。LST1诱导形态变化(包括在过表达于各种细胞类型中时产生丝状伪足和微刺)并且可参与树突状细胞成熟。LST1的同工型1和同工型2对淋巴细胞增殖具有抑制作用。在一些实施方案中，位于人类中的染色体6p上的LST1基因由6个外显子组成。在一些实施方案中，人类LST1蛋白具有97个氨基酸和/或10792Da的分子质量。

术语“LST1”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类LST1 cDNA和人类LST1蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/7940)。例如，已知至少6种不同人类LST1同工型。人类LST1同工型1(NP_009092.3)可由转录物变体1(NM_007161.3，其是最长转录物)编码。人类LST1同工型2(NP_995309.2)可由转录物变体2(NM_205837.2)编码，所述转录物变体与变体1相比在5′UTR中包括额外外显子并且在3′编码区中缺乏引起框移的内部外显子。人类LST1同工型3(NP_995310.2)可由转录物变体3(NM_205838.2)编码，所述转录物变体与变体1相比在5′UTR中包括额外外显子、在5′编码区中缺乏交替框内外显子并且在3′编码区中使用交替框内剪接位点。人类LST1同工型4(NP_995311.2)可由转录物变体4(NM_205839.2)编码，所述转录物变体与变体1相比在5′UTR中包括额外外显子并且在3′编码区中使用交替框内剪接位点。人类LST1同工型5(NP_995312.2)可由转录物变体5(NM_205840.2)编码，所述转录物变体与变体1相比在中心编码区中缺乏交替外显子并且在3′编码区中使用引起框移的交替剪接位点。人类LST1同工型6(NP_001160010.1)可由转录物变体6(NM_001166538.1)编码，所述转录物变体与变体1相比在5′编码区中缺乏交替框内外显子，从而产生短于同工型1的同工型6。除人类外的生物体中的LST1直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩LST1(XM_009450906.3和XP_009449181.1；XM_009450900.3和XP_009449175.1；XM_009450905.3和XP_009449180.1；XM_003950777.4和XP_003950826.1；XM_016955125.2和XP_016810614.1；XM_016955127.2和XP_016810616.1；XM_016955126.2和XP_016810615.1；XM_016955129.2和XP_016810618.1；XM_009450901.3和XP_009449176.1；以及XM_009450902.3和XP_009449177.1)。LST1直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测LST1蛋白的抗LST1抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX16300(GeneTex)、抗体NBP1-45072、NBP1-98482和H00007940-B01P(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab14557和ab172244(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：AM20987PU-N(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测LST1表达的试剂是众所周知的。多个LST1临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“TNFAIP8L2”或“TIPE2”是指TNFα诱导蛋白8样蛋白2。与TNFAIP8L2相关的疾病包括皮肤鳞状细胞癌。其相关途径是代谢和甘油磷脂生物合成。TNFAIP8L2通过维持免疫稳态来用作先天性免疫性和适应性免疫性的负性调控剂。TNFAIP8L2用作Toll样受体和T细胞受体功能的负性调控剂。其还防止免疫系统的高反应性并且维持免疫稳态。TNFAIP8L2抑制JUN/AP1和NF-κ-B活化并促进Fas诱导的细胞凋亡。在一些实施方案中，位于人类中的染色体1q上的TNFAIP8L2基因由14个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，其称为Tnfaip8l2

术语“TNFAIP8L2”或“TIPE2”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类TNFAIP8L2 cDNA和人类TNFAIP8L2蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/79626)。例如，人类TNFAIP8L2(NP_078851.2)是由转录物(NM_024575.4)编码。除人类外的生物体中的TNFAIP8L2直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩TNFAIP8L2(XM_009431068.3和XP_009429343.1；以及XM_003308373.4和XP_003308421.1)、恒河猴TNFAIP8L2(NM_001257419.1和NP_001244348.1)、狗TNFAIP8L2(XM_005630793.3和XP_005630850.1；以及XM_540310.6和XP_540310.2)、牛TNFAIP8L2(NM_001034389.1和NP_001029561.1)、小鼠TNFAIP8L2(NM_027206.2和NP_081482.1)、大鼠TNFAIP8L2(NM_001014039.1和NP_001014061.1)；热带爪蛙TNFAIP8L2(XM_012969840.1和XP_012825294.1；XM_012969842.1和XP_012825296.1；XM_012969839.1和XP_012825293.1；以及XM_012969841.1和XP_012825295.1)；和斑马鱼TNFAIP8L2(NM_200374.1和NP_956668.1)。TNFAIP8L2直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测TNFAIP8L2蛋白的抗TNFAIP8L2抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体H00079626-B01P和H00079626-D01P(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体目录#：TA315795、AP54305PU-N(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测TNFAIP8L2表达的试剂是众所周知的。多个TNFAIP8L2临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“SPI1”或“PU.1”是指Spi-1原癌基因，其为在髓系和B-淋巴样细胞发育期间激活基因表达的ETS结构域转录因子。核蛋白SPI1结合至发现于靶标基因启动子附近的称为PU盒的富嘌呤序列，并且协同其他转录因子和辅因子来调控其表达。SPI1蛋白还可调控靶标基因的交替剪接。SPI1结合至PU盒，所述PU盒是可用作淋巴样特异性增强子的富嘌呤DNA序列(5-GAGGAA-3)。SPI1蛋白是可特异性参与巨噬细胞或B细胞的分化或活化的转录活化剂。SPI1还结合RNA并且可调节mRNA前体剪接。与SPI1相关的疾病包括发炎性腹泻和嗜中性粒细胞特异性颗粒缺陷。其相关途径是破骨细胞中的RANK信号传导和破骨细胞分化。在一些实施方案中，位于人类中的染色体11p上的SPI1基因由8个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Spi1

术语“SPI1”或“PU.1”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类SPI1 cDNA和人类SPI1蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/6688)。例如，已知至少两种不同人类SPI1同工型。人类SPI1同工型1(NP_001074016.1)可由转录物变体1(NM_001080547.1，其是较长转录物)编码。人类SPI1同工型2(NP_003111.2)可由转录物变体2(NM_003120.2)编码，所述转录物变体与变体1相比在5′编码区中使用交替框内剪接位点，从而产生较短蛋白质(同工型2)。除人类外的生物体中的SPI1直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如狗SPI1(XM_005631240.3和XP_005631297.1；以及XM_848897.5和XP_853990.1)、牛SPI1(NM_001192133.2和NP_001179062.1)、小鼠SPI1(NM_011355.2和NP_035485.1)、大鼠SPI1(NM_001005892.2和NP_001005892.1)、鸡SPI1(NM_205023.1和NP_990354.1)、热带爪蛙SPI1(NM_001145983.1和NP_001139455.1)和斑马鱼SPI1(NM_001328368.1和NP_001315297.1；NM_001328369.1和NP_001315298.1.；以及NM_198062.2和NP_932328.2)。SPI1直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测SPI1蛋白的抗SPI1抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX128266、GTX101581和GTX60620(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-390659(Santa CruzBiotechnology)，抗体NBP2-27163、NBP1-00135、MAB7124和MAB5870(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab76543、ab88082和ab76542(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：CF808850和TA808850(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测SPI1表达的试剂是众所周知的。多个SPI1临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“LILRB2”是指白细胞免疫球蛋白样受体B2，其是白细胞免疫球蛋白样受体(LIR)家族的成员并且在人类中发现于染色体区域19q13.4处的基因簇中。所编码蛋白质属于LIR受体的亚家族B类，所述LIR受体通常含有两个或四个细胞外免疫球蛋白结构域、一个跨膜结构域和二至四个细胞质免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)。所述受体表达于免疫细胞上，在此其结合至抗原呈递细胞上的I类MHC分子并转导抑制免疫反应刺激的负信号。据认为，其可控制发炎反应和细胞毒性以帮助聚焦免疫反应并限制自身反应性。其相关途径是先天性免疫系统和破骨细胞分化。LILRB2是I类MHC抗原的受体。其识别宽范围的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-G等位基因。LILRB2参与免疫反应下调和耐受性产生。LILRB2与CD8A竞争结合至I类MHC抗原。LILRB2抑制细胞蛋白的FCGR1A介导的磷酸化和细胞内钙离子的动员。在一些实施方案中，位于人类中的染色体19q上的LILRB2基因由15个外显子组成。在一些实施方案中，人类LILRB2蛋白具有598个氨基酸和/或65039Da的分子质量。在一些实施方案中，LILRB2含有3个拷贝的称为免疫受体酪胺抑制基序(ITIM)的细胞质基序。该基序参与调节细胞反应。经磷酸化ITIM基序可结合若干含SH2磷酸酶的SH2结构域。LILRB2的已知结合伴侣包括例如PTPN6和FCGR1A。

术语“LILRB2”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类LILRB2 cDNA和人类LILRB2蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/10288)。例如，已知至少5种不同人类LILRB2同工型。人类LILRB2同工型1(NP_005865.3)可由转录物变体1(NM_005874.4，其是最长转录物)编码。人类LILRB2同工型2(NP_001074447.2和NP_001265332.2)可由转录物变体2(NM_001080978.3)编码，所述转录物变体2与变体1相比在中心编码区中使用交替框内剪接位点，并且可由转录物变体3(NM_001278403.2)编码，所述转录物变体3与变体1相比的不同之处在于5′UTR并且在中心编码区中使用交替框内剪接位点。所编码同工型2短于同工型1。变体2和3都编码相同同工型。人类LILRB2同工型3(NP_001265333.2)可由转录物变体4(NM_001278404.2)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏5′编码区的一部分，并且使用下游框内起始密码子。所编码同工型(3)与同工型1相比具有较短N末端。人类LILRB2同工型4(NP_001265334.2)可由转录物变体5(NM_001278405.2)编码，所述转录物变体与变体1相比具有较短5′UTR，并且缺乏产生框移和早期终止密码子的内部外显子。所编码同工型(4)与同工型1相比具有较短并且不同的C末端。人类LILRB2同工型5(NP_001265335.2)可由转录物变体6(NM_001278406.2)编码，所述转录物变体具有较短5′UTR，缺乏若干外显子，并且其3′末端外显子延伸至超过变体1中所使用的剪接位点。所得蛋白质(同工型5)与同工型1相比具有较短并且不同的C末端。LILRB2直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测LILRB2蛋白的抗LILRB2抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体sc-515288和sc-390287(Santa Cruz Biotechnology)，抗体MAB2078、AF2078、H00010288-M01和NBP1-98554(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab128349、ab95819和ab95820(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA349368和TA323297(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测LILRB2表达的试剂是众所周知的。多个LILRB2临床测试可在NIH GeneticTesting Registry

术语“CCR5”是指C-C基序趋化因子受体5，其为β趋化因子受体家族的成员并且预计为类似于G蛋白偶联受体的七跨膜蛋白。CCR5由T细胞和巨噬细胞表达，并且已知是使巨噬细胞嗜性病毒(包括HIv)进入宿主细胞的重要共受体。CCR5基因的缺陷性等位基因与HIV感染抗性相关。CCR5受体的配体包括单核细胞化学吸引剂蛋白2(MCP-2)、巨噬细胞发炎蛋白1α(MIP-1α)、巨噬细胞发炎蛋白1β(MIP-1β)和调节活化正常T细胞表达和分泌蛋白(RANTES)。还在前骨髓母细胞细胞系中检测到CCR5基因表达，从而指示该蛋白可在颗粒细胞谱系增殖和分化中发挥作用。CCR5基因位于趋化因子受体基因簇区域处。与CCR5相关的疾病包括西尼罗病毒(west nile virus)和胰岛素依赖性糖尿病。其相关途径是免疫系统中的细胞因子信号传导和akt信号传导。在一些实施方案中，位于人类中的染色体3p上的CCR5基因由3个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Ccr5

术语“CCR5”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CCR5 cDNA和人类CCR5蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/1234)。例如，人类CCR5(NP_000570.1和NP_001093638.1)可由转录物变体A(NM_000579.3，其是较长转录物)和转录物变体B(NM_001100168.1，其5′UTR与变体A不同)编码。两种变体都编码相同蛋白质。除人类外的生物体中的CCR5直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CCR5(NM_001009046.1和NP_001009046.1)、恒河猴CCR5(NM_001042773.3和NP_001036238.2；以及NM_001309402.1和NP_001296331.1)、狗CCR5(NM_001012342.3和NP_001012342.2)、牛CCR5(NM_001011672.2和NP_001011672.2)、小鼠CCR5(NM_009917.5和NP_034047.2)和大鼠CCR5(NM_053960.3和NP_446412.2)。CCR5直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测CCR5蛋白的抗CCR5抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX101330、GTX109635和GTX21673(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-57072和sc-55484(SantaCruz Biotechnology)，抗体MAB182、NBP2-31374、NBP1-41434和MAB181(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab65850、ab1673和ab7346(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA351039和TA348418(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗CCR5抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20010000241、US20020099176A1、US20090110686A1和US20080107595中者。另外，用于检测CCR5表达的试剂是众所周知的。多个CCR5临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“EVI2B”是指嗜亲性病毒整合位点2B。EVI2B是颗粒细胞分化和造血祖细胞的功能性(经由控制造血祖细胞的细胞周期进展和存活)所需。在一些实施方案中，位于染色体17q上的基因EVI2B由3个外显子组成。在一些实施方案中，人类EVI2B蛋白具有448个氨基酸和/或48666Da的分子质量。

术语“EVI2B”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类EVI2B cDNA和人类EVI2B蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/2124)。例如，人类EVI2B(NP_006486.3)是由转录物(NM_006495.3)编码。除人类外的生物体中的EVI2B直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩EVI2B(XM_024350668.1和XP_024206436.1；以及XM_001174747.4和XP_001174747.1)、恒河猴EVI2B(XM_001111968.3和XP_001111968.1；以及XM_001111891.3和XP_001111891.1)、狗EVI2B(XM_022423331.1和XP_022279039.1；XM_022423330.1和XP_022279038.1；XM_005624837.3和XP_005624894.1；以及XM_005624836.3和XP_005624893.1)、牛EVI2B(NM_001099166.2和NP_001092636.1)、小鼠EVI2B(NM_001077496.1和NP_001070964.1)和大鼠EVI2B(NM_001271482.1和NP_001258411.1)。EVI2B直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测EVI2B蛋白的抗EVI2B抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX79980、GTX79981和GTX46414(GeneTex，Irvine，CA)，抗体NBP1-85342、NBP2-62207、NBP1-59952和H00002124-M02(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab101146、ab101040和ab173149(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA341843和AM12138RP-N(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测EVI2B表达的试剂是众所周知的。多个EVI2B临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“CLEC7A”是指含C型凝集素结构域蛋白7A，其为C型凝集素/C型凝集素样结构域(CTL/CTLD)超家族的成员。所编码糖蛋白是具有细胞外C型凝集素样结构域折叠和细胞质结构域(具有免疫受体酪氨酸活化基序)的小II型膜受体。其用作识别来自真菌和植物的各种β-1，3-连接和β-1，6-连接的葡聚糖的模式识别受体，并且以这种方式在先天性免疫反应中发挥作用。该基因紧密连接至人类天然杀手基因复合物区域中的染色体12p13上的其他CTL/CTLD超家族成员。与CLEC7A相关的疾病包括家族性曲霉菌病(aspergillosis)和念珠菌病(candidiasis)。其相关途径是CLEC7A(Dectin-1)信号传导和先天性免疫系统。在一些实施方案中，位于染色体12p上的基因CLEC7A由8个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Clec7a

术语“CLEC7A”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CLEC7A cDNA和人类CLEC7A蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/64581)公开获得。例如，已知至少6种不同人类CLEC7A同工型。人类CLEC7A同工型a(NP_922938.1)可由转录物变体1(NM_197947.2，其是最长转录物)编码。人类CLEC7A同工型b(NP_072092.2)可由转录物变体2(NM_022570.4)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏交替框内外显子，从而产生短于同工型a的蛋白质(同工型b)。人类CLEC7A同工型c(NP_922939.1)可由转录物变体3(NM_197948.2)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏产生框移和早期终止密码子的交替外显子。所得蛋白质(同工型c)短于同工型a并且具有不同C末端。人类CLEC7A同工型d(NP_922940.1)可由转录物变体4(NM_197949.2)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏产生框移和早期终止密码子的两个交替外显子。所得蛋白质(同工型d)短于同工型a并且含有不同C末端。人类CLEC7A同工型e(NP_922941.1)可由转录物变体5(NM_197950.2)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏交替框内外显子，从而产生短于同工型a的蛋白质(同工型e)。人类CLEC7A同工型f(NP_922945.1)可由转录物变体6(NM_197954.2)编码，所述转录物变体与变体1相比在编码区中具有多个差异，其中的一个差异产生早期终止密码子。所得蛋白质(同工型f)相较于同工型a具有不同C末端并且要短得多。除人类外的生物体中的CLEC7A直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CLEC7A(XM_016922965.2和XP_016778454.1；XM_001144689.3和XP_001144689.1；XM_001144825.3和XP_001144825.1；XM_003313487.4和XP_003313535.1；XM_528732.4和XP_528732.2；以及XM_001144313.4和XP_001144313.1)、恒河猴CLEC7A(NM_001032943.1和NP_001028115.1)、狗CLEC7A(XM_022411028.1和XP_022266736.1；XM_849050.3和XP_854143.1；以及XM_005637163.2和XP_005637220.1)、牛CLEC7A(NM_001031852.1和NP_001027022.1)、小鼠CLEC7A(NM_001309637.1和NP_001296566.1；以及NM_020008.3和NP_064392.2)和大鼠CLEC7A(NM_001173386.1和NP_001166857.1)。CLEC7A直系同源物的代表性序列呈现于下表1中。

适于检测CLEC7A蛋白的抗CLEC7A抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX41467、GTX41471和GTX41466(GeneTex，Irvine，CA)，抗体MAB1859、AF1859、NBP1-45514和NBP2-41170(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab140039、ab82888和ab189968(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：TA322197和TA320003(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗CLEC7A抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20140322214A1和US20170095573A1以及美国专利第US7915041B2号中者。另外，用于检测CLEC7A表达的试剂是众所周知的。多个CLEC7A临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“TBXAS1”是指血栓烷A合酶1，其为细胞色素P450超家族酶的成员。细胞色素P450蛋白是单氧合酶，其催化涉及药物代谢和胆固醇、类固醇和其他脂质的合成的许多反应。然而，基于序列类似性而非功能类似性，该蛋白质可视为细胞色素P450超家族的成员。这种内质网膜蛋白催化前列腺素H2至血栓烷A2的转化，血栓烷A2是强力血管收缩剂和血小板聚集诱导剂。所述酶在若干病理生理学过程(包括止血、心血管疾病和中风)中发挥作用。与TBXAS1相关的疾病包括ghosal型血液骨干发育不良和出血病症血小板型14。其相关途径是血小板活化和代谢。在一些实施方案中，位于染色体7q上的基因TBXAS1由23个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Tbxas1

术语“TBXAS1”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类TBXAS1 cDNA和人类TBXAS1蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/6916)。例如，已知至少5种不同人类TBXAS1同工型。人类TBXAS1同工型1(NP_001052.2和NP_001124438.1)可由转录物变体1(NM_001061.4)和转录物变体3(NM_001130966.2)编码。该变体(3，也称为TXS-III)与变体1相比的不同之处在于5′UTR。变体1和3都编码相同的同工型(1，也称为同工型TXS-I)。人类TBXAS1同工型2(NP_112246.2)可由转录物变体2(NM_030984.3)编码，所述转录物变体与转录物变体1相比在3′编码区中缺乏编码血红素结合位点的交替外显子。所编码同工型(2，也称为同工型TXS-II)相较于同工型1缺乏血栓烷A合酶活性，具有不同C末端，并且较短。人类TBXAS1同工型3(NP_001159725.1)可由转录物变体4(NM_001166253.1)编码，所述转录物变体与变体1相比在中心编码区中包括交替框内外显子，从而产生长于同工型1的同工型(3)。人类TBXAS1同工型4(NP_001159726.1)可由转录物变体5(NM_001166254.1)编码，所述转录物变体与变体1相比的不同之处在于5′UTR，缺乏5′编码区的一部分，并且使用下游翻译起始密码子。所编码同工型(4)在N末端处短于同工型1。人类TBXAS1同工型5(NP_001300957.1)可由转录物变体6(NM_001314028.1)编码，所述转录物变体与变体1相比在内部外显子中使用交替剪接位点。所得同工型(5)短于同工型1并且具有不同N末端。除人类外的生物体中的TBXAS1直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如狗TBXAS1(XM_005629559.2和XP_005629616.1；XM_539887.5和XP_539887.2；XM_014119949.2和XP_013975424.1；以及XM_022403739.1和XP_022259447.1)、牛TBXAS1(NM_001046027.2和NP_001039492.1)、小鼠TBXAS1(NM_011539.3和NP_035669.3)、大鼠TBXAS1(NM_012687.1和NP_036819.1)、鸡TBXAS1(XM_016334.6和XP_416334.4；XM_004937846.3和XP_004937903.2；以及XM_025155784.1和XP_025011552.1)、热带爪蛙TBXAS1(NM_001171526.1和NP_001164997.1)和斑马鱼TBXAS1(NM_205609.2和NP_991172.2)。TBXAS1直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测TBXAS1蛋白的抗TBXAS1抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX83523、GTX83521和GTX83522(GeneTex，Irvine，CA)，抗体NBP2-02710、NBP2-33948、NBP2-33946和NBP2-33947(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab39362、ab187176和ab157481(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：CF501380和AP51174PU-N(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测TBXAS1表达的试剂是众所周知的。多个TBXAS1临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“SIGLEC7”是指唾液酸结合性Ig样凝集素7，其为介导唾液酸依赖性细胞结合的假定粘附分子。SIGLEC7优先结合至α-2，3-连接和α-2，6-连接的唾液酸。SIGLEC7还结合二唾液酸神经节苷酯(二唾液酸半乳糖基红血球糖苷脂、二唾液酰基乳四糖神经酰胺和二唾液酰基GalNAc乳四糖神经酰胺)。SIGLEC7的唾液酸识别位点可由相同细胞表面上与唾液酸的顺式相互作用所遮蔽。在免疫反应中，SIGLEC7可在配体诱导性酪氨酸磷酸化时通过经由SH2结构域募集细胞质磷酸酶来用作抑制受体，所述结构域经由信号传导分子去磷酸化来阻断信号转导。SIGLEC7介导天然杀手细胞细胞毒性的抑制。SIGLEC7可在造血中发挥作用。SIGLEC7在体外抑制CD34+细胞前体朝向骨髓单核细胞性细胞谱系的分化和白血病髓系细胞的增殖。与SIGLEC7相关的疾病包括嗜铬细胞瘤。其相关途径是造血干细胞分化途径以及谱系特异性标志物和先天性免疫系统。在一些实施方案中，位于染色体19q上的基因SIGLEC7由7个外显子组成。在一些实施方案中，人类SIGLEC7蛋白具有467个氨基酸和/或51143Da的分子质量。在一些实施方案中，SIGLEC7蛋白含有1个拷贝的称为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)的细胞质基序。该基序参与调节细胞反应。经磷酸化ITIM基序可结合若干含SH2磷酸酶的SH2结构域。SIGLEC7蛋白在磷酸化时与PTPN6/SHP-1相互作用。

术语“SIGLEC7”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类SIGLEC7 cDNA和人类SIGLEC7蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/27036)公开获得。例如，已知至少三种不同人类SIGLEC7同工型。人类SIGLEC7同工型1(NP_055200.1，最长同工型)可由转录物变体1(NM_014385.3)编码。人类SIGLEC7同工型2(NP_057627.2)可由转录物变体2(NM_016543.3)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏框内编码外显子。所得同工型(2)与同工型1相比缺乏内部区段。人类SIGLEC7同工型3(NP_001264130.1)可由转录物变体3(NM_001277201.1)编码，所述转录物变体与变体1相比缺乏所有内部编码外显子。所得同工型(3)与同工型1相比是C末端截短的。除人类外的生物体中的SIGLEC7直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩SIGLEC7(XM_016936700.1和XP_016792189.1；以及XM_016936701.1和XP_016792190.1)。SIGLEC7直系同源物的代表性序列呈现于下表1中。

适于检测SIGLEC7蛋白的抗SIGLEC7抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX107080、GTX116337和GTX53005(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-398919和sc-398181(Santa Cruz Biotechnology)，抗体AF1138、MAB1138、MAB11381和NBP2-20360(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab38573、ab38574和ab111619(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：AM05592FC-N和AM05592PU-L(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗SIGLEC7抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20170306014、US20190085077、US20190023786和US20180244770中者。另外，用于检测SIGLEC7表达的试剂是众所周知的。多个SIGLEC7临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“DOCK2”是指胞质分裂作用因子2。DOCK2属于CDM蛋白家族。其特异性表达于造血细胞中并且主要表达于外周血白细胞中。所述蛋白质参与重塑响应于趋化因子信号传导的淋巴细胞迁移所需的肌动蛋白细胞骨架。其通过用作鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)以将经结合GDP交换成游离GTP来活化GTP酶的Rho家族成员(例如RAC1和RAC2)。DOCK2参与响应于趋化因子的淋巴细胞迁移所需的细胞骨架重排。DOCK2通过用作将经结合GDP交换成游离GTP的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)来活化RAC1和RAC2，但并不活化CDC42。DOCK2还经由活化RAC2来参与IL2转录活化。存在基因敲除小鼠系，其称为Dock2

术语“DOCK2”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类DOCK2 cDNA和人类DOCK2蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/80231)。例如，人类DOCK2(NP_004937.1)可由转录物(NM_004946.3)编码。除人类外的生物体中的DOCK2直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩DOCK2(XM_016954161.2和XP_016809650.1；XM_016954163.2和XP_016809652.1；XM_016954162.2和XP_016809651.1；以及XM_016954164.2和XP_016809653.1)、狗DOCK2(XM_546246.5和XP_546246.3)、牛DOCK2(XM_024981420.1和XP_024837188.1，以及XM_024981421.1和XP_024837189.1)、小鼠DOCK2(NM_033374.3和NP_203538.2)、大鼠DOCK2(XM_008767630.2和XP_008765852.1)、鸡DOCK2(XM_425184.6和XP_425184.4)和热带爪蛙DOCK2(XM_018092631.1和XP_017948120.1)。DOCK2直系同源物的代表性序列呈现于下文的表1中。

适于检测DOCK2蛋白的抗DOCK2抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体TA340057和TA802698(OriGene，Rockville，MD)，抗体NBP2-46468和NBP2-38303(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab74659、ab226797和ab203068(AbCam，Cambridge，MA)等。另外，用于检测DOCK2表达的试剂是众所周知的。多个DOCK2临床测试可在NIH GeneticTesting Registry

术语“CD53”是指CD53分子，其为4跨膜蛋白超家族的成员并且也称为四分子交联体家族。大部分这些成员是特征在于存在4个疏水性结构域的细胞表面蛋白。所述蛋白质介导用于调控细胞发育、活化、生长和运动的信号转导事件。这种所编码蛋白质是已知与整联蛋白复合的细胞表面糖蛋白。其有助于转导T细胞和天然杀手细胞中的CD2生成信号并且已表明在生长调控中发挥作用。该基因的家族性缺陷涉及与由细菌、真菌和病毒引起的复发性感染性疾病相关的免疫缺陷。与CD53相关的疾病包括肠结核病和胃肠道结核病。其相关途径是先天性免疫系统。需要CD53以在细胞融合层面上有效形成再生肌肉中的肌纤维。CD53可参与造血细胞中的生长调控。在一些实施方案中，位于染色体1p上的基因CD53由9个外显子组成。在一些实施方案中，人类CD53蛋白具有219个氨基酸和/或24341Da的分子质量。

术语“CD53”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD53 cDNA和人类CD53蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/963)。例如，已知至少两种不同人类CD53同工型。人类CD53同工型1(NP_000551.1和NP_001035122.1)可由转录物变体1(NM_001040033.1，其代表较长转录物)和转录物变体2(NM_000560.3，其与变体1的不同之处在于5′UTR相比)编码。变体1和2编码相同蛋白质。人类CD53同工型2(NP_001307567.1)可由转录物变体3(NM_001320638.1)编码，所述转录物变体与变体1相比的不同之处在于5′UTR并且在编码区中缺乏外显子。所编码同工型(2)短于同工型1。除人类外的生物体中的CD53直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD53(XM_003308334.3和XP_003308382.1；XM_016925800.1和XP_016781289.1；以及XM_009429624.2和XP_009427899.1)、恒河猴CD53(XM_015148031.1和XP_015003517.1、XM_001102190.3和XP_001102190.1以及XM_015148036.1和XP_015003522.1)、狗CD53(XM_003639132.3和XP_003639180.1)、牛CD53(NM_001034232.2和NP_001029404.1)、小鼠CD53(NM_007651.3和NP_031677.1)和大鼠CD53(NM_012523.2和NP_036655.1)。CD53直系同源物的代表性序列呈现于下文的表2中。

适于检测CD53蛋白的抗CD53抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX34220、GTX79940和GTX79942(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-390185和sc-73365(SantaCruz Biotechnology)，抗体MAB4624、NB500-393、NBP2-44609和NBP2-14464(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab134094、ab68565和ab213083(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：SM1137AS和SM1137LE(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测CD53表达的试剂是众所周知的。多个CD53临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

术语“FERMT3”是指Fermitin家族成员3，并且属于介导涉及整联蛋白活化的蛋白质-蛋白质相互作用并由此在细胞粘附、迁移、分化和增殖中具有作用的蛋白质的小家族。FERMT3蛋白在止血和血栓形成的调控中具有关键作用。其还可帮助维持红血球的膜骨架。FERMT3基因中的突变会引起常染色体隐性白细胞粘附缺陷综合征-III(LAD-III)。FERMT3在造血细胞中的细胞粘附中发挥主要作用(Svensson等人(2009)Nat Med 15：306-312；Suratannon等人(2016)Pediatr Allergy Immunol 27：214-217)。FERMT3通过活化整联蛋白β-1-3(ITGB1、ITGB2和ITGB3)而发挥作用。FERMT3是整联蛋白介导的血小板粘附和白细胞至内皮细胞的粘附所需(Malinin等人(2009)Nat Med 15：313-318)，并且是多形核颗粒细胞(PMN)中的整联蛋白β-2(ITGB2)的活化所需。FERMT3的人类同工型2可用作NF-κ-B和细胞凋亡的抑制子。在一些实施方案中，位于染色体11q上的基因FERMT3由16个外显子组成。存在基因敲除小鼠系，包括Fermt3

术语“FERMT3”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类FERMT3eDNA和人类FERMT3蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/83706)。例如，已知至少两种不同人类FERMT3同工型。人类FERMT3同工型1(NP_848537.1)可由转录物变体1(NM_178443.2，其代表较长转录物)编码。人类FERMT3同工型2(NP_113659.3)可由转录物变体2(NM_031471.5)编码，所述转录物变体与变体1相比在编码外显子的5′端使用交替框内剪接点。所得同工型(2)与长同工型(1)相比具有相同但较短的N末端和C末端。除人类外的生物体中的FERMT3直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩FERMT3(XM_009423350.3和XP_009421625.1；以及XM_508522.6和XP_508522.3)、恒河猴FERMT3(XM_015113900.1和XP_014969386.1，以及XM_015113898.1和XP_014969384.1)、狗FERMT3(XM_003639655.3和XP_003639703.1)、小鼠FERMT3(NM_001362399.1和NP_001349328.1，以及NM_153795.2和NP_722490.1)、大鼠FERMT3(NM_001127543.1和NP_001121015.1)；和斑马鱼FERMT3(NM_200904.2和NP_957198.2)。FERMT3直系同源物的代表性序列呈现于下文的表2中。

适于检测FERMT3蛋白的抗FERMT3抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX116828、GTX85027和GTX88332(GeneTex，Irvine，CA)，抗体NBP2-45641、AF7004、NBP2-20821和H00083706-B01P(Novus Biologicals，Littleton，CO)，抗体ab68040、ab126900和ab173416(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：CF807994和TA807994(Origene，Rockville，MD)等。另外，用于检测FERMT3表达的试剂是众所周知的。多个FERMT3临床测试可在NIHGenetic Testing Registry

术语“CD37”是指CD37，其是4跨膜蛋白超家族的成员并且也称为四分子交联体家族。大部分这些成员是特征在于存在4个疏水性结构域的细胞表面蛋白。所述蛋白质介导用于调控细胞发育、活化、生长和运动的信号转导事件。CD37蛋白是已知与整联蛋白和其他4跨膜超家族蛋白复合的细胞表面糖蛋白。CD37可在T细胞-B细胞相互作用中发挥作用。存在基因敲除小鼠系，称为CD37

术语“CD37”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CD37 cDNA和人类CD37蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/951)。例如，已知至少两种不同人类CD37同工型。人类CD37同工型A(NP_001765.1)可由转录物变体1(NM_001774.2，其代表较长转录物)编码。人类CD37同工型B(NP_001035120.1)可由转录物变体2(NM_001040031.1)编码，所述转录物变体与变体1相比在5′编码区中缺乏交替框内区段并且使用下游起始密码子。所编码同工型(B)与同工型A相比具有较短N末端。除人类外的生物体中的CD37直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CD37(XM_016947061.2和XP_016802550.1；XM_016947063.2和XP_016802552.1；XM_016947062.2和XP_016802551.1；以及XM_016947064.2和XP_016802553.1)、恒河猴CD37(XM_015124560.1和XP_014980046.1；XM_001114865.3和XP_001114865.2；XM_015124562.1和XP_014980048.1；以及XM_015124563.1和XP_014980049.1)、狗CD37(XM_014118925.2和XP_013974400.1；XM_541497.5和XP_541497.2；以及XM_005616317.3和XP_005616374.1)、牛CD37(NM_001046011.2和NP_001039476.1)、小鼠CD37(NM_001290802.1和NP_001277731.1、NM_001290804.1和NP_001277733.1，以及NM_007645.4和NP_031671.1)、大鼠CD37(NM_017124.1和NP_058820.1)和热带爪蛙CD37(NM_001015801.2和NP_001015801.2)。CD37直系同源物的代表性序列呈现于下文的表2中。

适于检测CD37蛋白的抗CD37抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体GTX129598、GTX19701和GTX83137(GeneTex，Irvine，CA)，抗体sc-73364和sc-23924(SantaCruz Biotechnology)，抗体NBP1-28869、NBP2-33969、NBP2-33970和MAB4625(NovusBiologicals，Littleton，CO)，抗体ab170238、ab213068和ab227624(AbCam，Cambridge，MA)，抗体目录#：AM06314SU-N和AM32392PU-N(Origene，Rockville，MD)等。还已知其他抗CD37抗体并且包括例如阐述于美国专利公开US20160051694A1、US20100189722、US20180186876和US20140348745以及美国专利第US8333966B2号和第US8765917B2号中者。另外，用于检测CD37表达的试剂是众所周知的。多个CD37临床测试可在NIH GeneticTesting Registry

术语“CXorf21”是指染色体X开放阅读框21。在一些实施方案中，位于人类中的染色体Xp上的基因CXorf21由3个外显子组成。CXorf21基因在黑猩猩、恒河猴、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼和青蛙中是保守的。在一些实施方案中，人类CXorf21蛋白具有301个氨基酸和/或33894Da的分子质量。

术语“CXorf21”旨在包括其片段、变体(例如等位基因变体)和衍生物。代表性人类CXorf21 cDNA和人类CXorf21蛋白序列是本领域众所周知的并且可从国家生物技术信息中心(NCBI)公开获得(参见例如ncbi.nlm.nih.gov/gene/80231)。例如，人类CXorf21(NP_079435.1)可由转录物(NM_025159.2)编码。除人类外的生物体中的CXorf21直系同源物的核酸和多肽序列是众所周知的并且包括例如黑猩猩CXorf21(XM_001134922.2和XP_001134922.1)、恒河猴CXorf21(NM_001194018.1和NP_001180947.1)、狗CXorf21(XM_005641222.3和XP_005641279.1；XM_005641223.3和XP_005641280.1；XM_022416085.1和XP_022271793.1；以及XM_022416084.1和XP_022271792.1)、牛CXorf21(NM_001038537.2和NP_001033626.1)、小鼠CXorf21(NM_001163539.1和NP_001157011.1)、大鼠CXorf21(NM_001109318.1和NP_001102788.1)和鸡CXorf21(XM_003640512.4和XP_003640560.1)。CXorf21直系同源物的代表性序列呈现于下文的表2中。

适于检测CXorf21蛋白的抗CXorf21抗体是本领域众所周知的并且包括例如抗体NBP1-82317和H00080231-B01P(Novus Biologicals，Littleton，CO)、抗体ab69152(AbCam，Cambridge，MA)等。另外，用于检测CXorf21表达的试剂是众所周知的。多个CXorf21临床测试可在NIH Genetic Testing Registry

SIGLEC9

VSIG4

CD74

CD207

LRRC25

SELPLG

AIF1

CD84

IGSF6

CD48

CD33

LST1

TNFAIP8L2(TIPE2)

SPI1(PU.1)

LILRB2

CCR5

EVI2B

CLEC7A

TBXAS1

SIGLEC7

DOCK2

*表1中所列出的本发明所涵盖生物标志物的核酸和多肽序列已以本文所提供的独特识别符提交至GenBank，并且提交至GenBank的每个这种独特识别的序列的全部内容通过引用并入本文。

*表1包括RNA核酸分子(例如胸苷被尿苷代替)、编码所编码蛋白质的直系同源物的核酸分子以及包含在全长上与表1中所列出任何可公开获得的序列的核酸序列(参见例如下文)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高同一性的核酸序列的DNA或RNA核酸序列或其部分。这些核酸分子可具有全长核酸的功能，如本文进一步所述。

*表1包括蛋白质的直系同源物以及包含在全长上与表1中所列出任何可公开获得的序列的核酸序列(参见例如下文)具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高同一性的核酸序列的多肽分子或其部分。这些多肽可具有全长多肽的功能，如下文进一步所述。

*表1包括所列出生物标志物的其他已知核酸和氨基酸序列。

CD53

FERMT3

CD37

CXorf21

CD48

CD84

*表2中所列出的本发明所涵盖生物标志物的核酸和多肽序列已以本文所提供的独特识别符提交至GenBank，并且提交至GenBank的每个这种独特识别的序列的全部内容通过引用并入本文。

*表2包括RNA核酸分子(例如胸苷被尿苷代替)、编码所编码蛋白质的直系同源物的核酸分子以及包含在全长上与表2中所列出任何可公开获得的序列的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高同一性的核酸序列的DNA或RNA核酸序列或其部分。这些核酸分子可具有全长核酸的功能，如本文进一步所述。

*表2包括蛋白质的直系同源物以及包含在全长上与表2中所列出任何可公开获得的序列的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高同一性的核酸序列的多肽分子或其部分。这些多肽可具有全长多肽的功能，如下文进一步所述。

*表2包括所列出生物标志物的其他已知核酸和氨基酸序列。

IV.

本文证实，可通过单独或组合调节某些生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的拷贝数、量和/或活性来控制单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型，并且调节发炎表型可调节免疫反应。因此，本发明提供调节至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的拷贝数、量和/或活性的组合物，所述组合物可上调或下调发炎表型并且由此分别上调或下调免疫反应。本文还阐述可检测至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的拷贝数、量和/或活性的药剂，使得所述药剂可用于诊断、预后和筛选由至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)介导的效应。

下调表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂(例如下调本文所述的至少一种靶标的药剂，如抗体、siRNA等)可增加单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型。

下调表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂(例如下调本文所述的至少一种靶标的药剂，如抗体、siRNA等)可降低单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型。

本发明涵盖调节本文所述的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的任何药剂。所述药剂可调节基因序列、拷贝数、基因表达、翻译、翻译后修饰、亚细胞定位、降解、构形、稳定性、分泌、酶促活性、转录因子、受体活化、信号转导和由至少一种生物标志物介导的其他生物化学功能。

所述药剂可结合任何细胞部分，例如受体、细胞膜、抗原决定子或存在于靶分子或靶细胞上的其他结合位点。在一些实施方案中，所述药剂可扩散或传输至细胞中，其中药剂可在细胞内起作用。在一些实施方案中，药剂是基于细胞。

如下文进一步所述，代表性药剂包括但不限于核酸(DNA和RNA)、寡核苷酸、多肽、肽、抗体、融合蛋白、抗生素、小分子、脂质/脂肪、糖、载体、缀合物、疫苗、基因疗法药剂、细胞疗法药剂等，例如小分子、编码多肽的mRNA、CRISPR向导RNA(gRNA)、RNA干扰剂、小干扰RNA(siRNA)、CRISPR RNA(crRNA和tracrRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、反义寡核苷酸、肽或肽模拟物抑制剂、适体、结合并活化或抑制蛋白质生物标志物的天然配体和其衍生物、抗体、细胞内抗体或细胞，所述药剂单独存活或与其他药剂进行组合。

在一些实施方案中，调节至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)与天然结合伴侣之间的相互作用的药剂可用于本发明。例如，在一个实施方案中，直接阻断生物标志物与其天然结合伴侣中的一者或多者之间的相互作用的药剂(例如阻断抗体)可调节生物标志物活性并由此调节发炎表型。或者，可使用间接阻断相互作用的药剂。例如，通过结合至生物标志物天然结合伴侣或替代地通过模拟生物标志物的天然结合伴侣，可溶性蛋白质间接降低可用于结合至细胞上的相应蛋白质的生物标志物和/或生物标志物天然结合伴侣的有效浓度。示例性药剂包括针对生物标志物或生物标志物天然结合伴侣的抗体，其阻断生物标志物与天然结合伴侣之间的相互作用；非活化形式的生物标志物和/或生物标志物天然结合伴侣(例如显性阴性多肽)；阻断生物标志物与其天然结合伴侣之间的相互作用的小分子或肽；抑制生物标志物与其天然结合伴侣之间的相互作用的融合蛋白(例如融合至抗体或免疫球蛋白的Fc部分的生物标志物和/或其天然结合伴侣的细胞外部分)；阻断生物标志物和/或其天然结合伴侣的转录或翻译的核酸分子和/或基因修饰；非活化形式的生物标志物和/或其天然结合伴侣。

在其他示例性实施方案中，本发明涵盖促进生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)结合至一种或多种天然结合伴侣的药剂。调节这种相互作用的药剂可直接或间接进行。因此，在一个实施方案中，直接增强生物标志物与生物标志物的天然结合伴侣之间的相互作用的药剂是有用的调节剂。或者，阻断生物标志物和/或生物标志物的天然结合伴侣与其他结合伴侣的结合的药剂增加了可用于彼此结合的两种组分的有效浓度。示例性药剂包括针对生物标志物和/或其天然结合伴侣的抗体，小分子，以及活化或促进生物标志物与其天然结合伴侣之间的相互作用的肽。

本发明所涵盖的药剂可包含任何数量、类型和模态。例如，药剂可包含1、2、3、4、5种或更多或其间的任何范围(包括端值)数量的调节一种生物标志物或一种以上生物标志物的药剂(例如2种调节表1或表2中所列出的相同靶标的药剂、一种调节表1中所列出的靶标的药剂和调节表2中所列出的靶标的第二药剂、siRNA和调节表2中所列出的靶标的抗体药剂的组合、两种调节表1中所列出的单一靶标的siRNA以及调节表2中所列出的单一靶标的单一siRNA和调节表2中所列出的另一靶标的抗体剂的组合等)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的调节剂还包含一种或多种靶向吞噬细胞(例如单核细胞和/或巨噬细胞)的其他药剂。这些单核细胞/巨噬细胞靶向剂包括但不限于靶向CD11b的罗维珠单抗(rovelizumab)、小分子(包括MNRP1685A，其靶向神经菌毛素(Neurophilin)-1)、靶向ANG2的奈斯库单抗(nesvcumab)、对IL-4具有特异性的帕考珠单抗(pascolizumab)、对IL4Rα具有特异性的杜匹鲁单抗(dupilumab)、对IL-6R具有特异性的托珠单抗(tocilizumab)和撒里路单抗(sarilumab)、阿达木单抗(adalimumab)、赛妥珠单抗(certolizumab)、他奈西普(tanercept)、戈利木单抗(golimumab)和对TNF-α具有特异性的英夫利昔单抗(infliximab)和靶向CD40的CP-870和CP-893。

除下文和本文所述的药剂外，本领域已阐述调节本发明所涵盖的所关注生物标志物的示例性药剂(参见例如(i)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics，Inc.)在2019年6月4日提交的共同待决申请U.S.S.N.62/857,169，其名称为“Anti-PSGL-1Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage InflammatoryPhenotypes and Uses Thereof”；(ii)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics，Inc.)在2019年6月27日提交的共同待决申请U.S.S.N.62/867,569，其名称为“Anti-PSGL-1Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage InflammatoryPhenotypes and Uses Thereof”；(iii)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics，Inc.)在2019年6月4日提交的共同待决申请U.S.S.N.62/857,194，其名称为“Anti-SIGLEC-9Compositions and Methods for Modulating Monocyte and Macrophage InflammatoryPhenotypes and Uses Thereof”；(iv)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics，Inc.)在2019年6月27日提交的共同待决申请U.S.S.N.62/867,577，其名称为“Anti-SIGLEC-9Compositions and Methods for Modulating Monocyte and MacrophageInflammatory Phenotypes and Uses Thereof”；(v)由Novobrantseva等人(VerseauTherapeutics，Inc.)在2019年6月27日提交的共同待决申请U.S.S.N.62/867,593，其名称为“Anti-LRRC25 Compositions and Methods for Modulating Monocyte andMacrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof”；以及(vi)由Novobrantseva等人(Verseau Therapeutics，Inc.)在2019年6月27日提交的共同待决申请U.S.S.N.62/867,602，其名称为“Anti-CD53 Compositions and Methods for Modulating Monocyteand Macrophage Inflammatory Phenotypes and Uses Thereof”，所述申请各自的全部内容通过引用并入本文)。

1.

本发明所涵盖的一个方面涉及使用核酸分子。核酸分子可为脱氧核糖核酸(DNA)分子(例如cDNA、基因组DNA等)、核糖核酸(RNA)分子(例如mRNA、长非编码RNA、小RNA物质等)、DNA/RNA杂合体，以及使用核苷酸类似物生成的DNA或RNA的类似物。RNA剂可包括RNAi(RNA干扰)药剂(例如小干扰RNA(siRNA))、单链RNA(ssRNA)分子(例如反义寡核苷酸)或双链RNA(dsRNA)分子。dsRNA分子包含第一链和第二链，其中第二链与第一链基本上互补，并且第一链和第二链形成至少一个双链体区域。dsRNA分子可具有钝端或具有至少一个末端悬突。在用作结合靶核酸序列的剂时，本发明所涵盖的核酸剂可杂交至靶序列(例如基因组序列和/或mRNA序列)的任何区域，包括但不限于增强子区域、启动子区域、转录起始和/或终止区域、剪接位点、编码区、3′-非翻译区(3′-UTR)、5′-非翻译区(5′-UTR)、5′帽、3′聚腺苷酰基尾部或其任何组合。

“经分离”核酸分子是与存在于核酸分子天然来源中的其他核酸分子所分离者。优选地，“经分离”核酸分子不含天然侧接于衍生核酸的生物体的基因组DNA中的核酸的序列(优选地蛋白质编码序列，即位于核酸的5′端和3′端的序列)。例如，在各个实施方案中，经分离核酸分子可含有小于约5kB、4kB、3kB、2kB、1kB、0.5kB或0.1kB的天然侧接于衍生核酸的细胞的基因组DNA中的核酸分子的核苷酸序列。此外，“经分离”核酸分子(例如cDNA分子)可在通过重组技术产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或在以化学方式合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。

可使用标准分子生物学技术和本文所述数据库记录中的序列信息来分离本发明所涵盖的核酸分子。使用这些核酸序列的全部或一部分，可使用标准杂交和克隆技术来分离本发明所涵盖的核酸分子(例如如Sambrook等人编辑，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，2012中所述)。

可使用cDNA、mRNA或基因组DNA(作为模板)和适当寡核苷酸引物根据标准PCR扩增技术来扩增本发明所涵盖的核酸分子。可将如此扩增的核酸分子克隆至适当载体中并通过DNA序列分析进行表征。此外，可通过标准合成技术例如使用自动化核酸合成器来制备对应于本发明所涵盖核酸分子的全部或一部分的核酸分子。或者，可以生物方式使用亚克隆核酸的表达载体来产生核酸分子。例如，可以反义定向克隆反义核酸分子(即，从插入核酸转录的RNA与所关注靶核酸具有反义定向，如下文进一步所述)。

此外，本发明所涵盖的核酸分子可仅包含核酸序列的一部分，其中全长核酸序列包含本发明所涵盖的标志物或编码对应于本发明所涵盖的标志物的多肽。可使用这些核酸分子作为例如探针或引物。探针/引物通常是以一种或多种基本上纯化的寡核苷酸形式来使用。寡核苷酸通常包含在严格条件下杂交至生物标志物核酸序列的至少约7、优选地约15、更优选地约25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400或更多个连续核苷酸的核苷酸序列区域。可使用基于生物标志物核酸分子的序列的探针来检测对应于本发明所涵盖一个或多个标志物的转录物或基因组序列。探针包含附接至其的标记基团，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。

还涵盖由于遗传密码简并性而与编码对应于生物标志物的蛋白质的核酸分子的核苷酸序列不同并且由此编码相同蛋白质的生物标志物核酸分子。

另外，本领域技术人员将了解，在群体(例如人类群体)内可存在引起氨基酸序列变化的DNA序列多态性。在群体内的个体之间可由于天然等位基因变异而存在这样的基因多态性。等位基因是在给定遗传基因座替代性存在的一组基因中的一者。另外，应了解，还可存在影响RNA表达水平的DNA多态性，其可影响所述基因的总体表达水平(例如通过影响调节或降解)。

术语“等位基因”可在本文中与“等位基因变体”互换使用，其是指替代形式的基因或其部分。等位基因占据同源染色体上的相同基因座或位置。在受试者具有基因的两个相同等位基因时，所述受试者可称为对于所述基因或等位基因为纯合性。在受试者具有基因的两个不同等位基因时，所述受试者被称为对于所述基因或等位基因为杂合性。例如，生物标志物等位基因可在单一核苷酸或若干核苷酸中彼此不同，并且可包括核苷酸的取代、缺失和插入。基因的等位基因还可呈含有一种或多种突变的基因形式。

术语“基因的多态区域的等位基因变体”或“等位基因变体”可在本文中互换使用并且是指替代形式的具有发现于群体中的所述基因区域中的若干可能核苷酸序列之一的基因。如本文所用，等位基因变体意在涵盖功能性等位基因变体、非功能性等位基因变体、SNP、突变和多态性。

术语“单一核苷酸多态性”(SNP)是指由单一核苷酸占据的多态位点，其是等位基因序列之间的变化位点。所述位点的前后通常具有高度保守的等位基因序列(例如在群体的小于1/100或1/1000成员中有所变化的序列)。SNP通常源自使用一种核苷酸取代多态位点处的另一者。SNP还可源自相对于参考等位基因缺失核苷酸或插入核苷酸。通常，多态位点由除参考碱基外的碱基占据。例如，在参考等位基因在多态位点处含有碱基“T”(胸苷)的情形下，改变的等位基因可在所述多态位点处含有“C”(胞苷)、“G”(鸟嘌呤)或“A”(腺嘌呤)。SNP可出现于编码蛋白质的核酸序列中，在这种情形下其可产生缺陷性蛋白质或另外变体蛋白或基因疾病。这种SNP可改变基因的编码序列并且因此指定另一氨基酸(“误义”SNP)或SNP可引入终止密码子(“无义”SNP)。在SNP不改变蛋白质的氨基酸序列时，SNP被称为“沉默的”。SNP还可出现于核苷酸序列的非编码区域中。这可例如因交替剪接而产生缺陷性蛋白质表达，或者其可对蛋白质功能无影响。

如本文所用，术语“基因”和“重组基因”是指包含编码对应于本发明所涵盖标志物的多肽的开放阅读框的核酸分子。这些天然等位基因变化通常可引起给定基因的核苷酸序列中的1-5％变化。可通过对许多不同个体中的所关注基因测序来鉴定替代等位基因。这可通过使用杂交探针鉴定多个个体中的相同遗传基因座容易地实施。任何和所有这些核苷酸变化和因天然等位基因变化产生并且不改变功能活性的所得氨基酸多态性或变化意在处于本发明所涵盖的范围内。

在另一个实施方案中，生物标志物核酸分子的长度可为至少7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、4500或更多个核苷酸并且在严格条件下杂交至对应于本发明所涵盖标志物的核酸分子或杂交至编码对应于本发明所涵盖标志物的蛋白质的核酸分子。术语“在严格条件下杂交”意在阐述彼此至少60％(65％、70％、75％、80％、优选地85％)同一的核苷酸序列通常保持彼此杂交的杂交和洗涤条件。这些严格条件是本领域技术人员已知的并且可见于CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wilev&Sons，N.Y.(1989)的部分6.3.1-6.3.6中。严格杂交条件的优选的非限制性实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中在约45℃下杂交，接着在0.2X SSC、0.1％SDS中在50-65℃下洗涤一次或多次。

除可存在于群体中的本发明所涵益的核酸分子的天然存在等位基因变体外，本领域技术人员还应了解，可通过突变引入序列变化，由此改变所编码蛋白质的氨基酸序列并且并不改变由此编码的蛋白质的生物活性。例如，可进行核苷酸取代以在“非必需”氨基酸残基处产生氨基酸取代。“非必需”氨基酸残基是可从野生型序列改变而不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基为生物活性所需。例如，在各种物质的同源物中并不保守或仅半保守的氨基酸残基可对于活性来说是非必需的并且由此将是用于改变的可能靶标。或者，在各种物种(例如鼠类和人类)的同源物中保守的氨基酸残基可对于活性来说是必需的并且由此将不是用于改变的可能靶标。

因此，本发明所涵盖的另一方面涵盖编码本发明所涵盖多肽的核酸分子，所述核酸分子含有对于活性来说非必需的氨基酸残基的变化。这些多肽的氨基酸序列不同于对应于本发明所涵盖标志物的天然存在蛋白质，但保留生物活性。在一个实施方案中，生物标志物蛋白具有与本文所述生物标志物蛋白的氨基酸序列具有至少约40％同一性、50％、60％、70％、75％、80％、83％、85％、87.5％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

可通过以下方式来产生编码变体蛋白的经分离核酸分子：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入本发明所涵盖核酸的核苷酸序列中，从而将一个或多个氨基酸残基取代、添加或缺失引入所编码蛋白质中。可通过标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入突变。优选地，在一个或多个所预测非必需氨基酸残基处实现保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基代替的取代。本领域已定义具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，可沿编码序列的全部或一部分例如通过饱和诱变来随机引入突变，并且可针对生物活性来筛选所得突变体以鉴定保留活性的突变体。在诱变后，可以重组方式表达所编码蛋白质并且可测定蛋白质的活性。

如下文进一步所述，用于本发明的一些形式的核酸可用作抑制剂，其是指抑制生物靶标的功能的药剂。在一些实施方案中，抑制剂是防止表达基因或基因产物的基因沉默剂。“基因沉默”通常称为“基因敲低”。基因沉默可发生于转录层面上(即防止DNA转录成RNA)或翻译层面上(即转录后沉默，即防止mRNA翻译成蛋白质)。转录基因沉默的类型包括例如基因组印记、副突变、转座子沉默、组蛋白修饰、转基因沉默、位置效应和RNA定向DNA甲基化。转录后基因沉默的实例包括RNA干扰(RNAi)、RNA沉默和无义介导的衰变。基因沉默剂可被设计以沉默(例如抑制表达)特定基因或同时沉默多个基因。基因沉默剂可将基因和/或基因产物的表达减少至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或至少约100％。在一些实施方案中，基因沉默剂将基因和/或基因产物的表达减少至少约70％。

在一些实施方案中，基因组中的核酸是有用的并且可用作靶标和/或药剂。例如，可使用本领域众所周知的方法来操纵基因组中的靶标DNA。可通过缺失、插入和/或突变如逆转录病毒插入、人工染色体技术、基因插入、使用组织特异性启动子的随机插入、基因靶向、可转座元件和/或用于引入外来DNA或产生经修饰DNA/经修饰核DNA的任何其他方法来操纵基因组中的靶标DNA。其他修饰技术包括从基因组缺失DNA序列和/或改变核DNA序列。例如，可通过定点诱变来改变核DNA序列。

a.信使RNA(mRNA)和cDNA

在一些实施方案中，可使用编码靶蛋白和其变体的mRNA和/或cDNA作为调节所关注靶蛋白的量和/或活性的药剂。可修饰mRNA和cDNA以增加稳定性和/或免疫原性，例如密码子优化。

b.小干扰RNA(siRNA)

在一些实施方案中，核酸剂可为RNAi(RNA干扰)剂。RNAi剂可为单链RNA分子或双链RNA分子，例如小(或短)干扰RNA(siRNA)分子。siRNA分子是具有有义链和反义链的双链寡核苷酸或RNA分子，其中反义链与靶标mRNA分子中的序列基本上互补。siRNA分子在细胞递送时将诱导RNA干扰(RNAi)。RNAi是经由染色质重塑、抑制蛋白质翻译或直接mRNA降解来实现基因沉默的转录后机制。在RNAi过程期间，小RNA分子(例如siRNA)被募集至RNA诱导的沉默复合物(RISC)处。该复合物能够经由siRNA分子结合至基本上互补序列(即转录基因的mRNA)并且通过核酸内切酶活性将其降解。这最终可抑制编码与siRNA分子互补的mRNA的相应基因的表达(例如McManus和Sharp(2002)Nat.Rev.Genet.3：737-747)。

术语“双链RNA”、“双链体RNA”或“RNA双链体”是指具有两条链和至少一个双链区域的RNA，并且包括在双链区域内或在两个相邻双链区域之间具有至少一个间隙、切口、膨出部、环和/或泡状体的RNA分子。如果一条链在两个双链区域之间具有间隙或不匹配核苷酸的单链区域，则所述链可视为具有多个片段。如本文所用的双链RNA可在任一端或两端具有末端悬突。在一些实施方案中，双链体RNA的两条链可经由某些化学接头连接。

术语“反义链”是指与靶标信使RNA具有基本上序列互补性的RNA链。反义链可为siRNA分子的一部分、miRNA/miRNA双链体的一部分或单链成熟miRNA。

siRNA分子的有义链和反义链各自可包含约10至50个核苷酸或核苷酸类似物。优选地，siRNA分子的有义链和反义链各自具有约15-45个核苷酸的长度。进一步优选地，siRNA分子的反义链和有义链各自的长度为18至30个核苷酸，或21至23个核苷酸，例如约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约23个核苷酸、约24个核苷酸、约25个核苷酸、约26个核苷酸、约27个核苷酸、约28个核苷酸、约29个核苷酸或约30个核苷酸。

siRNA分子的有义链和反义链形成双链体区域。反义链包含与靶标mRNA基本上互补(或替代地基本上由其组成或由其组成)的核苷酸序列以介导RNAi。

术语“基本上互补”是指siRNA分子的碱基配对和双链区域中的互补性。互补性未必是完全的；可存在任何数量的碱基对错配，其并不影响杂交，即使在最不严格的杂交条件下。例如，本发明所涵盖siRNA分子的反义区可与靶标mRNA分子的核酸序列至少约70％或更大程度互补、至少约75％或更大程度互补、至少约80％或更大程度互补、或至少约85％或更大程度互补、或至少约90％或更大程度互补、或至少约91％或更大程度互补、或至少约92％或更大程度互补、或至少约93％或更大程度互补、或至少约94％或更大程度互补、或至少约95％或更大程度互补、或至少约96％或更大程度互补、或至少约97％或更大程度互补、或至少约98％或更大程度互补、或至少约99％或更大程度互补。

siRNA分子可进一步包括至少一个悬突区域，其中每一悬突区域具有6个或更少核苷酸。例如，在siRNA分子的反义链和有义链对准时，在不对准链的末端存在至少一个、两个、三个、四个、五个或六个核苷酸(即在相对链中无互补碱基)。在一些实例中，在将有义链和反义链退火时，悬突可出现于双链体的一端或两端。

在一些实例中，siRNA分子的反义区和有义区的长度、序列和其化学修饰的性质可有所变化。

c.微RNA(miRNA)和Piwi相互作用RNA(piRNA)

在一些实施方案中，核酸分子可为miRNA、miRNA模拟物或miRNA抑制剂。miRNA是一类长21-25个核苷酸的天然存在、小非编码RNA分子，其在转录后调控基因表达并且是细胞RNAi机制的一部分。miRNA与信使RNA(mRNA)分子部分地互补，并且其主要功能是经由翻译抑制、mRNA裂解和脱腺苷化来下调基因表达。

微RNA抑制剂是可用于使内源性miRNA沉默的拮抗剂。miRNA模拟物(mimetic/mimic)是miRNA激动剂，并且可用于代替内源性miRNA作为功能等效物并且由此上调由所述内源性miRNA影响的途径。

“Piwi相互作用RNA(piRNA)”是最大种类的小非编码RNA分子。piRNA经由与piwi蛋白的相互作用形成RNA-蛋白质复合物。这些piRNA复合物与生殖系细胞中的反转录转座子和其他基因元件(特别是精子生成中者)的表观遗传和转录后基因沉默相关。它们与微RNA(miRNA)具有不同大小(26-31nt而非21-24nt)，缺乏序列保守性，并且具有增加的复杂性。然而，如同其他小RNA，piRNA可视为参与基因沉默，具体来说转座子沉默。大多数piRNA对于转座子序列来说是反义的，从而表明转座子是piRNA靶标。在哺乳动物中，转座子沉默中的piRNA活性在胚胎发育期间似乎最为重要，并且在秀丽隐杆线虫(C.elegan)和人类中，piRNA是精子生成所需。piRNA经由形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)来用于RNA沉默。

d.反义核酸和寡核苷酸

在一些实施方案中，核酸分子可包含反义核酸分子，例如与具有与靶标mRNA互补和/或与双链cDNA的编码链互补的序列者。本发明所涵盖的反义核酸分子可氢键结至整个编码链或仅其一部分(例如蛋白质编码区(或开放阅读框)的全部或一部分)(即经其退火)，可与其互补。反义核酸分子还可对于编码所关注多肽的核苷酸序列中编码链的非编码区的全部或一部分是反义的。非编码区(“5′和3′非翻译区”)是侧接于编码区并且未翻译成氨基酸的5′和3′序列。

在一些实施方案中，核酸分子可包含寡核苷酸，包括反义寡核苷酸和有义寡核苷酸。寡核苷酸是在细胞摄取时可选择性抑制靶蛋白的表达和功能的短单链核酸分子。反义寡核苷酸与靶标mRNA互补和/或与双链cDNA的编码链互补并且通常长度为10-50个核苷酸，优选地长度为15-30个核苷酸，更优选地长度为18-20个核苷酸。例如，反义寡核苷酸可包含18个核苷酸、或19个核苷酸、或20个核苷酸、或21个核苷酸、或22个核苷酸、或23个核苷酸、或24个核苷酸、或25个核苷酸、或26个核苷酸、或27个核苷酸、或28个核苷酸、或29个核苷酸、或30个核苷酸。反义寡核苷酸可与靶标mRNA形成双链体并抑制其翻译或处理，从而抑制蛋白质生物合成。反义寡核苷酸优选地被设计以靶向起始剂密码子、靶向基因的转录起始位点或内含子-外显子接点。出于治疗目的，可使用寡核苷酸选择性阻断与涉及疾病的巨噬细胞相关的靶蛋白表达。

反义寡核苷酸可经由以下各种机制来抑制基因表达：(1)通过RNase H降解靶标RNA/DNA寡核苷酸之间的复合物。所述RNase H是DNA合成所需的普遍性核酶，其用作识别和裂解双链体中的RNA的核酸内切酶。大部分类型的寡核苷酸(但非全部)与mRNA形成引导通过RNase H裂解的复合物；(2)抑制通过核糖体复合物的翻译；(3)在寡核苷酸被设计成针对内含子-外显子接点时竞争mRNA剪接。

e.核酶和DNA酶

在一些实施方案中，核酸分子可为核酶和DNA酶。核酶是保留催化活性的单链RNA分子，其能够序列特异性地裂解RNA分子(参见例如Haselhoff和Gerlach(1988)Nature334：585-591)。它们通过经由反义序列特异性杂交结合至靶标并且通过裂解特定位点处的磷酸二酯主链来发挥作用。它们的结构是基于天然存在的位点特异性、自裂解RNA分子。已基于它们的独特特征阐述五类核酶，即四膜虫I组内含子、RNase P、锤头状核酶、发夹核酶和δ肝炎病毒核酶。锤头状核酶通过水解(如果是3′-5′磷酸二酯键)裂解核苷酸序列U-H(H＝A、C或U)处的RNA。发夹核酶利用核苷酸序列C-U-G作为其裂解位点。在一些实施方案中，核酶可通过靶向所关注细胞中的过表达基因来用于敲除疗法。可基于对应于标志物的cDNA的核苷酸序列来设计对编码对应于本发明所涵盖标志物的多肽的核酸分子具有特异性的核酶。例如，可构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与待裂解的核苷酸序列互补(参见例如美国专利第4,987,071号和第5,116,742号)。或者，可使用编码所关注多肽的mRNA从一组RNA分子来选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化RNA(参见例如Bartel和Szostak(1993)Science 261：1411-1418)。

DNA酶是具有较大生物稳定性的核酶类似物，其中RNA主链由赋予改进的生物稳定性的DNA基序代替。

f.适体

在一些实施方案中，核酸分子可为适体。DNA或RNA适体是可与靶蛋白直接相互作用并且干扰其活性的双链(即DNA适体)或单链(即RNA适体)核酸区段。通常，“适体”是结合至特异性靶分子的寡核苷酸或肽分子。“核酸适体”是已经由多轮体外选择或等效地SELEX(指数富集的配体系统进化)进行工程化以结合至各种分子靶标(例如小分子、蛋白质、核酸和甚至细胞、组织和生物体)的核酸物质。“肽适体”是经选择或工程化以结合特异性靶分子的人工蛋白质。这些蛋白质由显示为蛋白质支架的可变序列的一个或多个肽环组成。它们通常从组合文库分离并且通常随后通过定向突变或数轮可变区诱变和选择进行改进。“Affimer蛋白”(肽适体的进化物)是被工程化以显示肽环的较小高度稳定性蛋白质，其提供用于特异性靶蛋白的高亲和力结合表面。它是低分子量蛋白质(12-14kDa)，并且衍生自胱蛋白的半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族。适体可用于生物技术和治疗应用，这是因为它们提供与常用生物分子、抗体匹敌的分子识别性质。除独特识别外，适体相较于抗体还提供优点，这是因为它们可在试管中完全工程化，易于通过化学合成产生，拥有期望储存性质，并且在治疗应用中几乎不诱发免疫原性。在一些实施方案中，可使用适体来调节涉及疾病的巨噬细胞的靶蛋白的分子功能。在一些情况下，由于对靶蛋白的特异性和亲和力、非免疫原性和药物制剂的稳定性，因此适体在蛋白质抑制方面优于抗体。

g.核酸诱饵

在一些实施方案中，核酸分子可为诱饵DNA或诱饵RNA。核酸诱饵特别可用于靶向转录因子。RNA诱饵是特定设计的小RNA分子，以提供用作翻译活化剂或mRNA稳定元件的蛋白质的替代竞争性结合位点。可使用RNA诱饵来防止mRNA分子的翻译或诱导不稳定性并且最终将其破坏。在一些实例中，可使用对应于关键顺式作用性调控元件的过表达的短RNA分子作为反式活化蛋白的诱饵，由此防止这些反式活化剂结合至其相应顺式作用元件。

在其他实例中，诱饵可为对靶向蛋白具有高结合亲和力的双链核酸分子(例如DNA)，所述靶向蛋白特别是作为调节(增加或降低)巨噬细胞中一种或多种特定基因的转录速率的序列特异性双链DNA结合蛋白的转录因子。

h.核酸嵌合体

在一些实施方案中，核酸分子可为核酸嵌合体。核酸嵌合体是不同类型的经设计以调节巨噬细胞相关靶蛋白的核酸分子的缀合物。例如，可使用结合至细胞表面受体(作为载体)的细胞内化性DNA或RNA适体和对靶蛋白具有特异性的siRNA分子(或miRNA)的缀合物作为一种巨噬细胞调控方式。适体-siRNA嵌合体可改进递送和治疗作用。

i.三重螺旋结构

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可形成三重螺旋结构。例如，可通过靶向与编码多肽的基因的调控区(例如启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列以形成三重螺旋结构来抑制所关注蛋白质的表达，所述三重螺旋结构可防止靶细胞中的基因转录(参见例如Helene(1991)Anticancer Drug Des.6：569-584；Helene(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36；Maher(1992)Bioassays 14：807-815)。这些核酸可经由双重螺旋的大沟中的特异性相互作用结合至DNA双链体。

j.核酸修饰和变体

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可含有一种或多种化学修饰。所述修饰并不损害核酸分子的活性。本领域众所周知的化学修饰能够增加核酸分子的稳定性、可用性和/或细胞摄取。在一个实施方案中，可使用修饰来改进对降解(通过核酸酶)的抗性或改进细胞对核酸分子的摄取。在一些实施方案中，与相应未修饰核酸分子相比，本发明所涵盖的经修饰核酸分子可具有增强的靶标效率。

在一些实施方案中，可优化本发明所涵盖的核酸分子以例如增加表达，改进用于使靶标基因沉默的基因沉默的有效性，等等。在另一个实施方案中，可使用修饰来增加或降低对靶标mRNA和/或互补siRNA链中的互补核苷酸的亲和力。在一些实施方案中，可修饰本发明所涵盖的siRNA以增加避免或调节细胞、组织或生物体中的免疫反应的能力。

在一些实施方案中，可进一步修饰本发明所涵盖的核酸分子以增加膜渗透性和/或向靶器官、组织和细胞的递送。在一个实例中，可修饰核酸分子以增加其向髓系细胞、单核细胞和巨噬细胞的递送。例如，可修饰核酸分子，从而它们特异性结合至表达于所选细胞表面上的受体或抗原，例如通过使反义核酸分子连接到结合至细胞表面受体或抗原的肽或抗体来实现。核酸分子还可修饰为靶向所关注细胞和/或选择性表达于所关注细胞内的载体的一部分。

本发明所涵盖的双链体分子(例如siRNA分子)可包含经修饰有义链、经修饰反义链或经修饰有义链和反义链。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可为α-变旋异构核酸分子。α-变旋异构核酸分子与互补RNA形成特异性双链杂合体，其中与常见α单元不同，链彼此平行(Gaultier等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6625-6641)。反义核酸分子还可包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等人(1987)Nucleic Acids Res.15：6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等人(1987)FEBS Lett.215：327-330)。

本发明所涵盖的核酸分子可在5′端、3′端、5′和3′端和/或内部残基或其任何组合处进行修饰。如本文所述，具有重复核苷酸残基的天然存在核酸具有由糖和磷酸二酯组成的主链以及含氮碱基(通常称为核碱基或简称为碱基)。因此，经化学修饰的核苷酸可包括经修饰核碱基、经修饰糖和/或非磷酸二酯键联(即主链修饰)。在一些实施方案中，修饰是不同种类的本文所述修饰的混合物，例如解锁核单体剂(UNA)、经修饰帽结构、经修饰核苷间键联和或核碱基修饰的组合。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子还可包含至少一种末端修饰或“帽”。

例如，帽可为5′和/或3′帽结构。术语“帽”和“端帽”包括核酸分子的每条链的任一末端处的化学修饰(关于末端核糖核苷酸)；和/或5′端最后两个核苷酸和/或3′端最后两个核苷酸之间的键联处的修饰。帽结构可增加核酸分子对核酸外切酶的抗性并且并不损害与靶标mRNA或细胞机制的分子相互作用。可基于其增加的体外或体内功效来选择这些修饰。

帽可存在于5′末端(5′帽)或3′末端(3′帽)或可存在于两端。在某些实施方案中，5′和/或3′帽独立地选自硫代磷酸酯单磷酸酯、无碱基残基(部分)、硫代磷酸酯键联、4′-硫基核苷酸、碳环核苷酸、二硫代磷酸酯键联、倒转核苷酸或倒转无碱基部分(2′-3′或3′-3′)(例如Invabasic X、Abasic II、无碱基rSpacer/RNA和dSpacer)、二硫代磷酸酯单磷酸酯和甲基膦酸酯部分。在作为帽结构的一部分时，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键联通常位于5′端的两个末端核苷酸与3′端的两个末端核苷酸之间。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子具有至少一个末端硫代磷酸酯单磷酸酯。硫代磷酸酯单磷酸酯可位于核酸分子的每条链的5′端和/或3′端处。在其他实施方案中，核酸分子在有义链和/或反义链的5′末端和3′末端具有末端硫代磷酸酯单磷酸酯。硫代磷酸酯单磷酸酯可通过抑制核酸外切酶的作用来支持较高效力。

在一些实施方案中，5′端处的修饰在有义链中是优选的，并且包含例如5′-丙基胺基团。3′OH末端修饰位于有义链、反义链或有义链和反义链中。3′端修饰包含例如3′-嘌呤霉素(puromycin)、3′-生物素等。

末端修饰还可用于监测分布，并且在这些情形下，待添加的优选基团包括荧光团(例如荧光黄或Alexa染料，例如Alexa 488)。末端修饰还可用于增强摄取，用于此用途的有用修饰包括靶向配体。末端修饰还可用于使寡核苷酸交联至另一部分；可用于此用途的修饰包括丝裂霉素(mitomycin)C、补骨脂素(psoralen)和其衍生物。示例性5′-修饰包括但不限于5′-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5′)；5′-二磷酸酯((HO)

在一些实施方案中，核酸分子末端处的帽可为缀合物，例如5′缀合物。5′端缀合物可抑制5′至3′外切性核酸裂解(例如萘普生(naproxen)；布洛芬(ibuprofen)；小烷基链；芳基；杂环缀合物；经修饰糖(D-核糖、脱氧核糖、葡萄糖等))。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可包括天然核碱基的碱基修饰和/或取代。

术语“未修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在一些实施方案中，核酸分子可包含一个或多个核碱基修饰的核苷酸。其可包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或更多个核碱基修饰的核苷酸。在一些实例中，核酸分子可包含约1％至10％经修饰核苷酸或约10％至50％经修饰核苷酸。经修饰碱基是指通过代替或添加一个或多个原子或基团进行修饰的核苷酸碱基，例如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、黄嘌呤、肌苷和辫苷(queuosine)。可包含针对碱基部分修饰核苷酸的修饰类型的一些实例个别地或组合地包括但不限于烷基化、卤化、硫醇化、胺化、酰胺化或乙酰化碱基。更具体的实例包括例如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫基尿嘧啶、β-D-甘露糖基化辫苷、5′-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫基胞嘧啶、5-甲基-2-硫基尿嘧啶、2-硫基尿嘧啶、4-硫基尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、5-甲基-2-硫基尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤、5-丙炔基尿苷、5-丙炔基胞苷、6-甲基腺嘌呤、6-甲基鸟嘌呤、N，N-二甲基腺嘌呤、2-丙基腺嘌呤、2-丙基鸟嘌呤、2-氨基腺嘌呤、3-甲基尿苷、5-甲基胞苷、5-甲基尿苷和在5位具有修饰的其他核苷酸、5-(2-氨基)丙基尿苷、5-卤基胞苷、5-卤基尿苷、4-乙酰基胞苷、1-甲基腺苷、2-甲基腺苷、3-甲基胞苷、6-甲基尿苷、2-甲基鸟苷、7-甲基鸟苷、2，2-二甲基鸟苷、5-甲基氨基乙基尿苷、5-甲基氧基尿苷、脱氮核苷酸(例如7-脱氮-腺苷)、6-偶氮尿苷、6-偶氮胞苷、6-偶氮胸苷、5-甲基-2-硫基尿苷、其他硫基碱基(例如2-硫基尿苷和4-硫基尿苷和2-硫基胞苷)、二氢尿苷、假尿苷、辫苷、古嘌苷(archaeosine)、萘基和被取代萘基、任何O-和N-烷基化嘌呤和嘧啶(例如N6-甲基腺苷)、5-甲基羰基甲基尿苷、尿苷5-氧基乙酸、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基和经修饰苯基(例如氨基苯酚或2，4，6-三甲氧基苯)、用作G形夹核苷酸的经修饰胞嘧啶、8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-取代尿嘧啶和胸腺嘧啶、氮杂嘧啶、羧基羟基烷基核苷酸、羧基烷基氨基烷基核苷酸和烷基羰基烷基化核苷酸。经修饰核苷酸还包括那些针对糖部分进行修饰的核苷酸以及具有非核糖基糖或其类似物的核苷酸。例如，糖部分可为或基于甘露糖、阿拉伯糖、吡喃葡萄糖、吡喃半乳糖、4′-硫基核糖和其他糖、杂环或碳环。

示例性经修饰核碱基包括但不限于其他合成和天然经修饰核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫基尿嘧啶、2-硫基胸腺嘧啶和2-硫基胞嘧啶、5-卤基尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫基尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫基烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基、特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。在一些特定实施方案中，可用于本发明的核碱基修饰的核苷酸包括但不限于：5-溴-尿苷、5-碘-尿苷、5-甲基-胞苷、核糖-胸苷、2-氨基嘌呤、5-氟-胞苷和5-氟-尿苷、2，6-二氨基嘌呤、4-硫基-尿苷；和5-氨基-烯丙基-尿苷等。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子还可含有具有碱基类似物的核苷酸。

核碱基可为天然存在的非标准碱基，例如CpG岛，可与C、U或A碱基配对的肌苷，硫基尿苷，二氢尿苷，辫苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，水粉蕈素(nubularine)，异鸟嘌呤核苷(isoguanisine)，杀结核菌素(tubercidine)和怀俄苷(wyosine)。其他类似物可包括荧光团(例如罗丹明、荧光黄)和其他荧光碱基类似物，例如2-AP(2-氨基嘌呤)、3-MI、6-MI、6-MAP、吡咯并-dC、吡咯并-dC的经修饰和改进的衍生物、呋喃修饰的碱基和三环胞嘧啶家族(例如1，3-二氮杂-2-氧代吩噻嗪(tC)；tC的氧代-同源物(tC

在一些实施方案中，本发明所涵盖的经修饰核酸分子可包含人工核酸类似物。

术语“人工核酸类似物”或简称“核酸类似物”是指在结构上类似于天然存在的DNA或RNA的化合物。类似物的磷酸盐主链、糖或核碱基(即G、C、T、U和A)中的任一者可有所改变。在一些实施方案中，经修饰核苷酸可为解锁核单体剂(UNA)。UNA包括任何适于并入寡聚或聚合组合物(例如寡核苷酸或多核苷酸)中并且参照核苷或核苷酸具有解锁或非环状糖部分的单体单元。在这些UNA包括于较大寡聚物或聚合物中的情形下，这些较大寡聚物或聚合物(例如寡核苷酸)也可称为UNA寡聚物或UNA聚合物或UNA寡核苷酸。在UNA包括于标准核苷酸中的情形下，这些变体核苷酸称为UNA核苷酸。在UNA包括于标准核苷中的情形下，这种变体核苷称为UNA核苷。可使用UNA代替寡核苷酸中的核苷或核苷酸。在这种情形下，UNA(不论是单体还是含有单体的寡聚物)在本领域通称为“解锁核酸”。在本文中称为解锁核酸时，本领域技术人员应理解，本发明人是提及UNA。根据本发明，UNA并非天然存在的核单体剂。在一个实施方案中，核酸分子中的一个或多个核苷酸可被一个或多个解锁核酸/核单体剂(UNA)部分(包括阐述于例如PCT公开WO 2015/148580中者)代替。UNA寡聚物可为由UNA单体构成的链以及各种可基于天然存在的核苷的核苷酸或经修饰核苷酸。已报道，UNA寡聚物的脱靶效应相比于缺乏修饰的对应体寡核苷酸有所降低。可用于本发明的其他UNA修饰和应用包括任何公开于以下文献中者：美国公开US20150232851、美国专利US9051570、美国公开US20150232849、欧洲公开EP2162538、美国公开US20150239926、美国公开US20150239834、美国公开US20150141678、国际公开WO2015074085和/或欧洲公开EP2370577。

在一些实施方案中，具有主链类似物的人工核酸类似物包括但不限于双环核苷酸类似物，例如锁核酸(LNA)、桥核酸(BNA)、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和吗啉基。包含这些主链类似物的经修饰寡核苷酸尽管具有不同主链糖或在PNA的情形下使用氨基酸残基代替磷酸核糖，但根据沃森和克里克配对(Watson and Crick pairing)仍结合至RNA或DNA，并且对核酸酶活性具有免疫性。LNA阐述于例如美国专利第6,268,490号、第6,316,198号、第6,403,566号、第6,770,748号、第6,998,484号、第6,670,461号和第7,034,133号；PCT公开第99/14226号中。可并入本发明所涵盖的核酸分子中的其他合适锁核苷酸包括阐述于美国专利第6,403,566号、第6,833,361号和第7,060,809号中者。其他锁核酸衍生物(例如D-氧基-LNA、α-L-氧基-LNA、β-D-氨基-LNA、α-L-氨基-LNA、硫基-LNA、α-L-硫基-LNA、硒基-LNA、亚甲基-LNA和β-D-ENA)可并入本发明所涵盖的核酸分子中。那些阐述于美国专利第7,569,575号、第8,084,458号和第8,429,390号中的LNA衍生物也可并入核酸分子中。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可包含一个或多个糖修饰的核苷酸。

其可包含约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10个或更多个糖修饰的核苷酸。可用于本发明中的糖修饰的核苷酸包括但不限于：2′-氟修饰的核糖核苷酸、2′-OMe修饰的核糖核苷酸、2′-脱氧核糖核苷酸、2′-氨基修饰的核糖核苷酸和2′-硫基修饰的核糖核苷酸。经糖修饰的核苷酸可为例如2′-氟-胞苷、2′-氟-尿苷、2′-氟-腺苷、2′-氟-鸟苷、2′-氨基-胞苷、2′-氨基-尿苷、2′-氨基-腺苷、2′-氨基-鸟苷或2′-氨基-丁酰基-芘-尿苷。除主链糖的2′修饰外，糖基团可在其他位置被修饰。糖基团可在糖的同一碳处包含两种不同修饰。糖基团还可含有一个或多个与核糖中的相应碳拥有相反立体化学构型的碳。因此，核酸分子可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。核苷酸可在糖上的1′位置具有α键联，例如α-核苷。核苷酸还可在4′位具有相反构型，例如，C5′和H4′或代替其的取代基彼此互换。在C5′和H4′或代替其的取代基彼此互换，则所述糖被称为在4′位被修饰。

本发明所涵盖的核酸分子还可包括无碱基糖，所述无碱基糖在C-1′处缺乏核碱基或在C1′处具有其他化学基团代替核碱基(参见例如美国专利第5,998,203号)。这些无碱基糖还可进一步在一个或多个组分糖原子处含有修饰。在其他实施方案中，核酸分子还可含有一种或多种作为L异构体的糖。在一个方面，糖基团修饰还可包括使用硫、任选地被取代的氮或CH

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子的核苷间键联基团是被修饰的。

核苷间键联修饰可位于有义链内、反义链内、或有义链和反义链内。术语“核苷间键联基团”意在是指能够使两个核碱基(例如DNA残基之间、RNA残基之间、DNA和RNA残基以及核苷酸类似物之间、两个非LNA残基之间、非LNA残基与LNA残基之间，以及两个LNA残基之间，等等)以共价方式偶联至一起的基团。天然标准键联是由-O-P(O)

在一些实施方案中，键联的修饰还包含代替或修饰一个磷酸酯中的至少一个氧原子。在一些方面，可修饰或代替磷酸酯接头中的一或两个非连接性磷酸酯氧。经修饰磷酸酯可包括但不限于膦酰基甲酸酯(其中一个非连接性氧原子已被羧酸代替/修饰)(例如磷酸乙酸酯、膦酰基甲酸、氨基磷酸酯)；硫代磷酸酯(-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)

在本发明所涵盖的背景中，优选的实例包括磷酸酯键联、磷酸二酯(PO)键联和硫代磷酸酯(PS)键联。二硫代磷酸酯的两个非桥接氧被硫代替。二硫代磷酸酯中的磷中心是非手性的，这可防止形成寡核苷酸非对映异构体。因此，尽管不希望受限于理论，但对两个非连接性氧的修饰(其消除了手性中心，例如二硫代磷酸酯形成)可为期望的，其中它们不能产生非对映异构体混合物。因此，非连接性氧可独立地为O、S、Se、B、C、H、N或OR(R是烷基或芳基)中的任一者。在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可含有一个或多个硫代磷酸酯键联。例如，多核苷酸可部分地为硫代磷酸酯连接的，例如，硫代磷酸酯键联可与磷酸二酯键联交替。在某些实施方案中，寡核苷酸完全是硫代磷酸酯连接的。在其他实施方案中，寡核苷酸具有一至七个、一至五个或一至三个磷酸二酯键联。已使用硫代磷酸酯键联来促使寡核苷酸更加抵抗核酸酶裂解。除正常5′-3′键联外，经修饰寡核苷酸可具有5′-2′键联和具有反极性者(其中核苷单元的毗邻对的连接由3′-5′变为5′-3′或由2′-5′变为5′-2′)。教导核苷间键联基团的修饰的代表性美国专利包括美国专利第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,306号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号、第5,378,825号、第5,697,248号和第7,368,439号。教导核苷间键联修饰的其他参考文献包括Mesmaeker等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5：343-355；Freier和Altmann(1997)Nucl.Acids Res.25：4429-4443；和Micklefield(2001)Curr.Med.Chem.8：1157-1179。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可包含一个或多个主链修饰的核苷酸。

主链修饰的核苷酸位于有义链内、反义链内、或有义链和反义链内。如本文所用的正常“主链”是指DNA或RNA分子中的重复交替糖-磷酸酯序列。在天然存在的DNA和RNA分子中，核酸分子的主链包括在3′-羟基和5′-羟基处接合至酯键(即PO键联)中的磷酸酯基团的脱氧核糖/核糖。天然磷酸二酯键可被酰胺键代替，但两个糖单元之间的4个原子得以保留。这些酰胺修饰可增加与miRNA补体形成的双链体的热动力学稳定性(参见例如Mesmaeker等人(1997)PureAppl.Chem.3：437-440)。在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可在序列中含有针对非锁核苷酸的化学修饰，例如针对2′羟基的2′修饰。例如，在siRNA分子中并入2′位修饰的核苷酸可增加寡核苷酸对核酸酶的抗性和其与互补靶标的热稳定性。2′位的各种修饰可独立地选自提供增加的核酸酶抗性并且并不损害与靶标或细胞机构的分子相互作用。可基于其增加的体外或体内效力来选择这些修饰。在一些实施方案中，2′修饰可独立地选自多种不同的“氧基”或“脱氧”取代基。“氧基”-2′羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(例如O甲基、R＝H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖；聚乙二醇(PEG)、O(CH

在某些实施方案中，非锁核苷酸的基本上所有或所有核苷酸2′位可被修饰。例如，2′修饰可各自独立地选自O-甲基和氟。在示例性实施方案中，嘌呤核苷酸各自具有2′O-甲基并且吡咯烷核苷酸各自具有2′-F。根据本发明，2′位修饰还可包括小烃取代基。烃取代基包括烷基、烯基、炔基和烷氧基烷基，其中烷基(包括烷氧基的烷基部分)、烯基和炔基可被取代或未被取代。烷基、烯基和炔基可为C1至C10烷基、烯基或炔基，例如C1、C2或C3。烃取代基可包括一个或两个或三个可独立地选自N、O和/或S的非碳原子。2′修饰还可包括呈O-烷基、O-烯基和O-炔基形式的烷基、烯基和炔基。本发明的示例性2′修饰包括2′-H、2′-O-烷基(C1-3烷基，例如2′O-甲基或2′OEt)、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2′-O-DMAEOE)、2′-O-N-甲基乙酰胺基(2′-O-NMA)或孪位2′-OMe/2′F取代。在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子在非锁核苷酸中含有至少一个修饰为2′O-甲氧基(2′-OMe)的2′位。寡核苷酸可含有1至约5个2′-O-甲氧基(2′-OMe)修饰的核苷酸或1至约3个2′-O-甲氧基(2′-OMe)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，miR-124模拟物中的所有核苷酸都含有2′-O-甲氧基(2′-OMe)修饰。不同类型的2′位修饰的其他示例性组合可含有至少一个2′-卤基修饰(例如代替2′羟基)，例如2′-氟、2′-氯、2′-溴和2′-碘。

在一些实施方案中，可构建一条或所述条核酸分子链的主链，其中磷酸酯接头和核糖被抗核酸酶性核苷或核苷酸替代物代替。尽管不希望受限于理论，据认为，不存在重复性带电主链可减弱与识别聚阴离子的蛋白质(例如核酸酶)的结合。作为非限制性实例，这些核苷酸替代物包括吗啉基、环丁基、吡咯烷、肽核酸(PNA)、氨基乙基甘氨酰基PNA(Aegina)和主链延长的嘧啶PNA(bepPNA)核苷替代物(例如美国专利第5,359,044号、第5,519,134号、第5,142,047号和第5,235,033号；Bioorganic&Medicinal Chemistry(1996)，4：5-23)。用于代替糖-磷酸酯主链的替代物涉及PNA替代物(肽核酸)。术语“肽核酸(PNA)”是类似于DNA和RNA的化学合成的聚合物，其中主链是由通过肽键连接的重复N-(2-氨基乙基)-甘氨酸(AEG)单元构成(Nielsen等人(1991)Science 254：1497-1500)。具有PNA的合成寡核苷酸在结合至互补DNA或RNA时具有较高结合强度和较大特异性，其中PNA/DNA碱基错配相较于类似DNA/RNA双链体更为合意。PNA不易被核酸酶或蛋白酶识别，从而使得它们可抵抗酶降解。PNA也在宽pH范围内较为稳定。在多种研究中已表明，PNA可用于反义和抗基因疗法。PNA可抵抗DNase和蛋白酶并且可进一步修饰以增加细胞渗透，等等。

可使用PNA作为通过例如诱导转录或翻译停滞或抑制复制来序列特异性调节基因表达的反义或抗基因剂。PNA也可用于例如通过例如PNA定向PCR箝位来分析基因中的单一碱基对突变；在与其他酶(例如S1核酸酶)组合使用时用作人工限制酶(Hyrup等人(1996)Bioorg.Med.Chem.4：5-23；或用作DNA序列和杂交的探针或引物(Perry-O′Keefe等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：14670-14675)。

在另一个实施方案中，可通过以下方式来修饰PNA以例如增强其稳定性或细胞摄取：通过使亲脂性或其他辅助基团附接至PNA，通过形成PNA-DNA嵌合体，或通过使用脂质体或本领域已知的其他药物递送技术。例如，可生成可组合PNA和DNA的有利性质的PNA-DNA嵌合体。这些嵌合体容许DNA识别酶(例如RNASE H和DNA聚合酶)与DNA部分相互作用，而PNA部分将提供高结合亲和力和特异性。可使用针对碱基堆叠、核碱基之间的键数量和定向进行选择的适当长度的接头来连接PNA-DNA嵌合体(Hyrup等人(1996)Bioorg.Med.Chem.4：5-23)。可如以下文献中所述来合成PNA-DNA嵌合体：Hyrup等人(1996)Bioorg.Med.Chem.4：5-23和Finn等人(1996)Nucleic Acids Res.24：3357-3363。例如，可在固体载体上使用标准亚磷酰胺偶联化学和经修饰核苷类似物来合成DNA链。可使用例如5′-(4-甲氧基三苯甲基)氨基-5′-脱氧-胸苷亚磷酰胺等化合物作为PNA与DNA的5′端之间的连接(Mag等人(1989)Nucleic Acids Res.17：5973-5988)。然后以逐步方式偶联PNA单体以产生具有5′PNA区段和3′DNA区段的嵌合分子(Finn等人(1996)Nucleic Acids Res.24：3357-3363)。或者，可合成具有5′DNA区段和3′PNA区段的嵌合分子(Peterser等人(1975)BioorganicMed.Chem.Lett.5：1119-11124)。

本发明所涵盖的核酸分子还可含有其他修饰，例如错配、膨出部或交联。类似地，其还可包括其他缀合物，例如接头、异功能交联剂、树枝状聚合物、纳米颗粒、肽、有机化合物(例如荧光染料)和/或光可裂解化合物。在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可包含如本文所述的两种或更多种修饰的任何组合。核酸序列可独立地包含关于一个或多个糖部分、一个或多个核苷间键联和/或一个或多个核碱基的一个或多个修饰。如本文所公开，可使用化学修饰的任何组合来修饰这些序列。

在一些实施方案中，核酸分子是siRNA，其包含其中有义链和反义链包含一个或多个错配(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个错配)的核酸序列。术语“错配”是指由非互补碱基组成的碱基对，例如非正常互补G：C、A：T或A：U碱基对。在一些实施方案中，本发明所涵盖siRNA分子的反义链和靶标mRNA序列可包含一个或多个错配，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个错配。在一些情况下，错配可参照反义链位于裂解位点下游。更优选地，错配可存在于距反义链的3′端1-6个核苷酸内。在另一个实施方案中，本发明所涵盖的siRNA分子在双链体siRNA中包含膨出部，例如一个或多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)未配对碱基。优选地，膨出部可位于有义链中。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的siRNA分子包含一个或多个(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)交联，例如其中有义链交联至siRNA双链体的反义链的交联。可用于本发明的交联剂是本领域通常已知者，包括但不限于补骨脂素、丝裂霉素C、顺铂(cisplatin)、氯乙基亚硝基脲等。优选地，交联参照反义链存在于裂解位点下游，并且更优选地，交联存在于有义链的5′端处。根据本发明，还包括siRNA衍生物，例如具有单一交联(例如补骨脂素交联)的siRNA衍生物、具有光可裂解生物素(例如光可裂解生物素)的siRNA、肽(例如Tat肽)、纳米颗粒、肽模拟物、有机化合物(例如染料，例如荧光染料)或树枝状聚合物。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的核酸分子可包括其他附加基团，例如肽(例如用于靶向体内宿主细胞受体)或促进传输穿过细胞膜(参见例如Letsinger等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6553-6556；Lemaitre等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：648-652；PCT专利公开第WO 88/09810号)或血脑屏障(参见例如PCT公开第WO 89/10134号)的药剂。另外，可用杂交触发性裂解剂(参见例如Krol等人(1988)BioTechniques 6：958-976)或嵌入剂(参见例如Zon(1988)Pharm.Res.5：539-549)修饰核酸分子。

k.载体和其他核酸媒介物

根据本发明，可通过本领域已知的任何方法(例如直接合成和基因重组技术)来产生核酸分子和其变体。核酸分子可以任何形式存在，例如纯核酸分子、质粒、DNA载体、RNA载体、病毒载体和颗粒。术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。本发明所涵盖的载体还可用于将经包装多核苷酸递送至细胞、局部组织位点或受试者。

一类载体为“质粒”，其是指其他核酸区段可连接至其中的环形双链DNA环。另一类载体为“病毒载体”，其中其他DNA区段可连接至病毒基因组中。病毒核酸递送载体可为任何种类，包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和其变体。病毒载体技术是众所周知的并且阐述于Sambrook等人(2012，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory(第4版)，New York)中。

某些载体能够在已引入其的宿主细胞中进行自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞中时整合至宿主细胞的基因组中，并由此随宿主基因组一同复制。此外，某些载体即表达载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。一般来说，在重组DNA技术中可用的表达载体通常呈质粒(载体)形式。然而，本发明旨在包括提供等效功能的这些其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。

本发明所涵盖的重组表达载体包含本发明所涵盖的核酸，所述核酸呈适于在宿主细胞中表达核酸的形式。这意味着，重组表达载体包括一个或多个基于有待用于表达的宿主细胞所选择的调控序列，所述调控序列可操作地连接至待表达的核酸序列。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在是指所关注核苷酸序列以容许表达核苷酸序列(例如在体外转录/翻译系统中或在宿主细胞中(在将载体引入宿主细胞中时))的方式连接至调控序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如多聚腺苷酸化信号)。所述调控序列阐述于例如Goeddel，Methods in Enzymology：Gene ExpressionTechnology，第185卷，Academic Press，San Diego，CA(1991)中。调控序列包括在许多类型的宿主细胞中引导核苷酸序列的组成型表达者和仅在某些宿主细胞中引导核苷酸序列的表达者(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员应了解，表达载体的设计可取决于例如以下因素：待转化宿主细胞的选择、期望蛋白质表达水平等。可将本发明所涵盖的表达载体引入宿主细胞中以由此产生由如本文所述的核酸编码的蛋白质或肽(包括融合蛋白或肽)。例如，一般来说，载体含有在至少一种生物体中发挥作用的复制起点、启动子序列和合适的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选标志物(例如耐药基因)。载体可包含可操作地连接至本发明所涵盖的多核苷酸的天然或非天然启动子。所选启动子可为较强、较弱、组成型、可诱导型、组织特异性、发育阶段特异性和/或生物体特异性的。在一些实施方案中，载体可包含对引入载体的宿主细胞类型具有特异性的调控序列，例如增强子、转录和翻译起始和终止密码子。

用于本发明的重组表达载体可被设计用于在原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞)中表达对应于本发明所涵盖生物标志物的多肽。合适的宿主细胞进一步由Goeddel论述(同上)。或者，可在体外例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶来转录和翻译重组表达载体。

原核生物中的蛋白质表达最通常是在大肠杆菌中使用含有引导表达融合蛋白或非融合蛋白的组成型或可诱导型启动子的载体来实施。融合载体向其中所编码的蛋白质、通常向重组蛋白的氨基末端添加了众多氨基酸。这些融合载体通常用于以下三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和3)通过用作亲和力纯化中的配体来帮助纯化重组蛋白。通常，在融合表达载体中，将蛋白水解裂解位点引入融合部分与重组蛋白的接点处以使得能够在纯化融合蛋白后分离重组蛋白与融合部分。这类酶和其同族识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其分别使谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白质A融合至靶标重组蛋白。

合适的可诱导型非融合大肠杆菌表达载体的代表性、非限制性实例包括pTrc(Amann等人(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等人(1991)Meth.Enzymol.185：60-89)。来自pTrc载体的靶标生物标志物核酸表达依赖于来自杂合trp-lac融合启动子的宿主RNA聚合酶转录。来自pET 11d载体的靶标生物标志物核酸表达依赖于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的来自T7gn10-lac融合启动子的转录。这种病毒聚合酶是由来自驻留型原噬菌体的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)所供应，所述驻留型原噬菌体含有在lacUV 5启动子的转录控制下的T7 gn1基因。

最大化大肠杆菌中的重组蛋白表达的一种策略是在以蛋白水解方式裂解重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达蛋白质(Gottesman(1990)Meth.Enzymol.185：119-128)。另一种策略是改变待插入表达载体中的核酸的核酸序列，从而每一氨基酸的个别密码子是优先用于大肠杆菌中者(Wada等人(1992)Nucleic Acids Res.20：2111-2118)。本发明所涵盖核酸序列的这种改变可通过标准DNA合成技术来实施。

在一些实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于酿酒酵母(S.cerevisiae)表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari等人(1987)EMBO J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，San Diego，CA)。

或者，表达载体是杆状病毒表达载体。可用于在经培养昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。

在一些实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明所涵盖的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBO J.6：187-195)。在用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常是由病毒调控元件来提供。例如，常用启动子是源自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿病毒40。关于用于原核细胞和真核细胞的其他合适的表达系统，参见Sambrook等人，同上的第16和17章。

在一些实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够引导核酸优先表达于特定细胞类型中(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。本领域已知组织特异性调控元件。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等人(1987)Genes Dev.1：268-277)，淋巴样特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等人(1983)Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell 33：741-748)，神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：5473-5477)，胰腺特异性启动子(Edlund等人(1985)Science 230：912-916)和乳腺特异性启动子(例如乳清启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲申请公开第264,166号)。还涵盖发育调控性启动子，例如鼠类hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Camper和Tilghman(1989)GenesDev.3：537-546)。

本发明还提供用于表达反义核酸的重组表达载体，如下文进一步所述。例如，可以容许表达(通过转录DNA分子)RNA分子的方式使DNA分子可操作地连接至调控序列，所述RNA分子针对编码本发明所涵盖的多肽的mRNA是反义的。可选择可操作地连接至以反义定向克隆的核酸的调控序列来引导各种细胞类型中反义RNA分子的连续表达，例如，可选择引导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的病毒启动子和/或增强子或调控序列。反义表达载体可呈重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸是在高效调控区的控制下产生的，所述高效调控区的活性可由引入载体的细胞类型来决定。关于使用反义基因的基因表达的调控的论述(参见Weintraub等人(1986)Trends Genet.1(1))。

在一些实施方案中，逆转录病毒载体可用于本发明中。逆转录病毒的命名是因为在整合至宿主细胞基因组中之前需要将病毒RNA基因组逆转录成DNA。因此，逆转录病毒载体的最重要特征是将其基因物质永久性整合至靶标/宿主细胞的基因组中。用于核酸递送的最常用逆转录病毒载体是慢病毒媒介物/颗粒。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1和HIV-2、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、珍布拉那病病毒(Jembrana Disease Virus，JDv)、马感染性贫血病毒(EIAV)、马感染性贫血病毒、维斯那-梅迪病毒(visna-maedi)和山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。

通常，构成基因递送媒介物的慢病毒颗粒自身是复制缺陷性，从而其不能复制于宿主细胞中并且可感染仅一种细胞(也称为“自我不活化”)。慢病毒能够通过经由完整宿主核包膜的进入机制感染分裂细胞和非分裂细胞(Naldini等人(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9：457-463)。通过多次减毒HIV致病性基因来生成重组慢病毒媒介物/颗粒，例如，缺失基因Env、Vif、Vpr、Vpu、Nef和Tat，从而使得载体在生物上安全。相应地，源自例如HIV-1/HIV-2的慢病毒媒介物可介导转基因至非分裂细胞的有效递送、整合和长期表达。术语“重组”是指含有慢病毒序列和非慢病毒逆转录病毒序列的载体或其他核酸。可通过在产生细胞(例如HEK293T细胞、293G细胞、STAR细胞和其他病毒表达细胞系)中共表达病毒包装元件和载体基因组本身来生成慢病毒颗粒。这些元件通常提供于三个(在第二代慢病毒系统中)或4个单独质粒(在第三代慢病毒系统中)中。使用编码慢病毒组分(包括病毒的核心(即结构蛋白)和酶促组分以及包膜蛋白(称为包装系统))的质粒和编码待转移至靶细胞、媒介物本身(也称为转移载体)中的基因组(包括外来转基因)的质粒来共转染生产细胞。

重组慢病毒载体的包膜蛋白可为来自其他病毒的异源性包膜蛋白，例如水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus)的G蛋白(VSV G)或杆状病毒gp64包膜蛋白。VSV-G糖蛋白可尤其选自归类于水疱病毒属中的物种：卡拉加斯病毒(Carajas virus)(CJSV)、金迪普拉病毒(Chandipura virus)(CHPV)、科卡尔病毒(Cocal virus)(COCV)、伊斯法罕病毒(Isfahan virus)(ISFV)、马拉巴病毒(Maraba virus)(MARAV)、帛黎病毒(Piry virus)(PIRYV)、阿拉戈斯水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Alagoas virus)(VSAV)、印第安纳水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis Indiana virus)(VSIV)和新泽西水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis New Jersey virus)(vSNJV)；和/或临时性分类于水疱病毒属中的菌株，如草鱼弹状病毒(Grass carp rhabdovirus)、比安157575弹状病毒(BeAn157575 virus)(BeAn 157575)、博特克病毒(Boteke virus)(BTKV)、卡尔查基病毒(Calchaqui virus)(CQIV)、美洲鳗病毒(Eel virus American)(EVA)、格雷洛奇病毒(GrayLodge virus)(GLOV)、朱罗讷病毒(Jurona virus)(JURY)、克拉马斯病毒(Klamath virus)(KLAV)、克瓦塔病毒(Kwatta virus)(KWAV)、拉霍亚病毒(La Joya virus)(LJV)、马尔佩斯泉病毒(Malpais Spring virus)(MSPV)、埃尔岗蝙蝠病毒(Mount Elgon bat virus)(MEBV)、佩里内特病毒(Perinet virus)(PERV)、梭子鱼鱼苗弹状病毒(Pike fryrhabdovirus)(PFRV)、波登病毒(Porton virus)(PORV)、拉迪病毒(Radi virus)(RADIV)、鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus)(SVCV)、图帕伊阿病毒(Tupaiavirus)(TUPV)、溃疡病弹状病毒(Ulcerative disease rhabdovirus)(UDRV)和尤格波格丹诺夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus)(YBV)。gp64或其他杆状病毒包膜蛋白可源自苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcMNPV)、芹菜夜蛾(Anagraphafalcifera)核型多角体病毒、家蚕(Bombyx mori)核型多角体病毒、云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)核型多角体病毒、黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)单核衣壳核型多角体病毒、苹浅褐卷蛾(Epiphyas postvittana)核型多角体病毒、美国白蛾(Hyphantria cunea)核型多角体病毒、大蜡螟(Galleria mellonella)核型多角体病毒、佐立病毒(Dhori virus)、索戈托病毒(Thogoto virus)、柞蚕(Antheraea pemyi)核型多角体病毒或贝特肯病毒(Batken virus)。

生成重组慢病毒颗粒的方法在本领域已论述于例如美国专利第8,846,385号、第7,745,179号、第7,629,153号、第7,575,924号、第7,179,903号和第6,808,905号中。

所周慢病毒载体可选自(但不限于)pLVX、pLenti、pLenti6、pLJM1、FUGW、pWPXL、pWPI、pLenti CMV puro DEST、pLJM1-EGFP、pULTRA、pInducer20、pHIV-EGFP、pCW57.1、pTRPE、pELPS、pRRL和pLionII。还可使用本领域已知的慢病毒媒介物(参见美国专利第9,260,725号、第9,068,199号、第9,023,646号、第8,900,858号、第8,748,169号、第8,709,799号、第8,420,104号、第8,329,462号、第8,076,106号、第6,013,516号和第5,994,136号；PCT公开第WO 2012079000号)。

其他元件可包括于重组慢病毒颗粒中，包括在5′或3′末端的逆转录病毒LTR(长末端重复)、逆转录病毒输出元件、任选地慢病毒逆向反应元件(RRE)、启动子或其活性部分和基因座控制区(LCR)或其活性部分。其他元件包括中央多聚嘌呤区(cPPT)序列(用以改进非分裂细胞中的转导效率)、旱獭肝炎病毒(Woodchuck Hepatitis Virus，WHP)转录后调控元件(WPRE)(其增强转基因表达并增加效价)。效应模块连接至载体。除基于复杂HIV-1/2的慢病毒载体外，基于简单γ-逆转录病毒的逆转录病毒载体已广泛用于递送治疗性核酸并且在临床上证实为能够转导宽范围细胞类型的最有效并且强力的核酸递送系统之一。γ逆转录病毒的示例性物种包括鼠类白血病病毒(MLV)和猫白血病病毒(FeLV)。源自哺乳动物γ-逆转录病毒(例如鼠类白血病病毒(MLV))的γ-逆转录病毒载体可为重组的。γ逆转录病毒的MLV家族包括嗜亲性、双嗜性、嗜异性和多嗜性亚家族。嗜亲性病毒仅能够使用mCAT-1受体感染鼠类细胞。嗜亲性病毒的实例是莫罗尼(Moloney)MLV和AKV。双嗜性病毒经由Pit-2受体感染鼠类、人类和其他物种。双嗜性病毒的一个实例是4070A病毒。嗜异性和多嗜性病毒利用相同(Xpr1)受体，但其物种嗜性有所不同。嗜异性病毒(例如NZB-9-1)感染人类和其他物种，但不感染鼠类物种，而多嗜性病毒(例如病灶形成病毒(MCF))感染鼠类、人类和其他物种。

可在包装细胞中通过使用若干质粒共转染细胞来产生γ-逆转录病毒载体，所述质粒包括编码逆转录病毒结构和酶促(gag-pol)聚蛋白者、编码包膜(env)蛋白者和编码包含多核苷酸(其编码本发明所涵盖的组合物并且待包装至新形成病毒颗粒中)的载体mRNA者。可使用来自其他病毒的包膜蛋白使重组γ-逆转录病毒载体变为假型。将包膜糖蛋白并入病毒颗粒的外脂质层中，这可增加/改变细胞嗜性。示例性包膜蛋白包括长臂猿白血病病毒包膜蛋白(GALV)或水泡性口炎病毒G蛋白(vSV-G)，或猿内源性逆转录病毒包膜蛋白，或麻疹病毒H和F蛋白质，或人类免疫缺陷病毒gp120包膜蛋白，或科卡尔水泡病毒包膜蛋白(参见例如美国公开第2012/164118号)。在其他实施方案中，包膜糖蛋白可经基因修饰以将靶向/结合配体并入γ-逆转录病毒载体中，结合配体包括但不限于肽配体、单链抗体和生长因子(Waehler等人(2007)Nat.Rev.Genet.8：573-587)。这些工程化的糖蛋白可使载体再靶向表达其相应靶标部分的细胞。在其他方面，可引入“分子桥”以将载体引入特异性细胞中。分子桥具有双重特异性：一端可识别病毒糖蛋白，并且另一端可结合至靶细胞上的分子决定子。这样的分子桥(例如配体-受体、抗生物素蛋白-生物素、化学缀合物、单克隆抗体和工程化融合蛋白)可引导病毒载体附接至用于转导的靶细胞(Yang等人(2008)Biotechnol.Bioeng.101：357-368；Maetzig等人(2011)Viruses 3：677-713)。重组γ-逆转录病毒载体可为自我不活化(SIN)γ逆转录病毒载体。所述载体是复制缺陷性。SIN载体可在最初包含增强子/启动子活性的3′U3区域内带有缺失。此外，5′U3区域可用源自巨细胞病毒或RSV的强启动子(在包装细胞系时需要)或所选内部启动子和/或增强子元件代替。可根据本发明所涵盖的特定目的所需的基因表达的具体需求来选择内部启动子。

类似地，可使用重组腺相关病毒(rAAV)载体来包装和递送本发明所涵盖的核酸分子。这些载体或病毒颗粒可被设计以利用任何已知血清型衣壳或血清型衣壳的组合。血清型衣壳可包括来自任何所鉴定AAV血清型和其变体的衣壳，例如AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAVrh10(参见例如美国专利公开20030138772)或其变体。AAV载体不仅包括单链载体，并且还包括自我互补性AAV载体(scAAV)。scAAV载体含有一起退火以形成双链载体基因组的DNA。通过跳过第二链合成，scAAV容许快速表达于细胞中。可通过本领域标准方法(例如通过三重转染)在sf9昆虫细胞中或在人类细胞(例如HEK293细胞)的细胞培养悬浮液中来制造rAAV载体。本发明所涵盖的核酸分子可编码于一个或多个待包装于AAV衣壳中的病毒基因组中。除至少一或两个ITR(倒转末端重复序列)外，这些载体或病毒基因组还可包括从载体或病毒基因组表达所需的某些调控元件。这些调控元件是本领域众所周知的并且包括例如启动子、内含子、间隔子、填充序列等。

另外，核酸分子的非病毒递送系统是本领域众所周知的。术语“非病毒载体”共同地是指在不使用病毒颗粒下将本发明所涵盖的核酸分子转移至所关注细胞中的任何媒介物。这些非病毒递送载体的代表性实例是涂覆核酸的载体，所述涂覆基于载体上的阳离子位点与带负电核酸构成基因上的阴离子位点之间的电相互作用。用于递送的一些示例性非病毒载体可包括裸核酸递送系统、聚合递送系统和脂质体递送系统。阳离子聚合物和阳离子脂质可用于核酸递送，这是因为它们可容易地与阴离子核苷酸复合。常用聚合物可包括但不限于聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸、壳聚糖和树枝状聚合物。阳离子脂质可包括但不限于单价阳离子脂质、多价阳离子脂质、含胍脂质、胆固醇衍生物化合物、阳离子聚合物：聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚-1-赖氨酸)(PLL)、鱼精蛋白(protamine)、其他阳离子聚合物和脂质-聚合物杂合体。

可经由常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。如本文所用，术语“转化”和“转染”意在是指用于将外来核酸引入宿主细胞中的各种本领域公认技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(同上)和其他实验室手册中。

对于哺乳动物细胞的稳定转染来说，众所周知，取决于所用的表达载体和转染技术，仅小部分的细胞可将外来DNA整合至其基因组中。为鉴定和选择这些整合体，通常将编码可选标志物(例如对于抗生素抗性来说，如neo、DHFR、Gln合酶、ADA等)的基因与所关注基因一起引入宿主细胞中。优选的可选标志物包括赋予药物(例如G418、潮霉素(hygromycin)和甲氨蝶呤(methotrexate))抗性者。可通过药物选择来鉴定用所引入核酸稳定转染的细胞(例如，并入可选标志物基因的细胞将存活，而其他细胞会死亡)。

因此，本发明涵盖已引入本发明所涵盖的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”可在本文中互换使用。应理解，这些术语不仅是指特定受试者细胞，而且还指这种细胞的后代或潜在后代。由于突变或环境影响可使后续各代发生某些改变，因此，这种后代实际上可能与母细胞不同但却仍包括于本文所用术语的范围内。宿主细胞可为任何原核细胞(例如大肠杆菌细胞)或真核细胞(例如昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞)。

2.

本发明所涵盖的另一方面涉及基于氨基酸的药剂的用途。所述药剂可包括但不限于抗体、融合蛋白、合成多肽和肽以及其片段(例如生物活性片段)。还提供了编码这些基于氨基酸的化合物的多核苷酸。

本发明的基于氨基酸的药剂(例如抗体和重组蛋白)可以以下形式存在：全多肽、多个多肽或多肽片段(其可独立地由一个或多个核酸编码)、多个核酸、核酸片段或上文所提及物质中的任一者的变体。

术语“多肽”是指最通常由肽键连接至一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，所述术语是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。因此，术语多肽相互性包括术语“肽”和“蛋白质”。术语“融合蛋白”是指包含至少两个来自不同来源的氨基酸序列的融合多肽分子，其中组分氨基酸序列通过肽键直接或经由一个或多个肽接头彼此连接。在一些情况下，所编码多肽小于约50个氨基酸并且多肽则称为“肽”。如果多肽是肽，则其长度为至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述物质的其他等效物、变体和类似物。多肽可为单一分子或可为多分子复合物(例如二聚体、三聚体或四聚体)。其还可包含单链或多链多肽并且可进行缔合或连接。术语多肽还可适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物。

“经分离”或“经纯化”蛋白质或其生物活性部分基本上不含来自衍生蛋白质的细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白，或基本上不含化学前体或其他化学物(在以化学方式合成时)。术语“基本上不含细胞材料”包括其中蛋白质与从其分离或重组产生的细胞的细胞组分分离的蛋白质制剂。因此，基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)异源性蛋白质(在本文中也称为“污染蛋白”)的蛋白质制剂。在蛋白质或其生物活性部分是以重组方式产生时，其还优选地基本上不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂的体积的少于约20％、10％或5％。在蛋白质是通过化学合成产生时，其优选地基本上不含化学前体或其他化学物质，即，其与涉及蛋白质合成的化学前体或其他化学物质分离。因此，除所关注多肽外，这些蛋白质制剂具有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。

在一些实施方案中，可通过适当纯化方案使用标准蛋白质纯化技术从细胞或组织来源分离对应于标志物的天然多肽。在另一个实施方案中，通过重组DNA技术产生对应于本发明所涵盖标志物的多肽。作为重组表达的替代方式，可以化学方式使用标准肽合成技术来合成对应于本发明所涵盖标志物的多肽。

多肽片段包括含有与所关注氨基酸序列充分同一或衍生自所关注氨基酸序列的氨基酸序列的多肽，但所述多肽包括少于全长蛋白质的氨基酸。它们还可表现出相应全长蛋白质的至少一种活性。通常，生物活性部分包含具有相应蛋白质的至少一种活性的结构域或基序。本发明所涵盖蛋白质的生物活性部分可为长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此外，可通过重组技术制备缺失其他蛋白质区域的其他生物活性部分，并且评估本发明所涵盖多肽的天然形式的一种或多种功能活性。

优选多肽具有所关注多肽(例如由本文所述的核酸分子编码的多肽)的氨基酸序列。其他有用蛋白质与这些序列中的一者基本上同一(例如至少约40％、优选地50％、60％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)并且保留相应天然存在蛋白质的蛋白质功能活性，但氨基酸序列因天然等位基因变化或诱变而有所不同。

如应用于氨基酸序列的术语“同一性”定义为在比对序列并且视需要引入空位以实现最大同一性百分比之后，候选氨基酸序列中与第二序列的氨基酸序列中的残基同一的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。应理解，同源性取决于同一性百分比的计算，但其值可因引入计算中的空位和罚分而有所不同。

为测定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分比，出于最佳比较目的来比对序列(例如，可将空位引入第一氨基酸或核酸的序列中以用于与第二氨基酸或核酸序列进行最优选比对)。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则所述分子在所述位置同一。两个序列之间的同一性百分比是所述序列所共有的同一位置数的函数(即，同一性％＝同一位置数/总位置(例如重叠位置)数×100)。在一个实施方案中，两个序列具有相同长度。

可使用数学算法来测定两个序列之间的同一性百分比。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性实例是Karlin和Altschul的算法(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：2264-2268)，其根据Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5877加以修改。这种算法已并入Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序中(1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。可使用NBLAST程序(评分＝100，字长＝12)来实施BLAST核苷酸搜索以获得与本发明所涵盖的核酸分子同源的核苷酸序列。可使用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)来实施BLAST蛋白质搜索以获得与本发明所涵盖的蛋白质分子同源的氨基酸序列。出于比较目的，为获得加空位比对，可如Altschul等人(1997)Nucl.Acids Res.25：3389-3402中所述来利用加空位BLAST。或者，可使用PSI-Blast来实施迭代搜索以检测分子之间的远距离联系。在利用BLAST、加空位BLAST和PSI-Blast程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的预设参数(参见例如ncbi.nlm.nih.gov)。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller的算法(1988，Comput.Appl.Biosci.4：11-17)。这种算法已并入ALIGN程序(2.0版)中，后者是GCG序列比对软件包的一部分。在利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可使用PAM120加权残差表、等于12的空位长度罚分和等于4的空位罚分。用于鉴定具有局部序列类似性和比对的区域的另一种有用算法是FASTA算法，如Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444-2448中所述。在使用FASTA算法来比较核苷酸或氨基酸序列时，可例如使用PAM120加权残差表以及k-元组值2。可使用类似于上述技术的技术使用或不使用容许空位来测定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，仅计数精确匹配。

术语“多肽变体”或“氨基酸序列变体”是指氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置具有取代、缺失和/或插入。在提及序列时，术语“天然”或“参考”是提及可进行比较的原始分子的相对术语。天然或参考序列不应与野生型序列混淆。天然序列或分子可代表野生型(所述序列发现于自然界中)，但不与野生型序列相同。变体可与天然或参考序列具有至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.5％或至少约99.9％的氨基酸序列同一性(同源性)。

多肽变体具有改变的氨基酸序列并且在一些实施方案中可用作激动剂或拮抗剂。可通过诱变(例如离散点突变)或截短来生成变体。激动剂可保留天然存在形式的蛋白质的基本上相同的生物活性或生物活性子集。蛋白质拮抗剂可通过例如竞争性结合至细胞信号级联的下游或上游成员(其包括所关注蛋白质)来抑制天然存在形式的蛋白质的一种或多种活性。因此，可通过使用具有有限功能的变体进行处理来诱发特定生物效应。相对于使用天然存在形式的蛋白质的治疗，使用具有天然形式的蛋白质的生物活性子集的变体治疗受试者可在受试者中具有较少副效应。

可通过筛选本发明所涵盖蛋白质的突变体(例如截短突变体)的组合文库的激动剂或拮抗剂活性来鉴定用作激动剂或拮抗剂的生物标志物蛋白变体。在一个实施方案中，通过组合诱变在核酸层面上来生成变体多样化文库并通过多样化基因文库进行编码。可通过例如以下方式来产生多样化变体文库：以酶促方式使合成寡核苷酸的混合物接合至基因序列，使得简并组的潜在蛋白质序列可表示为个别多肽或替代地一组较大融合蛋白(例如用于噬菌体展示)。存在可用于从简并寡核苷酸序列产生本发明所涵盖多肽的潜在变体文库的多种方法。本领域已知合成简并寡核苷酸的方法(参见例如Narang(1983)Tetrahedron39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人(1984)Science 198：1056；和Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11：477)。

另外，可使用对应于本发明所涵盖标志物的多肽的编码序列的片段文库来生成用于筛选和随后选择变体的多肽多样化群体。例如，可通过以下方式来生成编码序列片段的文库：使用核酸酶在切口形成仅每分子发生约一次的条件下处理所关注编码序列的双链PCR片段，使双链DNA变性，使DNA复性以形成可包括来自不同切口形成产物的有义/反义对的双链DNA，通过使用S1核酸酶进行处理从再形成双链体去除单链部分，以及使所得片段文库接合至表达载体。通过这种方法，可衍生编码所关注蛋白质的各种大小的氨基末端和内部片段的表达文库。

本领域已知若干用于通过点突变或截短来筛选组合文库的基因产物和用于筛选cDNA文库中具有所选性质的基因产物的技术。用于筛选大型基因文库的最广泛使用的技术(其适于高通量分析)通常包括将基因文库克隆至可复制表达载体中，使用所得载体文库转化适当细胞，以及在其中检测期望活性促进分离编码其产物被检测的基因的载体的条件下表达组合基因。递归总体诱变(REM)是增强文库中的功能突变体频率的技术，其可与筛选测定组合用于鉴定本发明所涵盖蛋白质的变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：7811-7815和Delgrave等人(1993)Prot.Engin.6：327-331)。

在一些实施方案中，提供“变体模拟物”。如本文所用，术语“变体模拟物”是指含有一个或多个模拟活化序列的氨基酸的变体。例如，谷氨酸盐可用作磷酸-苏氨酸和/或磷酸-丝氨酸的模拟物。或者，变体模拟物可产生含有模拟物的去活化或不活化产物，例如，苯丙氨酸可用作酪氨酸的不活化替代物；或者丙氨酸可用作丝氨酸的不活化替代物。氨基酸序列可包含天然存在的氨基酸并且由此可视为蛋白质、肽、多肽或其片段。或者，本发明所涵盖的药剂可包含天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。非天然存在的氨基酸可包括但不限于包含羰基或氨基氧基或酰肼基团或氨基脲基团或叠氮化物基团的氨基酸。

如应用于氨基酸序列的术语“同源物”意指与第二物种的第二序列基本上同一的另一物种的相应序列。

术语“类似物”意在包括因一个或多个氨基酸改变(例如氨基酸残基的取代、添加或缺失)而有所不同并且仍维持亲代多肽的性质的多肽变体。

术语“衍生物”与术语“变体”同义使用并且是指相对于参考分子或起始分子以任何方式进行修饰或改变的分子。本发明涵盖若干类型的基于氨基酸的化合物和/或组合物(包括变体和衍生物)。这些物质包括取代、插入、缺失和共价变体和衍生物。因此，包含取代、插入、添加、缺失和/或共价修饰的药剂包括于本发明的范围内。位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基末端和氨基末端区域的氨基酸残基可任选地缺失，从而提供截短序列。取决于序列的用途(如例如使序列表达为可溶性或连接至固体载体的较大序列的一部分)，某些氨基酸(例如C末端或N末端残基)可替代地缺失。

在提及蛋白质时，“取代变体”是去除天然或参考序列中的至少一个氨基酸残基并且在相同位置插入不同氨基酸者。取代可为单一取代，其中仅取代分子中的一个氨基酸，或者其可为多取代，其中取代相同分子中的两个或更多个氨基酸。在一个实例中，本发明所涵盖多肽中的氨基酸被另一个具有类似结构和/或化学性质的氨基酸取代，例如保守氨基酸取代。如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指通常存在于序列中的氨基酸被具有所涉及残基的类似大小、电荷、极性、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的不同氨基酸取代。保守取代的实例包括使用非极性(疏水性)残基(例如丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸)取代另一非极性残基。同样，保守取代的实例包括使用一种极性(亲水性)残基取代另一残基，例如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间，以及甘氨酸与丝氨酸之间。另外，使用碱性残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)取代另一碱性残基或使用一种酸性残基(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代另一酸性残基是保守取代的其他实例。“非保守取代”必须将这些种类中的一者的成员交换为另一种类。非保守取代的实例包括使用非极性(疏水性)氨基酸残基(例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸)取代极性(亲水性)残基(例如半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸)和/或使用极性残基取代非极性残基。可使用本领域众所周知的基因或化学方法生成氨基酸突变。基因方法可包括定点诱变、PCR、基因合成等。预计还可使用通过除基因工程化外的方法来改变氨基酸的侧链基团的方法，例如化学修饰。

在提及蛋白质时，术语“插入变体”是紧邻天然或起始序列中的特定位置的氨基酸插入一个或多个氨基酸者。如本文所用，术语“紧邻”是指连结至起始或参考氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团的毗邻氨基酸。与之相比，在提及蛋白质时，术语“缺失变体”是去除天然或起始氨基酸序列中的一个或多个氨基酸者。通常，缺失变体在特定分子区域中缺失一个或多个氨基酸。

术语“衍生物”包括含有一个或多个使用有机蛋白质性或非蛋白质性衍生剂的修饰和翻译后修饰的天然或参考蛋白质的变体。通常通过以下方式来引入共价修饰：使蛋白质的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的有机衍生剂进行反应，或者利用在所选重组宿主细胞中发挥作用的翻译后修饰机制。所得共价衍生物可用于旨在鉴定对于生物活性、免疫测定或制备免疫亲和力纯化重组糖蛋白的抗蛋白质抗体较为重要的残基的程序。这些修饰在本领域的普通技能范围内并且无需过多实验即可实施。

某些翻译后修饰是重组宿主细胞对所表达多肽的作用的结果。通常使谷氨酰基和天冬氨酰基残基经翻译后脱酰胺成相应谷氨酰基和天冬氨酰基残基。或者，在弱酸条件下使这些残基脱酰胺。任一形式的这些残基可存在于根据本发明所用的蛋白质中。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure andMolecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页(1983))。

在一些实施方案中，提供经共价修饰的多肽(例如融合蛋白)，例如用异源性多肽和/或非多肽修饰进行修饰的多肽。例如，共价衍生物具体来说包括融合分子，其中本发明所涵盖的蛋白质共价键结至非蛋白质性聚合物。所述非蛋白质性聚合物通常是亲水性合成聚合物(即未另外发现于自然界中的聚合物)。然而，存在于自然界中并且通过重组或体外方法产生的聚合物是有用的，如从自然界分离的聚合物。亲水性聚乙烯基聚合物落在本发明的范围内，例如聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮。特别有用的是聚乙烯基亚烷基醚，例如聚乙二醇、聚丙二醇(PEG)。蛋白质可以陈述于美国专利第4,640,835号、第4,496,689号、第4,301,144号、第4,670,417号、第4,791,192号或第4,179,337号中的方式连接至各种非蛋白质性聚合物(例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯)。融合分子还可包含共价键结至其他生物活性分子或接头的本发明所涵盖的蛋白质。

术语“嵌合蛋白”或“融合蛋白”是指包含全部或一部分(优选地生物活性部分)对应于可操作地连接至异源性多肽(例如除生物标志物多肽外的多肽)的本发明所涵盖多肽的多肽的多肽。就融合蛋白来说，术语“可操作地连接”旨在指示，本发明所涵盖的多肽和异源性多肽在框内彼此融合。异源性多肽可融合至本发明所涵盖多肽的氨基末端或羧基末端。

一种有用的融合蛋白是GST融合蛋白，其中对应于本发明所涵盖标志物的多肽融合至GST序列的羧基末端。这些融合蛋白可促进本发明所涵盖的重组多肽的纯化。在另一个实施方案中，融合蛋白含有异源性信号序列、免疫球蛋白融合蛋白、毒素或其他有用的蛋白质序列。可通过标准重组DNA技术来产生本发明所涵盖的嵌合蛋白和融合蛋白。在另一个实施方案中，融合基因可通过常规技术(包括自动化DNA合成器)来合成。或者，基因片段的PCR扩增可使用锚定引物来实施，所述锚定引物在两个邻接基因片段之间产生互补悬突，其随后可退火并且再扩增以生成嵌合基因序列(参见例如Ausubel等人，同上)。此外，许多已编码融合部分(例如GST多肽)的表达载体可购得。可将编码本发明所涵盖多肽的核酸克隆至这种表达载体中，从而融合部分框内连接至本发明所涵盖的多肽。

可使用信号序列来促进经分泌蛋白质或其他所关注蛋白质的分泌和分离。信号序列的特征通常在于疏水性氨基酸的核心，所述疏水性氨基酸通常是在分泌期间于一个或多个裂解事件中从成熟蛋白质所裂解。这些信号肽含有处理位点，所述处理位点容许在成熟蛋白质通过分泌途径时从成熟蛋白质裂解信号序列。因此，本发明涵盖具有信号序列的所述多肽以及信号序列已以蛋白水解方式发生裂解的多肽(即裂解产物)。在一个实施方案中，编码信号序列的核酸序列可在表达载体中可操作地连接至所关注蛋白质(例如通常未分泌或另外难以分离的蛋白质)。信号序列引导例如从转化表达载体的真核宿主分泌蛋白质，并且信号序列随后或同时发生裂解。然后可通过本领域公认方法从细胞外介质容易地纯化蛋白质。或者，可使用促进纯化的序列(例如具有GST结构域)使信号序列连接至所关注蛋白质。

在提及蛋白质时，术语“特征”定义为分子的基于氨基酸序列的不同组分。本发明所涵盖蛋白质的特征包括表面表现、局部构形形状、折叠、环、半环、结构域、半结构域、位点、末端或其任何组合。例如，在提及蛋白质时，术语“表面表现”是指出现于最外表面上的蛋白质的基于多肽的组分。在提及蛋白质时，术语“局部构形形状”是指位于可确定蛋白质空间内的蛋白质的基于多肽的结构表现。在提及蛋白质时，术语“折叠”是指在能量最小化时氨基酸序列的所得构形。折叠可出现于折叠过程的二级或三级层面上。二级层面折叠的实例包括β折叠和α螺旋。三级折叠的实例包括因能量力的聚集或分离而形成的结构域和区域。以这种方式形成的区域包括疏水性和亲水性袋等。关于蛋白质构形的术语“转角”是指改变肽或多肽的主链方向的弯部并且可涉及一个、两个、三个或更多个氨基酸残基。关于蛋白质的术语“环”是指肽或多肽中逆转肽或多肽的主链方向的结构特征并且包含4个或更多个氨基酸残基(Oliva等人(1997)J.Mol.Biol.266：814-830)。在提及蛋白质时，术语“半环”是指所鉴定环中与衍生其的环相比具有至少一半数量的氨基酸残基的部分。应理解，环并不总是含有偶数个氨基酸残基。因此，在环含有或经鉴定包含奇数个氨基酸的那些情形下，奇数环的半环将包含环的整数部分或下一整数部分(环的氨基酸数/2+/-0.5个氨基酸)。例如，鉴定为7氨基酸环的环可产生具有3个氨基酸或4个氨基酸的半环(7/2＝3.5+/-0.5为3或4)。在提及蛋白质时，术语“结构域”是指多肽中具有一种或多种可鉴定结构或功能特性或性质(例如结合能力和/或用作蛋白质-蛋白质相互作用的位点)的基序。在提及蛋白质时，术语“半结构域”是指所鉴定结构域中与衍生其的结构域相比具有至少一半数量的氨基酸残基的部分。应理解，结构域并不总是含有偶数个氨基酸残基。因此，在结构域含有或经鉴定包含奇数个氨基酸的那些情形下，奇数结构域的半结构域将包含结构域的整数部分或下一整数部分(结构域的氨基酸数/2+/-0.5个氨基酸)。例如，鉴定为7氨基酸结构域的结构域可产生具有3个氨基酸或4个氨基酸的半结构域(7/2＝3.5+/-0.5为3或4)。还应理解，可在结构域或半结构域内鉴定子结构域，所述子结构域具有衍生其的结构域或半结构域中所鉴定的非全部的结构或功能性质。还应理解，包含本文的任何结构域类型的氨基酸未必沿多肽主链是邻接的(即，非毗邻氨基酸可在结构上发生折叠以产生结构域、半结构域或子结构域)。关于基于氨基酸的实施方案的术语“位点”与“氨基酸残基”和“氨基酸侧链”同义使用。位点代表肽或多肽内可在本发明所涵盖的基于氨基酸的分子内加以修饰、操纵、改变、衍生或变化的位置。在提及蛋白质时，术语“末端(termini/terminus)”是指肽或多肽的端部。这些端部并不仅限于肽或多肽的第一或最终位点，并且还可包括末端区域中的其他氨基酸。本发明所涵盖基于多肽的分子可表征为具有N末端(即终止于具有游离氨基(NH2)的氨基酸)和C末端(即终止于具有游离羧基(COOH)的氨基酸)。在一些情形下，本发明所涵盖的蛋白质是由通过二硫键或通过非共价力结合至一起的多个多肽链(例如多聚体或寡聚物)构成。这些蛋白质具有多个N末端和C末端。或者，可修饰多肽的末端，使得它们可根据情形始于或止于基于非多肽的部分(例如有机缀合物)。

在任何特征已鉴定或定义为本发明所涵盖分子的组分后，可通过移动、交换、倒转、缺失、随机化或复制来实施这些特征的若干操纵和/或修饰中的任一者。此外，应理解，操纵特征可与修饰本发明所涵盖的分子产生相同结果。例如，涉及缺失结构域的操纵将改变分子的长度，这正如修饰核酸以编码小于全长的分子所实现一般。可通过本领域已知方法(例如定点诱变)来实现修饰和操纵。

在一些实施方案中，本文所述的药剂可包含一个或多个同位素原子。如本文所用，术语“同位素”是指具有一个或多个额外中子的化学元素，例如氘同位素。

3.

在另一方面，本发明涵盖抗体剂和其变体和/或抗原结合片段。

a.抗体组合物

术语“抗体”或“Ab”是以最广泛意义使用并且具体来说包括但不限于全抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如由至少两种完整抗体形成的双特异性抗体、三特异性抗体或具有较大多特异性的抗体)、抗体片段、双价抗体、抗体变体和抗体源结合结构域(其为其他肽的一部分或与其缔合)。抗体主要是基于氨基酸的分子，但还可包含一种或多种修饰(包括但不限于添加糖部分、荧光部分、化学标签等)。在一些情形下，抗体可包括基于非氨基酸的分子。本发明所涵盖的抗体可为天然存在的或通过生物工程化产生。

在一些实施方案中，抗体可包含重链和轻链可变结构域以及Fc区。术语“天然抗体”是指约150,000道尔顿(dalton)的通常异源四聚体糖蛋白，其是由两条相同轻(L)链和两条相同重(H)链构成。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链，而在不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键的数量各不相同(例如IgG、IgA、IgE和IgM)。每条重链和轻链还具有规则间隔开的链内二硫键。每条重链在一端具有可变结构域(VH)，并且后接多个恒定结构域。每条轻链在一端均具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对准，并且轻链可变结构域与重链可变结构域对准。抗体的两条重链的其余重链恒定结构域构成抗体的可结晶片段(Fc)区。抗体的尾部区域中的Fc区与细胞表面受体(称为Fc受体)和补体系统的一些蛋白质相互作用。

术语“轻链”是指来自任何脊椎动物物种的抗体的组分，其基于恒定结构域的氨基酸序列可指派为两种完全不同类型(称为κ和λ)中的一者。取决于抗体重链中恒定结构域的氨基酸序列，可将抗体归类为不同种类。存在5个主要种类的完整抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且可将这些种类中若干种类进一步划分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。

术语“可变结构域”是指抗体重链和轻链上的特定抗体结构域，其序列在抗体中广泛不同并且用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。例如，术语“VH”是指“重链可变结构域”并且术语“VL”是指“轻链可变链”。可变结构域包含高变区。术语“高变区”是指可变结构域内包含负责抗原结合的氨基酸残基的区域。这些区域具有高变序列和/或形成结构限定的环。存在于高变区内的氨基酸决定了成为抗体中抗原结合位点的一部分的互补决定区(CDR)的结构。通常，抗体包含6个HVR；3个位于VH中(H1、H2、H3)，并且3个位于VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3显示6个HVR的大部分多样性，并且特定来说据认为H3在赋予抗体良好特异性方面发挥独特作用(参见例如Xu等人(2000)Immunity 13，37-45；Johnson和Wu(2003)Meth.Mol.Biol.248：1-25)。术语“CDR”是指抗体中包含与其靶抗原或表位互补的结构的区域。可变结构域中不与抗原相互作用的其他部分称为框架(FW)区。抗原结合位点(也称为抗原组合位点或互补位)包含与特定抗原相互作用所需的氨基酸残基。通常通过共晶体学使用结合抗原来阐明构成抗原结合位点的确切残基，然而，还可使用基于与其他抗体的比较的计算评价(Strohl，W.R.Therapeutic Antibody Engineering.WoodheadPublishing，Philadelphia PA.2012.第3章，第47-54页)。构成CDR的残基的测定可包括使用编号方案，包括但不限于由以下各项教导者：Kabat(Wu等人(1970)JEM 132：211-250；Kabat等人(1992)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，U.S.Department of Health and Human Services；Johnson等人(2000)Nucl.AcidsRes.28：214-218)、Chothia(Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901；Chothia等人(1989)Nature 342：877；Al-Lazikani等人(1997)J.Mol.Biol.273：927-948)、Lefranc(Lefranc等人(1995)Immunome Res.1：3)、Honegger(Honegger和Pluckthun(2001)J.Mol.Biol.309：657-670)和MacCallum(MacCallum等人(1996)J.Mol.Biol.262：732)。

VH和VL结构域各自具有三个CDR。VL CDR在本文中称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其出现顺序是沿可变结构域多肽从N末端移动至C末端。VH CDR在本文中称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，其出现顺序是沿可变结构域多肽从N末端移动至C末端。每个CDR具有有益的规范结构，CDR-H3除外，其包含在抗体之间序列和长度可高度变化的氨基酸序列，从而在抗原结合结构域中产生各种三维结构(Nikoloudis等人(2014)Peer J.2：e456)。在一些情形下，可在一组相关抗体中分析CDR-H3以评价抗体多样性。本领域已知测定CDR序列的各种方法并且可应用于已知抗体序列(Strohl，W.R.Therapeutic Antibody Engineering.WoodheadPublishing，Philadelphia PA.2012.第3章，第47-54页)。

在一些实施方案中，抗体片段和变体可包含完整抗体的任何部分。术语“抗体片段”和“抗体变体”还包括如同抗体一般通过结合至特异性抗原以形成复合物来发挥作用的任何合成或基因工程化的蛋白质/多肽。在一些实施方案中，抗体片段和变体包含来自完整抗体的抗原结合区域。抗体片段的实例可包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)

通过野生型抗体的限制性蛋白水解产生的抗体片段被称为蛋白水解性抗体片段。这些片段包括但不限于Fab片段、Fab′片段和F(ab′)

术语“Fv”是指包含完整抗原识别和抗原结合位点的抗体片段。这些区域由一个重链可变结构域与一个轻链可变结构域呈紧密非共价缔合形式的二聚体组成。Fv片段可通过蛋白水解裂解生成，但极其不稳定。本领域已知生成稳定Fv片段的重组方法，其通常经由在轻链可变结构域与重链可变结构域之间插入柔性接头(以形成单链Fv(scFv)或经由在重链可变结构域与轻链可变结构域之间引入二硫桥来实现(Strohl，W.R.TherapeuticAntibody Engineering.Woodhead Publishing，Philadelphia PA.2012.第3章，第46-47页)。

术语“单链Fv”或“scFv”是指VH抗体结构域和VL抗体结构域的融合蛋白，其中这些结构域由柔性肽接头一起连接成单一多肽链。在一些实施方案中，Fv多肽接头使得scFv能够形成用于抗原结合的期望结构。在一些实施方案中，可通过10至30个氨基酸残基的肽连接VH结构域和VL结构域。在一些实施方案中，使scFv与噬菌体展示、酵母展示或其他展示方法联合利用，其中它们可与表面成员(例如噬菌体外壳蛋白)相关联地表达并且用于鉴定给定抗原的高亲和力肽。在一些实施方案中，术语“单链抗体”还可包括但不限于二硫化物连接的Fv(dsFv)，其中两种单链抗体(各自可指向不同表位)通过二硫键连接至一起。使用分子基因学，可将两个scFv串联工程化为由接头结构域间隔开的单一多肽，称为“串联scFv”(tascFv)。使用具有两个不同scFv的基因构建tascFv会产生“双特异性单链可变片段”(双scFv)(Nelson(2010)Mabs 2：77-83)。还可包括巨抗体(融合至IgG的Fc(CH2-CH3结构域)的氨基末端的二价scFv)。

在一些实施方案中，抗体可包含经修饰Fc区。作为一个非限制性实例，经修饰Fc区可通过所述方法来制备或者可为美国专利公开第US 2015-0065690号中所述的任何区域。

术语“多克隆抗体”包括在针对具有许多表位的蛋白质的免疫原性反应中生成的抗体。多克隆抗体的组合物(例如血清)由此包括多种指向蛋白质内的相同和不同表位的不同抗体。本领域已知产生多克隆抗体的方法(参见例如Cooper等人，Short Protocols inMolecular Biology，第2版，第11章第III部分；Ausubel等人编辑，John Wiley and Sons，New York，1992，第11-37页至第11-41页)。

与之相比，术语“单克隆抗体”是指从基本上均质细胞(或克隆)的群体获得的抗体，即，构成群体的个别抗体相同和/或结合抗原的相同特异性表位，可在产生单克隆抗体期间出现的可能变体除外，这些变体通常是以极少量存在。与通常包括针对不同决定子(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂不同，每一单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。修饰词“单克隆”指示抗体的特征在于从基本上均质的抗体群体获得，并且不应理解为需要通过任何特定方法来产生所述抗体。单克隆抗体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的对应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的对应序列相同或同源；以及这些抗体的片段。

术语“抗体变体”是指经修饰抗体(相对于天然或起始抗体)或在结构和/或功能上类似于天然或起始抗体的生物分子，所述生物分子与天然或起始抗体(例如抗体模拟物)相比在氨基酸序列、组成或结构方面包括一定差异。与天然抗体相比，抗体变体的氨基酸序列、组成或结构可有所改变。抗体变体可包括但不限于具有改变的同种型的抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM)、人源化变体、优化变体、多特异性抗体变体(例如双特异性变体)和抗体片段。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包含抗体融合蛋白。如本文所用，术语“抗体融合蛋白”是重组产生的抗原结合分子，其中两种或更多种具有相同或不同特异性的相同或不同天然抗体、单链抗体或抗体片段区段连接至一起。融合蛋白的化合价指示融合蛋白针对抗原或表位所具有的结合臂或位点的总数；即单价、二价、三价或多价。抗体融合蛋白的多价性意指，其可利用多种相互作用结合至抗原，由此增加与抗原的结合亲合力。特异性指示抗体融合蛋白能够结合多少不同抗原或表位，即单特异性、双特异性、三特异性、多特异性等。使用这些定义，天然抗体(例如IgG)是二价的，这是因为它具有两个结合臂，但是为单特异性的，这是因为其结合至一种抗原。单特异性多价融合蛋白针对一个表位具有一个以上的结合位点，但仅结合相同抗原上的相同表位，例如具有两个与相同抗原具有反应性的结合位点的双价抗体。融合蛋白可包括不同抗体组分或多个拷贝的相同抗体组分的多价或多特异性组合。融合蛋白可另外包括治疗剂。适用于这些融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂(“抗体-免疫调节剂融合蛋白”)和毒素(“抗体-毒素融合蛋白”)。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNase)，优选是重组RNase。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包括多特异性抗体。如本文所用，术语“多特异性抗体”是指结合一个以上表位的抗体。如本文所用，术语“多体”或“多特异性抗体”是指其中两个或更多个可变区结合至不同表位的抗体。表位可位于相同或不同靶标上。在一个实施方案中，可通过PCT公开第WO 2011/109726号以及美国专利公开第2015-0252119号中所述的方法来生成多特异性抗体并优化。这些抗体能够以高特异性和高亲和力结合至多个抗原。在一些实施方案中，多特异性抗体是“双特异性抗体”。如本文所用，术语“双特异性抗体”是指能够结合相同或不同抗原上的两个不同表位的抗体。在一个方面，双特异性抗体能够结合两种不同抗原。这些抗体通常包含来自至少两种不同抗体的抗原结合区域。例如，双特异性单克隆抗体(BsMAb、BsAb)是由两种不同单克隆抗体的片段构成的人工蛋白质，由此容许BsAb结合至两种不同类型的抗原。双特异性抗体可包括Riethmuller(2012)Cancer Immun.12：12-18；Marvin等人(2005)Acta Pharmacol.Sinica 26：649-658；和Schaefer等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108：11187-11192中所述的任一者。已开发新一代BsMAb，称为“三功能双特异性”抗体。这些抗体由两条重链和两条轻链组成，每一者来自两种不同抗体，其中两个Fab区(臂)指向两种抗原，并且Fc区(足)包含两条重链并形成第三结合位点。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的组合物可包括抗肽抗体。如本文所用，术语“抗肽抗体”是指在针对短(通常5至20个氨基酸)免疫原性多肽的体液反应中生成的“单特异性抗体”，所述免疫原性多肽对应于衍生其的蛋白质(例如本发明所涵盖的靶蛋白)的较少(优选地一个)经分离表位。多个抗肽抗体包括各种针对蛋白质的特定部分(即针对含有至少一个、优选地仅一个表位的氨基酸序列)的不同抗体。本领域已知产生抗肽抗体的方法(参见例如Cooper等人，Short Protocols in Molecular Biology，第2版，第11章第III部分；Ausubel等人编辑，John Wiley and Sons，New York，1992，第11-42页至第11-46页)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包括双价抗体。如本文所用，术语“双价抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段。双价抗体在同一多肽链中包含连结至轻链可变结构域VL的重链可变结构域VH。通过使用过短而不容许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，迫使所述结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双价抗体更全面地阐述于例如以下文献中：EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包括细胞内抗体。如本文所用，术语“细胞内抗体”是指并非从产生其的细胞分泌而是靶向一种或多种细胞内蛋白质的抗体形式。可使用细胞内抗体来影响多种细胞过程，包括但不限于细胞内输送、转录、翻译、代谢过程、增殖性信号传导和细胞分裂。在一些实施方案中，本发明所涵盖的方法可包括基于细胞内抗体的疗法。在一些这样的实施方案中，可将本文所公开的可变结构域序列和/或CDR序列并入一种或多种用于基于细胞内抗体的疗法的构建体中。例如，细胞内抗体可靶向一种或多种糖化细胞内蛋白质或者可调节一种或多种糖化细胞内蛋白质与替代蛋白质之间的相互作用。细胞内抗体在哺乳动物细胞的不同腔室中的细胞内表达容许阻断或调节内源性分子的功能(Biocca等人(1990)EMBO J.9：101-108；Colby等人(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17616-17621)。细胞内抗体可改变蛋白质折叠、蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用、蛋白质-RNA相互作用和蛋白质修饰。它们可诱导表型敲除并且通过直接结合至靶抗原、通过使其细胞内输送转向或通过抑制其与结合伴侣的缔合而用作中和剂。鉴于对靶抗原的高特异性和亲和力，细胞内抗体可有利地阻断特定靶分子的某些结合相互作用，同时保留其他相互作用。可使用来自供体抗体的序列来产生细胞内抗体。细胞内抗体通常在细胞内重组表达为单一结构域片段(例如经分离VH和VL结构域)或单链可变片段(scFv)抗体。例如，细胞内抗体通常表达为单一多肽以形成包含由柔性接头多肽接合的重链和轻链的可变结构域的单链抗体。细胞内抗体通常缺乏二硫键并且能够经由其特异性结合活性来调节靶标基因的表达或活性。单链细胞内抗体通常表达自重组核酸分子并且被工程化以保留于细胞内(例如保留于细胞质、内质网或周质中)。可使用本领域已知方法来产生细胞内抗体，例如公开并综述于例如以下文献中的方法：Marasco等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：7889-7893；Chen等人(1994)Hum.GeneTher.5：595-601；Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：5932-5936；Maciejewski等人(1995)Nat.Med.1：667-673；Marasco(1995)Immunotech.1：1-19；Mhashilkar等人(1995)EMBOJ.14：542-1451；Chen等人(1996)Hum.Gene Therap.7：1515-1525；Marasco(1997)GeneTher.4：11-15；Rondon和Marasco(1997)Annu.Rev.Microbiol.51：257-283；Cohen等人(1998)Oncogene 17：2445-2456；Proba等人(1998)J.Mol.Biol.275：245-253；Cohen等人(1998)Oncogene 17：2445-2456；Hassanzadeh等人(1998)FEBSLett.437：81-86；Richardson等人(1998)Gene Ther.5：635-644；Ohage和Steipe(1999)J.Mol.Biol.291：1119-1128；Ohage等人(1999)J.Mol.Biol.291：1129-1134；Wirtz和Steipe(1999)ProteinSci.8：2245-2250；Zhu等人(1999)J.Immunol.Methods 231：207-222；Arafat等人(2000)Cancer Gene Ther.7：1250-1256；der Maur等人(2002)J.Biol.Chem.277：45075-45085；Mhashilkar等人(2002)Gene Ther.9：307-319；和Wheeler等人(2003)FASEB J.17：1733-1735)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包括嵌合抗体。如本文所用，术语“嵌合抗体”是指重组抗体，其中重链和轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源；以及所述抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性即可(参见例如美国专利第4,816,567号；Morrison等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：6851-6855)。例如，本文的所关注嵌合抗体可包括包含源自非人类灵长类动物(例如旧大陆猴(Old World Monkey)，例如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人类恒定区序列的“灵长类化”抗体。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可为人源化抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指包含来自一种或多种非人类(例如鼠类)抗体来源的最小部分并且其余部分源自一种或多种人类免疫球蛋白来源的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是如下人类免疫球蛋白(接受者抗体)：其中来自接受者抗体的高变区的残基由来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物)的抗体(供体抗体)的高变区中具有期望特异性、亲和力和/或能力的残基代替。在一个实施方案中，抗体可为人源化全长抗体。可使用蛋白质工程化技术来生成人源化抗体(例如Gussow和Seemann(1991)Meth.Enzymol.203：99-121)。作为一个非限制性实例，可使用美国专利公开第2013/0303399号中所教导的方法使抗体人源化。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包括经半胱氨酸修饰的抗体。在“经半胱氨酸修饰的抗体”中，通过基因操纵将半胱氨酸氨基酸插入或取代于抗体表面上并用于经由例如二硫桥使抗体缀合至另一分子。已阐述抗体的半胱氨酸取代或插入(参见例如美国专利第5,219,996号)。将半胱氨酸残基引入用于位点特异性缀合抗体的IgG抗体的恒定区中的方法阐述于Stimmel等人(2000)J.Biol.Chem.275：330445-30450)中。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体变体可为抗体模拟物。如本文所用，术语“抗体模拟物”是指模拟抗体的功能或效应并且以高亲和力特异性结合至其分子靶标的任何分子。在一些实施方案中，抗体模拟物可为单抗体，其经设计以并入纤连蛋白类型III结构域(Fn3)作为蛋白质支架(参见美国专利第6,673,901号和第6,348,584号)。在一些实施方案中，抗体模拟物可包括本领域已知那些中的任一者，包括但不限于亲和体分子、亲和素、阿非丁(affitin)、抗运载蛋白、高亲和性多聚物、Centyrin、DARPINS

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可包含单一抗原结合结构域。这些分子极小，其中分子量大约为针对全尺寸mAb所观测者的十分之一。其他抗体可包括源自骆驼和骆马中所发现缺乏轻链的重链抗体的抗原结合可变重链区域(VHH)的“纳米抗体”(参见例如Nelson(2010)Mabs 2：77-83)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可为“小型化”的。mAb小型化的一个实例是小模块免疫药物(SMIP)。这些分子可为单价或二价的，其为含有一个VL、一个VH抗原结合结构域和一或两个恒定“效应”结构域的重组单链分子，所述结构域都由接头结构域连接。(参见例如Nelson(2010)Mabs 2：77-83)。据认为，这种分子可提供以下优点：增加了由片段所要求的组织或肿瘤渗透，同时保留由恒定结构域赋予的免疫效应功能。小型化抗体的另一个实例称为“单抗体”，其中已从IgG4分子去除铰链区。尽管IgG4分子不稳定并且可彼此交换轻-重链异二聚体，但缺失铰链区可完全防止重链-重链配对，从而留下高度特异性的单价轻/重异二聚体，同时保留Fc区以确保稳定性和体内半衰期。这种构型可最小化免疫活化或致癌生长的风险，这是因为IgG4很少与FcR相互作用并且单价单抗体不能促进细胞内信号传导复合物形成(参见例如Nelson(2010)Mabs 2：77-83)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体变体可为单一结构域抗体(sdAb或纳米抗体)。如本文所用，术语“sdAb”或“纳米抗体”是指由单一单体可变抗体结构域组成的抗体片段。如同完整抗体，其能够选择性结合至特异性抗原。在一个方面，sdAb可为“骆驼Ig”或“骆驼科VHH”。如本文所用，术语“骆驼Ig”是指重链抗体的最小已知抗原结合单元(Koch-Nolte等人(2007)FASEB J.21：3490-3498)。“重链抗体”或“骆驼科抗体”是指含有两个VH结构域并且不含轻链的抗体(Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363：446-448(1993)；Sheriff等人(1996)Nat.Struct.Biol.3：733-736；Riechmann等人(1999)J.Immunol.Meth.231：25-38；PCT公开第WO1994/04678号和第WO 1994/025591号；以及美国专利第6,005,079号)。在另一方面，sdAb可为“免疫球蛋白新抗原受体”(IgNAR)。术语“免疫球蛋白新抗原受体”是指来自鲨鱼免疫谱的抗体类别，其由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成。IgNAR代表一些最小已知免疫球蛋白基蛋白质支架，并且高度稳定并具有有效结合特性。固有稳定性可归因于以下因素：(i)基础Ig支架，其与发现于鼠类抗体中的常规抗体VH和VL结构域相比呈现大量带电和亲水性表面暴露残基；和(ii)互补决定区(CDR)环中的稳定结构特征，包括环间二硫化物桥和环内氢键模式。其他小型化抗体片段可包括“互补决定区肽”或“CDR肽”。CDR肽(也称为“最小识别单元”)是对应于单一互补决定区(CDR)的肽，并且可通过构建编码所关注抗体的CDR的基因来制备。例如，通过使用聚合酶链反应从抗体产生细胞的RNA合成可变区来制备这些基因(参见例如Larrick等人(1991)Methods Enzymol.2：106)。

包含抗体的抗原结合片段的其他变体可包括但不限于二硫化物连接的Fv(sdFv)、V

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可为如美国专利第5,091,513号中所述的抗体。这种抗体可包括一个或多个构成表现为生物合成抗体结合位点(BABS)的区域的氨基酸序列。所述位点包含1)非共价缔合或二硫化物键结的合成VH和VL二聚体；2)VH-VL或VL-VH单链，其中VH和VL由多肽接头附接；或3)个别VH或VL结构域。结合结构域包含可源自单独免疫球蛋白的连接的CDR和FR区域。生物合成抗体还可包括用作例如酶、毒素、结合位点或至固定介质或放射性原子的附接位点的其他多肽序列。公开了用于产生生物合成抗体，用于设计具有任何可通过体内生成抗体来诱发的特异性的BABS，和用于产生其类似物的方法。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可为具有美国专利第8,399,625号中所教导的抗体受体框架的抗体。这些抗体受体框架可特别充分适于接受来自所关注抗体的CDR。

在一个实施方案中，抗体可为条件性活性生物蛋白。可使用抗体来生成在野生型正常生理学条件下可逆地或不可逆地不活化的条件性活性生物蛋白，以及提供所述条件性活性生物蛋白和所述条件性活性生物蛋白的用途。所述方法和条件性活性蛋白教导于例如PCT公开第WO 2015/175375号和第WO 2016/036916号以及美国专利公开第2014/0378660号中。

可使用重组多核苷酸来产生如本文所述的抗体以及其变体和/或片段。在一个实施方案中，多核苷酸具有模块设计以编码抗体、其片段或变体中的至少一者。作为一个非限制性实例，多核苷酸构建体可编码下列设计中的任一者：(1)抗体的重链，(2)抗体的轻链，(3)抗体的重链和轻链，(4)通过接头间隔开的重链和轻链，(5)VH1、CH1、CH2、CH3结构域、接头和轻链，或(6)VH1、CH1、CH2、CH3结构域、VL区和轻链。这些设计中的任一者还可包含任何结构域和/或区域之间的任选接头。可使用本文所述的抗体或任何其组分部分作为起始分子来工程化本发明所涵盖的多核苷酸以产生任何标准类别的免疫球蛋白。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体是治疗性抗体。如本文所用，术语“治疗性抗体”意指有效治疗患有或易患疾病或病症的哺乳动物的疾病或病症的抗体。抗体可为细胞渗透抗体、中和抗体、激动剂抗体、部分激动剂、反激动剂、部分拮抗剂或拮抗剂抗体。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体可为裸抗体。如本文所用，术语“裸抗体”是不含其他修饰的完整抗体分子，所述其他修饰是例如与毒素或用于结合至放射性核素的螯合物缀合。裸抗体的Fc部分可提供效应功能，例如补体固定和ADCC(抗体依赖性细胞毒性)，所述效应功能开启了可产生细胞裂解的机制(参见例如Markrides(1998)Pharmacol.Rev.50：59-87)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体不具有针对表达所关注生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物)的细胞的ADCC活性。在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体不具有针对表达所关注生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物)的细胞的CDC活性。在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体并不缀合至另一治疗部分(例如细胞毒性剂)。在一些实施方案中，本发明所涵盖的抗体在结合细胞和/或由细胞内化时不杀伤表达所关注生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物)的细胞。

b.抗体生成

本发明所涵盖的抗体可为天然存在的或经由本领域已知的任何方法人工制得，例如通过常规杂交瘤技术、重组技术、突变或优化已知抗体、从抗体文库或抗体片段文库进行选择和免疫化产生的单克隆抗体(mAb)。本领域众所周知抗体(不论单克隆或多克隆)的生成。本领域众所周知的产生抗体的技术并且阐述于例如以下文献中：Harlow和Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Harlow和Lane“Using Antibodies：A Laboratory Manual”Cold Spring HarborLaboratory Press，1999；和“Therapeutic Antibody Engineering：Current and FutureAdvances Driving the Strongest Growth Area in the Pharmaceutical Industry”Woodhead Publishing，2012。

抗体开发方法通常依赖于用于选择、免疫化和/或证实抗体亲和力和/或特异性的靶分子的使用。根据本发明使用的靶分子包括靶抗原。靶抗原可为基于氨基酸的分子、非基于氨基酸的分子，或由基于氨基酸的分子和非基于氨基酸的分子构成的化合物。术语“氨基酸”是指所有天然存在的L-α-氨基酸以及非天然存在的氨基酸。氨基酸是通过如下单字母或三字母名称来鉴定：天冬氨酸(Asp：D)、异亮氨酸(Ile：I)、苏氨酸(Thr：T)、亮氨酸(Leu：L)、丝氨酸(Ser：S)、酪氨酸(Tyr：Y)、谷氨酸(Glu：E)、苯丙氨酸(Phe：F)、脯氨酸(Pro：P)、组氨酸(His：H)、甘氨酸(Gly：G)、赖氨酸(Lys：K)、丙氨酸(Ala：A)、精氨酸(Arg：R)、半胱氨酸(Cys：C)、色氨酸(Trp：W)、缬氨酸(Val：V)、谷氨酰胺(Gln：Q)、甲硫氨酸(Met：M)和天冬酰胺(Asn：N)，其中首先列出氨基酸，接着在括号内分别通过三字母代码和单字母代码列出。基于氨基酸的靶抗原可为蛋白质或肽。如本文所用，术语“肽”是指具有2至50个或更多个氨基酸的基于氨基酸的分子。特殊标示符适用于较小肽，其中“二肽”是指两氨基酸分子并且“三肽”是指三氨基酸分子。具有50个以上邻接氨基酸的基于氨基酸的分子可视为多肽或蛋白质。

在一些实施方案中，可经由使用一种或多种靶抗原使宿主免疫化来制备抗体，所述靶抗原用作免疫原来诱发免疫学反应。在一些情形下，可仅使用给定抗原的部分或区域。在基于氨基酸的抗原的情形下，可使用一种或多种抗原源多肽或肽(在本文中称为“抗原肽”)。适于生成抗体的抗原肽优选地含有长度为至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、约5至约50个氨基酸、约10至约30个氨基酸、约10至约20个氨基酸、约40至约200个氨基酸、或至少200个氨基酸的序列。在使用较大多肽或蛋白质来生成抗体的本发明所涵盖的某些实施方案中，这些多肽或蛋白质的长度优选为至少50、至少55、至少60、至少70、至少80、至少90或更多个氨基酸。

通过免疫化生成抗体通常涉及使用非人类动物宿主作为免疫化受试者(在本文中称为“免疫原性宿主”)。在一些实施方案中，免疫原性宿主是选自任何脊椎动物。在其他实施方案中，免疫原性宿主是选自所有哺乳动物。在其他实施方案中，免疫原性宿主是小鼠，包括转基因或基因敲除小鼠。其他免疫原性宿主可包括但不限于大鼠、兔、猫、狗、山羊、绵羊、仓鼠、豚鼠、牛、马、猪、骆马、骆驼和鸡。

使用本文所述的靶抗原使免疫原性宿主免疫化可包含使用一种或多种佐剂。可使用佐剂在这些免疫原性宿主中诱发较高免疫反应。因此，可基于影响抗体效价的能力来选择根据本发明所用的佐剂。佐剂可包括但不限于弗氏佐剂(Freund′s)(完全和不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普罗尼克(pluronic)多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔帽贝血蓝蛋白、二硝基苯酚和其他有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂在本领域中也是众所周知的。在一些实施方案中，油包水乳液可用作佐剂。油包水乳液可通过形成移动抗原储积物来发挥作用，从而促进缓慢抗原释放并增强至免疫组分的抗原呈递。弗氏佐剂可以以下形式使用：完全弗氏佐剂(CFA)，其包含已干燥并且不活化的分支杆菌颗粒；或不完全弗氏佐剂(IFA)，其缺乏这种颗粒。其他基于油包水的佐剂包括

可使用本领域技术人员已知的充分确立的方法来制备本发明所涵盖的单克隆抗体。在一个实施方案中，使用杂交瘤技术来制备单克隆抗体(Kohler等人(1975)Nature256：495-497)。在杂交瘤方法中，通常使用免疫剂(例如靶抗原)对小鼠、仓鼠或其他适当的免疫原性宿主动物实施免疫以诱发产生或能够产生特异性结合至免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外对淋巴细胞实施免疫。然后使用合适的融合剂(例如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding，J.W.，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice.Academic Press.1986；59-1031)。永生化细胞系通常是经转化哺乳动物细胞，特别是啮齿动物、兔、牛和人类来源的骨髓瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。可在合适的培养基中培养杂交瘤细胞，所述培养基优选地含有一种或多种抑制未融合、永生化细胞的生长或存活的物质。例如，如果亲代细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(“HAT培养基”)，所述物质会防止HGPRT缺陷型细胞的生长。

在一些实施方案中，永生化细胞系是那些可有效融合、支持所选抗体产生细胞稳定大量表达抗体并且对例如HAT培养基的培养基敏感的细胞。这些细胞系可为鼠类骨髓瘤细胞系，其可例如从沙克研究院细胞分配中心(Salk Institute Cell DistributionCenter，San Diego，Calif.)和美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection，Manassas，Va)获得。还已阐述用于产生人类单克隆抗体的人类骨髓瘤和小鼠-人类异源骨髓瘤细胞系(Kozbor等人(1984)J.Immunol.133：3001-3005；Brodeur，B.等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications.Marcel Dekker，Inc.，New York.1987；33：51-63)。然后可测定培养杂交瘤细胞的培养基以用于确定单克隆抗体的存在。优选地，通过免疫沉淀或通过体外结合测定(例如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性(即特异性免疫反应性)。这些技术和测定是本领域技术人员已知的。可例如通过斯卡乍得分析(Scatchard analysis)(Munson(1980)Anal.Biochem.107：220-239)来测定单克隆抗体的结合特异性。在鉴定期望杂交瘤细胞之后，可通过限制性稀释程序亚克隆所述克隆并通过标准方法使其生长。适用于此目的的培养基包括例如达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)或RPMI-1640培养基。或者，可使杂交瘤细胞作为哺乳动物体内的腹水在体内生长。可通过常规免疫球蛋白纯化程序(例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、渗析或亲和色谱法)将由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基或腹水液分离或纯化。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的单克隆抗体还可通过重组DNA方法(例如美国专利第4,816,567号中所述者)制得。使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)可容易地分离编码本发明所涵盖的单克隆抗体的DNA并测序。本发明所涵盖的杂交瘤细胞用作DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染至原本不产生免疫球蛋白的宿主细胞(例如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)中以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可通过例如使用人类重链和轻链恒定结构域的编码序列代替同源鼠类序列(参见例如美国专利第4,816,567号)或通过共价接合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列来对DNA进行修饰。这种非免疫球蛋白多肽可代替本发明所涵盖抗体的恒定结构域，或者可代替本发明所涵盖抗体的可变结构域以产生嵌合二价抗体。

还可通过本领域众所周知的用于产生多克隆抗体的各种程序来产生本发明所涵盖的抗体。多克隆抗体产生通常涉及例如通过腹膜内和/或真皮内注射使用游离或与载体偶联的免疫原(例如靶抗原)将免疫原性宿主动物(例如兔、大鼠、小鼠、绵羊或山羊)免疫化。注射材料通常是含有约100μg免疫原或载体蛋白的乳液。可能需要例如以约两周的间隔实施若干加强注射以提供有用抗体效价，抗体效价可例如通过ELISA测定使用吸附至固体表面的游离肽来检测。可通过根据本领域众所周知的方法选择抗体(例如通过使肽吸附于固体载体上)并且洗脱所选抗体来增加来自免疫化动物的血清中的抗体效价。

c.抗体选择

期望抗体可选自基于针对靶抗原和/或其表位的亲和力和/或特异性的两种或更多种候选抗体的较大集合。在一些实施方案中，可使用抗体结合测定来实施抗体选择。这些测定可包括但不限于基于表面等离子体共振(SPR)的测定、ELISA和基于流式细胞术的测定。测定可利用靶抗原结合期望抗体并且然后使用一种或多种检测方法来检测结合。

在一些实施方案中，可使用高通量发现方法来选择和产生本发明所涵盖的抗体。在一个实施方案中，经由使用展示文库来产生本发明所涵盖的抗体。术语“展示”是指在给定展示宿主的表面上表达或“展示”蛋白质或肽。术语“文库”是指独特cDNA序列的集合体。文库可含有从少至两个独特cDNA至数千亿个独特cDNA。在一些实施方案中，使用抗体展示文库或抗体片段展示文库来产生包含合成抗体的检测剂。术语“抗体片段展示文库”是指其中每一成员编码含有抗体的至少一个可变区的抗体片段的展示文库。这些抗体片段优选是Fab片段，但也涵盖其他抗体片段(例如单链可变片段(scFv))。在Fab抗体片段文库中，所编码的每一Fab可相同，但含于Fab片段的互补决定区(CDR)的可变环内的氨基酸序列除外。在一个替代或其他实施方案中，个别VH和/或VL区内的氨基酸序列也可有所不同。

展示文库可表达于多种可能的宿主(在本文中称为“展示宿主”)，所述宿主包括但不限于酵母、细菌噬菌体(在本文中也称为“噬菌体”或“噬菌体颗粒”)、细菌和逆转录病毒。可使用的其他展示技术包括核糖体展示、微珠展示和蛋白质-DNA键联技术。在表达时，Fab会修饰宿主(例如噬菌体或酵母)的表面，在此它们可与给定靶抗原相互作用。可使用任何靶抗原来选择表达对所述靶标具有最高亲和力的抗体片段的展示宿主。然后可经由测序使用结合颗粒或细胞来测定编码结合抗体片段的可变结构域的DNA序列。在一些实施方案中，使用正向选择来开发抗体。术语“正向选择”是指基于针对含有期望靶位点的靶抗原的亲和力从展示文库选择抗体和/或其片段的过程。在一些实施方案中，利用负向选择来开发抗体。术语“负向选择”是指在抗体开发期间使用非靶标剂从给定展示文库排除抗体和/或其片段的过程。在一些实施方案中，在使用展示文库开发抗体时在多轮选择期间利用正向选择过程和负向选择过程。

在酵母展示中，将编码不同抗体片段的cDNA引入酵母细胞中，在此表达cDNA并且使抗体片段“展示”于细胞表面上，如由Chao等人(2006)Nat.Protoc.1：755-768所述。在酵母表面展示中，所表达抗体片段含有包含酵母凝集素蛋白Aga2p的其他结构域。该结构域容许抗体片段融合蛋白经由与表面表达的Aga1p形成二硫键而附接至酵母细胞的外表面。最终，酵母细胞涂覆于特定抗体片段中。最初利用编码这些抗体片段的cDNA的展示文库，其中抗体片段各自具有独特序列。这些融合蛋白表达于数百万个酵母细胞的细胞表面上，其中它们可与期望靶标(与细胞一起培育)相互作用。可使用化学或磁性基团以共价方式或以其他方式修饰靶标肽以容许在成功结合合适的抗体片段之后实现有效细胞分选。可通过以下方式进行回收：磁性活化细胞分选(MACS)、荧光活化细胞分选(FACS)或本领域已知的其他细胞分选方法。一旦选择出酵母细胞的亚群，就可分析相应质粒以测定所展示抗体片段的序列。

细菌噬菌体展示方法通常利用丝状噬菌体，包括fd、F1和M13病毒体。这些菌株是非裂解性，从而继续传播宿主并增加病毒效价。可用于制备本发明所涵盖抗体的噬菌体展示方法的实例包括公开于以下文献中者：Miersch等人(2012)Methods.57：486-498；Bradbury等人(2011)Nat.Biotechnol.29：245-254；Brinkman等人(1995)J.Immunol.Meth.182：41-50；Ames等人(1995)J.Immunol.Meth.184：177-186；Kettleborough等人(1994)Eur.J.Immunol.24：952-958)；Persic等人(1997)Gene 187：9-18)；PCT公开第PCT/GB91/01134号、第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/11236号、第WO 95/15982号和第WO 95/20401号；以及美国专利第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号和第5,969,108号。

可通过将编码片段的cDNA插入表达病毒外壳蛋白的基因中来进行细菌噬菌体上的抗体片段表达。丝状细菌噬菌体的病毒外壳是由5种由单链基因组编码的外壳蛋白构成。外壳蛋白pIII是用于抗体片段表达的优选蛋白质，其通常位于N末端处。如果抗体片段表达危害pIII功能，则可经由共表达野生型pIII来恢复病毒功能，但这种表达将减少表达于病毒外壳上的抗体片段的数量，但可增强靶标至抗体片段的可及性。病毒以及抗体片段蛋白质的表达可替代地编码于多个质粒上。这种方法可用于减小感染性质粒的总体大小并增强转化效率。噬菌体展示文库可包含数百万至数十亿个噬菌体颗粒，每一噬菌体颗粒在其病毒外壳上表达独特抗体片段。这些文库可提供可用于选择可能数百个针对一种或多种靶标具有不同亲和力水平的抗体片段的丰富资源(McCafferty等人(1990)Nature 348：552-554；Edwards等人(2003)JMB 334：103-118；Schofield等人(2007)Genome Biol.8：R254和Pershad等人(2010)Prot.Engm.Design Select.23：279-288)。通常，存在于这些文库中的抗体片段包含scFv抗体片段，所述抗体片段包含通过柔性接头(例如富Ser/Gly接头)接合的VH和VL抗体结构域的融合蛋白。这些片段通常首先包含VH结构域，但VL-接头-VH片段也涵盖于本文中。在一些情形下，除编码互补决定区(CDR)的可变环的独特序列外，scFv可含有相同序列。在一些情形下，scFv表达为连接至病毒外壳蛋白(例如病毒pIII外壳蛋白的N末端)的融合蛋白。VL链可单独表达以与VH链组装于周质中，然后将复合体并入病毒外壳中。

在一些实施方案中，噬菌体富集包括溶液相噬菌体富集，其中靶抗原存在于与噬菌体溶液组合的溶液中。根据这些方法，靶抗原可包含可检测标记(例如生物素标记)以促进从溶液的提取和结合噬菌体的回收。在其他实施方案中，溶液相噬菌体富集可包含使用结合至珠粒(例如抗生蛋白链菌素珠粒)的靶标。在一些情形下，这些珠粒可为磁性珠粒以促进沉淀。在其他实施方案中，噬菌体富集可包含固相富集，其中靶抗原固定于固体表面上。根据这些方法，可使用噬菌体溶液接触固体表面以富集经固定靶标。固体表面可包括任何能够保留靶标的表面并且可包括但不限于盘、板、烧瓶、膜和管。在一些情形下，可使用免疫管，其中所述管的内表面被靶抗原涂覆(例如通过使生物素化靶标通过用抗生蛋白链菌素或中和抗生物素蛋白(neutravidin)涂覆的管)。可通过使噬菌体溶液通过管以富集经结合靶标来使用免疫管进行噬菌体富集。

在选择之后，可使用结合噬菌体感染使用辅助噬菌体共感染的大肠杆菌培养物以产生用于下一轮富集的扩增输出文库。可重复该过程以产生越来越窄的克隆组。在一些实施方案中，限制富集轮数以改进所选噬菌体的多样性。可从结合噬菌体对沉淀文库成员测序以获得编码期望scFv的cDNA。可将这些序列直接并入抗体序列中以用于重组抗体产生，或者实施突变并用于经由体外亲和力成熟进行进一步优化。可合成包含一个或多个来自所选scFv的可变结构域的IgG抗体以用于进一步测试和/或产品开发。这类抗体可通过将一个或多个scFv cDNA区段插入适于IgG产生的表达载体中来产生。

d.抗体工程化

如上所述，可用于产生抗体和抗体片段(例如Fab和scFv)的技术是本领域众所周知的并且包括阐述于以下文献中者：美国专利第4,946,778号和第5,258,498号；Miersch等人(2012)Methods 57：486-498；Chao等人(2006)Nat.Protoc.1：755-768)；Huston等人(1991)Methods Enzymol.203：46-88；Shu等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：7995-7999；和Skerra等人(1988)Science 240：1038-1041)。

在分离或选择靶抗原特异性抗体之后，可使用抗体序列来重组产生和/或优化这类抗体。在从展示文库分离抗体片段的情形下，可使用来自所分离片段的编码区来生成全抗体(包括人类抗体)或任何其他期望靶标结合片段，并且表达于任何期望宿主(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌)中，例如如下文详细所述。如果期望，则可从根据本文所述方法产生或选择的可变结构域片段来合成IgG抗体(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)以用于进一步测试和/或产品开发。可通过将一个或多个编码期望氨基酸序列的cDNA区段插入适于IgG产生的表达载体中来产生这类抗体。表达载体可包含适用于哺乳动物细胞中的IgG表达的哺乳动物表达载体。可实施哺乳动物IgG表达以确保所产生抗体包含哺乳动物蛋白的修饰(例如糖基化)特性，和/或确保抗体制剂并无可存在于来自细菌表达系统的蛋白质制剂中的内毒素和/或其他污染物。

在一些实施方案中，实施亲和力成熟。术语“亲和力成熟”是指经由连续数轮突变和选择编码抗体或抗体片段的cDNA序列来产生对给定靶标具有增加的亲和力的抗体的方法。在一些情形下，在体外实施该过程。为实现该过程，可使用易错PCR扩增可变结构域序列(在一些情形下限于CDR编码序列)以产生数百万个含有突变(包括但不限于点突变、区域突变、插入突变和缺失突变)的拷贝。如本文所用，术语“点突变”是指其中核苷酸序列内的一个核苷酸变为不同核苷酸的核酸突变。如本文所用，术语“区域突变”是指其中两个或更多个连续核苷酸变为不同核苷酸的核酸突变。如本文所用，术语“插入突变”是指其中将一个或多个核苷酸插入核苷酸序列中的核酸突变。如本文所用，术语“缺失突变”是指其中从核苷酸序列去除一个或多个核苷酸的核酸突变。插入或缺失突变可包括完全代替整个密码子或通过改变起始密码子的一或两个核苷酸来将一个密码子变为另一密码子。

可在编码CDR的cDNA序列上实施诱变以产生数百万个在重链和轻链CDR区中具有单一突变的突变体。在另一种方法中，仅在最可能改进亲和力的CDR残基处引入随机突变。可使用这些新生诱变文库重复所述过程以筛选编码对靶标肽具有极高亲和力的抗体片段的克隆。连续数轮突变和选择可促进具有越来越大亲和力的克隆的合成(参见例如Chao等人(2006)Nat.Protoc.1：755-768)。

可基于如通过结合测定(例如FACS、ELISA、表面等离子体共振等)所测定的亲和力来选择亲和力成熟的克隆。然后可将所选克隆转变成IgG并且进一步测试亲和力和功能活性。在一些情形下，亲和力优化的目标是与原始抗体的亲和力相比将亲和力增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1,000倍或更高倍。在优化亲和力小于期望的情形下，可重复所述过程。

在一些实施方案中，生成嵌合和/或人源化抗体是有用的。例如，对于一些应用(包括抗体在人类中的体内应用和体外检测测定)来说，可优选使用嵌合、人源化或人类抗体。嵌合抗体是其中不同抗体部分源自不同动物物种的分子，例如具有源自鼠类单克隆免疫球蛋白的可变区和人类免疫球蛋白恒定区的抗体。产生嵌合抗体的方法是本领域众所周知的(参见例如Morrison(1985)Science 229：1202-1207；Gillies等人(1989)J.Immunol.Meth.125：191-202；以及美国专利第5,807,715号、第4,816,567号和第4,816,397号)。

人源化抗体是来自非人类物种的抗体分子，其结合至期望靶标并且具有一个或多个来自非人类物种的互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。通常，人类框架区中的框架残基被来自供体抗体的CDR和框架区的相应残基取代以改变、优选地改进靶标结合。这些框架取代是通过本领域众所周知的方法来鉴定，例如通过对CDR与框架残基的相互作用建模以鉴定对靶标结合至关重要的框架残基，以及通过比较序列以鉴定特定位置的不寻常框架残基(参见例如美国专利第5,693,762号和第5,585,089号；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-327)。

可使用本领域已知的各种技术使抗体人源化，所述技术包括例如CDR移植(参见例如欧洲专利公开第239,400号；PCT公开第WO 91/09967号；美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号)；饰面或表面重整(参见例如欧洲专利公开第592,106号；欧洲专利公开第519,596号；Padlan(1991)Mol.Immunol.28：489-498；Studnicka等人(1994)Protein Eng.7：805-814；Roguska等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：969-973)；以及链改组(参见例如美国专利第5,565,332号)。

完全人类抗体特别期望用于治疗性治疗人类患者，以避免或缓解对外来蛋白质的免疫反应。人类抗体可通过本领域已知的各种方法制得，包括使用源自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的上述抗体展示方法(参见例如美国专利第4,444,887号和第4,716,111号；以及PCT公开第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO 98/24893号、第WO 98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号和第WO 91/10741号)。还可使用不能表达功能内源性免疫球蛋白但可表达人类免疫球蛋白多核苷酸的转基因小鼠来产生人类抗体。例如，可随机或通过同源重组将人类重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸复合物引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除人类重链和轻链多核苷酸外，还可将人类可变区、恒定区和多样化区引入小鼠胚胎干细胞中。可分别地或与通过同源重组引入人类免疫球蛋白基因座同时使小鼠重链和轻链免疫球蛋白多核苷酸变为非功能性。特别是，JH区的纯合缺失可防止内源性抗体产生。将经修饰的胚胎干细胞扩增并微注射至胚泡中以产生嵌合小鼠。然后将嵌合小鼠育种以产生表达人类抗体的纯合后代。以常用方式使用所选免疫原(例如靶抗原)对转基因小鼠实施免疫。使用这种技术，可产生有用人类IgG、IgA、IgM、IgD和IgE抗体。如上文所阐释，产生人类抗体和人类单克隆抗体的方法以及产生这类抗体的方案是本领域众所周知的(还参见例如PCT公开第WO 98/24893号、第WO 92/01047号、第WO 96/34096号和第WO 96/33735号；以及美国专利第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、第5,885,793号、第5,916,771号、第5,939,598号、第6,075,181号和第6,114,598号)。

一旦已通过动物、细胞系产生本发明所涵盖的抗体分子，以化学方式合成或以重组方式表达，就可通过本领域已知的任何方法纯化(即分离)以纯化免疫球蛋白或多肽分子，所述方法是例如通过色谱法(例如离子交换色谱法、亲和色谱法，特别是用于特定靶标的亲和色谱法、蛋白质A色谱法和粒度分级柱色谱法)、离心、差别溶解性或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。另外，本发明所涵盖的抗体或其片段可与本文所述或以其他方式为本领域已知的异源多肽序列融合以促进纯化。

根据本发明，特异性结合至抗原的抗体可存在于溶液中或结合至底物。在一些实施方案中，抗体结合至纤维素纳米珠粒并限制于检测装置的基板的一个或多个检测区域中。

e.抗体表征

可通过一种或多种选自由以下组成的组的特性来表征本发明所涵盖的抗体：结构、同种型、结合(例如亲和力和特异性)、缀合、糖基化和其他区分特征。

本发明所涵盖的抗体可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，这些抗体是人类、鼠类(例如小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡来源的抗体。本发明所涵盖的抗体可为单特异性或多特异性。多特异性抗体可对本发明所涵盖肽的不同表位具有特异性，或者可对本发明所涵盖的肽和异源性表位(例如异源性肽或固体载体材料)具有特异性(参见例如PCT公开第WO 93/17715号、第WO 92/08802号、第WO 91/00360号和第WO92/05793号；Tutt等人(1991)J.Immunol.147：60-69；美国专利第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号和第5,601,819号；以及Kostelny等人(1992)J.Immunol.148：1547-1553)。例如，可针对含有本发明所涵盖肽序列的重复单元的肽产生抗体，或者它们可针对含有两个或更多个本发明所涵盖的肽序列的肽产生，或它们的组合。作为一个非限制性实例，已设计异源二价配体(HBL)系统，其竞争性抑制抗原结合至肥大细胞结合的IgE抗体，由此抑制肥大细胞脱粒(Handlogten等人(2011)Chem.Biol.18：1179-1188)。

可相对于标准物在正常生理学条件下在体外或体内测定抗体特性。还可相对于抗体的存在或不存在来进行测量。这类测量方法包括组织或流体(例如血清或血液)中的标准测量，例如Western印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、活性测定、报告基因测定、荧光素酶测定、聚合酶链反应(PCR)阵列、基因阵列、实时逆转录酶(RT)PCR等。

抗体可结合靶蛋白上或沿靶蛋白的任何数量的位置或与其相互作用。所涵盖抗体靶位点包括靶蛋白上的任何和所有可能的位点。可针对结合(可逆地或不可逆地)至特定靶标上的一个或多个表位的能力来选择抗体。靶标上的表位可包括但不限于一个或多个特征、区域、结构域、化学基团、官能团或部分。这些表位可由以下各项构成：一个或多个原子、原子团、原子结构、分子结构、环状结构、疏水性结构、亲水性结构、糖、脂质、氨基酸、肽、糖肽、核酸分子或任何其他抗原结构。

f.抗体缀合物

在一些实施方案中，可根据本领域众所周知的方法使本发明所涵盖的抗体与一种或多种用于检测目的可检测标记缀合。标记可为放射性同位素、荧光化合物、化学发光化合物、酶或酶辅因子，或本领域已知的任何其他标记。在一些实施方案中，结合至期望靶标的抗体(在本文中也称为“一级抗体”)未经标记，但可通过结合特异性结合至一级抗体的第二抗体(在本文中称为“二级抗体”)来进行检测。根据这些方法，二级抗体可包括可检测标记。

在一些实施方案中，可附接至抗体的酶可包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶(GOx)。荧光化合物可包括但不限于溴化乙锭(ethidiumbromide)；荧光黄和其衍生物(例如FITC)；花青和其衍生物(例如吲哚羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青和部花青)；罗丹明；俄勒冈绿(oregon green)；曙红(eosin)；得克萨斯红(texas red)；尼罗红(nile red)；尼罗蓝(nile blue)；甲酚紫；噁嗪170；原黄素(proflavin)；吖啶橙；吖啶黄；金胺；结晶紫；孔雀绿；卟吩；酞菁；胆红素；别藻蓝蛋白(APC)；绿色荧光蛋白(GFP)和其变体(例如黄色荧光蛋白YFP、蓝色荧光蛋白BFP和青色荧光蛋白CFP)；

在一些实施方案中，本发明涵盖抗体-药物缀合物(ADC)剂。ADC是抗体与另一部分的缀合物，使得所述剂具有由抗体赋予的靶向能力和由所述部分赋予的另一效应。例如，可使细胞毒性药物栓系至单克隆抗体，所述单克隆抗体使所述药物靶向有助于疾病进展(例如肿瘤进展)的所关注细胞并且在内化后向细胞释放其毒性有效载荷。不同效应是基于如上文所述的缀合部分来实现。

4.

在另一方面，本发明涵盖小分子剂。小分子可为本文所述的生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的抑制剂、活化剂或调节剂。术语“小分子”是指可帮助调控生物过程的约10

小分子还可包括那些化合物的结晶和非晶形式，包括例如所述化合物的多晶型、假多晶型、溶剂化物、水合物、未溶剂化多晶型(包括无水物)、构形多晶型和非晶形式以及它们的混合物。除非预指特定结晶或非晶形式，否则术语“结晶形式”和“多晶型”旨在包括化合物的所有结晶和非晶形式，包括例如多晶型、假多晶型、溶剂化物、水合物、未溶剂化多晶型(包括无水物)、构形多晶型和非晶形式以及它们的混合物。

结合至并调节靶标基因和/或基因产物的已知小分子以及关于所影响生物活性和途径的信息可容易地从可公开获得的数据库(例如Drugbank、PharmGKB、MedChemExpress和Selleckchem)获得。

5.

在另一方面，涵盖基于细胞的药剂。在一些实施方案中，操纵单核细胞和/或巨噬细胞(例如与一种或多种药剂接触)以调节本发明所涵盖的一种或多种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)。例如，可使经培养细胞和/或原代细胞与药剂接触，处理，并且引入测定、受试者等中。这些细胞的子代由本文所述的基于细胞的药剂涵盖。

在一些实施方案中，以重组方式工程化单核细胞和/或巨噬细胞以调节本发明所涵盖的一种或多种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)。例如，如上所述，可使用基因组编辑来调节所关注生物标志物的拷贝数或基因序列，例如所关注生物标志物的组成型或诱导型敲除或突变。例如，可使用CRISPR-Cas系统来精确编辑基因组核酸(例如用于产生非功能或无效突变)。在这些实施方案中，可表达CRISPR向导RNA和/或Cas酶。例如，可将仅含向导RNA的载体施用于Cas9酶转基因动物或细胞。可使用类似策略(例如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)或归巢大范围核酸酶(HE)，例如MegaTAL、MegaTev、Tev-mTALEN、CPF1等)。这些系统是本领域众所周知的(参见例如美国专利第8,697,359号；Sander和Joung(2014)Nat.Biotech.32：347-355；Hale等人(2009)Cell139：945-956；Karginov和Hannon(2010)Mol.Cell37：7；美国专利公开第2014/0087426号和第2012/0178169号；Boch等人(2011)Nat.Biotech.29：135-136；Boch等人(2009)Science326：1509-1512；Moscou和Bogdanove(2009)Science 326：1501；Weber等人(2011)PLoS One6：e19722；Li等人(2011)Nucl.Acids Res.39：6315-6325；Zhang等人(2011)Nat.Biotech.29：149-153；Miller等人(2011)Nat.Biotech.29：143-148；Lin等人(2014)Nucl.Acids Res.42：e47)。这些基因策略可根据本领域众所周知的方法使用组成型表达系统或诱导型表达系统。

基于细胞的药剂与受试者宿主具有免疫相容性关系并且任何这种关系涵盖用于本发明中。例如，细胞(例如过继性单核细胞和/或巨噬细胞、T细胞等)可为同基因的。术语“同基因”可指衍生自、源于或为相同物种的成员的状态，所述成员在基因上相同，特别是在抗原或免疫学反应方面。这些情形包括具有匹配MHC类型的同卵双胞胎。因此，“同基因移植”是指将供体细胞转移至在与供体在基因上相同或足够免疫学相容以容许移植而无不期望不良免疫原性反应(例如不利于诠释本文所述的免疫学筛选结果)的接受者。

如果所转移细胞是获自并移植至同一受试者，则同基因移植可为“自体”的。“自体移植”是指收获并再输注或移植受试者的自身细胞或器官。排他性或补充性使用自体细胞可消除或减少将细胞施用回宿主的许多不良作用，特别是移植物抗宿主反应。

如果所转移细胞是获自并移植至相同物种的不同成员，但具有足够匹配的主要组织相容性复合物(MHC)抗原以避免不良免疫原性反应，则同基因移植可为“匹配同种异体”的。可根据本领域已知和使用的标准测试来测定MHC错配程度。例如，在人类中存在至少6大类鉴定为在移植生物学中较为重要的MHC基因。HLA-A、HLA-B、HLA-C编码I类HLA蛋白质，而HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP编码II类HLA蛋白质。这些群组中的每一者内的基因高度多型，如在发现于人类群体中的众多HLA等位基因或变体中所反映，并且这些组的个体间差异与针对移植细胞的免疫反应的强度相关。测定MHC匹配程度的标准方法可检查HLA-B和HLA-DR、或HLA-A、HLA-B和HLA-DR组内的等位基因。因此，可分别测试两个或三个HLA组内的至少4种和甚至5或6种MHC抗原。在血清学MHC测试中，使针对每一HLA抗原类型的抗体与来自一个受试者(例如供体)的细胞进行反应以测定与抗体反应的某些MHC抗原的存在或不存在。将这个结果与另一受试者(例如接受者)的反应性特征进行比较。通常通过以下方式来测定抗体与MHC抗原的反应：使抗体与细胞一起培育，并且然后添加补体以诱导细胞裂解(即淋巴细胞毒性测试)。检查反应并根据反应中所裂解的细胞量来分级(参见例如Mickelson和Petersdorf(1999)Hematopoietic Cell Transplantation，Thomas，E.D.等人编辑，第28-37页，Blackwell Scientific，Malden，Mass.)。其他基于细胞的测定包括使用经标记抗体的流式细胞术或酶联免疫测定(ELISA)。测定MHC类型的分子方法是众所周知的并且通常采用合成探针和/或引物来检测编码HLA蛋白的特异性基因序列。可使用合成寡核苷酸作为杂交探针来检测与特定HLA类型相关的限制片段长度多态性(Vaughn(2002)Method.Mol.Biol.MHC Protocol.210：45-60)。或者，可使用引物来扩增HLA序列(例如通过聚合酶链反应或连接链反应)，其产物可进一步通过直接DNA测序、限制片段多态性分析(RFLP)或与一系列序列特异性寡核苷酸引物(SSOP)杂交进行检查(Petersdorf等人(1998)Blood 92：3515-3520；Morishima等人(2002)Blood 99：4200-4206；以及Middleton和Williams(2002)Method.Mol.Biol.MHC Protocol.210：67-112)。

如果所转移细胞和受试者细胞通常因近亲交配而在限定基因座(例如单一基因座)中有所不同，则同基因移植可为“同基因型”。术语“同基因型”是指衍生自、源于或为相同物种的成员，其中所述成员除小基因区域(通常是单一遗传基因座，即单一基因)外在基因上相同。“同基因型移植”是指将细胞或器官从供体转移至接受者并且其中接受者与供体除单一遗传基因座外在基因上相同。例如，CD45是以若干等位基因形式存在，并且存在同基因型小鼠系，其中所述小鼠系在是否表达CD45.1或CD45.2等位基因方面有所不同。

与之相比，“错配同种异体”是指衍生自、源于或为相同物种中具有足以诱发不良免疫原性反应的不同主要组织相容性复合物(MHC)抗原(即蛋白质)的成员，如通常通过本领域所用的标准测定(例如限定数量的MHC抗原的血清学或分子分析)所测定。“部分错配”是指在成员之间、通常在供体与接受者之间测得的MHC抗原的部分匹配。例如，“半错配”是指50％的MHC抗原测试为在两个成员之间显示不同MHC抗原类型。“全”或“完全”错配是指所有MHC抗原都测试为在两个成员之间不同。

类似地，与之相比，“异基因”是指衍生自、源于或为不同物种(例如人类和啮齿动物、人类和猪、人类和黑猩猩等)的成员。“异基因移植”是指将细胞或器官从供体转移至接受者并且其中接受者是不同于供体的物种。

另外，可从单一来源或多个来源(例如单一受试者或多个受试者)获得细胞。多个是指至少两个(例如一个以上)。在再一个实施方案中，非人类哺乳动物是小鼠。获得所关注细胞类型的动物可为成人、新生(例如小于48小时)、不成熟或子宫内动物。所关注细胞类型可为原代癌细胞、癌症干细胞、确立癌细胞系、永生化原代癌细胞等。在某些实施方案中，宿主受试者的免疫系统可经工程化或另外选择以与所移植癌细胞免疫学相容。例如，在一个实施方案中，可使受试者“人源化”以与人类癌细胞相容。术语“免疫系统人源化”是指包含人类HSC谱系细胞和人类获得性和先天性免疫细胞的动物(例如小鼠)，所述细胞可存活而不从宿主动物排斥，由此容许人类造血作用以及获得性和先天性免疫性重构于宿主动物中。获得性免疫细胞包括T细胞和B细胞。先天性免疫细胞包括巨噬细胞、颗粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞)、DC、NK细胞和肥大细胞。代表性、非限制性实例包括SCID-hu、Hu-PBL-SCID、Hu-SRC-SCID、NSG(NOD-SCID IL2r-γ(无效)缺乏先天性免疫系统、B细胞、T细胞和细胞因子信号传导)、NOG(NOD-SCID IL2r-γ(截短))、BRG(BALB/c-Rag2(无效)IL2r-γ(无效))和H2dRG(Stock-H2d-Rag2(无效)IL2r-γ(无效))小鼠(参见例如Shultz等人(2007)Nat.Rev.Immunol.7：118；Pearson等人(2008)Curr.Protocol.Immunol.15：21；Brehm等人(2010)Clin.Immunol.135：84-98；McCune等人(1988)Science 241：1632-1639；美国专利7,960,175以及美国专利公开第2006/0161996号)以及免疫相关基因的相关无效突变体如Rag1(缺乏B和T细胞)、Rag2(缺乏B和T细胞)、TCRα(缺乏T细胞)、穿孔素(cD8+ T细胞缺乏细胞毒性功能)、FoxP3(缺乏功能性CD4+ T调控细胞)、IL2rg或Prfl，以及PD-1、PD-L1、Tim3和/或2B4的突变体或敲除物，其容许有效植入人类免疫细胞和/或提供免疫受损动物如小鼠的腔室特异性模型(参见例如PCT公开第WO2013/062134号)。另外，NSG-CD34+(NOD-SCID IL2r-γ(无效)CD34+)人源化小鼠可用于研究动物模型如小鼠中的人类基因和肿瘤活性。

如本文所用，从生物材料来源“获得”意指从供体收获或分配生物材料来源的任何常规方法。例如，生物材料可从实体肿瘤、血样(例如外周血或脐带血样品)获得，或从另一体液(例如骨髓液或羊水)收获。用于获得这类样品的方法的本领域技术人员众所周知的。在本发明中，样品可为新鲜样品(即从供体获得并且未冷冻)。此外，可在扩增之前进一步操纵样品以去除外源性或不期望组分。还可从保存储备液获得样品。例如，在细胞系或流体(例如外周血或脐带血)的情形下，可从这些细胞系或流体的低温或其他保存库提取样品。可从任何合适供体获得这些样品。

所获得细胞群体可直接使用或经冷冻以待以后使用。本领域已知用于冷冻保存的各种介质和方案。通常，冷冻介质包含约5-10％DMSO、10-90％血清白蛋白和50-90％培养基。可用于保存细胞的其他添加剂包括(例如但不限于)二糖(例如海藻糖)(Scheinkonig等人(2004)Bone Marrow Transplant.34：531-536)或血浆增容剂(例如羟乙基淀粉(hetastarch))(即羟乙基淀粉)。在一些实施方案中，可使用等渗缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。示例性冷冻保存组合物具有含有4％HSA、7.5％二甲基亚砜(DMSO)和2％羟乙基淀粉的细胞培养基。用于冷冻保存的其他组合物和方法是众所周知的并且在本领域中有所阐述(参见例如Broxmeyer等人(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：645-650)。在小于约-135℃的最终温度下保存细胞。

在一些实施方案中，免疫疗法可为CAR(嵌合抗原受体)-T疗法，其中T细胞经工程化以表达包含对所关注肿瘤细胞上的抗原具有特异性的抗原结合结构域的CAR。术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指具有期望抗原特异性和信号传导结构域以在抗原结合时传播细胞内信号的受体。例如，T淋巴细胞经由T细胞受体(TCR)与由I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的短肽的相互作用来识别特异性抗原。对于初始活化和克隆扩增来说，未处理T细胞依赖于提供其他共刺激信号的专职性抗原呈递细胞(APC)。在不存在共刺激下的TCR活化可产生不反应性和克隆无变应性。为绕过免疫化，已开发用于衍生具有移植识别特异性的细胞毒性效应细胞的不同方法。已构建由源自对TCR相关CD3复合物的细胞表面组分具有特异性的天然配体或抗体的结合结构域组成的CAR。在抗原结合时，这些嵌合抗原受体连接至效应细胞中的内源性信号通路并生成类似于由TCR复合物所引发信号的活化信号。自关于嵌合抗原受体的首次报告开始，这种概念已逐步完善并已优化嵌合受体的分子设计，并且通常使用任何数量的众所周知的结合结构域(例如scFV、Fav和本文所述的另一蛋白质结合片段)。

在一些实施方案中，可将单核细胞和巨噬细胞工程化以例如表达嵌合抗原受体(CAR)。经修饰细胞可募集至肿瘤微环境，在此其通过浸润肿瘤并杀伤靶标癌细胞而用作强力免疫效应物。CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。抗原结合结构域结合至靶细胞上的抗原。可用作结合至CAR的抗原结合结构域的抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌、寄生虫感染、自身免疫疾病和癌细胞相关者(例如肿瘤抗原)。

在一个实施方案中，抗原结合结构域结合至肿瘤抗原(例如对所关注肿瘤或癌症具有特异性的抗原)。肿瘤相关抗原的非限制性实例包括BCMA、CD19、CD24、CD33、CD38；CD44v6、CD123、CD22、CD30、CD117、CD171、CEA、CS-1、CLL-1、EGFR、ERBB2、EGFRvIII、FLT3、GD2、NY-BR-1、NY-ESO-1、p53、PRSS21、PSMA、ROR1、TAG72、Tn Ag、VEGFR2。

在一个实施方案中，跨膜结构域与CAR中的一个或多个结构域天然缔合。跨膜结构域可源自天然或合成来源。特定用于本发明中的跨膜区可源自(即包含至少其跨膜区)T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的α、β或ζ链。在一些情况下，还可采用各种人类铰链，包括人类Ig(免疫球蛋白)铰链。

在一个实施方案中，CAR的细胞内结构域包括负责信号活化和/或转导的结构域。细胞内结构域的实例包括来自一种或多种包括但不限于以下的分子或受体的片段或结构域：TCR、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD86、共有FcRγ、FcRβ(FcεRib)、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP 12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD l id、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、LFA-1、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDllc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAMl、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD 162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll样受体1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、本文所述的其他共刺激分子，其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，和其任何组合。

在一些实施方案中，可使用本发明所涵盖的药剂、组合物和方法来再工程化单核细胞和巨噬细胞以增加其将抗原呈递至其他免疫效应细胞(例如T细胞)的能力。作为抗原呈递细胞(APC)的工程化单核细胞和巨噬细胞将处理肿瘤抗原并且将抗原性表位呈递至T细胞以刺激攻击肿瘤细胞的适应性免疫反应。

V.

本文所述的组合物和药剂可用于关于本文所述的生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的各种调节、治疗、筛选、诊断、预后和治疗应用中。在本文所述的任何方法(例如调节方法、治疗方法、筛选方法、诊断方法、预后方法或它们的组合)中，所述方法的所有步骤可由单一行动者或替代地由一个以上行动者来实施。例如，可由提供治疗性治疗的行动者直接实施诊断。或者，提供治疗剂者可要求实施诊断测定。诊断医师或治疗干预者可诠释诊断测定结果以确定治疗策略。类似地，这些替代过程可应用于其他测定(例如预后测定)。

另外，本文所述的本发明的任何方面可单独实施，或与本发明的任何其他方面(包括其一个、一个以上或所有实施方案)组合实施。例如，可单独或与治疗步骤组合实施诊断和/或筛选方法，从而例如在确定适当诊断和/或筛选结果后提供适当的疗法。

1.

本发明所涵盖的一个方面涉及调节本文所述的至少一种生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出的一种或多种靶标)的拷贝数、量(例如表达)和/或活性(例如调节亚细胞定位)以例如用于治疗目的方法。这些药剂可用于操纵单核细胞和/或巨噬细胞的特定亚群并且调控生理学条件中的其数量和/或活性，并且用于治疗巨噬细胞相关疾病和其他临床疾患。例如，本发明所涵盖的药剂(包括组合物和药物制剂)可调节生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出的至少一种靶标)的拷贝数、量和/或活性以由此调节单核细胞和/或巨噬细胞的发炎表型并且进一步调节免疫反应。在一些实施方案中，调节细胞活性(例如细胞因子分泌、细胞群体比率等)，而非调节免疫反应本身。提供使用本文所公开的药剂、组合物和制剂来调节单核细胞和巨噬细胞发炎表型的方法。因此，所述药剂、组合物和方法可用于通过以下方式来调节免疫反应：调节生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出的至少一种靶标)的拷贝数、量和/或活性，消耗或富集某些类型的细胞，和/或调节细胞类型的比率。例如，表1和/或表2中所列出的某些靶标是细胞存活所需，因此抑制所述靶标可引起细胞死亡。这种调节可用于调节免疫反应，因为介导免疫反应的细胞类型的比率(例如促炎细胞对抗炎细胞)得以调节。在一些实施方案中，使用所述药剂来治疗患有癌症的受试者的癌症。

本公开证实，下调巨噬细胞中的这些基因的表达可再极化巨噬细胞(例如改变其表型)。在一些实施方案中，改变M2巨噬细胞的表型以产生具有1型(M2样)或M1表型的巨噬细胞，或关于M1巨噬细胞和2型(M2样)或M2表型反之亦然。在一些实施方案中，使用本发明所涵盖的药剂来调节(例如抑制)具有M2表型的单核细胞和巨噬细胞的输送、极化和/或活化，或关于1型和M1巨噬细胞反之亦然。本发明另外提供减少所关注单核细胞和/或巨噬细胞(例如M1巨噬细胞、M2巨噬细胞(例如肿瘤中的TAM)等)的群体的方法。

在一些实施方案中，本发明提供改变单核细胞和/或巨噬细胞(包括其亚型，例如促肿瘤巨噬细胞和抗肿瘤巨噬细胞)的分布的方法。在一个实例中，本发明提供将巨噬细胞从抗炎免疫反应驱向促炎免疫反应并且反之亦然的方法。细胞类型可消耗和/或富集5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高或其间的任何范围(包括端值，例如45-55％)。

在一些实施方案中，调节发生于细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或其他吞噬细胞(如树突状细胞))中。在一些实施方案中，细胞是巨噬细胞亚型，例如本文所述的巨噬细胞亚型。例如，巨噬细胞可为组织驻留型巨噬细胞(TAM)或衍生自血流中的循环单核细胞的巨噬细胞。

在一些实施方案中，调节单核细胞和/或巨噬细胞发炎表型可产生期望的经调节免疫反应，例如异常单核细胞迁移和增殖的调节、组织驻留型巨噬细胞的未调控增殖、未调控促炎巨噬细胞、未调控抗炎巨噬细胞、组织中的促炎和抗炎巨噬细胞亚群的不平衡分布、疾病疾患中异常采用的单核细胞和巨噬细胞的活化状态、经调节细胞毒性T细胞活化和功能、克服癌细胞对疗法的抗性和癌细胞对免疫疗法(例如免疫检查点疗法)的敏感性。在一些实施方案中，逆转这些表型。

治疗和/或预防与单核细胞和巨噬细胞相关的疾病的方法包括使细胞与本发明所涵盖的药剂和组合物体外、离体或体内(例如施用于受试者)接触，其中所述药剂和组合物操纵单核细胞和巨噬细胞的迁移、募集、分化和极化、活化、功能和/或存活。在一些实施方案中，调节本发明所涵盖的一种或多种生物标志物可用于调节(例如抑制或消耗)组织微环境(例如肿瘤组织)中的单核细胞和巨噬细胞的增殖、募集、极化和/或活化。

在本发明所涵盖的一个方面，提供减小单核细胞和/或巨噬细胞的抗炎活性的方法。

在本发明所涵盖的另一方面，提供增加单核细胞和/或巨噬细胞的促炎活性的方法。

在本发明所涵盖的另一方面，提供平衡组织中的促炎单核细胞和巨噬细胞和抗炎单核细胞和巨噬细胞的方法。

本发明所涵盖的调节方法涉及使细胞与一种或多种本发明所涵盖的生物标志物(包括本发明所涵盖的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)，包括表1、表2和实施例中所列出的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标))或其片段的调节剂或调节与细胞相关的生物标志物活性中的一种或多种活性的药剂接触。调节生物标志物活性的药剂可为如本文所述的药剂，例如核酸或多肽、生物标志物的天然结合伴侣、针对生物标志物的抗体、针对生物标志物的抗体和针对其他免疫相关靶标的抗体的组合、至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)激动剂或拮抗剂、至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)激动剂或拮抗剂的肽模拟物、至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)肽模拟物、其他小分子或针对至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)核酸基因表达产物的小RNA或其模拟物。

调节本发明所涵盖的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)(包括本发明所涵盖的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)，包括表1、表2和实施例中所列出的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标))或其片段的表达的药剂是例如反义核酸分子、RNAi分子、shRNA、成熟miRNA、miRNA前体、初级miRNA、miRNA*、抗miRNA或miRNA结合位点或其变体或其他小RNA分子、三元寡核苷酸、核酶或用于表达至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)多肽的重组载体。例如，可合成与至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)多肽翻译起始位点的周围区域互补的寡核苷酸。可通常以200μg/ml将一个或多个反义寡核苷酸添加至细胞培养基中或施用于患者以防止至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)多肽的合成。反义寡核苷酸由细胞吸收并且杂交至至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)mRNA以防止翻译。或者，可使用结合双链DNA以形成三元构建体来防止DNA解开和转录的寡核苷酸。出于任何情形，生物标志物多肽的合成得以阻断。在调节生物标志物表达时，这种调节可通过除敲除生物标志物基因外的方式进行。

鉴于调节表达的药剂实际上控制细胞中的生物标志物的量，因此其还调节细胞中的生物标志物活性的总量。

在一个实施方案中，所述药剂刺激本发明所涵盖的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)(包括表1和实施例中所列出的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标))或其片段的一种或多种活性。这类刺激剂的实例包括活性生物标志物多肽或其片段和引入细胞中的编码生物标志物或其片段的核酸分子(例如cDNA、mRNA、shRNA、siRNA、小RNA、成熟miRNA、miRNA前体、初级miRNA、miRNA*、抗miRNA或miRNA结合位点或其变体或本领域技术人员已知的其他功能等效分子)。在另一个实施方案中，所述药剂抑制一种或多种生物标志物活性。在一个实施方案中，所述药剂抑制或增强生物标志物与其天然结合伴侣的相互作用。这类抑制剂的实例包括反义核酸分子、抗生物标志物抗体、生物标志物抑制剂和本文所述筛选测定中所鉴定的化合物。

在一些实施方案中，一种或多种生物标志物是本文所述的一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种等(最多并且包括所有)生物标志物和其间的任何范围(例如表1和/或表2中所列出的2-4种靶标)。

这些调节方法可在体外实施(例如通过使细胞与药剂接触)，或替代地通过使药剂与细胞在体内接触来实施(例如通过向受试者施用药剂)。在一些实施方案中，可在接种疫苗期间使用本发明所涵盖的药剂、组合物和方法来调节单核细胞和/或巨噬细胞。疫苗保护通常需要诱导促炎细胞因子。一种潜在治疗干预可为在接种疫苗期间操纵单核细胞和/或巨噬细胞群体以例如最小化调控性巨噬细胞的诱导。

a.受试者

本发明提供治疗患有疾患或病症的受试者的方法，所述疾患或病症将受益于上调或下调表1和/或表2和实施例中列出的本发明所涵盖的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)或其片段，例如特征在于生物标志物或其片段的不期望、不充分或异常表达或活性的病症。在一个实施方案中，所述方法涉及施用调节(例如上调或下调)生物标志物表达或活性的药剂(例如通过本文所述的筛选测定鉴定的药剂)或药剂组合。在另一个实施方案中，所述方法涉及以疗法形式施用至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)多肽或核酸分子以补偿减小、异常或不期望的生物标志物表达或活性。可根据本文所述的方法和其他方法(例如也阐述于本文中者)来治疗需要疗法的受试者，可与这些治疗方法(例如用以诊断、预后、监测等的方法)进行组合(例如调节经证实以表达所关注生物标志物的单核细胞和/或巨噬细胞的群体，和包含这些单核细胞和/或巨噬细胞的受试者)。

在生物标志物异常下调和/或增加的生物标志物活性很可能具有有益作用的情形下，期望刺激生物标志物活性。同样，在生物标志物异常上调和/或降低的生物标志物活性很可能具有有益作用的情形下，期望抑制生物标志物活性。

在一些实施方案中，受试者是动物。动物可为任一性别并且可处于任何发育阶段。在一些实施方案中，动物是脊椎动物，例如哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是非人类哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是家养动物，例如狗、猫、牛、猪、马、绵羊或山羊。在一些实施方案中，受试者是伴侣动物，例如狗或猫。在一些实施方案中，受试者是家畜动物，例如牛、猪、马、绵羊或山羊。在一些实施方案中，受试者是动物园动物。在一些实施方案中，受试者是研究动物，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、狗、猪或非人类灵长类动物。在一些实施方案中，动物是经基因工程化的动物。在一些实施方案中，动物是转基因动物(例如转基因小鼠和转基因猪)。在一些实施方案中，受试者是鱼或爬行动物。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者是癌症动物模型。例如，动物模型可以是人类源癌症的同位异种移植物动物模型。

在本发明所涵盖方法的一些实施方案中，受试者尚未经受治疗(例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法)。在一些实施方案中，受试者已经受治疗(例如化学疗法、放射疗法、靶向疗法和/或免疫疗法)。

在一些实施方案中，受试者已进行手术以去除癌性或癌症前期组织。在一些实施方案中，癌性组织尚未去除，例如，癌性组织可位于不宜手术的身体区域(例如生命必需组织)或手术程序将向患者引起重大危害风险的区域中。

在一些实施方案中，受试者或其细胞抵抗相关疗法，例如抵抗免疫检查点抑制剂疗法。例如，调节本发明所涵盖的一种或多种生物标志物可克服免疫检查点抑制剂疗法抗性。

在一些实施方案中，受试者需要根据本文所述的组合物和方法的调节，例如已鉴定为具有本文所述的一种或多种生物标志物的不期望不存在、存在或异常表达和/或活性者。

在一些实施方案中，受试者具有经巨噬细胞浸润的实体肿瘤，所述巨噬细胞占肿瘤或肿瘤微环境中的细胞的质量、体积和/或数量的至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％或更多或其间的任何范围(包括端值)(例如至少约5％至至少约20％)。这些细胞可为任何阐述为可用于本文中的其他实施方案者，例如表达CD11b或CD14或CD11和CD14二者等的1型巨噬细胞、M1巨噬细胞、TAM、单核细胞和/或巨噬细胞。

可使用本发明所涵盖的方法来测定受试者的许多不同癌症(例如本文所述者)的癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出生物标志物的至少一种调节剂)的反应性。

另外，这些调节剂还可以组合疗法施用以进一步调节期望活性。例如，可使用靶向IL-4、IL-4Rα、IL-13和CD40的药剂和组合物来调节单核细胞和/或巨噬细胞分化和/或极化。可使用靶向CD11b、CSF-1R、CCL2、奈罗利姆(neurophilim)-1和ANG-2的药剂和组合物来调节巨噬细胞至组织的募集。可使用靶向IL-6、IL-6R和TNF-α的药剂和组合物来调节巨噬细胞功能。其他药剂包括但不限于化学治疗剂、激素、抗血管生成剂、经放射性标记的化合物，或使用手术、冷冻疗法和/或放射疗法。前述治疗方法可与其他形式的常规疗法(例如本领域技术人员众所周知的癌症标准护理治疗)联合施用，其是与常规疗法连续、在其之前或之后施用。例如，这些调节剂可与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在另一个实施方案中，联合施用这些调节剂与化学疗法以增强化学治疗剂的活性和功效。医师案头参考(Physicians′Desk Reference，PDR)公开了已用于治疗各种癌症的化学治疗剂的剂量。这些上文所提及的治疗有效性化学治疗药物的给药方案和剂量将取决于所治疗的特定黑素瘤、疾病程度和其他为本领域熟练医师所熟知并且可由医师确定的因素。

b.癌症疗法

在一些实施方案中，使用本发明所涵盖的药剂来治疗癌症。例如，本发明提供降低单核细胞和/或巨噬细胞的促肿瘤功能(即致瘤性)和/或增加单核细胞和/或巨噬细胞的抗肿瘤功能的方法。在一些特定实施方案中，本发明所涵盖的方法可降低巨噬细胞的至少一种促肿瘤功能，包括1)肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的募集和极化、2)肿瘤血管生成、3)肿瘤生长、4)肿瘤细胞分化、5)肿瘤细胞存活、6)肿瘤侵袭和转移、7)免疫抑制和8)免疫抑制性肿瘤微环境。

可使用癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂)或疗法组合(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂与至少一种免疫疗法的组合)来接触癌细胞和/或施用于期望受试者(例如指示为癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂)的可能反应者的受试者)。在另一个实施方案中，在受试者指示为并非癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂)的可能反应者后，可避免使用这种癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂)并且可施用替代治疗方案(例如靶向和/或非靶向癌症疗法)。也涵盖组合疗法并且可包含例如一种或多种化学治疗剂和放射、一种或多种化学治疗剂和免疫疗法、或一种或多种化学治疗剂、放射和化学疗法，其中每一组合可使用或不使用癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂)。

可用于调节本发明所涵盖的生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的代表性示例性药剂阐述于上文中。如下文进一步所述，抗癌剂涵盖生物治疗性抗癌剂(例如干扰素、细胞因子(例如肿瘤坏死因子、干扰素α、干扰素γ等)、疫苗、造血生长因子、单克隆血清疗法、免疫刺激剂和/或免疫调节剂(例如IL-1、2、4、6和/或12)、免疫细胞生长因子(例如GM-CSF)和抗体(例如曲妥珠单抗(trastuzumab)、T-DM1、贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab)等)以及化学治疗剂。

术语“靶向疗法”是指施用选择性地与所选生物分子相互作用以由此治疗癌症的药剂。例如，关于免疫检查点抑制剂的抑制的靶向疗法可与本发明所涵盖的方法组合使用。

术语“免疫疗法”通常是指以有益方式调节免疫反应的任何策略，并且涵盖通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式调节免疫反应的方法来治疗患有疾病或处于染上或经受疾病复发的风险下的受试者，以及使用某些部分的受试者免疫系统来抵抗疾病(例如癌症)的任何治疗。在施用或不施用一种或多种用于所述目的的药剂的情况下，刺激(或抑制)受试者的自身免疫系统。经设计以诱发或扩增免疫反应的免疫疗法称为“活化免疫疗法”。经设计以降低或抑制免疫反应的免疫疗法称为“抑制免疫疗法”。在一些实施方案中，免疫疗法对所关注细胞(例如癌细胞)具有特异性。在一些实施方案中，免疫疗法可为“非靶向”，其是指施用不选择性地与免疫系统细胞相互作用但调节免疫系统功能的药剂。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。

一些形式的免疫疗法是可包含例如使用癌症疫苗和/或敏化抗原呈递细胞的靶向疗法。例如，溶瘤病毒是能够感染并裂解癌细胞的病毒，但其使正常细胞不受损害，从而使得它们可用于癌症疗法中。溶瘤病毒的复制促进了肿瘤细胞破坏并且也在肿瘤位点处产生剂量扩增。它们也可用作抗癌基因的载体，容许所述抗癌基因特异性递送至肿瘤位点。免疫疗法可涉及用于宿主短期保护的被动免疫性，所述被动免疫性是通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预形成抗体(例如施用针对肿瘤抗原的任选地连接至化学治疗剂或毒素的单克隆抗体)来实现。例如，抗VEGF和mTOR抑制剂已知可有效治疗肾细胞癌。免疫疗法也可着眼于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，可使用反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三重螺旋多核苷酸等来选择性调节与肿瘤或癌症的开始、进展和/或病理学有关的生物分子。类似地，免疫疗法可采用基于细胞的疗法的形式。例如，过继性细胞免疫疗法是一类使用对患者癌症具有天然或基因工程化的反应性的免疫细胞(例如T细胞)的免疫疗法，其中生成所述免疫细胞并且然后转移回癌症患者中。注射大量经活化肿瘤特异性T细胞可诱导癌症的完全和持久性消退。

免疫疗法可涉及用于宿主短期保护的被动免疫性，所述被动免疫性是通过施用针对癌症抗原或疾病抗原的预形成抗体(例如施用针对肿瘤抗原的任选地连接至化学治疗剂或毒素的单克隆抗体)来实现。免疫疗法还可着眼于使用癌细胞系的细胞毒性淋巴细胞识别表位。或者，可使用反义多核苷酸、核酶、RNA干扰分子、三重螺旋多核苷酸等来选择性调节与肿瘤或癌症的开始、进展和/或病理学有关的生物分子。

在一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫刺激分子的激动剂；免疫抑制分子的拮抗剂；趋化因子的拮抗剂；刺激T细胞活化的细胞因子的激动剂；拮抗或抑制可抑制T细胞活化的细胞因子的药剂；和/或结合至B7家族的膜结合蛋白的药剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂是免疫抑制分子的拮抗剂。在一些实施方案中，免疫治疗剂可为针对细胞因子、趋化因子和生长因子的药剂，例如，中和肿瘤相关细胞因子、趋化因子、生长因子和其他可溶性因子(包括IL-10、TGF-β和VEGF)的抑制作用的中和抗体。

在一些实施方案中，免疫疗法包含一种或多种免疫检查点的抑制剂。术语“免疫检查点”是指CD4+和/或CD8+ T细胞的细胞表面上通过调节抗癌免疫反应(例如下调或抑制抗肿瘤免疫反应)来微调免疫反应的分子的组。免疫检查点蛋白是本领域众所周知的并且包括但不限于CTLA-4、PD-1、VISTA、B7-H2、B7-H3、PD-L1、B7-H4、B7-H6、ICOS、HVEM、PD-L2、CD200R、CD160、gp49B、PIR-B、KRLG-1、KIR家族受体、TIM-1、TIM-3、TIM-4、LAG-3(CD223)、IDO、GITR、4-IBB、OX-40、BTLA、SIRPα(CD47)、CD48、2B4(CD244)、B7.1、B7.2、ILT-2、ILT-4、TIGIT、HHLA2、嗜乳脂蛋白(butyrophilin)和A2aR(参见例如WO 2012/177624)。

一些免疫检查点是“免疫抑制性免疫检查点”，其涵盖抑制、下调或压制免疫系统的功能(例如免疫反应)的分子(例如蛋白质)。例如，PD-L1(程序化死亡配体1)也称为CD274或B7-H1，其是传输减小T细胞增殖以抑制免疫系统的抑制信号的蛋白质。CTLA-4(细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)也称为CD152，其是抗原呈递细胞表面上用作下调免疫反应的免疫检查点(“关断”开关)的蛋白质受体。TIM-3(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白质3)也称为HAVCR2，其是用作调控巨噬细胞活化的免疫检查点的细胞表面蛋白。VISTA(T细胞活化的V-结构域Ig抑制因子)是一类用作抑制T细胞效应功能并且维持外周耐受性的免疫检查点的I跨膜蛋白。LAG-3(淋巴细胞活化基因3)是负性调控T细胞的增殖、活化和稳态的免疫检查点受体。BTLA(B-和T-淋巴细胞衰减蛋白)是经由与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)的相互作用来显示T细胞抑制的蛋白质。KIR(杀手细胞免疫球蛋白样受体)是表达于NK细胞和少数T细胞上的抑制NK细胞的细胞毒性活性的蛋白质的家族。在一些实施方案中，免疫治疗剂可为对免疫抑制酶具有特异性的药剂，例如可阻断精氨酸酶(ARG)和吲哚胺2，3-二氧合酶(IDO)(一种抑制T细胞和NK细胞的免疫检查点蛋白)的活性的抑制剂，所述抑制剂改变氨基酸精氨酸和色氨酸在免疫抑制性肿瘤微环境中的分解代谢。所述抑制剂可包括但不限于N-羟基-L-Arg(NOHA)，其靶向表达ARG的M2巨噬细胞；硝基阿司匹林(nitroaspirin)或西地那非(sildenafil)

与之相比，其他免疫检查点是涵盖“免疫刺激性”的分子(例如蛋白质)，其活化、刺激或促进免疫系统的功能(例如免疫反应)。在一些实施方案中，免疫刺激分子是CD28、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、4-1BB(CD137)、4-1BBL(CD137L)、CD27、CD70、CD40、CD40L、CD122、CD226、CD30、CD30L、OX40、OX40L、HVEM、BTLA、GITR和其配体GITRL、LIGHT、LTβR、LTαβ、ICOS(CD278)、ICOSL(B7-H2)和NKG2D。CD40(分化簇40)是发现于抗原呈递细胞上的为所述细胞的活化所需的共刺激蛋白。OX40也称为肿瘤坏死因子受体超家族成员4(TNFRSF4)或CD134，其在活化之后通过防止T细胞死亡并且随后增加细胞因子产生来参与维持免疫反应。CD137是肿瘤坏死因子受体(TNF-R)家族中共刺激活化T细胞以增强增殖和T细胞存活的成员。CD122是白介素-2受体(IL-2)蛋白的亚单元，其促进不成熟T细胞分化成调控性T细胞、效应T细胞或记忆T细胞。CD27是肿瘤坏死因子受体超家族的成员并且用作共刺激免疫检查点分子。CD28(分化簇28)是表达于T细胞上的提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号的蛋白质。GITR(糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白)也称为TNFRSF18和AITR，其是在通过调控性T细胞维持的显性免疫学自我耐受性来发挥关键作用的蛋白质。ICOS(诱导型T细胞共刺激因子)也称为CD278，其是表达于活化T细胞上并且在T细胞信号传导和免疫反应中发挥作用的CD28超家族共刺激分子。

免疫检查点和其序列是本领域众所周知的并且代表性实施方案进一步阐述于下文中。免疫检查点通常涉及抑制受体和天然结合伴侣(例如配体)的对。例如，PD-1多肽是能够将抑制信号传输至免疫细胞以由此抑制免疫细胞效应功能的抑制受体，或能够例如在以可溶性单体形式存在时促进免疫细胞的共刺激(例如通过竞争性抑制)。优选的PD-1家族成员与PD-1共有序列同一性并且结合至一种或多种B7家族成员(例如B7-1、B7-2)、PD-1配体和/或抗原呈递细胞上的其他多肽。术语“PD-1活性”包括PD-1多肽例如通过接合抗原呈递细胞上的天然PD-1配体来调节活化免疫细胞中的抑制信号的能力。调节免疫细胞中的抑制信号使得可调节免疫细胞的增殖和/或免疫细胞的细胞因子分泌。因此，术语“PD-1活性”包括PD-1多肽结合其天然配体的能力，调节免疫细胞抑制信号的能力，和调节免疫反应的能力。术语“PD-1配体”是指PD-1受体的结合伴侣并且包括PD-L1(Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192：1027-1034)和PD-L2(Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2：261)。术语“PD-1配体活性”包括PD-1配体多肽结合其天然受体(例如PD-1或B7-1)的能力，调节免疫细胞抑制信号的能力，和调节免疫反应的能力。

如本文所用，术语“免疫检查点疗法”是指抑制免疫抑制性免疫检查点(例如抑制其核酸和/或蛋白质)的药剂的应用。抑制一种或多种所述免疫检查点可阻断或另外中和抑制性信号传导以由此上调免疫反应，从而更有效地治疗癌症。可用于抑制免疫检查点的示例性药剂包括可结合和/或不活化或抑制免疫检查点蛋白或其片段的抗体、小分子、肽、肽模拟物、天然配体和天然配体衍生物；以及可下调免疫检查点核酸或其片段的表达和/或活性的RNA干扰剂、反义物、核酸适体等。上调免疫反应的示例性药剂包括针对一种或多种免疫检查点蛋白的阻断所述蛋白质与其天然受体之间的相互作用的抗体；非活化形式的一种或多种免疫检查点蛋白(例如显性阴性多肽)；阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用的小分子或肽；结合至其天然受体的融合蛋白(例如融合至抗体或免疫球蛋白的Fc部分的免疫检查点抑制蛋白的细胞外部分)；阻断免疫检查点核酸转录或翻译的核酸分子；等。这些药剂可直接阻断一种或多种免疫检查点与其天然受体(例如抗体)之间的相互作用以防止抑制性信号传导并上调免疫反应。或者，药剂可间接阻断一种或多种免疫检查点蛋白与其天然受体之间的相互作用以防止抑制性信号传导并上调免疫反应。例如，可溶性形式的免疫检查点蛋白配体(例如稳定化细胞外结构域)可结合至其受体以间接减小结合至适当配体的受体的有效浓度。在一个实施方案中，单独或组合使用抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体和/或抗PD-L2抗体来抑制免疫检查点。用于阻断PD-1途径的治疗剂包括拮抗性抗体和可溶性PD-L1配体。针对PD-1和PD-L1/2抑制途径的拮抗剂可包括但不限于针对PD-1或PD-L1/2的拮抗性抗体(例如17D8、2D3、4H1、5C4(也称为尼沃鲁单抗(nivolumab)或BMS-936558)、4A11、7D3和5F4，其公开于美国专利第8,008,449号中；AMP-224、匹利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)、派姆单抗(pembrolizumab)以及美国专利第8,779,105号、第8,552,154号、第8,217,149号、第8,168,757号、第8,008,449号、第7,488,802号、第7,943,743号、第7,635,757号和第6,808,710号中所公开的抗体。类似地，其他代表性检查点抑制剂可为(但不限于)针对抑制性调控因子CTLA-4(抗细胞毒性T-淋巴细胞抗原4)的抗体，例如伊匹单抗(ipilimumab)、曲美目单抗(tremelimumab)(完全人源化)、抗CD28抗体、抗CTLA-4阿德奈汀(adnectin)、抗CTLA-4结构域抗体、单链抗CTLA-4抗体片段、重链抗CTLA-4片段、轻链抗CTLA-4片段和其他抗体(例如公开于以下文献中者：美国专利第8,748,815号、第8,529,902号、第8,318,916号、第8,017,114号、第7,744,875号、第7,605,238号、第7,465,446号、第7,109,003号、第7,132,281号、第6,984,720号、第6,682,736号、第6,207,156号和第5,977,318号以及欧洲专利第1212422号、美国专利公开第2002/0039581号和第2002/086014号和Hurwitz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95：10067-10071)。

针对PD-1、PD-L1、PD-L2和CTLA-4示例的免疫检查点的活性、配体、阻断等的代表性定义通常适用于其他免疫检查点。

术语“非靶向疗法”是指施用不与所选生物分子选择性相互作用但仍治疗癌症的药剂。非靶向疗法的代表性实例包括但不限于化学疗法、基因疗法和放射疗法。

在一个实施方案中，使用化学疗法。化学疗法包括施用化学治疗剂。这种化学治疗剂可为(但不限于)选自下列化合物群者：铂化合物、细胞毒性抗生素、抗代谢物、抗有丝分裂剂、烷基化剂、砷化合物、DNA拓扑异构酶抑制剂、紫杉烷(taxane)、核苷类似物、植物生物碱和毒素；和其合成衍生物。示例性药剂包括但不限于烷基化剂：氮芥(nitrogen mustard)(例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、曲磷胺(trofosfamide)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、雌氮芥(estramustine)和美法仑(melphalan))、亚硝基脲(例如卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU))、烷基磺酸盐(例如白消安(busulfan)和曲奥舒凡(treosulfan))、三氮烯(例如达卡巴嗪(dacarbazine)、替莫唑胺(temozolomide))、顺铂、曲奥舒凡和曲磷胺；植物生物碱：长春碱(vinblastine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxol)；DNA拓扑异构酶抑制剂：替尼泊苷(teniposide)、克立那托(crisnatol)和丝裂霉素；抗叶酸剂：甲氨蝶呤、霉酚酸(mycophenolic acid)和羟基脲；嘧啶类似物：5-氟尿嘧啶、脱氧氟尿苷(doxifluridine)和胞嘧啶阿糖核苷(cytosine arabinoside)；嘌呤类似物：巯基嘌呤和硫基鸟嘌呤；DNA抗代谢物：2′-脱氧-5-氟尿苷、甘氨酸阿非迪霉素(aphidicolin glycinate)和吡唑并咪唑；和抗有丝分裂剂：软海绵素(halichondrin)、秋水仙碱(colchicine)和利索新(rhizoxin)。类似地，其他示例性药剂包括含铂化合物(例如顺铂、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin))、长春花生物碱(vinca alkaloid)(例如长春新碱(vincristine)、长春碱、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine))、类紫杉醇(taxoid)(例如太平洋紫杉醇或太平洋紫杉醇等效物，例如纳米颗粒白蛋白结合太平洋紫杉醇(ABRAXANE)、二十二碳六烯酸结合-太平洋紫杉醇(DHA-太平洋紫杉醇，Taxoprexin)、聚谷氨酸盐结合-太平洋紫杉醇(PG-太平洋紫杉醇、聚谷氨酸太平洋紫杉醇(paclitaxel poliglumex)、CT-2103、XYOTAX)、肿瘤活化前药(TAP)ANG1005(结合三个太平洋紫杉醇分子的Angiopep-2)、太平洋紫杉醇-EC-1(结合至erbB2识别肽EC-1的太平洋紫杉醇)和葡萄糖缀合的太平洋紫杉醇(例如2′-太平洋紫杉醇琥珀酸甲酯2-吡喃葡萄糖基酯)；多西紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(taxol))、表鬼白毒素(epipodophyllin)(例如依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷、托泊替康(topotecan)、9-氨基喜树碱(9-aminocamptothecin)、伊立替康注射液(camptoirinotecan)、伊立替康(irinotecan)、克立那托、丝裂霉素C(mytomycin C))、抗代谢物、DHFR抑制剂(例如甲氨蝶呤、二氯甲氨蝶呤(dichloromethotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate)、依达曲沙(edatrexate))、IMP脱氢酶抑制剂(例如霉酚酸、噻唑羧胺核苷(tiazofurin)、利巴韦林(ribavirin)和EICAR)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如羟基脲和去铁胺(deferoxamine))、尿嘧啶类似物(例如5-氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(floxuridine)、脱氧氟尿苷、雷替曲塞(ratitrexed)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、卡培他滨(capecitabine))、胞嘧啶类似物(例如阿糖胞苷(cytarabine)(ara C)、胞嘧啶阿糖胞苷和氟达拉滨(fludarabine))、嘌呤类似物(例如巯基嘌呤和硫鸟嘌呤)、维生素D3类似物(例如EB 1089、CB 1093和KH 1060)、异戊烯化抑制剂(例如洛伐他汀(lovastatin))、多巴胺能神经毒素(例如1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子)、细胞周期抑制剂(例如星状孢子素(staurosporine))、放线菌素(actinomycin)(例如放线菌素D、更生霉素(dactinomycin))、博来霉素(bleomycin)(例如博来霉素A2、博来霉素B2、培洛霉素(peplomycin))、蒽环类抗生素(例如柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、聚乙二醇化脂质多柔比星、埃达霉素(idarubicin)、泛艾霉素(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)、佐柔比星(zorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))、MDR抑制剂(例如维拉帕米(verapamil))、Ca

在另一个实施方案中，使用放射疗法。放射疗法中使用的放射线可为离子化放射线。放射疗法还可为γ射线、X射线或质子光束。放射疗法的实例包括但不限于外部光束放射疗法、间质植入放射性同位素(I-125、钯、铱)、放射性同位素(例如锶-89)、胸腔放射疗法、腹膜内P-32放射疗法和/或总腹盆放射疗法(total abdominal and pelvic radiationtherapy)。关于放射疗法的一般概述，参见Hellman，第16章：Principles of CancerManagement：Radiation Therapy，第6版，2001，DeVita等人编辑，J.B.LippencottCompany，Philadelphia。放射疗法可作为外部光束放射或远距离放射疗法来施用，其中放射是从远程来源引入。放射治疗还可作为内部疗法或近距离放射疗法来施用，其中将放射源置于身体内部靠近癌细胞或肿瘤团块处。也涵盖使用光动力学疗法，其包括施用光敏剂(例如血紫质和其衍生物、维替泊芬(Vertoporfin)(BPD-MA)、酞青素、光敏剂Pc4、脱甲氧基-竹红菌甲素A；和2BA-2-DMHA)。

在另一个实施方案中，使用激素疗法。激素治疗性治疗剂可包括例如激素激动剂、激素拮抗剂(例如氟他胺(flutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON)、LH-RH拮抗剂)、激素生物合成和处理的抑制剂和类固醇(例如地塞米松、类视色素、类维生素D(deltoid)、倍他米松(betamethasone)、皮质醇、可的松(cortisone)、泼尼松、脱氢睾固酮(dehydrotestosterone)、糖皮质激素、盐皮质激素、雌激素、睾固酮、助孕素)、维生素A衍生物(例如全反视黄酸(ATRA))；维生素D3类似物；抗孕激素(例如米非司酮(mifepristone)、奥那司酮(onapristone))或抗雄激素(例如乙酸环丙孕酮(cyproterone acetate))。

在另一个实施方案中，使用热疗，其为其中使身体组织暴露于高温(高达106°F)的程序。热量可通过损害细胞或剥夺其存活所需物质来帮助缩小肿瘤。热疗疗法可为局部热疗、区域热疗和全身热疗，其使用外部和内部加热装置。热疗几乎总是与其他形式的疗法(例如放射疗法、化学疗法和生物疗法)一起使用以试图增加其有效性。局部热疗是指将热量施加至极小区域(例如肿瘤)。可使用来自身体外部装置的针对肿瘤的高频波外部加热所述区域。为实现内部加热，可使用若干类型的无菌探针中的一者，包括细加热丝或填充有温水的空心管；植入微波天线；和射频电极。在区域热疗中，加热器官或肢体。将产生高能量的磁体和装置置于待加热区域上方。在称为灌注的另一种方法中，取出一些患者的血液，加热，并且然后抽吸(灌注)至待内部加热的区域中。使用全身加热来治疗已扩散至全身的转移性癌症。其可使用温水毯、热蜡、感应线圈(如电毯中者)或热室(类似于大培育器)来实现。热疗不引起辐射副作用或并发症的任何显著增加。然而，直接施加至皮肤的热量可在约一半所治疗患者中引起不适或甚至显著局部疼痛。其还可引起通常快速愈合的水泡。

在再一个实施方案中，使用光动力学疗法(也称为PDT、光放射疗法、光疗法或光化学疗法)来治疗一些类型的癌症。它是基于如下发现：在将单细胞生物体暴露于特定类型的光时，某些称为光敏剂的化学物质可杀伤所述生物体。PDT经由使用固定频率激光与光敏剂的组合来破坏癌细胞。在PDT中，将光敏剂注射至血流中并由全身的细胞吸收。所述药剂在癌细胞中的保留时间长于正常细胞。在将所治疗癌细胞暴露于激光时，光敏剂吸收光并且产生破坏所治疗癌细胞的活性氧形式。曝光必须严格定时，使得其发生于大部分光敏剂已离开健康细胞但仍存在于癌细胞中时。可引导PDT中所用的激光穿过光纤(极细玻璃原丝)。将光纤置于靠近癌症处以递送适当量的光。可引导光纤穿过支气管视镜进入肺中以用于治疗肺癌或穿过内视镜进入食管中以用于治疗食道癌。PDT的优点在于其对健康组织引起最小损害。然而，因为当前使用的激光不能穿过大于约3厘米(略大于1.125英寸)的组织，PDT主要用于治疗皮肤上或皮肤正下方或内部器官衬层上的肿瘤。光动力学疗法使皮肤和眼睛在治疗之后对光敏感6周或更长。建议患者避免直射日光和明亮室内光至少6周。如果患者必须去户外，则其需要穿戴防护服(包括太阳镜)。PDT的其他暂时性副作用与特定区域的治疗相关并且可包括咳嗽、吞咽困难、腹痛和呼吸疼痛或呼吸短促。在1995年12月，美国食品药物监督管理局(U.S.Food and Drug Administration，FDA)批准称为卟吩姆钠(porfimersodium)或

在又一个实施方案中，使用激光疗法来提供高强度光以破坏癌细胞。这种技术通常用于减轻癌症症状(例如出血或堵塞)，尤其在癌症不能通过其他治疗治愈时。它还可用于通过缩小或破坏肿瘤来治疗癌症。术语“激光”代表通过刺激辐射发射来放大光。普通光(例如来自电灯泡者)具有许多波长并且在所有方向上扩散。另一方面，激光具有特定波长并聚焦于窄光束中。这类高强度光含有许多能量。激光极为强大并且可用于切割钢或使金刚石成型。激光还可用于极精确手术工作，例如修复眼睛中的经损害视网膜或切割组织(代替解剖刀)。尽管存在若干不同种类的激光，但仅以下三类广泛用于医学中：二氧化碳(CO

使用癌症疗法(例如表1和/或表2中列出的生物标志物的至少一种调节剂)的治疗的持续时间和/或剂量可根据表1和/或表2中列出的生物标志物的特定调节剂或它们的组合而有所变化。本领域技术人员应了解用于特定癌症治疗剂的适当治疗时间。本发明涵盖继续评价每一癌症治疗剂的最佳治疗时间表，其中如由本发明所涵盖方法测定的受试者的癌症表型是决定最佳治疗剂量和时间表的因素。

2.

本发明所涵盖的另一方面涵盖筛选测定。

在一些实施方案中，提供用于选择调节单核细胞和/或巨噬细胞中本发明所涵盖的一种或多种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的拷贝数、量和/或活性的药剂(例如抗体、融合蛋白、肽或小分子)的方法。在一些实施方案中，所选药剂也调节由这些单核细胞和/或巨噬细胞介导的免疫反应(例如调节CD8+细胞毒性T细胞杀伤；调节癌细胞对免疫检查点疗法的敏感性；调节抗癌疗法如免疫检查点疗法的抗性；调节癌症疗法；调节例如NK、嗜中性粒细胞和巨噬细胞的免疫细胞迁移、募集、分化和/或存活；等)。因此，本文所述的任何诊断、预后或筛选方法可使用本文所述的生物标志物作为期望表型(例如经调节免疫表型)的读出，以及使用调节本文所述一种或多种生物标志物的拷贝数、量和/或活性的药剂来证实一种或多种生物标志物的调节和/或证实所述药剂对期望表型的读出的效应(例如经调节免疫反应、对免疫检查点阻断的敏感性等)。这些方法可利用筛选测定，包括基于细胞的测定和基于非细胞的测定。

例如，提供筛选使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂的方法，所述方法包括：a)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触，所述单核细胞和/或巨噬细胞与i)至少一种降低表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂和/或ii)至少一种增加表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性的药剂接触；b)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在未与至少一种药剂或多种药剂接触的对照单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触；以及c)通过鉴定在a)中与b)相比增加细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法功效(例如细胞杀伤)的药剂来鉴定使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂。

在一些实施方案中，所述测定涉及通过测定一种或多种生物标志物的相反调节效应来鉴定抑制免疫细胞增殖和/或效应功能或诱导无变应性、克隆缺失和/或消耗的药剂。本发明还涵盖经由这种调节来抑制免疫细胞增殖和/或效应功能或诱导无变应性、克隆缺失和/或消耗的方法。

在另一个实例中，提供筛选使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法敏感的药剂的方法，所述方法包括a)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触，所述单核细胞和/或巨噬细胞被工程化以降低表1中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性和/或ii)被工程化以增加表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性；b)使癌细胞与细胞毒性T细胞和/或免疫检查点疗法在对照单核细胞和/或巨噬细胞存在下接触；以及c)鉴定与b)相比在a)中使癌细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤和/或免疫检查点疗法功效(例如细胞杀伤)敏感的药剂。

通常，本发明涵盖用于筛选结合至本发明所涵盖的一种或多种生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出的靶标)或调节其活性的药剂(例如测试化合物)的测定。在一个实施方案中，鉴定调节免疫反应的药剂的方法需要测定药剂调节(例如增强或抑制)表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的能力。这些药剂包括但不限于抗体、蛋白质、融合蛋白、小分子和核酸。

在一些实施方案中，鉴定增强免疫反应的药剂的方法需要测定候选药剂调节一种或多种生物标志物和进一步调节所关注免疫反应(例如经调节发炎表型、细胞毒性T细胞活化和/或活性、癌细胞对免疫检查点疗法的敏感性等)的能力。

在一些实施方案中，测定是无细胞或基于细胞的测定，其包括使一种或多种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)与测试剂接触，以及例如通过测量如下文所述的直接或间接参数来测定测试剂调节(例如上调或下调)生物标志物的拷贝数、量和/或活性的能力。

在一些实施方案中，测定是基于细胞的测定，例如包含以下步骤者：使(a)所关注细胞(例如单核细胞和/或巨噬细胞)与测试剂接触，以及测定测试剂调节(例如上调或下调)一种或多种生物标志物的拷贝数、量和/或活性(例如一种或多种生物标志物与一种或多种天然结合伴侣之间的结合)的能力。可例如通过测量直接结合或通过测量免疫细胞活化的参数来测定多肽彼此结合或相互作用的能力。

在另一个实施方案中，测定是基于细胞的测定，其包括使癌细胞与细胞毒性T细胞、单核细胞和/或巨噬细胞和测试剂接触，以及例如通过测量如下文所述的直接或间接参数来测定测试剂调节表1和/或表2中列出的至少一种靶标的拷贝数、量和/或活性和/或调节免疫反应的能力。

上文和本文所述的方法还可适于测试一种或多种已知调节本文所述的一种或多种生物标志物的拷贝数、量和/或活性的药剂，从而证实一种或多种生物标志物的调节和/或证实所述药剂对期望表型的读出的效应(例如经调节免疫反应、对免疫检查点阻断的敏感性等)。

在直接结合测定中，可使生物标志物蛋白(或其相应靶标多肽或分子)与放射性同位素或酶促标记偶联，从而可通过检测复合物中的经标记蛋白质或分子来测定结合。例如，可使用

可在任何适于含有反应物的器皿中使测试剂结合至靶标。这类器皿的非限制性实例包括微量滴定板、测试管和微型离心管。固定形式的本发明所涵盖的抗体还可包括结合至固相的抗体，所述固相如多孔、微孔(平均孔隙直径小于约一微米)或大孔(平均孔隙直径大于约10微米)材料，例如膜、纤维素、硝基纤维素或玻璃纤维；珠粒，例如由琼脂糖或聚丙烯酰胺或乳胶制得者；或盘、板或孔的表面，例如由聚苯乙烯制得者。

例如，在直接结合测定中，可使多肽与放射性同位素或酶促标记偶联，从而可通过检测复合物中的经标记蛋白质来测定多肽相互作用和/或活性(例如结合事件)。例如，可使用

在不标记任何相互作用物下测定药剂调节所关注参数的能力也在本发明的范围内。例如，可在不标记待监测多肽下使用微生理记录仪来检测多肽之间的相互作用(McConnell等人(1992)Science 257：1906-1912)。如本文所用，“微生理记录仪”(例如细胞传感器)是使用光寻址电位传感器(LAPS)来测量细胞酸化其环境的速率的分析仪器。这种酸化速率的变化可用于指示化合物与受体之间的相互作用。

在一些实施方案中，可通过测定给定组多肽中一种或多种成员的活性来测定阻断剂(例如抗体、融合蛋白、肽或小分子)拮抗所述组多肽之间的相互作用的能力。例如，可通过以下方式来测定蛋白质和/或一种或多种天然结合伴侣的活性：检测细胞第二信使的诱导(例如细胞内信号传导)，检测适当底物的催化/酶促活性，检测报告基因(包含可操作地连接至编码可检测标志物(例如氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶)的核酸的靶标反应性调控元件)的诱导，或检测由蛋白质和/或一种或多种天然结合伴侣调控的细胞反应。可例如通过以下方式来测定阻断剂结合至所述多肽或与其相互作用的能力：在增殖测定中测量化合物调节免疫细胞共刺激或抑制的能力，或干扰所述多肽结合至识别其部分的抗体的能力。

可通过在添加至体外测定中时抑制免疫细胞增殖和/或效应功能或诱导无变应性、克隆缺失和/或消耗的能力来鉴定调节生物标志物量和/或活性(例如与一种或多种天然结合伴侣的相互作用)的药剂。例如，可在刺激经由活化受体的信号转导的药剂存在下培养细胞。可采用细胞活化的许多识别读出在活化剂存在下来测量细胞增殖或效应功能(例如抗体产生、细胞因子产生、吞噬作用)。通过使用本领域已知的技术来测量药剂降低所测量增殖或效应功能的能力，可容易地测定测试剂阻断这种活化的能力。

例如，可在T细胞测定中测试本发明所涵盖的药剂抑制或增强共刺激的能力，如Freeman等人(2000)J.Exp.Med.192：1027和Latchman等人(2001)Nat.Immunol.2：261中所述。可从人类PBMC分离CD4+ T细胞并用活化抗CD3抗体进行刺激。可通过

或者，可测试本发明所涵盖的药剂调节细胞因子的细胞产生的能力，所述细胞因子是通过调节一种或多种生物标志物所产生或所述产生可在免疫细胞中响应于调节一种或多种生物标志物而得以增强或抑制。由所关注免疫细胞释放的指示性细胞因子可通过ELISA来鉴定，或通过抗体阻断细胞因子以抑制免疫细胞增殖或由所述细胞因子诱导的其他细胞类型的增殖的能力来鉴定。例如，可从Genzyme(Cambridge MA)获得IL-4ELISA试剂盒以及IL-7阻断抗体。可从Genetics Institute(Cambridge，MA)获得针对IL-9和IL-12的阻断抗体。体外免疫细胞共刺激测定也可用于鉴定可通过调节一种或多种生物标志物来调节的细胞因子的方法中。例如，如果在共刺激时诱导的特定活性(例如免疫细胞增殖)不能通过添加已知细胞因子的阻断抗体来抑制，则所述活性可源自未知细胞因子的作用。在共刺激后，可通过常规方法从培养基纯化这种细胞因子并且通过其诱导免疫细胞增殖的能力来测量其活性。为鉴定可用于诱导耐受性的细胞因子，可使用如上文所述的体外T细胞共刺激测定。在这种情形下，给予T细胞一级活化信号并且使其与所选细胞因子接触，但并不给予共刺激信号。在洗涤并静置免疫细胞之后，使用一级活化信号和共刺激信号再攻击细胞。如果免疫细胞不具有反应(例如增殖或产生细胞因子)，则其已变得耐受并且细胞因子尚未防止耐受性诱导。然而，如果免疫细胞具有反应，则耐受性诱导已由细胞因子防止。能够防止耐受性诱导的那些细胞因子可联合阻断B淋巴细胞抗原的试剂靶向体内阻断，这可作为诱导患有自身免疫疾病的移植接受者或受试者中的耐受性的更有效方式。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的测定是用于筛选调节生物标志物和/或一种或多种天然结合伴侣间的相互作用的药剂的无细胞测定，其包括使多肽和一种或多种天然结合伴侣或其生物活性部分与测试剂接触，以及测定测试化合物调节多肽与一种或多种天然结合伴侣或其生物活性部分之间的相互作用的能力。可如上文所述来直接或间接测定测试化合物的结合。在一个实施方案中，所述测定包括使多肽或其生物活性部分与其结合伴侣接触以形成测定混合物，使测定混合物与测试化合物接触，以及测定测试化合物与测定混合物中的多肽相互作用的能力，其中测定测试化合物与多肽相互作用的能力包括测定与结合伴侣相比测试化合物优先结合至多肽或其生物活性部分的能力。

在一些实施方案中，不论是基于细胞的测试或是无细胞测定，可利用其他结合伴侣进一步测定测试剂以确定其是否影响多肽与一种或多种天然结合伴侣之间的结合和/或相互作用活性。其他有用结合分析方法包括使用实时生物分子相互作用分析(BIA)(Sjolander和Urbaniczky(1991)Anal.Chem.63：2338-2345和Szabo等人(1995)Curr.Opin.Struct.Biol.5：699-705)。如本文所用，“BIA”是用于在不标记任何相互作用物的情况下实时研究生物特异性相互作用的技术(例如BIAcore)。可使用表面等离子体共振(SPR)的光学现象变化来指示生物多肽之间的实时反应。可将所关注多肽固定于BIAcore芯片上并且可测试多种药剂(阻断抗体、融合蛋白、肽或小分子)与所关注多肽的结合。使用BIA技术的一个实例阐述于Fitz等人(1997)Oncogene 15：613中。

本发明所涵盖的无细胞测定适于使用可溶性和/或膜结合形式的蛋白质。在使用膜结合形式蛋白质的无细胞测定的情形下，可期望利用增溶剂，从而使膜结合形式的蛋白质维持于溶液中。这类增溶剂的实例包括非离子型洗涤剂，例如正辛基葡萄糖苷、正十二烷基葡萄糖苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺、

在上述测定方法的一个或多个实施方案中，可期望固定任一多肽以促进一或两种蛋白质的复合形式与未复合形式的分离以及适应测定自动化。可在任何适于含有反应物的器皿中使测试化合物结合至多肽。这类器皿的实例包括微量滴定板、测试管和微型离心管。在一个实施方案中，可提供增加容许一或两种蛋白质结合至基质的结构域的融合蛋白。例如，可使基于谷胱甘肽-S-转移酶的多肽融合蛋白或谷胱甘肽-S-转移酶/靶标融合蛋白吸附于谷胱甘肽琼脂糖珠粒(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化微量滴定板上，然后与测试化合物组合，并且在有助于复合物形成的条件下(例如在关于盐和pH的生理学条件下)培育混合物。在培育后，洗涤珠粒或微量滴定板孔以去除任何未结合组分，在珠粒的情形下固定基质，直接或间接例如如上文所述来测定复合物。或者，可使复合物与基质解离，并且使用标准技术测定多肽结合或活性的水平。

在一个替代实施方案中，可如上文针对基于细胞的测定所述来测定测试化合物调节所关注生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的活性的能力，例如通过测定测试化合物调节在多肽下游发挥作用的多肽活性的能力来实现。例如，可测定第二信使的水平，可测定相互作用剂多肽在适当靶标上的活性，或可如先前所述来测定相互作用剂与适当靶标的结合。

本发明还涉及通过上述筛选测定鉴定的新颖药剂。因此，将如本文所述鉴定的药剂进一步用于适当动物模型中在本发明的范围内。例如，如本文所述鉴定的药剂可用于动物模型中以测定使用这种药剂的治疗的功效、毒性或副作用。或者，如本文所述鉴定的药剂可用于动物模型中以测定这种药剂的作用机制。此外，本发明涉及通过上述筛选测定鉴定的新颖药剂用于如本文所述的治疗的用途。

3.

本发明部分地提供用于精确分类生物样品是否与所关注输出相关的方法、系统和代码，所述所关注输出是例如根据本文所述的一种或多种生物标志物的调节能够具有经调节表型的单核细胞和/或巨噬细胞，可能对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标的至少一种调节剂)具有反应的癌症，等。在一些实施方案中，本发明可用于使用统计学算法和/或经验数据(例如表1和/或表2中列出的至少一种靶标的量或活性)来分类涉及对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)具有反应或不具有反应或处于所述风险下的样品(例如来自受试者)。在一些实施方案中，本发明涵盖基于检测本文所述的生物标志物(例如表1、表2、实施例等中所列出者，例如CD53、PSGL1和/或VSIG4)的存在、不存在和/或经调节表达来检测单核细胞和/或巨噬细胞的免疫表型状态(例如M1、1型、M2、2型等)的方法。

检测生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的量或活性并且由此可用于针对样品很可能或不可能对发炎表型调节、癌症疗法等具有反应进行分类的示例性方法涉及使生物样品与能够检测生物样品中生物标志物的量或活性的药剂(例如蛋白质结合剂，如抗体或其抗原结合片段；或核酸结合剂，如寡核苷酸)接触。在一些实施方案中，所述方法还包括例如从测试受试者获得生物样品。在一些实施方案中，使用至少一种药剂，其中可组合(例如在夹心式ELISA)或连续使用2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种所述药剂。在某些情况下，统计学算法是单一学习统计学分类系统。例如，可使用单一学习统计学分类系统基于预测或机率值和生物标志物的存在或水平来使样品分类。使用单一学习统计学分类系统通常以至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和/或整体准确度来将样品分类。

其他合适统计学算法是本领域技术人员众所周知的。例如，学习统计学分类系统包括能够适用于复杂数据集(例如所关注标志物组)并且基于所述数据集作出决策的机器学习算法技术。在一些实施方案中，使用单一学习统计学分类系统，例如分类树(例如随机森林)。在其他实施方案中，优选地串联使用2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个学习统计学分类系统的组合。学习统计学分类系统的实例包括但不限于使用以下各项者：归纳学习(例如决策/分类树，例如随机森林、分类和回归树(C&RT)、提升树等)、大概近似正确(PAC)学习、连接学习(例如神经网络(NN)、人工神经网络(ANN)、神经模糊网络(NFN)、网络结构、感知器(例如多层感知器)、多层前馈网络、神经网络应用、信任网络中的贝叶斯学习(Bayesianlearning in belief network)等)、强化学习(例如已知环境中的被动学习(例如初始学习、适应性动态学习和时间差分学习)、未知环境中的被动学习、未知环境中的主动学习、学习动作值函数、强化学习应用等)和基因算法和演化规划。其他学习统计学分类系统包括支持向量机(例如核方法(Kernel method))、多元适应性回归样条法(MARS)、李文博格-马夸特算法(Levenberg-Marquardt algorithm)、高斯-牛顿算法(Gauss-Newton algorithm)、混合高斯模型(mixtures of Gaussians)、梯度下降算法和学习矢量量化(LVQ)。在某些实施方案中，本发明所涵盖的方法还包括将样品分类结果发送给临床医师(例如肿瘤学家)。

在一些实施方案中，在诊断受试者后向个体施用治疗有效量的基于所述诊断的限定治疗。

在一些实施方案中，所述方法还涉及获得对照生物样品，例如来自并不患有癌症或其癌症对癌症疗法易感的受试者的生物样品，来自缓解期间受试者的生物样品，或来自针对不管使用何种癌症疗法发生癌症进展进行治疗期间的受试者的生物样品。

4.

本发明还涉及预测医学领域，其中使用诊断测定、预后测定和监测临床试验来实现预后(预测)目的以由此预防性治疗个体。因此，本发明所涵盖的一个方面涵盖诊断测定，其用于测定(例如检测)在生物样品(例如血液、血清、细胞或组织)的背景中本文所述生物标志物(例如表1和/或表2中所列出者)的存在、不存在、拷贝数、量和/或活性水平，由此测定患有癌症的个体是否可能对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)具有反应，不论在原始癌症还是复发性癌症中。这些测定可用于预后或预测目的以由此在特征在于生物标志物多肽、核酸表达或活性或与其相关的病症发作之前或在复发之后预防性治疗个体。本领域技术人员应了解，任何方法可使用一种或多种(例如组合)本文所述的生物标志物(例如表1和/或表2中所列出者)。对于任何预测医学分析来说，可分析所关注生物标志物、所关注分级指示因子(例如CD11b+状态、CD14+状态等)或其任何组合。

本发明所涵盖的另一方面涵盖监测药剂(例如药物、化合物和基于小核酸的分子)对表1和/或表2中列出的靶标的表达或活性和/或所关注细胞的发炎表型的影响。这些和其他药剂进一步详细阐述于下列部分中。

本领域技术人员还应了解，在某些实施方案中，本发明所涵盖的方法实施计算机程序和计算机系统。例如，可使用计算机程序来实施本文所述的算法。计算机系统还可存储和操纵由本发明所涵盖方法生成的数据，所述数据包括可由计算机系统用于实施本发明方法的多个生物标志物信号变化/特征。在某些实施方案中，计算机系统接收生物标志物表达数据；(ii)存储所述数据；以及(iii)比较本文所述任何数量方式中的数据(例如相对于适当对照的分析)以测定来自癌性或癌前期组织的信息性生物标志物的状态。在其他实施方案中，计算机系统(i)比较所测定表达生物标志物水平与临限值；以及(ii)输出所述生物标志物水平是否显著调节(例如高于或低于)临限值的指示或基于所述指示的表型。

在某些实施方案中，所述计算机系统也视为本发明所涵盖的部分。可使用众多类型的计算机系统根据通过生物信息和/或计算机领域的熟练技术人员所拥有的知识来实施本发明的分析方法。在操作这种计算机系统期间，可将若干软件组件加载至内存中。所述软件组件可包括本领域的标准软件组件和本发明的特殊组件(例如Lin等人(2004)Bioinformatics 20，1233-1240中所述的dCHIP软件；本领域已知的径向基础机器学习算法(RBM))。

本发明所涵盖的方法也可程序化或建模于数学软件包中，所述数学软件包容许方程式的符号式输入和处理的高级规范(包括待使用的具体算法)，由此使得用户无需程序性程序化个别方程式和算法。这些软件包包括例如来自Mathworks(Natick，Mass.)的Matlab，来自Wolfram Research(Champaign，Ill.)的Mathematica或来自MathSoft(Seattle，Wash.)的S-Plus。

在某些实施方案中，计算机包括用于存储生物标志物数据的数据库。可存取这些存储特征并用于在后续时间点实施所关注比较。例如，可存储源自受试者非癌性组织的样品的生物标志物表达特征和/或从相同物种的相关群体中所关注信息性基因座的群体基分布生成的特征，并且稍后与源自受试者的癌性组织或受试者的疑似癌性组织的样品进行比较。

除本文所述的示例性程序结构和计算机系统外，其他替代程序结构和计算机系统对于本领域技术人员也是显而易见的。这些替代系统并不在精神或范围上偏离上述计算机系统和程序结构，并且因此旨在涵盖于所附权利要求书内。

此外，可使用本文所述的预后测定来确定是否可向受试者施用药剂(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、多肽、肽、核酸、小分子或其他候选药物)以治疗与异常生物标志物表达或活性相关的疾病或病症。

5.

可通过本领域已知的任何方法来测量临床功效。例如，对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)的反应涉及例如在开始新辅助或辅助化学疗法之后癌症(例如肿瘤)对疗法的任何反应，优选地涉及癌细胞数量、肿瘤质量和/或肿瘤体积的变化。可在新辅助或辅助情况下评价肿瘤反应，其中可比较全身性干预后的肿瘤大小与初始大小和尺寸(如通过CT、PET、乳房X光摄影片、超声波或触诊所测量)，并且可以组织学方式估计肿瘤的细胞性并与在开始治疗之前获取的肿瘤活检的细胞性进行比较。还可通过在活检或手术切除术之后肿瘤的测径器测量或病理学检查来评价反应。可以定量方式如肿瘤体积或细胞性的变化百分比来记录反应，或使用半定量评分系统如残余癌症负荷(Symmans等人，J.Clin.Oncol.(2007)25：4414-4422)或米勒-佩恩评分(Miller-Paynescore)(Ogston等人(2003)Breast(Edinburgh，Scotland)12：320-327)以定性方式如“病理完全反应”(pCR)、“临床完全缓解”(cCR)、“临床部分缓解”(cPR)、“临床稳定疾病”(cSD)、“临床进展性疾病”(cPD)或其他定性标准来记录。可在开始新辅助或辅助疗法之后早期(例如在数小时、数天、数周之后或优选地在数月之后)来评价肿瘤反应。反应评价的典型终点是在终止新辅助化学疗法后或在手术去除残余肿瘤细胞和/或肿瘤床后。

在一些实施方案中，可通过测量临床受益率(CBR)来测定本文所述的治疗性治疗的临床功效。通过测定在从疗法结束至少6个月的时间点完全缓解(CR)的患者百分比、部分缓解(PR)的患者数和患有稳定疾病(SD)的患者数的总和来测量临床受益率。该式简写为CBR＝超过6个月的CR+PR+SD。在一些实施方案中，表1和/或表2中所列出的生物标志物的特定调节剂治疗方案的CBR为至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或更高。

用于评估对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)的反应的其他标准与“存活”相关，其包括所有下列标准：直至死亡的存活率，也称为总体存活率(其中所述死亡率可为任何病因或与肿瘤相关)；“无复发存活”(其中术语复发应包括局部复发和远端复发)；无转移存活；无疾病存活(其中术语疾病应包括癌症和与其相关的疾病)。可通过参照限定起点(例如诊断或开始治疗的时间)和端点(例如死亡、复发或转移)来计算所述存活的持续时间。另外，治疗功效的标准可扩展至包括对化学疗法的反应、存活机率、给定时间段内的转移机率和肿瘤复发机率。

例如，为测定适当临限值，可将一种或多种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的靶标)的特定调节剂施用于受试者群体，并且结果可与在施用任何癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)之前测得的生物标志物测量相关。结果测量可为对在新辅助设置中给予的疗法的病理学反应。或者，可在已知生物标志物测量值的癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)后一定时间段内监测受试者的结果测量(例如总体存活率和无疾病存活)。在某些实施方案中，向每一受试者施用相同剂量的调节表1和/或表2中所列出的至少一种生物标志物的药剂。在相关实施方案中，所施用剂量是本领域已知用于调节本发明所涵盖的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种靶标)的药剂的标准剂量。监测受试者的时间段可有所变化。例如，可监测受试者至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45、50、55或60个月。可使用例如实施例部分中所述的方法来测定与癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)的结果相关的生物标志物测量临限值。

6.

a.样品收集和制备

在一些实施方案中，将来自受试者的样品中的生物标志物量和/或活性测量与预定对照(标准)样品进行比较。来自受试者的样品通常是来自患病组织(例如癌细胞或组织)。对照样品可来自相同受试者或来自不同受试者。对照样品通常是正常非患病样品。然而，在一些实施方案中，例如，为对疾病分期或评估治疗功效，对照样品可来自患病组织。对照样品可为来自若干不同受试者的样品的组合。在一些实施方案中，对来自受试者的生物标志物量和/或活性测量与预定水平进行比较。该预定值通常是从正常样品获得。如本文所述，“预定”生物标志物量和/或活性测量可为用于(仅举例来说)以下各项的生物标志物量和/或活性测量：评估可经选择用于治疗的受试者，评估对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种生物标志物的至少一种调节剂)的反应，和/或评估对组合癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的一种或多种生物标志物的至少一种调节剂与至少一种免疫疗法的组合)的反应。可在患有或未患癌症的患者群体中测定预定生物标志物量和/或活性测量。预定生物标志物量和/或活性测量可为同等适用于每一患者的单一数值，或预定生物标志物量和/或活性测量可根据患者的特定亚群有所变化。受试者的年龄、体重、身高和其他因素可影响个体的预定生物标志物量和/或活性测量。此外，可个别地测定每一受试者的预定生物标志物量和/或活性。在一个实施方案中，在本文所述的方法中所测定和/或比较的量是基于绝对测量。

在另一个实施方案中，在本文所述的方法中所测定和/或比较的量是基于相对测量，例如比率(例如治疗前的生物标志物拷贝数、水平和/或活性对治疗后的生物标志物拷贝数、水平和/或活性，这些生物标志物测量相对于内参或人工制得的对照，这些生物标志物测量相对于管家基因的表达等)。例如，相对分析可基于治疗前生物标志物测量与治疗后生物标志物测量相比的比率。治疗前生物标志物测量可在开始癌症疗法之前的任何时间进行。治疗后生物标志物测量可在开始癌症疗法之后的任何时间进行。在一些实施方案中，治疗后生物标志物测量是在开始癌症疗法之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20周或更久进行，并且甚至朝向无限期更久以继续监测。治疗可包括癌症疗法，例如包含表1和/或表2中列出的至少一种靶标的一种或多种调节剂的治疗方案，所述治疗方案单独使用或与其他癌症药剂(例如免疫检查点抑制剂)组合使用。

预定生物标志物量和/或活性测量可为任何合适标准。例如，可从评价患者选择的相同或不同人类获得预定生物标志物量和/或活性测量。在一个实施方案中，可从同一患者的先前评价获得预定生物标志物量和/或活性测量。以这种方式，可随时间监测患者选择的进展。另外，如果受试者是人类，则可从另一人或多人(例如所选人类组)的评价获得对照。以这种方式，可将评价选择的人类选择程度与合适的其他人(例如与所关注人类处于类似情况下的其他人，例如患有类似或相同疾患和/或属相同种族者)进行比较。

在本发明所涵盖的一些实施方案中，生物标志物量和/或活性测量相比于预定水平的变化为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5或5.0倍或更大或其间的任何范围(包括端值)。这些截止值同样适用于在测量是基于相对变化(例如基于治疗前生物标志物测量与治疗后生物标志物测量相比的比率)时。

生物样品可收集自来自患者的各种来源，包括体液样品、细胞样品或包含核酸和/或蛋白质的组织样品。“体液”是指从身体排泄或分泌的流体以及通常并非从身体排泄或分泌的流体(例如羊水、眼房水、胆汁、血液和血浆、脑脊髓液、耳垢和耵聍、考珀液(cowper′sfluid)或预射精液、乳糜、食糜、粪便、女性射液、间质液、细胞内液、淋巴液、经血、乳液、粘液、胸膜液、脓液、唾液、皮脂、精液、血清、汗液、滑液、泪液、尿液、阴道润滑液、玻璃体液、呕吐物)。在一个优选的实施方案中，受试者和/或对照样品选自由以下组成的组：细胞、细胞系、组织学切片、石蜡包埋组织、活检、全血、乳头抽吸液、血清、血浆、颊部刮片、唾液、脑脊髓液、尿液、粪便和骨髓。在一个实施方案中，样品是血清、血浆或尿液。在另一个实施方案中，样品是血清。

可经一定纵向时间段(例如在约数天、数周、数月、每年、每半年等一次或多次)从个体重复收集样品。经一定时间段从个体获得众多样品可用于验证来自先前检测的结果和/或鉴定由于例如疾病进展、药物治疗等引起的生物模式变化。例如，可获取受试者样品并且根据本发明每月、每两月或以一个月、两个月或三个月间隔的组合进行监测。另外，随时间获得的受试者的生物标志物量和/或活性测量可便利地彼此比较以及与在监测时段期间的正常对照进行比较，由此提供受试者的自身值作为用于长期监测的内部或个人对照。

取决于所收集样品类型和/或生物标志物测量的分析，样品制备和分离可涉及任何程序。这些程序包括(通过仅举例来说)浓缩，稀释，调节pH，去除高丰度多肽(例如白蛋白、γ球蛋白和转铁蛋白等)，添加防腐剂和校准剂，添加蛋白酶抑制剂，添加变性剂，使样品脱盐，浓缩样品蛋白，提取和纯化脂质。

样品制备还可分离以非共价复合物形式结合至其他蛋白质(例如载体蛋白)的分子。该过程可分离那些结合至特定载体蛋白(例如白蛋白)的分子，或使用更一般过程，例如经由蛋白质变性(例如使用酸)从所有载体蛋白释放结合分子，接着去除载体蛋白。

可使用高亲和力试剂、高分子量过滤器、超离心和/或电渗析从样品去除不期望蛋白质(例如高丰度、非信息性或不可检测的蛋白质)。高亲和力试剂包括选择性结合至高丰度蛋白质的抗体或其他试剂(例如适体)。样品制备还可包括离子交换色谱法、金属离子亲和色谱法、凝胶过滤、疏水性色谱法、色谱聚焦、吸附色谱法、等电聚焦和相关技术。分子量过滤器包括基于大小和分子量分离分子的膜。这些过滤器可进一步采用反渗透、纳米过滤、超滤和微过滤。

超离心是从样品去除不期望多肽的方法。超离心是在约15,000-60,000rpm下离心样品，同时使用光学系统监测颗粒的沉降(或其缺乏)。电渗析是使用电膜或半渗透膜的程序，在该过程中，使离子在潜在梯度的影响下从一种溶液传输穿过半渗透膜进入另一溶液中。由于电渗析中所使用的膜可能能够选择性传输具有正电荷或负电荷的离子、排斥具有相反电荷的离子或基于大小和电荷容许物质迁移穿过半渗透膜，因此其使得电渗析可用于浓缩、去除或分离电解质。

本发明中的分离和纯化可包括本领域已知的任何程序，例如毛细管电泳(例如在毛细管中或在芯片上)或色谱法(例如在毛细管、柱中或在芯片上)。电泳是可用于在电场影响下分离离子型分子的方法。电泳可实施于凝胶、毛细管或芯片上的微通道中。用于电泳的凝胶的实例包括淀粉、丙烯酰胺、聚环氧乙烷、琼脂糖或它们的组合。可通过交联、添加洗涤剂或变性剂、固定酶或抗体(亲和力电泳)或底物(酶色谱法)和并入pH梯度来对凝胶改性。用于电泳的毛细管的实例包括与电喷雾界接的毛细管。

毛细管电泳(CE)优选用于分离复杂亲水性分子和高度带电溶质。CE技术还可实施于微流体芯片上。取决于所用毛细管和缓冲液的类型，CE可进一步分成例如以下分离技术：毛细管区带电泳(CZE)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管等速电泳(cITP)和毛细管电色谱法(CEC)。使CE技术与电喷雾离子化耦合的一个实施方案涉及使用挥发性溶液，例如含有挥发性酸和/或碱和有机物(例如醇或乙腈)的水性混合物。

毛细管等速电泳(cITP)是其中分析物以恒定速度移动通过毛细管但根据其相应迁移率分离的技术。毛细管区带电泳(CZE)也称为自由溶液CE(FSCE)，它是基于物质的电泳迁移率差，所述电泳迁移率差是根据分子上电荷和分子在迁移期间遇到的摩擦阻力(其通常与分子大小成正比)所测定。毛细管等电聚焦(CIEF)容许弱离子化两性分子通过电泳在pH梯度中分离。CEC是传统高效液相色谱法(HPLC)与CE之间的混合技术。

本发明中所使用的分离和纯化技术包括本领域已知的任何色谱法程序。色谱法可基于微分吸附和某些分析物的洗脱或分析物在移动相与固定相之间的分配。色谱法的不同实例包括但不限于液相色谱法(LC)、气体色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)等。

b.分析生物标志物核酸和多肽

可根据本文所述的方法和本领域技术人员已知的技术来分析生物标志物核酸和/或生物标志物多肽以鉴定可用于本发明的这类基因或表达改变，所述基因或表达改变包括但不限于1)生物标志物转录物或多肽的水平的改变，2)从生物标志物基因缺失或添加一种或多种核苷酸，4)取代生物标志物基因的一种或多种核苷酸，5)生物标志物基因(例如表达调控区)的异常修饰，等。

c.检测拷贝数和/或基因组核酸突变的方法

评估生物标志物核酸的拷贝数和/或基因组核酸状态(例如突变)的方法是本领域技术人员众所周知的。可简单地通过测定本文所鉴定区域或标志物的拷贝数来评估染色体增加或损失的存在或不存在。

在一个实施方案中，测试生物样品的含有基因组标志物的基因座中的拷贝数变化的存在。在一些实施方案中，表1中列出的至少一种靶标的增加的拷贝数和/或表2中列出的至少一种靶标的降低的拷贝数可预测癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)的不良结果。表1和/或表2中列出的至少一种靶标的至少3、4、5、6、7、8、9或10个的拷贝数可预测很可能对癌症疗法(例如表1和/或表2中所列出的生物标志物的至少一种调节剂)具有反应。

评估生物标志物基因座的拷贝数的方法包括但不限于基于杂交的测定。基于杂交的测定包括但不限于传统“直接探针”方法(例如Southern印迹)、原位杂交(例如FISH和FISH+SKY)方法和“比较探针”方法，例如比较基因组杂交(CGH)，例如基于cDNA或基于寡核苷酸的CGH。所述方法可以多种形式使用，包括但不限于底物(例如膜或玻璃)结合方法或基于阵列的方法。

在一个实施方案中，评估样品中的生物标志物基因拷贝数涉及Southern印迹。在Southern印迹中，使基因组DNA(通常片段化并分离于电泳凝胶上)杂交至靶标区域的特异性探针。比较来自靶标区域探针的杂交信号强度与来自正常基因组DNA(例如相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的分析的对照探针信号可估计靶核酸的相对拷贝数。或者，可利用Northern印迹来评估样品中的编码核酸的拷贝数。在Northern印迹中，使mRNA杂交至靶标区域的特异性探针。比较来自靶标区域探针的杂交信号强度与来自正常RNA(例如相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的分析的对照探针信号可估计靶核酸的相对拷贝数。或者，可使用本领域众所周知的用于检测RNA的其他方法，从而相对于适当对照(例如相同或相关细胞、组织、器官等的非扩增部分)的较高或较低表达可估计靶核酸的相对拷贝数。

测定基因组拷贝数的替代方式是原位杂交(例如Angerer(1987)Meth.Enzymol152：649)。通常，原位杂交包括下列步骤：(1)固定待分析的组织或生物结构；(2)在杂交前处理生物结构以增加靶标DNA的可及性并减少非特异性结合；(3)使核酸混合物杂交至生物结构或组织中的核酸；(4)在杂交后洗涤以去除在杂交中未结合的核酸片段；以及(5)检测经杂交的核酸片段。这些步骤中的每一者中所使用的试剂和使用条件取决于特定应用而有所变化。在典型原位杂交测定中，使细胞固定至固体载体(通常是载玻片)上。如果核酸待探测，则通常使用热量或碱使细胞变性。然后使细胞与杂交溶液在中等温度下接触以允许编码蛋白质的核酸序列的特异性经标记探针发生退火。然后通常以预定严格度下或在增加的严格度下洗涤靶标(例如细胞)直至获得适当信噪比为止。通常例如使用放射性同位素或荧光报告基因标记探针。在一个实施方案中，探针足够长以与靶核酸在严格条件下特异性杂交。探针长度通常介于约200个碱基至约1000个碱基之间。在一些应用中，需要阻断重复序列的杂交能力。因此，在一些实施方案中，使用tRNA、人类基因组DNA或Cot-I DNA来阻断非特异性杂交。

测定基因组拷贝数的替代方式是比较基因组杂交。一般来说，从正常参考细胞以及测试细胞(例如肿瘤细胞)分离基因组DNA并且视需要扩增。以不同方式标记两种核酸并且然后原位杂交至参考细胞的中期染色体。去除参考DNA和测试DNA中的重复序列或通过一定方式(例如通过使用适当阻断核酸预杂交和/或包括在所述杂交期间用于所述重复序列的所述阻断核酸序列)减小其杂交能力。然后视需要以可视化形式呈现所结合的经标记DNA序列。可通过检测两种DNA信号的比率发生改变的区域来鉴定测试细胞中具有增加或降低的拷贝数的染色体区域。例如，与基因组的其他区域相比，测试细胞中拷贝数有所降低的那些区域所展示来自测试DNA的信号相对来说低于参考。测试细胞中拷贝数有所增加的区域将显示相对较高的来自测试DNA的信号。在存在染色体缺失或增加的情形下，检测到来自两种标记的信号的比率的差异并且所述比率将提供拷贝数的量度。在CGH的另一个实施方案(阵列CGH(aCGH))中，使用位于阵列上的结合固体载体的靶核酸的集合体代替经固定染色体元件，从而容许较大或全部百分比的基因组由结合固体载体的靶标的集合体代表。靶核酸可包含cDNA、基因组DNA、寡核苷酸(例如用于检测单一核苷酸多态性)等。还可使用单色标记实施基于阵列的CGH(与之相比，可使用两种不同染料标记对照和可能的肿瘤样品并且在杂交之前将其混合，这将产生由阵列上的探针的竞争性杂交所致的比率)。在单色CGH中，标记对照并杂交至一个阵列并且读取绝对信号，并且标记可能的肿瘤样品并杂交至第二阵列(使用相同含量)并读取绝对信号。基于来自两个阵列的绝对信号来计算拷贝数差。制备固定染色体或阵列并实施比较性基因组杂交的方法是本领域众所周知的(参见例如美国专利第6,335,167号、第6,197,501号、第5,830,645号和第5,665,549号以及Albertson(1984)EMBO J.3：1227-1234；Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：9138-9142；欧洲专利公开第430,402号；Methods in Molecular Biology，第33卷：In situ HybridizationProtocols，Choo编辑，Humana Press，Totowa，N.J.(1994)，等等)。在另一个实施方案中，使用Pinkel等人(1998)Nat.Genet.20：207-211或Kallioniemi(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：5321-5325(1992)的杂交方案。

在再一个实施方案中，可使用基于扩增的测定来测量拷贝数。在这些基于扩增的测定中，核酸序列用作扩增反应(例如聚合酶链反应(PCR)中的模板。在定量扩增中，扩增产物的量与原始样品中的模板量成正比。与适当对照(例如健康组织)进行比较可提供拷贝数的量度。

“定量”扩增的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，定量PCR涉及使用相同引物同时共扩增已知量的控制序列。这提供可用于校准PCR反应的内部标准。用于定量PCR的详细方案提供于Innis等人(1990)PCR Protocols，A Guide to Methods andApplications，Academic Press，Inc.N.Y.)中。使用定量PCR分析来测量微卫星基因座处的DNA拷贝数已阐述于Ginzonger等人(2000)Cancer Res.60：5405-5409中。基因的已知核酸序列足以使得本领域技术人员能够以常规方式选择引物来扩增基因的任何部分。荧光定量PCR还可用于本发明所涵盖的方法中。在荧光定量PCR中，量化是基于荧光信号(例如TaqMan和SYBR绿)的量。

其他合适的扩增方法包括但不限于连接酶链反应(LCR)(参见Wu和Wallace(1989)Genomics 4：560，Landegren等人(1988)Science 241：1077，和Barringer等人(1990)Gene89：117)、转录扩增(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173)、自持续序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1874)、点PCR和接头适体PCR等。

还可使用杂合性损失(LOH)和主要拷贝比例(MCP)定位(Wang等人(2004)CancerRes.64：64-71；Seymour等人(1994)Cancer Res.54：2761-2764；Hahn等人(1995)CancerRes.55：4670-4675；Kimura等人(1996)Gernes Chromosomes Cancer 17：88-93；Li等人(2008)MBC Bioinform.9：204-219)以鉴定扩增或缺失的区域。

d.检测生物标志物核酸表达的方法

可通过多种用于检测经转录分子或蛋白质的表达的众所周知的方法中的任一者来评价生物标志物表达。这些方法的非限制性实例包括用于检测分泌、细胞表面、细胞质或核蛋白的免疫学方法，蛋白质纯化方法，蛋白质功能或活性测定，核酸杂交方法，核酸逆转录方法和核酸扩增方法。

在优选的实施方案中，通过所测量基因转录物(例如mRNA)、所测量翻译蛋白的量或所测量基因产物活性来表征特定基因的活性。可以各种方式来监测标志物表达，包括通过检测mRNA水平、蛋白质水平或蛋白质活性，其中的任一者可使用标准技术来测量。检测可涉及量化基因表达水平(例如基因组DNA、cDNA、mRNA、蛋白质或酶活性)，或替代地，可定性评价基因表达水平(特别是与对照水平相比)。所检测水平类型自上下文显而易见。

在另一个实施方案中，检测或测定生物标志物和其功能类似同源物(包括其片段或基因改变，例如在其调控或启动子区域中)的表达水平包含检测或测定所关注标志物的RNA水平。在一个实施方案中，获得来自受试者的一种或多种待测试细胞并且从细胞分离RNA。在一个优选的实施方案中，从受试者获得乳房组织细胞的样品。

在一个实施方案中，从单一细胞获得RNA。例如，可通过激光捕获显微切割(LCM)从组织样品分离细胞。使用这种技术，可从组织切片(包括经染色组织切片)分离细胞，由此确保期望细胞得以分离(参见例如Bonner等人(1997)Science 278：1481；Emmert-Buck等人(1996)Science 274：998；Fend等人(1999)Am.J.Path，154：61；和Murakami等人(2000)Kidney Int.58：1346)。例如，Murakami等人(同上)阐述自先前从免疫染色的组织切片分离细胞。

还可从受试者获得细胞并且在体外培养细胞以例如获得可提取RNA的较大细胞群体。本领域已知确立非转化细胞的培养物(即原代细胞培养物)的方法。

在从来自个体的组织样品或细胞分离RNA时，在已从受试者取出组织或细胞之后防止基因表达发生任何进一步变化可能是重要的。已知表达水平的变化在扰动(例如热激或使用脂多糖(LPS)或其他试剂活化)后会快速变化。另外，组织和细胞中的RNA可迅速变得降解。因此，在一个优选的实施方案中，尽可能将从受试者获得的组织或细胞速冻。

可通过各种方法从组织样品提取RNA，例如硫氰酸胍裂解并且接着是CsCl离心(Chirgwin等人(1979)Biochem.18：5294-5299)。可如从单一细胞制备cDNA文库的方法中所述来获得来自单一细胞的RNA，例如Dulac(1998)Curr.Top.Dev.Biol.36：245和Jena等人(1996)J.Immunol.Methods 190：199中所述。必须例如通过并入RNA来确保避免RNA降解。

然后可使RNA样品富集于特定物质中。在一个实施方案中，从RNA样品分离聚(A)+RNA。一般来说，这种纯化利用了mRNA上的聚A尾部。特定来说并且如上所述，可将聚T寡核苷酸固定于固体载体内以用作mRNA的亲和力配体。用于该目的的试剂盒可购得，例如MessageMaker试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY)。

在一个优选的实施方案中，使RNA群体富集于标志物序列中。可例如通过引物特异性cDNA合成或多轮基于cDNA合成的线性扩增和模板定向体外转录来实施富集(参见例如Wang等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：9717；Dulac等人(同上)；和Jena等人(同上))。

可进一步扩增富集或未富集于特定物质或序列中的RNA群体。如本文中所定义，设计“扩增过程”以增强、增加或增大RNA内的分子。例如，在RNA为mRNA的情形下，可利用扩增过程如RT-PCR来扩增mRNA，从而可检测信号或检测增强。这种扩增过程是有益的，特别是在生物、组织或肿瘤样品具有较小大小或体积时。

可使用各种扩增和检测方法。例如，本发明范围内涵盖将mRNA逆转录成cDNA并且接着实施聚合酶链反应(RT-PCR)；或在两个步骤中使用单一酶，如美国专利第5,322,770号中所述；或将mRNA逆转录成cDNA并且接着实施对称间隙连接酶链反应(RT-AGLCR)，如由Marshall等人(1994)PCR Methods Appls.4：80-84所述。也可使用实时PCR。

可用于本文中的其他已知扩增方法包括但不限于所谓的“NASB A”或“3SR”技术，如Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1874-1878中所述以及Compton等人(1991)Nature 350：91-92中所述；Q-β扩增，如欧洲专利公开第4544610号中所述；链置换扩增，如Walker等人(1996)Clin.Chem.42：9-13和欧洲专利公开第684315号中所述；靶标介导的扩增，如由PCT公开第WO 93/22461号所述；PCR；连接酶链反应(LCR)(参见例如Wu和Wallace(1989)Genomics 4：560；Landegren等人(1988)Science 241：1077)；自持续序列复制(SSR)(参见例如Guatelli等人(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.87：1874)；和转录扩增(参见例如Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173)。

本领域已知许多用于测定基因表达的绝对和相对水平的技术，适用于本发明中的常用技术包括Northern分析、RNase保护测定(RPA)、微阵列和基于PCR的技术(例如定量PCR和差异显示PCR)。例如，Northern印迹涉及在变性琼脂糖凝胶上制备RNA，并且将其转移至合适载体(例如活化纤维素、硝基纤维素或玻璃或尼龙膜)中。然后使经放射性标记的cDNA或RNA杂交至所述制剂，洗涤并通过自动射线摄影术进行分析。

还可采用原位杂交可视化，其中使经放射性标记的反义RNA探针与活检样品的薄切片杂交，洗涤，使用RNase裂解并暴露于敏感乳液以实施自动射线摄影术。可使用苏木素(hematoxylin)将样品染色以证实样品的组织学组成，并且使用合适滤光器的暗视场成像显示显影乳液。也可使用非放射性标记，例如地高辛(digoxigenin)。

或者，可在DNA阵列、芯片或微阵列上检测mRNA表达。可使从受试者获得的测试样品的经标记核酸杂交至包含生物标志物DNA的固体表面。使用含有生物标志物转录物的样品获得正杂交信号。制备DNA阵列的方法和其用途是本领域众所周知的(参见例如美国专利第6,618,6796号、第6,379,897号、第6,664,377号、第6,451,536号和第6,548,257号；美国专利公开第2003/0157485号；以及Schena等人(1995)Science 20：467-470；Gerhold等人(1999)Trends Biochem.Sci.24：168-173；和Lennon等人(2000)Drug Discovery Today 5：59-65)。也可实施基因表达系列分析(SAGE)(参见例如美国专利公开第2003/0215858号)。

为监测mRNA水平，例如，从待测试生物样品提取mRNA，逆转录，并生成经荧光标记的cDNA探针。然后使用经标记cDNA探针探测能够杂交至标志物cDNA的微阵列，扫描载玻片并测量荧光强度。这种强度与杂交强度和表达水平相关。

可用于本文所述方法中的探针类型包括cDNA、核糖探针、合成寡核苷酸和基因组探针。所用探针类型通常取决于特定情况，例如用于原位杂交的核糖探针和用于Northern印迹的cDNA。在一个实施方案中，探针涉及RNA的独特核苷酸区域。探针可根据需要较短以差异性识别标志物mRNA转录物，并且可短至例如15个碱基；然而，可使用具有至少17、18、19或20个或更多个碱基的探针。在一个实施方案中，引物和探针在严格条件下特异性杂交至具有对应于标志物的核苷酸序列的DNA片段。如本文所用，术语“严格条件”意指杂交仅发生于核苷酸序列具有至少95％同一性时。在另一个实施方案中，在“严格条件”下杂交发生于序列之间具有至少97％同一性时。

标记探针的形式可为任何适当者，例如使用放射性同位素(例如

在一个实施方案中，生物样品含有来自测试受试者的多肽分子。或者，生物样品可含有来自测试受试者的mRNA分子或来自测试受试者的基因组DNA分子。

在另一个实施方案中，所述方法还涉及从对照受试者获得对照生物样品，使对照样品与能够检测标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的化合物或药剂接触，从而在生物样品中检测标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在，以及比较对照样品中的标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在与测试样品中的标志物多肽、mRNA、基因组DNA或其片段的存在。

e.检测生物标志物蛋白表达的方法

可通过检测或量化所表达多肽来检测和/或量化生物标志物蛋白的活性或水平。可通过本领域技术人员众所周知的众多方式中的任一者来检测和量化多肽。由生物标志物核酸和其功能类似同源物(包括其片段或基因改变，例如在其调控或启动子区域中)所编码多肽的多肽表达的异常水平与癌症对T细胞介导的细胞毒性调节剂(单独或与免疫疗法治疗组合)的反应可能性相关。可使用本领域已知用于检测多肽的任何方法。这些方法包括但不限于免疫扩散、免疫电泳、放射性免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、Western印迹、结合剂-配体测定、免疫组织化学技术、凝集、补体测定、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法等(例如Basic and Clinical Immunology，Sites和Terr编辑，Appleton and Lange，Norwalk，Conn.第217-262页，1991)。优选的是结合剂-配体免疫测定方法，其包括使抗体与一个或多个表位进行反应并且竞争性置换其经标记多肽或衍生物。

例如，可实施ELISA和RIA程序，从而标记(使用放射性同位素(例如

上述技术可基本上实施为“单步骤”或“两步骤”测定。“单步骤”测定涉及使抗原与经固定抗体接触并且在不洗涤下使混合物与经标记抗体接触。“两步骤”测定涉及在使混合物与经标记抗体接触之前进行洗涤。还可在适当时采用其他常规方法。

在一个实施方案中，测量生物标志物蛋白水平的方法包括以下步骤：使生物样本与选择性结合生物标志物蛋白的抗体或其变体(例如片段)接触，以及检测所述抗体或其变体是否结合至所述样品并且由此测量生物标志物蛋白的水平。

可通过常规方式来酶促和放射性标记生物标志物蛋白和/或抗体。这些方式通常包括例如通过戊二醛使酶特异性共价连接至所论述抗原或抗体以致不会不利地影响酶活性，这意指酶必须仍能够与其底物相互作用，但无需所有酶都具有活性，条件是足够酶保持活性以允许实现测定。实际上，用于结合酶的一些技术是非特异性的(例如使用甲醛)，并且仅产生一部分活性酶。

通常期望将测定系统的一种组分固定于载体上，由此容许系统的其他组分与所述组分接触并且易于无需费力和耗时的工作即可去除。可远离第一相固定第二相，但一种相通常是足够的。

可使酶本身固定至载体上，但如果需要固相酶，则然后这通常是通过结合至抗体并且使抗体附着至载体来最佳地实现，其模型和系统是本领域众所周知的。简单聚乙烯可提供合适的载体。

可用于标记的酶并无特定限制，但可选自例如氧化酶组的成员。这些酶通过与其底物进行反应来催化产生过氧化氢，并且因良好稳定性、便利可用性和廉价性以及其底物(葡萄糖)的随时可用性而通常使用葡萄糖氧化酶。可通过测量在使酶标记抗体与底物在本领域众所周知的受控条件下反应之后形成的过氧化氢的浓度来测定氧化酶活性。

可使用其他技术根据专业人员的偏好基于本公开来检测生物标志物蛋白。一种这样的技术是Western印迹(Towbin等人(1979)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A 76：4350)，其中在SDS-PAGE凝胶上操作经合适处理的样品，然后转移至固体载体(例如硝基纤维素滤膜)上。然后使抗生物标志物蛋白抗体(未标记)与载体接触并通过二级免疫学试剂(例如经标记蛋白质A或抗免疫球蛋白，合适标记包括

可使用免疫组织化学来检测例如活检样品中的生物标志物蛋白的表达。使合适抗体与例如细胞薄层接触，洗涤，并且然后与第二经标记抗体接触。可通过荧光标志物、酶(例如过氧化物酶)、抗生物素蛋白或放射性标记进行标记。使用显微术对测定进行目测评分。

抗生物标志物蛋白抗体(例如细胞内抗体)也可用于成像目的以例如检测受试者细胞和组织中的生物标志物蛋白的存在。合适的标记包括放射性同位素即碘(

对于体内成像目的来说，抗体本身不可从身体外部检测到，并且由此必须进行标记或以其他方式修饰以允许检测。用于此目的的标志物可为任何不基本上干扰抗体结合但容许外部检测者合适标志物可包括可通过X射线摄影术、NMR或MRI检测者。对于X射线摄影术技术来说，例如，合适标志物包括任何发射可检测辐射但并不明显危害受试者的放射性同位素(例如钡或铯)。用于NMR和MRI的合适标志物通常包括具有可检测特征性自旋者(例如氘)，其可例如通过合适地标记相关杂交瘤的营养物来并入抗体中。

受试者体型和所用成像系统将决定产生诊断影像所需的成像部分的量。在放射性同位素部分的情形下，对于人类受试者来说，所注入放射性的量通常介于约5毫居里锝-99至20毫居里锝-99之间。经标记抗体或抗体片段然后优先累积于含有生物标志物蛋白的细胞位置。然后可使用已知技术检测经标记抗体或抗体片段。

可用于检测生物标志物蛋白的抗体包括足够强烈并且特异性地结合至待检测生物标志物蛋白的任何抗体，不论是天然或合成、全长或其片段、单克隆或多克隆。抗体可具有至多约10

抗体可购得或者可根据本领域已知方法来制备。

在一些实施方案中，使用除抗体外的特异性结合至生物标志物蛋白的药剂，例如肽。可通过本领域已知的任何方式来鉴定特异性结合至生物标志物蛋白的肽。例如，可使用肽噬菌体展示文库来筛选生物标志物蛋白的特异性肽结合剂。

f.检测生物标志物结构改变的方法

可使用下列阐释性方法来鉴定生物标志物核酸和/或生物标志物多肽分子中的结构改变的存在以例如鉴定影响癌细胞的T细胞介导的杀伤的序列或药剂。

在某些实施方案中，检测改变涉及在聚合酶链反应(PCR)(参见例如美国专利第4,683,195号和第4,683,202号)如锚PCR或RACE PCR中或替代地在连接链反应(LCR)(参见例如Landegran等人(1988)Science 241：1077-1080；和Nakazawa等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：360-364)中使用探针/引物，后者可特别适用于检测生物标志物核酸如生物标志物基因中的点突变(参见Abravaya等人(1995)Nucl.Acids Res.23：675-682)。这种方法可包括以下步骤：从受试者收集细胞样品，从样品的细胞分离核酸(例如基因组、mRNA或二者)，使核酸样品与一个或多个在生物标志物基因(如果存在)发生杂交和扩增的条件下特异性杂交至生物标志物基因的引物接触，以及检测扩增产物的存在或不存在，或检测扩增产物的检测大小并将长度与对照样品进行比较。预计可期望联合使用PCR和/或LCR(作为初步扩增步骤)与用于检测本文所述突变的任何技术。

替代扩增方法包括：自持续序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等人(1988)Biotechnol.6：1197)或任何其他核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增分子。这些检测方案尤其可用于检测核酸分子(如果所述分子以极低数量存在)。

在一个替代实施方案中，可通过限制性酶裂解模式的改变来鉴定来自样品细胞的生物标志物核酸中的突变。例如，分离样品和对照DNA，扩增(任选地)，使用一种或多种限制性核酸内切酶消化，并且通过凝胶电泳测定片段长度大小并加以比较。样品与对照DNA之间的片段长度大小的差异指示样品DNA中的突变。此外，可使用序列特异性核酶(参见例如美国专利第5,498,531号)通过产生或损失核酶裂解位点来对特异性突变的存在进行评分。

在其他实施方案中，可通过使样品和对照核酸(例如DNA或RNA)杂交至含有数百或数千个寡核苷酸探针的高密度阵列来鉴定生物标志物核酸中的基因突变(Cronin等人(1996)Hum.Mutat.7：244-255；Kozal等人(1996)Nat.Med.2：753-759)。例如，可在含有光生成DNA探针的二维阵列中鉴定生物标志物基因突变，如Cronin等人(1996)(同上)中所述。简言之，可使用探针的第一杂交阵列扫描穿过样品和对照中的长DNA片段以通过制备顺序、重叠探针的线性阵列来鉴定序列间的碱基变化。该步骤容许鉴定点突变。在该步骤之后接着是第二杂交阵列，其容许通过使用与所检测的所有变体或突变互补的较小特殊探针阵列来表征特异性突变。每一突变阵列是由平行探针组构成，一组与野生型基因互补并且另一组与突变体基因互补。可在各种背景(包括例如种系突变和体细胞突变)中鉴定这些生物标志物基因突变。

在又一个实施方案中，可使用本领域已知的各种测序反应中的任一者来直接对生物标志物基因测序并且通过比较样品生物标志物的序列与相应野生型(对照)序列来检测突变。对反应测序的实例包括基于由Maxam和Gilbert(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：560或Sanger(1977)Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.74：5463开发的技术者。此外预计，可在实施诊断测定(Naeve(1995)Biotechniques 19：448-53)时利用各种自动化测序程序中的任一者，包括通过质谱进行测序(参见例如PCT公开第WO 94/16101号；Cohen等人(1996)Adv.Chromatogr.36：127-162；和Griffin等人(1993)Appl.Biochem.Biotechnol.38：147-159)。

用于检测生物标志物基因中的突变的其他方法包括使用裂解剂保护来检测RNA/RNA或RNA/DNA异源双链体中的错配碱基的方法(Myers等人(1985)Science 230：1242)。一般来说，“错配裂解”的本领域技术始于提供通过使用从组织样品获得的潜在突变体RNA或DNA杂交(标记)含有野生型生物标志物序列的RNA或DNA所形成的异源双链体。使用裂解双链体的单链区域(例如由于对照与样品链之间的碱基对错配而存在者)的试剂处理双链双链体。例如，可使用RNase处理RNA/DNA双链体并且使用SI核酸酶处理DNA/DNA杂合体来以酶促方式消化错配区域。在其他实施方案中，可使用羟基胺或四氧化锇和使用哌啶来处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以消化错配区域。在消化错配区域之后，然后根据大小在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离所得材料以测定突变位点。参见例如Cotton等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：4397和Saleeba等人(1992)Methods Enzymol.217：286-295。在一个优选的实施方案中，可标记对照DNA或RNA以用于检测。

在再一个实施方案中，错配裂解反应在限定系统中采用一种或多种识别双链DNA中的错配碱基对的蛋白质(所谓的“DNA错配修复”酶)来检测和定位从细胞样品获得的生物标志物cDNA中的点突变。例如，大肠杆菌的mutY酶裂解G/A错配处的A并且来自HeLa细胞的胸苷DNA糖苷酶裂解G/T错配处的T(Hsu等人(1994)Carcinogenesis 15：1657-1662)。根据一个示例性实施方案，可使用电泳方案等来检测基于生物标志物序列(例如经DNA错配修复酶处理的野生型生物标志物)的探针和裂解产物(如果存在)(例如美国专利第5,459,039号)。

在其他实施方案中，可使用电泳迁移率的改变来鉴定生物标志物基因中的突变。例如，可使用单链构形多态性(SSCP)来检测突变体与野生型核酸之间的电泳迁移率差(Orita等人(1989)Proc Natl.Acad.Sci U.S.A.86：2766；Cotton(1993)Mutat.Res.285：125-144；Hayashi(1992)Genet.Anal.Tech.Appl.9：73-79)。使样品和对照生物标志物核酸的单链DNA片段变性并使其复性。单链核酸的二级结构根据序列而变化，电泳迁移率的所得改变使得能够检测甚至单一碱基变化。可使用经标记探针来标记或检测DNA片段。可通过使用RNA(而非DNA)来增强测定敏感性，其中二级结构对序列变化更为敏感。在一个优选的实施方案中，目标方法利用异源双链体分析以基于电泳迁移率的变化来分离双链异源双链体分子(Keen等人(1991)Trends Genet.7：5)。

在又一个实施方案中，使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)来测定突变体或野生型片段在含有变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(Myers等人(1985)Nature 313：495)。在使用DGGE作为分析方法时，通过例如使用PCR添加大约40bp高熔点富GC DNA的GC钳来修饰DNA以确保其不完全变性。在另一个实施方案中，使用温度梯度代替变性梯度来鉴定对照和样品DNA的迁移率差(Rosenbaum和Reissner(1987)Biophys.Chem.265：12753)。

用于检测点突变的其他技术的实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增或选择性引物延伸。例如，可制备在中心置入已知突变的寡核苷酸引物并且然后在仅在发现完美匹配时允许杂交的条件下杂交至靶标DNA(Saiki等人(1986)Nature 324：163；Saiki等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：6230)。在这些等位基因特异性寡核苷酸附接至杂交膜并与经标记靶标DNA杂交时，所述寡核苷酸杂交至经PCR扩增的靶标DNA或许多不同突变。

或者，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异性扩增技术可与本发明联合使用。用作特异性扩增的引物的寡核苷酸可在以下位置携载所关注突变：分子中心(从而扩增取决于差异杂交)(Gibbs等人(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)；或一个引物的末端3′端，其中在适当条件下可防止错配或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech.11：238)。另外，可期望在突变区域中引入新颖限制位点以进行基于裂解的检测(Gasparini等人(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。预计在某些实施方案中还可使用用于扩增的Taq连接酶来实施扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：189)。在这些情形下，连接仅发生于在5′序列的3′端存在完美匹配时，从而使得可通过寻找扩增的存在或不存在来检测在特定位点处已知突变的存在。

VI.

涵盖(但不限于)包含本发明所涵盖的药剂的组合物。例如，涵盖基于核酸的组合物(例如信使RNA(mRNA)、cDNA、siRNA、反义核酸、寡核苷酸、核酶、DNA酶、适体、核酸诱饵、核酸嵌合体、三重螺旋结构等)，基于蛋白质的组合物，基于细胞的组合物，以及其变体、修饰和工程化形式，以用于本文所述的方法，并且涵盖组合物本身。在一些实施方案中，本发明涵盖具有有义链核酸序列和反义链核酸序列(其各自选自本文所述的序列以及其序列变体和/或化学修饰形式)的siRNA分子并且详细阐述于上文中。在一些实施方案中，如本文所述修饰的细胞(例如单核细胞和/或巨噬细胞)具有经调节发炎表型。

这些组合物可包含于药物组合物和/或制剂内。可通过已知或将来开发于药理学领域中的任何方法来制备这些组合物。一般来说，这些制备方法包括以下步骤：使药剂(例如活性成分)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分混合，并且然后视需要和/或在期望时使产物成型和/或包装为期望单一或多剂量单元。如本文所用，术语“活性成分”是指在暴露时于人类或动物中具有生理学效应的任何化学和生物物质。在本发明所涵盖的背景中，制剂中的活性成分可为任何调节本发明所涵盖的生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)的药剂。

1.

根据本发明的组合物可以散装、作为单一单位剂量和/或作为多个单一单位剂量来制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将向受试者施用的活性成分的剂量和/或这种剂量的适宜分率(例如这种剂量的二分之一或三分之一)。

术语“药学上可接受”是指那些在合理医学判断范围内适于与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症并且与合理益处/风险比相称的药剂、材料、组合物和/或剂型。

本发明所涵盖的药物组合物可呈现为无水药物制剂和剂型、液体药物制剂、固体药物制剂、疫苗等。合适的液体制剂可包括但不限于缓冲至所选pH的等渗水溶液、悬浮液、乳液或粘性组合物。

如下文所详述，可以特别方式配制本发明所涵盖的药剂和其他组合物以供以固体或液体形式施用，所述施用形式包括适于例如以下各种施用途径者：(1)经口施用，例如兽用顿服药(水性或非水性溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉剂、颗粒剂、糊剂；(2)肠胃外施用，例如皮下、肌内或静脉内注射，以例如无菌溶液或悬浮液形式；(3)局部施加，例如以乳膏、软膏或喷雾剂形式施加至皮肤；(4)经阴道内或经直肠内施用，例如以阴道栓剂、乳膏或发泡剂形式；或(5)含有化合物的气雾剂(例如呈水性气雾剂形式)、脂质体制剂或固体颗粒。涵盖用于本文所述的药剂或组合物的任何适当形状因子，例如但不限于片剂、胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。

本发明所涵盖的药物组合物可呈现为离散剂型如胶囊、药袋或片剂，或液体或气雾剂喷雾剂(各自含有预定量的呈粉剂或颗粒剂形式的活性成分)，溶液或悬浮液(于水性或非水性液体中)，水包油乳液，油包水液体乳液，重构用粉剂，口服粉剂，瓶(包括粉剂或液体瓶)，经口溶解膜，糖锭，糊剂，管，胶状物和包装。这些剂型可通过任何制药方法来制备。

可通过压缩或模制来制备片剂，其任选地含有一种或多种辅助成分。压缩片剂可使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可通过在合适机器中模制经惰性液体稀释剂润湿的粉末状肽或肽模拟物的混合物来制得。

可任选地使用包衣和包壳(例如肠溶包衣和医药配制领域中众所周知的其他包衣)刻痕或制备片剂和其他固体剂型(例如糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒剂)。以不同比例使用例如提供期望释放特征的羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、脂质体和/或微球体，它们也可经配制以提供其中活性成分的缓慢或受控释放。它们可通过例如经由细菌截留过滤器过滤或通过并入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂呈无菌固体组合物形式，可在即将使用前将其溶于无菌水或一些其他无菌可注射介质中。这些组合物还可任选地含有遮光剂并且还可为任选地以延迟方式仅仅或优先在胃肠道的某一部分中释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。在适当时，活性成分也可呈含有一种或多种赋形剂的微囊封形式。

在用于经口施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣药丸、粉剂、颗粒剂等)中，可将活性成分与一种或多种药学上可接受的载体(例如柠檬酸钠或磷酸二钙)和/或以下中的任一者混合：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)缓溶剂，例如石蜡；(6)吸收加速剂，例如季铵化合物；(7)润湿剂，例如乙酰醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂，例如高岭土和膨润土；(9)润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和它们的混合物；和(10)着色剂。在胶囊、片剂和丸剂的情形下，药物组合物还可包含缓冲剂。在使用例如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇等赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中，还可使用类似类型的固体组合物作为填充剂。

用于经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分外，所述液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特定来说，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇脂肪酸酯和它们的混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。除活性剂外，悬浮液还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶和它们的混合物。

用于直肠或阴道施用的制剂可作为栓剂呈现，所述栓剂可通过将一种或多种药剂与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体(包含例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐)混合来制备，并且所述栓剂在室温下为固体，但在体温下为液体，并且因此将在直肠或阴道腔中融化并释放活性剂。

适于阴道施用的制剂还包括含有本领域已知适当的载体的子宫托、阴道塞(tampon)、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂。

用于局部或透皮施用调节(例如抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂的剂型包括粉剂、喷雾剂、软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。可在无菌条件下将所述活性组分与药学上可接受的载体并且与任何可需要的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。

除药剂外，软膏、糊剂、乳膏和凝胶可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉和氧化锌或它们的混合物。

除调节(例如抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂外，粉剂和喷雾剂还可含有赋形剂，例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉剂或这些物质的混合物。喷雾剂可另外含有常规推进剂，例如氯氟烃类和未被取代的挥发性烃类，例如丁烷和丙烷。

可通过气雾剂施用药剂。这可通过制备含有所述化合物的水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒来实现。可使用非水性(例如氟碳推进剂)悬浮液。声波雾化器是优选的，因为它们使药剂在可使得化合物降解的剪切中的暴露降至最低。

通常，通过将药剂的水溶液或悬浮液与常规药学上可接受的载体和稳定剂配制在一起来制得水性气雾剂。载体和稳定剂随特定化合物的需要而变，但通常包括非离子型表面活性剂(吐温(Tween)、普朗尼克(Pluronic)或聚乙二醇)、无害蛋白质(如血清白蛋白)、脱水山梨糖醇酯、油酸、卵磷脂、氨基酸(例如甘氨酸)、缓冲剂、盐、糖或糖醇。气雾剂通常是从等渗溶液制备。

透皮贴剂的额外优点是将药剂受控递送至身体中。这类剂型可通过将所述药剂溶解或分散于适当介质中来制得。还可使用吸收增强剂来增加肽模拟物的跨皮肤通量。这种通量的速率可通过提供速率控制膜或将肽模拟物分散于聚合物基质或凝胶中来控制。

眼部制剂、眼用软膏、粉剂、溶液等也涵盖于本发明的范围内。

在一些实施方案中，将本发明所涵盖的药物组合物配制成肠胃外剂型。肠胃外制剂可为含有载体或赋形剂(例如盐、碳水化合物和缓冲剂(例如在3至9的pH下))的水溶液；或无菌非水性溶液，或干燥形式，其可与合适媒介物(例如无菌无热原水)联合使用。例如，本发明所涵盖治疗剂的水溶液包含等渗盐水、5％葡萄糖或其他药学上可接受的液体载体(例如液体醇、二醇、酯和酰胺)，例如如美国专利第7,910,594号中所公开。在另一实例中，本发明所涵盖治疗剂的水溶液包含用于静脉内施用的磷酸盐缓冲制剂(pH 7.4)，如PCT公开第WO 2011/014821号中所公开。肠胃外剂型可呈包含本发明所涵盖治疗剂的剂量的可重构冻干物的形式。可利用本领域已知的任何延长释放剂型(例如美国专利第4,713,249号、第5,266,333号和第5,417,982号中所述的生物可降解碳水化合物基质)，或替代地可使用慢泵(例如渗透泵)。可容易地使用本领域技术人员众所周知的标准医药技术在无菌条件下例如通过在无菌条件下冻干来制备肠胃外制剂。可通过使用适当配制技术(例如并入溶解性增强剂)来增加用于制备肠胃外制剂的本发明所涵盖的治疗剂的溶解性。用于肠胃外施用的制剂可包含一种或多种药剂与以下物质的组合：一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液；或无菌粉末，其可在即将使用前重构为无菌可注射溶液或分散液，所述物质可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、可使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质或悬浮剂或增稠剂。

这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。微生物作用的防止可通过包括各种抗细菌和抗真菌剂来确保，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等。所述组合物中也可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。另外，可通过并入吸收延迟剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射药物形式的吸收。

在一些情形下，为延长药物作用，期望减缓来自皮下或肌内注射的药物的吸收。这可通过使用具有不良水溶性的结晶或非晶材料的液体悬浮液来实现。因而，药物吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小和结晶形式。或者，通过将肠胃外施用的药物形式溶解或悬浮于油媒介物中来实现所述药物的延迟吸收。

通过在生物可降解聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成调节(例如抑制)生物标志物表达和/或活性的药剂的微胶囊基质来制备可注射储积形式。取决于药物对聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可控制药物释放速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。储积可注射制剂也可通过将药物包裹于与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。

在本发明所涵盖的药剂作为药物施用于人类和动物时，其可以原样或作为含有例如0.1％至99.5％(更优选地0.5％至90％)活性成分与药学上可接受的载体的组合的药物组合物给予。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可取决于本发明所涵盖的方法，以获得可有效地实现特定受试者、组合物和施用模式的期望治疗反应而对受试者无毒的活性成分量。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的药物组合物可经配制用于受控释放和/或靶向递送。如本文所用，“受控释放”是指符合特定释放模式以实现治疗结果的药物组合物或化合物释放特征。在一个实施方案中，可将本发明所涵盖的组合物囊封至本文所述和/或本领域已知的递送剂中以用于受控释放和/或靶向递送。如本文所用，术语“囊封”意指包封、环绕或包壳。在涉及本发明所涵盖的制剂时，囊封可为基本上、完全或部分的。术语“基本上囊封”意指，至少大于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.9％或大于99.999％的本发明所涵盖的治疗剂可包封、环绕或包壳于颗粒内。术语“部分地囊封”意指，小于10％、10％、20％、30％、40％、50％或更少的本发明所涵盖的缀合物可包封、环绕或包壳于颗粒内。例如，至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％的本发明所涵盖的药物组合物或化合物囊封于制剂中。

在一些实施方案中，也可构建这类制剂或改变组成，从而将其被动或主动地引导至不同体内细胞类型(包括但不限于单核细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞(例如树突状细胞、抗原呈递细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和天然杀手细胞)、癌细胞等)中。也可经由在细胞表面上表达不同配体来选择性靶向制剂，如通过(但不限于)叶酸盐、转铁蛋白、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)和抗体靶向方法所示例。

2.赋形剂

可使用一种或多种赋形剂来配制本发明所涵盖的药物组合物以实现以下用途：(1)增加稳定性；(2)允许持续或延迟释放(例如从储积制剂)；(3)改变生物分布(例如使药剂靶向特定组织或细胞类型)；(4)改变药剂的体内释放特征。赋形剂的非限制性实例包括任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂和防腐剂。本发明所涵盖的赋形剂也可包括但不限于类脂质、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物(lipoplex)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、透明质酸酶、纳米颗粒模拟物和它们的组合。

术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”旨在包括适于特定期望剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散剂或悬浮剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、崩解剂、防腐剂、缓冲剂、固体粘合剂、润滑剂、油、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、吸收延迟剂等。Remington′s The Science and Practice of Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro(Lippincott，Williams&Wilkins，Baltimore，MD，2006)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和其已知制备技术。除非任何常规赋形剂介质都因例如产生任何不期望生物效应或以有害方式与药物组合物中的任何其他组分相互作用而与某一物质或其衍生物不相容，否则其使用涵盖于本发明范围内。也可将补充活性成分并入所述组合物中。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％或100％纯。在一些实施方案中，批准赋形剂用于人类和兽医学用途中。在一些实施方案中，赋形剂是由美国食品药物监督管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是医药级。在一些实施方案中，赋形剂满足美国药典(UnitedStates Pharmacopoeia，USP)、欧洲药典(European Pharmacopoeia，EP)、英国药典(British Pharmacopoeia)和/或国际药典(Intemational Pharmacopoeia)的标准。

示例性稀释剂包括但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉等和/或它们的组合。

示例性造粒和/或分散剂包括但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘果肉、琼脂、膨润土、纤维素和木质产品、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚(乙烯基-吡咯烷酮)(交聚维酮(crospovidone))、羧甲基淀粉钠(羟基乙酸淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(starch 1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝

示例性表面活性剂和/或乳化剂包括但不限于天然乳化剂(例如阿拉伯胶、琼脂、海藻酸、海藻酸钠、黄蓍胶、克罗珠克(chondrux)、胆固醇、黄原胶、果胶、明胶、蛋黄、酪蛋白、羊毛脂、胆固醇、蜡和卵磷脂)，胶质粘土(例如膨润土[硅酸铝]和

示例性粘合剂包括但不限于淀粉(例如玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)；天然和合成胶(例如阿拉伯胶、海藻酸钠、角叉菜提取物、潘瓦尔胶(panwar gum)、印度胶(ghatti gum)、伊沙波果壳(isapolhusk)的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、乙酸纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、硅酸镁铝

示例性防腐剂可包括但不限于抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和/或其他防腐剂。示例性抗氧化剂包括但不限于α生育酚、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸基酯、丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯、单硫基甘油、偏亚硫酸氢钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠和/或亚硫酸钠。示例性螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)、单水合柠檬酸、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和/或依地酸三钠。示例性抗微生物防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、苄索氯铵(benzethonium chloride)、苄基醇、溴硝丙二醇、十六烷基三甲基溴化铵(cetrimide)、鲸蜡基吡啶鎓氯化物、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、氯甲酚、氯二甲酚、甲酚、乙醇、甘油、海克替啶(hexetidine)、咪脲、酚、苯氧基乙醇、苯基乙基醇、硝酸苯汞、丙二醇和/或硫柳汞(thimerosal)。示例性抗真菌防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯甲酸钾、山梨酸钾、苯甲酸钠、丙酸钠和/或山梨酸。示例性醇防腐剂包括但不限于乙醇、聚乙二醇、酚、酚系化合物、双酚、氯丁醇、羟基苯甲酸酯和/或苯基乙基醇。示例性酸性防腐剂包括但不限于维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、柠檬酸、乙酸、脱氢乙酸、抗坏血酸、山梨酸和/或植酸。其他防腐剂包括但不限于生育酚、生育酚乙酸酯、甲磺酸去铁胺、十六烷基三甲基溴化铵、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、乙二胺、月桂基硫酸钠(SLS)、月桂基醚硫酸钠(SLES)、亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钾、偏亚硫酸氢钾、GLYDANT

示例性缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油基磷酸钙、乳酸钙、丙酸、乙酰丙酸钙、戊烷酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、羟基磷灰石(calcium hydroxide phosphate)、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、胺丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、乙醇等和/或它们的组合。

示例性润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石粉、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠等和它们的组合。

示例性油包括但不限于杏仁油、苦杏仁油、鳄梨油、巴巴苏(babassu)油、佛手柑油、黑加仑籽油、玻璃苣油、刺桧油、甘菊油、芥花油、香菜油、巴西棕榈油、蓖麻油、肉桂油、可可油、椰子油、鱼肝油、咖啡油、玉米油、棉籽油、鸸鹋油、桉树油、月见草油、鱼油、亚麻籽油、香叶醇油、葫芦油、葡萄籽油、榛子油、牛膝草油、肉豆蔻酸异丙基酯油、荷荷巴(jojoba)油、夏威夷果油、杂熏衣草油、熏衣草油、柠檬油、荜澄茄油、火山豆油、锦葵油、芒果籽油、白芒花籽油、水貂油、肉豆蔻油、橄榄油、橙油、深海鱼油、棕榈油、棕榈仁油、桃仁油、花生油、罂粟籽油、南瓜籽油、油菜籽油、米糠油、迷叠香油、红花油、檀香油、山茶花油、开胃香油、沙棘油、芝麻油、雪亚脂油、硅油、大豆油、向日葵油、茶树油、蓟油、山茶油、岩石草油、胡桃油和小麦胚油。示例性油包括但不限于硬脂酸丁酯、辛酸三甘油酯、癸酸三甘油酯、环甲基聚硅氧烷、癸二酸二乙基酯、二甲基聚硅氧烷360、肉豆蔻酸异丙基酯、矿物油、辛基十二烷醇、油醇、硅油和/或它们的组合。

根据配制者的判断，可在组合物中存在赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡、着色剂、涂覆剂、甜味剂、调味剂和/或香味剂。

药物制剂还可包含药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指衍生自本领域已知的各种有机和无机相对离子的盐(参见例如Berge等人(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这些盐可在药剂最后分离和纯化期间原位制备，或通过使呈游离碱形式的经纯化药剂与合适有机或无机酸单独反应并分离由此形成的盐来制备。可使用无机酸和有机酸来形成药学上可接受的酸加成盐。可从其衍生盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸和磷酸。可从其衍生盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸。药学上可接受的碱加成盐可使用无机碱和有机碱来形成。可从其衍生盐的无机碱包括例如钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝。可从其衍生盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺，包括天然存在的被取代胺的被取代胺，环胺和碱性离子交换树脂。具体实例包括异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。在一些实施方案中，药学上可接受的碱加成盐是选自铵、钾、钠、钙和镁的盐。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的药剂可含有一种或多种酸性官能团并且因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情形下，术语“药学上可接受的盐”是指调节(例如抑制)生物标志物表达的药剂的相对无毒性的无机和有机碱加成盐。同样，这些盐可在药剂的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使经纯化药剂以其游离酸形式与合适碱(例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)、与氨或与药学上可接受的有机伯胺、仲胺或叔胺单独反应而制备。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括锂、钠、钾、钙、镁和铝的盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等(参见例如Berge等人，同上)。

术语“共晶体”是指衍生自本领域已知的多种共晶体形成剂的分子复合物。不同于盐，共晶体通常不涉及共晶体与药物之间的氢转移，而是涉及共晶体形成剂与晶体结构中的药物之间的分子间相互作用(例如氢键结、芳族环堆叠或分散力)。

可用于形成本发明所涵盖的药物组合物和剂型的示例性表面活性剂包括但不限于亲水性表面活性剂、亲脂性表面活性剂和它们的混合物。也就是说，可采用亲水性表面活性剂的混合物，可采用亲脂性表面活性剂的混合物，或可采用至少一种亲水性表面活性剂和至少一种亲脂性表面活性剂的混合物。亲水性表面活性剂可为离子型或非离子型。合适的离子型表面活性剂包括但不限于烷基铵盐；夫西地酸(fusidic acid)盐；氨基酸、寡肽和多肽的脂肪酸衍生物；氨基酸、寡肽和多肽的甘油酯衍生物；卵磷脂和氢化卵磷脂；溶血卵磷脂和氢化溶血卵磷脂；磷脂和其衍生物；溶血磷脂和其衍生物；肉毒碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸盐；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；和它们的混合物。离子型表面活性剂可包括例如：卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂、溶血磷脂和其衍生物；肉毒碱脂肪酸酯盐；烷基硫酸盐；脂肪酸盐；多库酯钠；酰基乳酸盐；单甘油酯和二甘油酯的单乙酰化和二乙酰化酒石酸酯；琥珀酰化单甘油酯和二甘油酯；单甘油酯和二甘油酯的柠檬酸酯；和它们的混合物。

离子型表面活性剂可为离子化形式的卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酸、溶血磷脂酰丝氨酸、PEG-磷脂酰乙醇胺、PVP-磷脂酰乙醇胺、脂肪酸的乳酸酯、硬脂酰基-2-乳酸酯、乳酸硬脂酰基酯、琥珀酰化单甘油酯、单/二甘油酯的单/二乙酰化酒石酸酯、单/二甘油酯的柠檬酸酯、胆酰肌氨酸、己酸盐、辛酸盐、癸酸盐、月桂酸盐、肉豆蔻酸盐、棕榈酸盐、油酸盐、蓖麻油酸盐、蓖麻油酸盐、亚麻酸盐、硬脂酸盐、月桂基硫酸盐、十四烷基硫酸盐(teracecyl sulfate)、多库酯盐、月桂酰基肉毒碱、棕榈酰基肉毒碱、肉豆蔻酰基肉毒碱，以及其盐和混合物。

亲水性非离子型表面活性剂可包括但不限于烷基葡萄糖苷；烷基麦芽糖苷；烷硫基葡萄糖苷；月桂基聚乙二醇甘油酯；聚氧基亚烷基烷基醚，例如聚乙二醇烷基醚；聚氧基亚烷基烷基酚，例如聚乙二醇烷基酚；聚氧基亚烷基烷基酚脂肪酸酯，例如聚乙二醇脂肪酸单酯和聚乙二醇脂肪酸二酯；聚乙二醇甘油脂肪酸酯；聚甘油脂肪酸酯；聚氧基亚烷基脱水山梨糖醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯；多元醇与至少一种由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和固醇组成的组的成员的亲水性酯基转移产物；聚氧乙烯固醇、其衍生物和类似物；聚氧基乙基化维生素和其衍生物；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物；和它们的混合物；聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯以及多元醇与至少一种由三甘油酯、植物油和氢化植物油组成的组的成员的亲水性酯基转移产物。多元醇可为甘油、乙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇、丙二醇、异戊四醇或糖。

其他亲水性非离子型表面活性剂包括但不限于PEG-10月桂酸酯、PEG-12月桂酸酯、PEG-20月桂酸酯、PEG-32月桂酸酯、PEG-32二月桂酸酯、PEG-12油酸酯、PEG-15油酸酯、PEG-20油酸酯、PEG-20二油酸酯、PEG-32油酸酯、PEG-200油酸酯、PEG-400油酸酯、PEG-15硬脂酸酯、PEG-32二硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯、PEG-20二月桂酸酯、PEG-25甘油基三油酸酯、PEG-32二油酸酯、PEG-20甘油基月桂酸酯、PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-20甘油基硬脂酸酯、PEG-20甘油基油酸酯、PEG-30甘油基油酸酯、PEG-30甘油基月桂酸酯、PEG-40甘油基月桂酸酯、PEG-40棕榈仁油、PEG-50氢化蓖麻油、PEG-40蓖麻油、PEG-35蓖麻油、PEG-60蓖麻油、PEG-40氢化蓖麻油、PEG-60氢化蓖麻油、PEG-60玉米油、PEG-6癸酸盐/辛酸盐甘油酯、PEG-8癸酸盐/辛酸盐甘油酯、聚甘油基-10月桂酸酯、PEG-30胆固醇、PEG-25植物固醇、PEG-30大豆固醇、PEG-20三油酸酯、PEG-40脱水山梨糖醇油酸酯、PEG-80脱水山梨糖醇月桂酸酯、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、POE-9月桂基醚、POE-23月桂基醚、POE-10油基醚、POE-20油基醚、POE-20硬脂基醚、生育酚基PEG-100琥珀酸酯、PEG-24胆固醇、聚甘油基-10油酸酯、Tween 40、Tween 60、蔗糖单硬脂酸酯、蔗糖单月桂酸酯、蔗糖单棕榈酸酯、PEG 10-100壬基酚系列、PEG 15-100辛基酚系列和泊洛沙姆(poloxamer)。

合适的亲脂性表面活性剂可包括但不限于脂肪醇；甘油脂肪酸酯；乙酰化甘油脂肪酸酯；低级醇脂肪酸酯；丙二醇脂肪酸酯；脱水山梨糖醇脂肪酸酯；聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯；固醇和固醇衍生物；聚氧基乙基化固醇和固醇衍生物；聚乙二醇烷基醚；糖酯；糖醚；单甘油酯和二甘油酯的乳酸衍生物；多元醇与至少一种由甘油酯、植物油、氢化植物油、脂肪酸和固醇组成的组的成员的疏水性酯基转移产物；油溶性维生素/维生素衍生物；和它们的混合物。在该组内，优选的亲脂性表面活性剂包括甘油脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯和它们的混合物，或者是多元醇与至少一种由植物油、氢化植物油和三甘油酯组成的组的成员的疏水性酯基转移产物。

可在本发明制剂中包括增溶剂以确保本发明所涵盖药剂(例如化学化合物)的良好增溶和/或溶解并且最小化本发明所涵盖药物形式的沉淀。对于用于口服使用的组合物(例如注射用组合物)，这可尤其重要。也可添加增溶剂以增加亲水性药物和/或其他组分(例如表面活性剂)的溶解性，或使组合物维持为稳定或均质溶液或分散液。合适的增溶剂的实例包括但不限于下列试剂：醇和多元醇，例如乙醇、异丙醇、丁醇、苄基醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇和其异构体、甘油、异戊四醇、山梨糖醇、甘露糖醇、二乙二醇单乙基醚(transcutol)、二甲基异山梨醇、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素和其他纤维素衍生物、环糊精和环糊精衍生物；平均分子量为约200至约6000的聚乙二醇的醚，例如四氢糠基醇PEG醚(糖糠醇)或甲氧基PEG；酰胺和其他含氮化合物，例如2-吡咯烷酮、2-哌啶酮、

还可使用增溶剂的混合物。实例包括但不限于三醋精、柠檬酸三乙基酯、油酸乙酯、辛酸乙酯、二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、N-羟乙基吡咯烷酮、聚乙烯基吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、羟丙基环糊精、乙醇、聚乙二醇200-100、糖糠醇、二乙二醇单乙基醚、丙二醇和二甲基异山梨醇。特别优选的增溶剂包括山梨糖醇、甘油、三醋精、乙醇、PEG-400、糖糠醇和丙二醇。

药学上可接受的添加剂可视需要包括于制剂中。这些添加剂和赋形剂包括但不限于防粘剂、抗发泡剂、缓冲剂、聚合物、抗氧化剂、防腐剂、螯合剂、粘度调节剂、张力剂、调味剂、着色剂、芳香剂、遮光剂、悬浮剂、粘合剂、填充剂、增塑剂、润滑剂和它们的混合物。

另外，可将酸或碱并入组合物中以促进处理，增强稳定性或用于其他原因。药学上可接受的碱的实例包括氨基酸、氨基酸酯、氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁、硅酸镁铝、合成硅酸铝、合成水滑石、氢氧化镁铝、二异丙基乙基胺、乙醇胺、乙二胺、三乙醇胺、三乙胺、三异丙醇胺、三甲胺、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)等。此外合适的是呈药学上可接受的酸的盐形式的碱，所述酸例如乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、烷烃磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、草酸、对溴苯基磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、硫基乙醇酸、甲苯磺酸、尿酸等。也可使用多元酸的盐，例如磷酸钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。当碱为盐时，阳离子可为任何适宜的药学上可接受的阳离子，例如铵、碱金属和碱土金属。实例可包括但不限于钠、钾、锂、镁、钙和铵。

合适的酸是药学上可接受的有机酸或无机酸。合适的无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸、硼酸、磷酸等。合适的有机酸的实例包括乙酸、丙烯酸、己二酸、海藻酸、烷烃磺酸、氨基酸、抗坏血酸、苯甲酸、硼酸、丁酸、碳酸、柠檬酸、脂肪酸、甲酸、富马酸、葡萄糖酸、氢醌磺酸、异抗坏血酸、乳酸、马来酸、甲烷磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、丙酸、对甲苯磺酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、鞣酸、酒石酸、硫基乙醇酸、甲苯磺酸和尿酸。

3.

在一些实施方案中，使用基于脂质的制剂。因此，本文提供包含如本文所述的组合物和一种或多种脂质的基于脂质的制剂。在一些实施方案中，脂质是脂质颗粒或两亲性化合物。脂质在生理学pH下可为中性、阴离子性或阳离子性。

合适的固体脂质包括但不限于高级饱和醇、高级脂肪酸、鞘脂、合成酯和高级饱和脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯。固体脂质可包括具有10-40个、优选地12-30个碳原子的脂族醇，例如鲸蜡硬脂醇。固体脂质可包括10-40个、优选地12-30个碳原子的高级脂肪酸，例如硬脂酸、棕榈酸、癸酸和山嵛酸。固体脂质可包括具有10-40个、优选地12-30个碳原子的高级饱和脂肪酸的甘油酯(包括单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯)，例如单硬脂酸甘油酯、甘油山嵛酸酯、甘油棕榈酸硬脂酸酯、甘油三月桂酸酯、三癸精、三月桂精、三肉豆蔻精、三棕榈精、三硬脂精和氢化蓖麻油。合适的固体脂质可包括棕榈酸鲸蜡基酯、蜂蜡或环糊精。

两亲性化合物包括但不限于磷脂，例如1，2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、二山嵛酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、二-二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)和二木脂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)，其是以介于0.01-60(重量脂质/重量聚合物)之间(例如介于0.1-30(重量脂质/重量聚合物)之间)的比率并入。可用磷脂包括但不限于磷脂酸、具有饱和和不饱和脂质的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰衍生物、心磷脂和β-酰基-y-烷基磷脂。磷脂的实例包括但不限于磷脂酰胆碱，例如二油酰基磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二-十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、二山嵛酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、二-二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、二木脂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)；和磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰基乙醇胺或1-十六烷基-2-棕榈酰基甘油基磷酸乙醇胺。也可使用具有不对称酰基链(例如具有一条6碳酰基链和另一条12碳酰基链)的合成磷脂。

在一些实施方案中，使用基于脂质的颗粒。术语“脂质颗粒”是指由一种生物相容脂质或不同生物相容脂质的混合物(例如至少一种或多种阳离子脂质和/或一种或多种中性脂质和/或聚乙二醇(PEG)脂质)构成的脂质体、脂质胶束、固体脂质颗粒、脂质复合物、脂质纳米颗粒(LNP)或脂质稳定的聚合颗粒。

颗粒可为脂质胶束。脂质胶束可形成为例如含有脂质表面活性剂的油包水乳液。乳液是两种不混溶相的共混物，其中添加表面活性剂以稳定分散液滴。在一些实施方案中，脂质胶束是微乳液。微乳液是至少由水、油和脂质表面活性剂构成的热动力学稳定系统，所述脂质表面活性剂可产生液滴大小小于1微米、约10nm至约500nm或约10nm至约250nm的透明热动力学稳定系统。脂质胶束通常可用于囊封疏水性活性剂(包括疏水性治疗剂、疏水性预防剂或疏水性诊断剂)。

颗粒可为固体脂质颗粒。固体脂质颗粒可替代胶质胶束和脂质体。固体脂质颗粒通常是亚微米大小，即约10nm至约1微米、10nm至约500um、或10nm至约250nm。固体脂质颗粒是由在室温下为固体的脂质形成。它们通过使用固体脂质代替液体油而衍生自水包油乳液。

颗粒可为脂质体。脂质体是由环绕有配置成球形双层的脂质的水性介质构成的小囊泡。脂质体可分类为小单层囊泡、大单层囊泡或多层囊泡。多层脂质体含有多个同心脂质双层。脂质体可用于通过将亲水性药剂捕集于水性内部或双层之间或通过将疏水性药剂捕集于双层内来囊封药剂。

脂质胶束和脂质体通常具有水性中心。水性中心可含有水或水和醇的混合物。合适的醇包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇(例如异丙醇)、丁醇(例如正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、戊醇(例如戊醇、异丁基甲醇)、己醇(例如1-己醇、2-己醇、3-己醇)、庚醇(例如1-庚醇、2-庚醇、3-庚醇和4-庚醇)或辛醇(例如1-辛醇)或它们的组合。

脂质体是可主要由脂质双层构成的人工制得的囊泡并且可用作用于施用营养物和药物制剂的递送媒介物。脂质体可具有不同大小，例如但不限于多层囊泡(MLV)，其可具有数百纳米的直径并且可含有一系列由窄水性腔室分隔的同心双层；小单细胞囊泡(SUV)，其直径可小于50nm；和大单层囊泡(LUV)，其直径可介于50nm与500nm之间。脂质体设计可包括但不限于调理素或配体以改善脂质体与不健康组织的附接或活化事件(例如但不限于胞吞作用)。脂质体可含有低或高pH以改善药物制剂的递送。

脂质体的形成可取决于物理化学特性，例如但不限于所包埋药物制剂和脂质体成分、分散脂质囊泡的介质的性质、所包埋物质的有效浓度和其潜在毒性、在施加和/或递送囊泡期间所涉及的任何其他过程、用于预期应用的囊泡的优化大小、多分散性和储架寿命，以及大规模生产安全和有效脂质体产品的批次间再现性和可能性。

在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可包括但不限于脂质体(例如由1，2-二油基氧基-N，N-二甲基氨基丙烷(DODMA)脂质体形成者)，来自Marina Biotech(Bothell，WA)的DiLa2脂质体、1，2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2，2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)和MC3(例如如美国专利公开第2010/0324120号中所述)。

在一个实施方案中，本发明所涵盖的组合物可配制成脂质-多聚阳离子复合物。可通过本领域已知和/或如美国专利公开第2012/0178702号中所述的方法来形成脂质-多聚阳离子复合物。作为一个非限制性实例，多聚阳离子可包括阳离子肽或多肽，例如但不限于聚赖氨酸、聚鸟氨酸和/或聚精氨酸和PCT公开第WO 2012/013326号中所述的阳离子肽。在另一个实施方案中，本发明所涵盖的组合物可配制成脂质-多聚阳离子复合物，其可进一步包括中性脂质，例如但不限于胆固醇或二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。脂质体制剂可由(但不限于)以下因素影响：所选阳离子脂质组分、阳离子脂质饱和程度、聚乙二醇化性质、所有组分的比率和生物物理参数(例如大小)。

在一些实施方案中，脂质颗粒是脂质纳米颗粒(LNP)。术语“脂质纳米颗粒(LNP)”是指亚微米范围内的基于脂质的颗粒，其包括一种或多种如本文所述的脂质组分。LNP可具有脂质体的结构特性和/或具有替代非双层型结构，其可用于全身性递送基于核酸的药物，包括例如与从本文所述的至少一种生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的至少一种靶标)转录的mRNA的核酸序列互补的siRNA分子。在一些实施方案中，LNP制剂包含一种或多种阳离子脂质。阳离子脂质是在任何生理学pH下携载净正电荷的脂质。在某些特定实施方案中，LNP包含如本文所述的类脂质。正电荷可用于与带负电治疗剂(例如siRNA分子)缔合。

在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含一种或多种脂质和如本文所述的组合物。在某些特定实施方案中，如本文所述的组合物囊封于脂质纳米颗粒内。

在一些实施方案中，将LNP的大小和电荷比率以及其他物理性质(例如膜流动性)优化以增加细胞转染和递送。

脂质或类脂质颗粒可包含例如阳离子脂质、中性脂质、基于氨基酸或肽的脂质、聚乙二醇(PEG)-脂质(例如具有PEG链的脂质)，例如氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇(CHE)、1，2-二硬脂酰基-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(PEG)-2000](DSPE-PEG2000)、在链远端经马来酰亚胺基团修饰的1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(PEG)-2000]、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺N-[马来酰亚胺(PEG)-2000]、DSPE-PEG2000-MAL、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550](DMPE-PEG550)、1，2-二油酰基-1-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)和具有甘油主链者(例如DMG-PEG、DSG-PEG(DMG-PEG2000))等。如本文所用，脂质体是包含包封水性内部的含脂质膜的结构。例如，可使用基于脂质的制剂来递送本发明的核酸剂(例如siRNA、miRNA、寡核苷酸、经修饰mRNA和其他类型的核酸分子)。

合适的中性和阴离子脂质包括但不限于固醇和脂质，例如胆固醇、磷脂、溶血脂质、溶血磷脂质、鞘脂或聚乙二醇化脂质。中性和阴离子脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)(例如鸡蛋PC、大豆PC)，包括1，2-二酰基-甘油-3-磷酸胆碱；磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇(PI)；糖脂；鞘磷脂，例如鞘髓磷脂和鞘糖脂(也称为1-神经酰胺基糖苷)，例如神经酰胺吡喃半乳糖苷、神经节苷脂和脑苷脂；含有羧酸基团的脂肪酸、固醇，例如胆固醇；1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，包括但不限于1，2-二油基磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二-十六烷基磷酸乙醇胺(DHPE)、1，2-二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)和1，2-二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)。脂质还可包括脂质的各种天然(例如组织源L-α-磷脂酰基：蛋黄、心脏、脑、肝、大豆)和/或合成(例如饱和和不饱和1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-酰基-2-酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二庚酰基-SN-甘油-3-磷酸胆碱)衍生物。

多种阳离子脂质和其制备方法阐述于例如美国专利第5,830,430号、第6,056,938号、第7,893,302号、第7,404,969号、第8,034,376号、第8,283,333号和第8,642,076号以及PCT公开第WO 2010/054406号、第WO 2010/054401号、第WO 2010/054405号、第WO 2010/054384号、第WO 2012/040184号、第WO 2011/153120号、第WO 2011/149733号、第WO 2011/090965号、第WO 2011/043913号、第WO 2011/022460号、第WO 2012/061259号、第WO 2012/054365号、第WO 2012/044638号、第WO 2010/080724号、第WO 2010/21865号和第WO 2008/103276号。

术语“阳离子脂质”旨在包括那些具有一或两个脂肪酸或脂肪脂族链和氨基头基(包括烷基氨基或二烷基氨基)的脂质，其可在生理学pH下发生质子化以形成阳离子脂质并且由带正电头基和疏水性尾部组成。带正电头基可用于以静电方式结合带负电siRNA分子，而疏水性尾部则自组装成亲脂性颗粒。阳离子脂质的实例可包括但不限于：DLin-K-DMA、DLinDMA、DLinDAP、DLin-K-C2-DMA、DLin-K2-DMA、DOTAP、DMRIE、DORIE、DOTMA、DDAB、乙基PC、多价阳离子脂质和DC-胆固醇、DODA、DODMA、DSDMA、DOTMA、DDAB、DODAP、DOTAP、DOTAP-Cl、DC-Chol、DMRIE、DOSPA、DOGS、DOPE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP。多种这些脂质和相关类似物已阐述于美国专利公开第2006/0083780号和第2006/0240554号；以及美国专利第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、第5,283,185号、第5,753,613号和第5,785,992号中。阳离子脂质也可为lipofectin(参见例如美国专利第5,705,188号)，例如

在大约生理学pH下携载净正电荷的其他阳离子脂质可用于本发明的脂质颗粒中，包括但不限于N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、二-十八烷基二甲基铵(DODMA)、二硬脂基二甲基铵(DSDMA)、N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(DODAP)、N-(1-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1，2-二油基氧基-3-三甲氨基丙烷氯化物盐(DOTAP.Cl)、3-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、N-(1，2-二肉豆蔻酰基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、2，3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸盐(DOSPA)、二-十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)、1，2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(DOPE，其在生理学pH下携载正电荷，但在酸性pH下则不携载正电荷)、3-二甲基氨基-2-(胆甾基-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式，顺式-9，12-十八烷二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(胆甾基-5-烯-3β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式，顺式-9′，1-2′-十八烷二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N，N-二甲基-3，4-二油基氧基苄基胺(DMOBA)、1，2-N，N′-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、1，2-N，N′-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1，2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)和它们的混合物。多种这些脂质和相关类似物已阐述于美国专利申请公开第2006/0083780号和第2006/0240554号；美国专利第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、第5,283,185号、第5,753,613号和第5,785,992号中。

合适的其他阳离子脂质还可包括但不限于N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵盐(也称为TAP脂质，例如甲基硫酸盐)。合适的TAP脂质包括但不限于DOTAP(二油酰基-)、DMTAP(二肉豆蔻酰基-)、DPTAP(二棕榈酰基-)和DSTAP(二硬脂酰基-)。脂质体中的合适阳离子脂质包括但不限于二甲基二-十八烷基溴化铵(DDAB)、1，2-二酰基氧基-3-三甲基铵丙烷、N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N-二甲基胺(DODAP)、1，2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷、N-[1-(2，3-二油基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1，2-二烷基氧基-3-二甲基铵丙烷、二-十八烷基酰胺基甘氨酰基精胺(DOGS)、3-[N-(N′，N′-二甲基氨基-乙烷)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；2，3-二油酰基氧基-N-(2-(精胺甲酰胺基)-乙基)-N，N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸盐(DOSPA)、β-丙氨酰基胆固醇、鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)、二C

阳离子脂质也可为可离子化阳离子脂质。用于配制本文所述组合物的合适的可离子化阳离子脂质包括WO2015/074805中所述的脂质。适于配制本发明组合物的其他合适的可离子化阳离子脂质可包括US 2015/0239834中所述者。

在一些实施方案中，对称或不对称或可离子化阳离子脂质可用于纳米颗粒或脂质制剂中。这类脂质公开于例如美国专利申请公开第2015/0239926号、第2015/0239834号和第2015/0141678号和PCT公开第WO 2015/074805号中。

另外，可使用阳离子脂质的多种商业制剂，例如

阳离子脂质也可为适于细胞递送包含本文所述药剂(例如siRNA分子)的组合物的经修饰阳离子脂质(参见例如美国专利公开第2013/0323269号中所述者)；阳离子甘油衍生物，和多阳离子分子如聚赖氨酸(PCT公开第WO 97/30731号)，包括一个或多个生物可降解基团的阳离子基团(美国专利公开第2013/0195920号)。

在一些实施方案中，可离子化脂质可为WO 2015/074805或US 2015/0239834中所述的可离子化氨基脂质。

在某些实施方案中，本文所述的组合物还包含如WO 2010/053572中所述的氨基醇类脂质。在某些实施方案中，类脂质化合物选自式(I)-(V)：

和其药学上可接受的盐，其中：

A是被取代或未被取代的、支链或无支链、环状或非环状的C

R

R

R

R

R

在某些特定实施方案中，类脂质具有式(VI)：

或其药学上可接受的盐，其中：

p是介于1与3之间的整数(包括端值)；

m是介于1与3之间的整数(包括端值)；

R

R

R

其中R

x在每次出现时为介于1与10之间的整数(包括端值)；

y在每次出现时为介于1与10之间的整数(包括端值)；

R

R

在式(VI)的某些实施方案中，p为1。在某些实施方案中，m为1。在某些实施方案中，p和m都为1。在某些实施方案中，R

在某些实施方案中，所述组合物包含选自C14-120、C16-120、C14-98、C14-113、C14-96、C12-200、C12-205、C16-96、C12-111和C12-210的氨基醇类脂质(参见上文所提及的美国专利第8,450,298号和PCT公开第WO 2010/053572号)。

在某些特定实施方案中，氨基醇类脂质是C12-200：

在某些特定实施方案中，类脂质具有式(VII)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R

其中至少一个R

R

x在每次出现时为介于1与10之间的整数(包括端值)；并且

y在每次出现时为介于1与10之间的整数(包括端值)。

在某些实施方案中，本文所述的组合物还包含如WO 2014/028847中所述的含胺类脂质。

在某些实施方案中，含胺类脂质具有式(VIII)：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个L独立地为支链或无支链的C

每个R

每个R独立地为氢或-CH

每个R

q为1、2或3；

条件是至少三个R基团是-CH

条件是所述化合物不为

在某些实施方案中，本文所述的组合物还包含如WO 2016/004202中所述的聚胺-脂肪酸源类脂质。

在某些实施方案中，含胺类脂质具有式(IX)：

或药学上可接受的盐，其中：

X是被取代或未被取代的亚烷基、被取代或未被取代的亚烯基、被取代或未被取代的亚炔基、被取代或未被取代的亚杂烷基、被取代或未被取代的亚杂烯基、被取代或未被取代的亚杂炔基、被取代或未被取代的亚碳环基、被取代或未被取代的亚杂环基、被取代或未被取代的亚芳基、被取代或未被取代的亚杂芳基、式：

每一情况的L

每一情况的R

L

R

R

L

R

R

R

在某些实施方案中，本文所述的组合物还包含如WO 2013/063468中所述的氨基酸-、肽-或多肽脂质。在某些实施方案中，含胺类脂质具有式(X)：

或药学上可接受的盐，其中：

p是介于1与9之间的整数(包括端值)；

每一情况的Q独立地为O、S或NR

每一情况的R

或至少一种情况的R

其中L是任选地被取代的亚烷基、任选地被取代的亚烯基、任选地被取代的亚炔基、任选地被取代的亚杂烷基、任选地被取代的亚杂烯基、任选地被取代的亚杂炔基、任选地被取代的亚碳环基、任选地被取代的亚杂环基、任选地被取代的亚芳基或任选地被取代的亚杂芳基，并且

R

每一情况的R

式(i)、(ii)和(iii)是：

其中：

每一情况的R′独立地为氢或任选地被取代的烷基；

X是O、S、NR

Y是O、S、NR

R

R

条件是至少一种情况的R

在某些特定实施方案中，氨基酸-、肽-或多肽脂质具有下式：

在某些特定实施方案中，可使用含有C12-200的脂质纳米颗粒来配制如本文所述的组合物。在一些实施方案中，C12-200是以占总组合物约1.0％至约60.0％、约10.0％至40.0％、或约20.0％至约50.0％的摩尔百分比存在。在一些实施方案中，所述组合物包含以下浓度的C12-200：约5.0％、约7.5％、约10.0％、约12.5％、约15.0％、约17.5％、约20.0％、约20.5％、约21.0％、约21.5％、约22.0％、约22.5％、约23.0％、约23.5％、约24.0％、约24.5％、约25.0％、约25.5％、约26.0％、约26.5％、约27.0％、约27.5％、约28.0％、约28.5％、约29.0％、约29.5％、约30.0％、约30.5％、约31.0％、约31.5％、约32.0％、约32.5％、约33.0％、约33.5％、约34.0％、约34.5％、约35.0％、约35.5％、约36.0％、约36.5％、约37.0％、约37.5％、约38.0％、约38.5％、约39.0％、约39.5％、约40.0％、约40.5％、约41.0％、约41.5％、约42.0％、约42.5％、约43.0％、约43.5％、约44.0％、约44.5％、约45.0％、约45.5％、约46.0％、约46.5％、约47.0％、约47.5％、约48.0％、约48.5％、约49.0％、约49.5％、约50.0％、约50.5％、约51.0％、约52.0％、约53.0％、约54.0％、约55.0％、约56.0％、约57.0％、约58.0％、约59.0％或约60.0％(基于总组合物的摩尔数)。在某些实施方案中，所述组合物包含约50.0摩尔％的C12-200。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还可包括一种或多种辅助脂质(在本文中也称为“共脂质”)，所述辅助脂质包括但不限于中性脂质、两亲性脂质、含PEG脂质、阴离子脂质和固醇。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含一种或多种中性脂质。中性脂质(在存在时)可为多种脂质物质中的任一者，其在生理学pH下以不带电或中性两性离子形式存在。这类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰基乙醇胺、神经酰胺、鞘髓磷脂、二氢鞘髓磷脂、脑磷脂和脑苷脂。在一些实施方案中，中性脂质组分是具有两个酰基的脂质(例如二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰基乙醇胺)。在一些实施方案中，中性脂质包含碳链长度在C

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含一种或多种阴离子脂质。阴离子脂质是在生理学pH下携载净负电荷的脂质。在与阳离子脂质组合使用时，阴离子脂质可减少脂质颗粒的总表面电荷，和/或引入脂质结构的pH依赖性破坏，促进配制于脂质颗粒中的治疗剂(例如siRNA分子)的释放。阴离子脂质可包括但不限于脂肪酸(例如油酸、亚油酸、亚麻酸)；半琥珀酸胆固醇基酯(CHEMS)；1，2-二-0-十四烷基-sn-甘油-3-磷酸-(1′-外消旋-甘油)(二醚PG)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1′-外消旋-甘油)(钠盐)；1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(钠盐)；1-十六烷酰基，2-(9Z，12Z)-十八烷二烯酰基-sn-甘油-3-磷酸盐；1，2-二油酰基-sn-甘油-3-[磷酸-外消旋-(1-甘油)](DOPG)；二油酰基磷脂酸(DOPA)；1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(DOPS)；和其衍生物。合适的阴离子脂质的其他实例包括但不限于：脂肪酸，例如油酸、亚油酸和亚麻酸；和半琥珀酸胆固醇基酯。这类脂质可单独或组合用于各种目的，例如使配体附接至脂质体表面。

脂质纳米颗粒还可包括一种或多种能够减少聚集的脂质。在配制期间减少颗粒聚集的脂质的实例包括PEG脂质(例如DMG-PEG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇-PEG)、DMA-PEG(聚(乙二醇)-二甲基丙烯酸酯-PEG)和DMPE-PEG550(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-550])，PEG)、单唾液酸神经节苷酯Gml和聚酰胺寡聚物(PAO)，例如美国专利第6,320,017号中所述者。脂质纳米颗粒可包括DMPE-PEG2000或可被DMPE-PEG2000取代的DMG-PEG(在本文所教导的任何制剂中)。其他合适的PEG脂质包括但不限于PEG改性的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如PEG-CerC

在一些实施方案中，能够减少聚集的脂质是DMPE-PEG2000或DMG-PEG(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇，PEG)。在一些实施方案中，所述组合物包含约0.1摩尔％至约5.0摩尔％的DMPE-PEG2000或DMG-PEG(即约0.1％至约5.0％DMPE-PEG2000或0.1％至约5.0％DMG-PEG)或约0.5摩尔％至2.0摩尔％的DMPE-PEG2000或DMG-PEG。在一些实施方案中，所述组合物包含占总组合物约0.1摩尔％、约0.2摩尔％、约0.3摩尔％、约0.4摩尔％、约0.5摩尔％、约0.6摩尔％、约0.7摩尔％、约0.8摩尔％、约0.9摩尔％、约1.0摩尔％、约1.1摩尔％、约1.2摩尔％、约1.3摩尔％、约1.4摩尔％、约1.5摩尔％、约1.6摩尔％、约1.7摩尔％、约1.8摩尔％、约1.9摩尔％、约2.0摩尔％、约2.1摩尔％、约2.2摩尔％、约2.3摩尔％、约2.4摩尔％、约2.5摩尔％、约2.6摩尔％、约2.7摩尔％、约2.8摩尔％、约2.9摩尔％、约3.0摩尔％、约3.1摩尔％、约3.2摩尔％、约3.3摩尔％、约3.4摩尔％、约3.5摩尔％、约3.6摩尔％、约3.7摩尔％、约3.8摩尔％、约3.9摩尔％、约4.0摩尔％、约4.1摩尔％、约4.2摩尔％、约4.3摩尔％、约4.4摩尔％、约4.5摩尔％、约4.6摩尔％、约4.7摩尔％、约4.8摩尔％、约4.9摩尔％或约5.0摩尔％的DMPE-PEG2000或DMG-PEG。在一些实施方案中，所述组合物包含约1.5摩尔％的DMPE-PEG2000或DMG-PEG。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含固醇。在一些实施方案中，固醇为胆固醇。在一些实施方案中，所述组合物包含约10.0摩尔％至约50.0摩尔％的胆固醇，或约15.0摩尔％至约40.0摩尔％的胆固醇。在一些实施方案中，所述组合物包含约10.0摩尔％、约11.0摩尔％、约11.5摩尔％、约12.0摩尔％、约12.5摩尔％、约13.0摩尔％、约13.5摩尔％、约14.0摩尔％、约14.5摩尔％、约15.0摩尔％、约15.5摩尔％、约16.0摩尔％、约16.5摩尔％、约17.0摩尔％、约17.5摩尔％、约18.0摩尔％、约18.5摩尔％、约19.0摩尔％、约19.5摩尔％、约20.0摩尔％、约20.5摩尔％、约21.0摩尔％、约21.5摩尔％、约22.0摩尔％、约22.5摩尔％、约23.0摩尔％、约23.5摩尔％、约24.0摩尔％、约24.5摩尔％、约25.0摩尔％、约25.5摩尔％、约26.0摩尔％、约26.5摩尔％、约27.0摩尔％、约27.5摩尔％、约28.0摩尔％、约28.5摩尔％、约29.0摩尔％、约29.5摩尔％、约30.0摩尔％、约30.5摩尔％、约31.0摩尔％、约31.5摩尔％、约32.0摩尔％、约32.5摩尔％、约33.0摩尔％、约33.5摩尔％、约34.0摩尔％、约34.5摩尔％、约35.0摩尔％、约35.5摩尔％、约36.0摩尔％、约36.5摩尔％、约37.0摩尔％、约37.5摩尔％、约38.0摩尔％、约38.5摩尔％、约39.0摩尔％、约39.5摩尔％或约40.0％的胆固醇。在一些实施方案中，所述组合物包含约38.5摩尔％的胆固醇。

可增加或降低LNP制剂中的PEG的比率和/或可将PEG脂质的碳链长度从C14变为C18以改变LNP制剂的药物动力学和/或生物分布。

在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒还包含一种或多种能够增强脂质纳米颗粒和/或其囊封组合物(例如基因沉默剂、siRNA分子、肽等)的细胞摄取或胞质分布的化合物。可增强细胞摄取的化合物可包括左旋多巴(levodopa)、萘甲唑啉盐酸盐(naphazoline hydrochloride)、乙酸己脲(acetohexamide)、氯硝柳胺(niclosamide)、二羟丙茶碱(diprophylline)和伊索昔康(isoxicam)或它们的组合。可增强胞质分布的化合物可包括氮杂鸟嘌呤-8、乙酸异氟普酮(isoflupredone acetate)、氯喹(chloroquine)、曲美苄胺盐酸盐(trimethobenzamide hydrochloride)、异舒普林盐酸盐(isoxsuprinehydrochloride)和甲硫酸二苯甲哌(diphemanil methylsulfate)或它们的组合。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含囊封本发明所涵盖的一种或多种药剂(例如与本文所述的至少一种生物标志物的mRNA转录产物充分互补的siRNA分子)的脂质双层。在一些实施方案中，配制脂质纳米颗粒以促进细胞中的摄取。在一些实施方案中，配制脂质纳米颗粒以促进单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞中的摄取。

在一些方面，脂质纳米颗粒还可包含其他剂。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含一种或多种抗氧化剂。不希望受限于任何特定理论，抗氧化剂可帮助稳定脂质纳米颗粒并防止、降低和/或抑制囊封于脂质纳米颗粒中的阳离子脂质和/或活性剂的降解。在一些实施方案中，抗氧化剂是亲水性抗氧化剂、亲脂性抗氧化剂、金属螯合剂、一级抗氧化剂、二级抗氧化剂、或其盐或混合物。在一些实施方案中，抗氧化剂包含EDTA或其盐。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含EDTA与1、2、3、4、5、6、7、8种或更多种其他抗氧化剂(例如一级抗氧化剂、二级抗氧化剂或其他金属螯合剂)的组合。抗氧化剂的实例包括但不限于亲水性抗氧化剂、亲脂性抗氧化剂和它们的混合物。亲水性抗氧化剂的非限制性实例包括螯合剂(例如金属螯合剂)，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐、乙二醇四乙酸(EGTA)、1，2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸(BAPTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、2，3-二巯基-1-丙烷磺酸(DMPS)、二巯基琥珀酸(DMSA)、cc-硫辛酸、水杨醛异烟酰腙(SIR)、己基硫基乙基胺盐酸盐(HTA)、去铁胺、其盐和其混合物。其他亲水性抗氧化剂包括抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、二氢硫辛酸、2-巯基乙烷磺酸、2-巯基苯并咪唑磺酸、6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-甲酸、偏亚硫酸氢钠、其盐和其混合物。亲脂性抗氧化剂的非限制性实例包括维生素E异构体，例如α-、β-、γ-和δ-生育酚以及α-、β-、γ-和δ-生育三烯酚；多酚，例如2-叔丁基-4-甲基酚、2-叔丁基-5-甲基酚和2-叔丁基-6-甲基酚；丁基化羟基苯甲醚(BHA)(例如2-叔丁基-4-羟基苯甲醚和3-叔丁基-4-羟基苯甲醚)；丁基羟基苯(BHT)；叔丁基氢醌(TBHQ)；棕榈酸抗坏血酸基酯；rc-没食子酸丙酯；其盐；和其混合物。

在一些实施方案中，被配制用于递送一种或多种药剂(例如基因沉默剂、siRNA分子、肽)的基于脂质的颗粒是选自脂质载体、脂质体、脂质复合物、脂质纳米颗粒和胶束。在一些实施方案中，基于脂质的颗粒是pH敏感性纳米颗粒。这些pH敏感性纳米颗粒(PNSDS)是包含经由酸不稳定缩醛接头与多臂聚(乙二醇)载体以化学方式交联的siRNA的无正电荷纳米载体，其可有益地用于递送siRNA分子(Tang等人，SiRNA Crosslinked Nanoparticlesfor the Treatment of Inflammation-induced Liver Injury，Advanced Science，2016，4(2)，e1600228)。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒还包含一种或多种C12-200氨基醇脂质。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约40.0摩尔％至约50.0摩尔％的C12-200。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约5.0摩尔％至约10.0摩尔％的DSPC。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约1.0摩尔％至约2.0摩尔％的DMG-PEG。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含约20.0摩尔％至约40.0摩尔％的胆固醇。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含50摩尔％C12-200、10.0摩尔％DSPC、1.5摩尔％DMG-PEG和38.5摩尔％胆固醇。

在一些实施方案中，制剂内的总siRNA分子摩尔数相对于总脂质摩尔数的范围为约1∶5至约1∶20。在一些实施方案中，总siRNA分子摩尔数相对于总脂质摩尔数为约1∶5、约1∶6、约1∶7、约1∶8、约1∶9、约1∶10、约1∶11、约1∶12、约1∶13、约1∶14、约1∶15、约1∶16、约1∶17、约1∶18、约1∶18、约1∶19或约1∶20。在一些实施方案中，总siRNA分子摩尔数相对于总脂质摩尔数为约1∶9。

在一些实施方案中，使用自发性囊泡形成配制程序来配制脂质纳米颗粒(LNP)以囊封药剂(例如siRNA)，如先前在Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28172-28176中所述。

在一些实施方案中，制剂中与本文所述至少一种生物标志物的mRNA转录产物充分互补的本发明所涵盖的一种或多种药剂(例如siRNA分子)的总浓度为约0.001mg/ml至约100mg/ml、约0.01mg/ml至约10mg/ml或约0.1mg/ml至约20mg/ml。在一些实施方案中，两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、或所有六种siRNA分子的总浓度为约0.001mg/ml至约100mg/ml、约0.01mg/ml至约10mg/ml、或约0.1mg/ml至约20mg/ml。

在一些实施方案中，脂质纳米颗粒(LNP)的大小范围为约40nm至约200nm、或约50nm至约100nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的大小为约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约110nm、约120nm、约130nm、约140nm、约150nm、约160nm、约170nm、约180nm或约200nm。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒的大小为约80nm。

根据本发明，如本文所述的制剂是稳定的。如本文所用的术语“稳定”意指保持适合施用于患者的状态或条件。在一些实施方案中，制剂是基本上纯的。如本文所用，“基本上纯”意指，活性成分(例如与本文所述的至少一种生物标志物的mRNA转录产物充分互补的siRNA分子)是存在于制剂中的主要物质。在一些实施方案中，基本上纯的组合物包含含有80％以上的大分子物质(例如活性剂、基因沉默剂、siRNA分子、其他试剂(例如抗氧化剂))的组合物。在一些实施方案中，基本上纯的组合物包含含有大于85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的大分子物质的组合物。在一些实施方案中，将一种或多种活性剂纯化至基本均质性(即，通过常规检测方法在组合物中检测不到污染物物质)，其中所述组合物基本上由单一大分子物质组成。

可使用其他纳米颗粒作为本文所述的药剂和组合物的递送媒介物。在一些实施方案中，纳米颗粒包含经化学和/或酶促修饰的脂蛋白(例如载脂蛋白，如美国专利公开第2011/0256224号中所述)。在一些实施方案中，纳米颗粒包含其他基于脂蛋白的纳米颗粒，例如HDL、HDL样脂蛋白颗粒或合成HDL样颗粒(参见例如美国专利公开第2009/0110739号；以及美国专利第7,824,709号)。

在一些实施方案中，使用具有增加的巨噬细胞靶向递送的纳米颗粒来囊封如本文所述的组合物。在一些实施方案中，纳米颗粒是包含1，3-D-葡聚糖的GP纳米颗粒(Soto等人(2012)J.Drug.Deliv.e143524)或甘露糖基化壳聚糖(MCS)纳米颗粒(Peng等人(2015)J.Nanosci.Nanotechnol.15：2619-2627)。

纳米颗粒制剂可为包含碳水化合物载体的碳水化合物纳米颗粒。作为一个非限制性实例，碳水化合物载体可包括但不限于经酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料、植物糖原琥珀酸辛烯基酯、植物糖原β-糊精、经酸酐修饰的植物糖原β-糊精。(参见例如PCT公开第WO2012/109121号)。

在一些实施方案中，可将脂质纳米颗粒工程化以改变颗粒的表面性质，因此脂质纳米颗粒可渗透粘膜屏障。粘膜位于粘膜组织上，所述粘膜组织例如但不限于口腔(例如颊和食管膜以及扁桃体组织)、眼部、胃肠道(例如胃、小肠、大肠、结肠、直肠)、鼻、呼吸道(例如鼻、咽、气管和支气管膜)、生殖器(例如阴道、子宫颈和尿道膜)。大于10-200nm的纳米颗粒对于较高药物囊封效率和能够持续递送多种药物来说是优选的，据认为，其过大以致不能快速扩散穿过粘膜屏障。连续分泌粘液，流出，弃除或消化并且再循环，因此可在数秒内或数小时内从粘膜组织去除大部分所捕集颗粒。用低分子量聚乙二醇(PEG)致密涂覆的大聚合纳米颗粒(直径为200nm-500nm)仅以低于相同颗粒在水中的扩散4至6倍的速率扩散穿过粘液(Lai等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：1482-1487；Lai等人(2009)AdvDrug Deliv Rev.61：158-171)。可使用渗透速率和/或荧光显微术技术(包括但不限于光漂白后的荧光恢复(FRAP)和高分辨率多颗粒追踪(MPT))来测定纳米颗粒的传输。作为一个非限制性实例，可如美国专利第8,241,670号中所述来制备可渗透粘膜屏障的组合物。

经工程化以渗透粘液的脂质纳米颗粒可包含聚合物材料(即聚合物核心)和/或聚合物-维生素缀合物和/或三嵌段共聚物。聚合物材料可包括但不限于聚胺、聚醚、聚酰胺、聚酯、聚氨酯、聚脲、聚碳酸酯、聚(苯乙烯)、聚酰亚胺、聚砜、聚氨酯、聚乙炔、聚乙烯、聚乙烯亚胺、聚异氰酸酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈和聚芳基酯。聚合物材料可具有生物可降解性和/或生物相容性。可另外辐照聚合物材料。作为一个非限制性实例，可对聚合物材料实施γ辐照(参见例如PCT公开第WO 2012/082165号)。具体聚合物的非限制性实例包括聚(己内酯)(PCL)、乙烯乙酸乙烯酯聚合物(EVA)、聚(乳酸)(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(L-乳酸-共-乙醇酸)(PLLGA)、聚(D，L-丙交酯)(PDLA)、聚(L-丙交酯)(PLLA)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯)、聚(D，L-丙交酯-共-己内酯-共-乙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PEO-共-D，L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯-共-PPO-共-D，L-丙交酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚氨酯、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸羟丙基酯(HPMA)、聚乙二醇、聚-L-谷氨酸、聚(羟基酸)、聚酸酐、聚原酸酯、聚(酯酰胺)、聚酰胺、聚(酯醚)、聚碳酸酯、聚烯烃(例如聚乙烯和聚丙烯)、聚亚烷基二醇(例如聚(乙二醇)(PEG))、聚环氧烷(PEO)、聚亚烷基对苯二甲酸酯(例如聚(对苯二甲酸乙二醇酯))、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯(例如聚(乙酸乙烯酯))、聚乙烯基卤化物(例如聚(氯乙烯)(PVC))、聚乙烯基吡咯烷酮、聚硅氧烷、聚苯乙烯(PS)、聚氨酯、衍生纤维素(例如烷基纤维素、羟基烷基纤维素、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素)、丙烯酸聚合物(例如聚((甲基)丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁基酯)、聚((甲基)丙烯酸己基酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸基酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂基酯)、聚((甲基)丙烯酸苯基酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙基酯)、聚(丙烯酸异丁基酯)、聚(丙烯酸十八烷基酯)和其共聚物和混合物)、聚二氧杂环己酮和其共聚物、聚羟基烷酸酯、聚富马酸丙二酯、聚甲醛、泊洛沙姆、聚(原酸)酯、聚(丁酸)、聚(戊酸)、聚(丙交酯-共-己内酯)和碳酸三亚甲基酯、聚乙烯基吡咯烷酮。脂质纳米颗粒可用共聚物涂覆或与其缔合，所述共聚物例如但不限于嵌段共聚物和(聚(乙二醇))-(聚(环氧丙烷))-(聚(乙二醇))三嵌段共聚物(参见例如美国专利公开第2012/0121718号和第2010/0003337号；以及美国专利第8,263,665号)。共聚物可为通常认为安全(GRAS)的聚合物并且可以不产生新化学实体的方式来形成脂质纳米颗粒。例如，脂质纳米颗粒可包含泊洛沙姆涂层PLGA纳米颗粒，而不形成仍能够快速渗透人类粘液的新化学实体(Yang等人(2011)Angew.Chem.Int.Ed.50：2597-2600)。

例如，本发明所涵盖的LNP可包含PLGA-PEG嵌段共聚物(参见例如美国专利公开第2012/0004293号以及美国专利第8,236,330号)；PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物(参见例如美国专利第8,246,968号)；多嵌段共聚物(参见例如美国专利第8,263,665号和第8,287,910号)；包含非聚合物胶束和嵌段共聚物的多离子复合物(参见例如美国专利公开第2012/00768号)；或含胺聚合物，例如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物、聚(β-氨基酯)(参见例如美国专利第8,287,849号)。

本发明所涵盖的LNP可包含一种或多种其他聚合物，例如丙烯酸聚合物。丙烯酸聚合物可包括但不限于丙烯酸、甲基丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯和它们的组合。

本发明所涵盖的LNP可包含至少一种可含有多阳离子侧链的可降解聚酯。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)和它们的组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。LNP还可包括至少一种靶向配体。靶向配体可为本领域已知的任何配体，例如但不限于单克隆抗体(Kirpotin等人(2006)Cancer Res.66：6732-6740)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的组合物可配制为固体脂质纳米颗粒。固体脂质纳米颗粒(SLN)可为球形并且平均直径介于10nm至1000nm之间。SLN具有可溶解亲脂性分子并且可经表面活性剂和/或乳化剂稳定的固体脂质核心基质。在另一个实施方案中，脂质纳米颗粒可为自组装脂质-聚合物纳米颗粒(参见例如Zhang等人(2008)ACS Nano 2：1696-1702)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的药剂可为持续释放制剂(例如囊封至纳米颗粒或快速消除性纳米颗粒中)并且所述纳米颗粒或快速消除性纳米颗粒可然后囊封至本文所述和/或本领域已知的聚合物、水凝胶和/或手术密封剂。作为一个非限制性实例，聚合物、水凝胶或手术密封剂可为PLGA、乙烯乙酸乙烯酯(EVAc)、泊洛沙姆、

在一些实施方案中，本发明所涵盖的组合物可配制为受控释放纳米颗粒。在一个实例中，用于受控释放和/或靶向递送的纳米颗粒制剂还可包括至少一个受控释放涂层。受控释放涂层包括但不限于

在另一个实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的组合物可配制为脂质复合物，例如但不限于ATUPLEXwM系统、DACC系统、DBTC系统和来自Silence Therapeutics(London，UnitedKingdom)的其他缀合物-脂质复合物技术，来自

在一些实施方案中，本发明所涵盖的治疗剂和组合物可囊封于合成纳米载体中，与其连接和/或与其缔合。合成纳米载体包括但不限于阐述于以下文献中者：国际公开第WO2010/005740号、第WO 2010/030763号、第WO 2012/13501号、第WO 2012/149252号、第WO2012/149255号、第WO 2012/149259号、第WO 2012/149265号、第WO 2012/149268号、第WO2012/149282号、第WO 2012/149301号、第WO 2012/149393号、第WO 2012/149405号、第WO2012/149411号和第WO 2012/149454号，以及美国专利公开第2011/0262491号、第2010/0104645号、第2010/0087337号和第2012/0244222号。在另一个实施方案中，可例如通过PCT公开第WO 2011/072218号以及美国专利第8,211,473号中所述的方法来冻干合成纳米载体制剂。

在一些实施方案中，合成纳米载体可含有反应性基团以释放本文所述的缀合物(参见例如PCT公开第WO 2012/0952552号以及美国专利公开第2012/0171229号)。在一个实施方案中，合成纳米载体可经配制用于靶向释放。在一个实施方案中，配制合成纳米载体以在指定pH下和/或在期望时间间隔之后释放治疗剂。作为一个非限制性实例，可配制合成纳米颗粒以在24小时之后和/或在pH 4.5下释放缀合物(参见例如PCT公开第WO 2010/138193号和第WO 2010/138194号以及美国专利公开第2011/0020388号和第2011/0027217号)。在一些实施方案中，合成纳米载体可经配制用于受控和/或持续释放本文所述的缀合物。作为一个非限制性实例，可通过本领域已知、本文所述和/或如PCT公开第WO 2010/138192号以及美国专利公开第2010/0303850号中所述的方法来配制用于持续释放的合成纳米载体。

在一些实施方案中，可优化纳米颗粒以用于经口施用。纳米颗粒可包含至少一种阳离子生物聚合物，例如但不限于壳聚糖或其衍生物。作为一个非限制性实例，可通过美国专利公开第20120282343号中所述的方法来配制纳米颗粒。

在一些实施方案中，还可使用天然和/或合成聚合物来配制本发明所涵盖的药剂。可用于药物递送的聚合物的非限制性实例包括但不限于来自

本发明所用的聚合物可经受处理以减少和/或抑制不期望物质(例如但不限于细菌)与聚合物表面的附接。可通过本领域已知和/或阐述和/或PCT公开第WO 2011/50467号中所述的方法来处理聚合物。

纳米颗粒可含有一种或多种聚合物。聚合物可含有下列聚酯中的一者或多者：包括羟乙酸单元(在本文中称为“PGA”)和乳酸单元(例如聚-L-乳酸、聚-D-乳酸、聚-D，L-乳酸、聚-L-丙交酯、聚-D-丙交酯和聚-D，L-丙交酯，在本文中通称为“PLA”)和己内酯单元(例如聚((-己内酯)，在本文中通称为“PCL”)的均聚物；和包括乳酸和羟乙酸单元的共聚物(例如各种形式的聚(乳酸-共-乙醇酸)和聚(丙交酯-共-乙交酯)，其特征在于乳酸∶乙醇酸的比率，在本文中通称为“PLGA”)；和聚丙烯酸酯；和其衍生物。示例性聚合物还包括聚乙二醇(PEG)和上文所提及聚酯的共聚物，例如各种形式的PLGA-PEG或PLA-PEG共聚物，其在本文中通称为“聚乙二醇化聚合物”。在某些实施方案中，PEG区域可通过可裂解接头与聚合物共价缔合以产生“聚乙二醇化聚合物”。

纳米颗粒可含有一种或多种亲水性聚合物。亲水性聚合物包括纤维素聚合物，例如淀粉和多糖；亲水性多肽；聚(氨基酸)，例如聚-L-谷氨酸(PGS)、γ-聚谷氨酸、聚-L-天冬氨酸、聚-L-丝氨酸或聚-L-赖氨酸；聚亚烷基二醇和聚环氧烷，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚(环氧乙烷)(PEO)；聚(氧基乙基化多元醇)；聚(烯系醇)；聚乙烯基吡咯烷酮)；聚(羟基烷基甲基丙烯酰胺)；聚(羟基烷基甲基丙烯酸酯)；聚(糖)；聚(羟基酸)；聚(乙烯醇)；聚噁唑啉；和其共聚物。

纳米颗粒可含有一种或多种疏水性聚合物。合适的疏水性聚合物的实例包括聚羟基酸，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸)；聚羟基烷酸酯，例如聚3-羟基丁酸酯或聚4-羟基丁酸酯；聚己内酯；聚(原酸酯)；聚酸酐；聚(磷腈)；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯，例如酪氨酸聚碳酸酯；聚酰胺(包括合成和天然聚酰胺)、多肽和聚(氨基酸)；聚酯酰胺；聚酯；聚(二氧杂环己酮)；聚(亚烷基烷基化物)；疏水性聚醚；聚氨酯；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚丙烯酸酯；聚甲基丙烯酸甲酯；聚硅氧烷；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；聚缩酮；聚磷酸酯；聚羟基戊酸酯；聚草酸亚烷基酯；聚琥珀酸亚烷基酯；聚(马来酸)，以及其共聚物。

在某些实施方案中，疏水性聚合物是脂族聚酯。在一些实施方案中，疏水性聚合物是聚(乳酸)、聚(乙醇酸)或聚(乳酸-共-乙醇酸)。

纳米颗粒可含有一种或多种两亲性聚合物。两亲性聚合物可为含有疏水性聚合物嵌段和亲水性聚合物嵌段的聚合物。疏水性聚合物嵌段可含有一种或多种上述疏水性聚合物或其衍生物或共聚物。亲水性聚合物嵌段可含有一种或多种上述亲水性聚合物或其衍生物或共聚物。在一些实施方案中，两亲性聚合物是含有从疏水性聚合物形成的疏水端和从亲水性聚合物形成的亲水端的二嵌段聚合物。在一些实施方案中，可使某一部分附接至疏水端、亲水端或二者。所述颗粒可含有两种或更多种两亲性聚合物。

聚合物还可包括但不限于聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、聚(1-赖氨酸)(PLL)、接枝至PLL的PEG、阳离子脂质聚合物、生物可降解阳离子脂质聚合物、聚乙烯亚胺(PEI)、交联支链聚(亚烷基亚胺)、聚胺衍生物、经改性泊洛沙姆、生物可降解聚合物、弹性生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解无规共聚物、生物可降解聚酯共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯嵌段无规共聚物、多嵌段共聚物、线性生物可降解共聚物、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸)(PAGA)、生物可降解交联阳离子多嵌段共聚物、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)、丙烯酸聚合物、含胺聚合物、右旋糖酐聚合物、右旋糖酐聚合物衍生物或它们的组合。

聚合物可为可交联聚酯。可交联聚酯包括本领域已知并且阐述于美国专利公开第2012/0269761号中者。

纳米颗粒可含有一种或多种生物可降解聚合物。生物可降解聚合物可包括不溶或微溶于水中并且在身体中以化学方式或以酶促方式转化成水溶性材料的聚合物。生物可降解聚合物可包括通过可水解交联基团交联以致使交联聚合物不溶或微溶于水中的可溶性聚合物。

生物可降解聚合物可包括聚酰胺、聚碳酸酯、聚亚烷基、聚亚烷基二醇、聚环氧烷、聚对苯二甲酸亚烷基酯、聚乙烯醇、聚乙烯基醚、聚乙烯基酯、聚乙烯基卤化物、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙交酯、聚硅氧烷、聚氨酯和其共聚物、烷基纤维素(例如甲基纤维素和乙基纤维素)、羟基烷基纤维素(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丁基甲基纤维素)、纤维素醚、纤维素酯、硝基纤维素、乙酸纤维素、丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸邻苯二甲酸纤维素、羧基乙基纤维素、三乙酸纤维素、纤维素硫酸钠盐、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合物(例如聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸己酯)、聚(甲基丙烯酸异癸酯)、聚(甲基丙烯酸月桂酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)、聚(丙烯酸十八烷酯))、聚乙烯、聚丙烯、聚(乙二醇)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙酸乙烯酯)、聚氯乙烯、聚苯乙烯和聚乙烯基吡咯烷酮、其衍生物、其线性和支链共聚物和嵌段共聚物，和其共混物。示例性生物可降解聚合物包括聚酯、聚(原酸酯)、聚(乙烯亚胺)、聚(己内酯)、聚(羟基烷酸酯)、聚(羟基戊酸酯)、聚酸酐、聚(丙烯酸)、聚乙交酯、聚(氨基甲酸酯)、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚磷腈、其衍生物、其线性和支链共聚物和嵌段共聚物和其共混物。在一些实施方案中，所述颗粒含有生物可降解聚酯或聚酸酐，例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)和聚(乳酸-共-乙醇酸)。

可降解聚酯可含有多阳离子侧链。可降解聚酯包括但不限于聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)和它们的组合。在另一个实施方案中，可降解聚酯可包括PEG缀合以形成聚乙二醇化聚合物。

可通过本领域已知的方法(例如美国专利第6,696,038号以及美国专利公开第2003/0073619号和第2004/0142474号中所述者)来制备生物可降解阳离子脂质聚合物。可使用本领域已知的方法(例如美国专利公开第2010/0004315号中所述者)来制备聚(亚烷基亚胺)。可使用本领域已知的方法(例如美国专利第6,517,869号和第6,267,987号中所述者)来制备生物可降解聚合物、生物可降解嵌段共聚物、生物可降解无规共聚物、生物可降解聚酯嵌段共聚物、生物可降解聚酯聚合物或生物可降解聚酯无规共聚物。可使用本领域已知的方法(例如美国专利第6,652,886号中所述者)来制备线性生物可降解共聚物。可使用本领域已知的方法(例如美国专利第6,217,912号中所述者)来制备PAGA聚合物。可使PAGA聚合物与例如但不限于聚-L-赖氨酸、聚精氨酸、聚鸟氨酸、组织蛋白、抗生物素蛋白、鱼精蛋白、聚交酯和聚(丙交酯-共-乙交酯)的聚合物共聚合以形成共聚物或嵌段共聚物。可使用本领域已知的方法(例如美国专利第8,057,821号以及美国专利公开第2012/009145号中所述者)来制备生物可降解交联阳离子多嵌段共聚物。例如，可使用与支链聚乙烯亚胺相比具有不同模式的线性聚乙烯亚胺(LPEI)嵌段来合成多嵌段共聚物。

本文所述的聚合物可缀合至脂质封端性PEG。作为一个非限制性实例，PLGA可缀合至脂质封端性PEG以形成PLGA-DSPE-PEG。作为另一个非限制性实例，根据本发明使用的PEG缀合物阐述于PCT公开第WO 2008/103276号中。可使用配体缀合物(例如但不限于美国专利第8,273,363号中所述的缀合物)来缀合聚合物。

聚合物纳米颗粒还可包含壳聚糖。壳聚糖制剂包括带正电壳聚糖的核心和带负电基质的外侧部分(参见例如美国专利公开第2012/0258176号)。壳聚糖包括但不限于N-三甲基壳聚糖、单-N-羧基甲基壳聚糖(MCC)、N-棕榈酰基壳聚糖(NPCS)、EDTA-壳聚糖、低分子量壳聚糖、壳聚糖衍生物或它们的组合。

聚合物纳米颗粒还可包含PLGA。PLGA制剂可包括但不限于PLGA可注射储积物(例如

在一些实施方案中，可使用Evac，其是广泛用于临床前持续释放植入应用(例如延迟释放产品Ocusert(用于青光眼的匹鲁卡品(pilocarpine)眼部插入物)或progestasert(持续释放助孕酮子宫内装置)；透皮递送系统Testoderm、Duragesic和Selegiline；和导管)的不可生物降解、生物相容聚合物。泊洛沙姆F-407NF是一种亲水性、非离子型表面活性剂，其是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的三嵌段共聚物，在小于5℃的温度下具有低粘度并且在大于15℃的温度下形成固体凝胶。基于PEG的手术密封剂包含混合于递送装置中的两种合成PEG组分，所述手术密封剂可在一分钟内制得，在3分钟内密封并在30天内再吸收。

根据本发明可用的聚合物纳米颗粒的其他代表性实例包括接枝有PLL的PEG的聚合化合物(如美国专利第6，177,274号中所述)，以及呈含有阳离子聚合物的溶液或介质、干燥药物组合物或能够干燥的溶液的形式的悬浮液(如美国专利公开第2009/0042829号和第2009/0042825号中所述)。

可使用聚胺衍生物来递送本发明所涵盖的治疗剂和组合物或治疗和/或预防疾病或并入可植入或可注射装置中(美国专利公开第2010/0260817号)。作为一个非限制性实例，可使用包含1，3-双极性加成聚合物的聚酰胺聚合物来递送本发明所涵盖的药剂，所述1，3-双极性加成聚合物是通过组合碳水化合物二叠氮化物单体与包含寡胺的二炔烃单元来制备(美国专利第8,236,280号)。

其他聚合物可包括丙烯酸聚合物，例如丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸乙氧基乙基酯、甲基丙烯酸氰基乙基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚氰基丙烯酸酯和它们的组合；或含胺聚合物，例如但不限于聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚(酰胺基胺)树枝状聚合物或它们的组合；或PEG-电荷转化聚合物(Pitella等人(2011)Biomat.32：3106-3114)。

聚合物纳米颗粒还可包含二嵌段共聚物。在一个实施方案中，二嵌段共聚物可包括PEG与例如但不限于以下聚合物的组合：聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯、聚胺、聚赖氨酸、聚(乙烯亚胺)、聚(丝氨酸酯)、聚(L-丙交酯-共-L-赖氨酸)、聚(4-羟基-L-脯氨酸酯)或它们的组合。在一些实施方案中，可使用PLGA-PEG嵌段共聚物(参见例如美国专利公开第US2012/0004293号和美国专利第8,236,330号)或PLGA-PEG-PLGA嵌段共聚物(参见例如美国专利第6,004,573号)来配制本发明所涵盖的药剂。作为一个非限制性实例，可使用PEG和PLA或PEG和PLGA的二嵌段共聚物来配制本发明所涵盖的药剂(参见例如美国专利第8,246,968号)。

在一些实施方案中，聚合物纳米颗粒可包含多种聚合物，例如但不限于亲水性-疏水性聚合物(例如PEG-PLGA)、疏水性聚合物(例如PEG)和/或亲水性聚合物(参见例如PCT公开第WO 2012/0225129号)。

在一些实施方案中，聚合物纳米颗粒可配制为治疗性纳米颗粒。可通过本文所述和本领域(例如但不限于PCT公开第WO 2010/005740号、第WO 2010/030763号、第WO 2010/005721号、第WO 2010/005723号和第WO 2012/054923号以及美国专利公开第2011/0262491号、第2010/0104645号、第2010/0087337号、第2010/0068285号、第2011/0274759号、第2010/0068286号和第2012/0288541号以及美国专利第8,206,747号、第8,293,276号、第8,318,208号和第8,318,211号)已知的方法和聚合物来配制治疗性纳米颗粒。在一些实施方案中，可通过美国专利公开第2012/0140790号中所述的方法来鉴定治疗性聚合物纳米颗粒。

还可经由表达不同配体(例如但不限于叶酸盐、转铁蛋白和N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc))来选择性靶向聚合物制剂(Benoit等人(2011)Biomacromol.12：2708-2714；Rozema等人(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.104：12982-12887；Davis(2009)Mol.Pharm.6：659-668；Davis(2010)Nature 464：1067-1070)。

在一些实施方案中，可通过使本发明所涵盖的聚合物制剂(其可包括阳离子载体)与可共价连接至胆固醇和聚乙二醇基团的阳离子脂质聚合物接触来稳定所述聚合物制剂。可使用美国专利公开第2009/0042829号中所述的方法使聚合物制剂与阳离子脂质聚合物接触。阳离子载体可包括但不限于聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-聚胺、二脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、精脒、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙基酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树枝状聚合物、壳聚糖、1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-[1-(2，3-二油酰基氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)咪唑鎓氯化物(DOTIM)、2，3-二油基氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸盐(DOSPA)、3B-[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基]胆固醇盐酸盐(DC-胆固醇HCl)、二-十七烷基酰胺基甘氨酰基精脒(DOGS)、N，N-二硬脂基-N，N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1，2-二肉豆蔻酰基氧基丙-3-基)-N，N-二甲基N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)和它们的组合。

本发明所涵盖的缀合物可配制于一种或多种聚合物的聚合物复合物(polyplex)中(参见例如美国专利公开第2012/0237565号和第2012/0270927号)。在一个实施方案中，聚合物复合物包含两种或更多种阳离子聚合物。阳离子聚合物可包含聚(乙烯亚胺)(PEI)，例如线性PEI。

在一些实施方案中，可使用其他形式的纳米颗粒。

例如，可使用聚合物、脂质和/或其他生物可降解剂(例如但不限于磷酸钙)的组合将本发明所涵盖的药剂和组合物配制为纳米颗粒。可使组分组合于核-壳、混合体和/或逐层架构中以容许微调纳米颗粒，从而递送本发明所涵盖的组合物。生物可降解磷酸钙纳米颗粒与脂质和/或聚合物的组合已显示可在体内递送治疗剂。在一个实施方案中，可使用经脂质涂覆的磷酸钙纳米颗粒(其还可含有靶向配体，例如茴香酰胺)以递送本发明所涵盖的组合物(参见例如Li等人(2010)J.Contr.Rel.142：416-421；Li等人(2012)J.Contr.Rel.158：108-114；Yang等人(2012)Mol.Ther.20：609-615)。这种递送系统组合了靶向纳米颗粒和用以增强胞内体逃逸的组分磷酸钙以改善药剂的递送。

在一些实施方案中，颗粒可为疏水性离子成对复合物或通过一种或多种上述缀合物和相对离子形成的疏水性离子对。

在一些实施方案中，核-壳纳米颗粒可用于药物制剂中。核-壳纳米颗粒的使用已另外着眼于高通量方式来合成阳离子交联纳米凝胶核心和各种壳体(Siegwart等人(2011)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108：12996-13001)。可通过改变纳米颗粒的核心和壳体组分中的化学组成来精确控制聚合纳米颗粒的复合、递送和内化。例如，在使胆固醇共价附接至纳米颗粒之后，核-壳纳米颗粒可将治疗剂有效递送至小鼠肝细胞。用于本发明所涵盖的组合物中的核-壳纳米颗粒阐述于美国专利第8,313,777号中并且可通过其中所述的方法形成。

无机纳米颗粒表现出物理、化学、光学和电子性质的组合并提供高度多功能性平台来使疾病成像并诊断，以选择性递送治疗剂并且使细胞和组织对治疗方案敏感。不希望受限于任何理论，无机纳米颗粒的增强的渗透和保留(EPR)效应提供选择性累积许多高分子量药物的基础。循环无机纳米颗粒优先累积于肿瘤部位处和发炎组织中(Yuan等人(1995)Cancer Res.55：3752-3756)并且因其低扩散性而得以保留(Pluen等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：4628-4633。无机纳米颗粒的大小可为10nm-500nm、10nm-100nm、或100nm-500nm。无机纳米颗粒可包含金属(金、铁、银、铜、镍等)、氧化物(ZnO、TiO

无机纳米颗粒具有高表面积/单位体积。因此，其可以高密度载有治疗药物和成像剂。可使用各种方法将治疗药物负载至无机纳米颗粒中/上，包括但不限于共价键、静电相互作用、包裹和囊封。除治疗剂药物负载外，可使用靶向部分(例如肿瘤靶向配体)在表面上对无机纳米颗粒实施功能化。使用无机纳米颗粒配制治疗剂容许对治疗剂进行成像、检测和监测。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的药剂和组合物是疏水性的并且可与经水溶性两性离子配体功能化的金纳米颗粒形成动力学稳定的复合物(参见例如Kim等人(2009)JACS 131：1360-1361)。

可使用金纳米壳体配制本发明所涵盖的药剂和组合物。作为一个非限制性实例，可使用包含聚合物和金纳米壳体的温度敏感系统来递送组合物并且可以光热方式释放(参见例如Sershen等人(2000)J.Biomed.Mater.51：293-298)。通过纳米壳体吸收1064nm下辐照并转化成热，这引起氢塌陷并释放药物。还可例如通过药剂与纳米颗粒之间的共价键结使药剂囊封于空心金纳米壳体内部。可经由接头(例如游离硫醇、胺或羧酸酯官能团)来共价附接至金纳米颗粒。在一些实施方案中，接头位于金纳米颗粒的表面上。在一些实施方案中，本发明所涵盖的药剂可经修饰以包含接头。接头可包含具有可变长度的PEG或寡乙二醇部分以增加生物环境中的颗粒稳定性并且控制药物负载的密度。PEG或寡乙二醇部分也最小化不期望生物分子的非特异性吸附。PEG或寡乙二醇部分可为支链或直链的(参见例如Tong等人(2009)Langmuir 25：12454-12549)。本发明所涵盖的药剂可栓系至胺功能化金纳米颗粒(参见例如Lippard等人(2009)JACS 131：14652-14653)。Pt(IV)-金纳米颗粒复合物的细胞毒性效应高于游离Pt(IV)药物和游离顺铂。

在一些实施方案中，可使用磁性纳米颗粒(例如由铁、钴、镍和其氧化物或氢氧化铁纳米颗粒制得者)来配制本发明所涵盖的药剂。可使用定位磁场梯度来将磁性纳米颗粒吸引至所选位点，使其保持于此处直至完成疗法为止，并且然后将其去除(参见例如Alexiou等人(2000)Cancer Res.60：6641-6648)。在一些实施方案中，可使用接头将本发明所涵盖的药剂键结至磁性纳米颗粒。接头可为能够发生分子内环化以释放药剂的接头。可使用所公开的任何接头和纳米颗粒(参见例如PCT公开第WO 2014/124329号)。可通过加热磁性纳米颗粒或通过向磁性纳米颗粒施加交替电磁场来诱导环化。

在一些实施方案中，将本发明所涵盖的药剂负载于氧化铁纳米颗粒上。在一些实施方案中，使用基于由氧化铁组成的核心的超顺磁纳米颗粒(SPION)来配制本发明所涵盖的药剂。使用无机材料(二氧化硅、金等)或有机材料(磷脂、脂肪酸、多糖、肽或其他表面活性剂和聚合物)涂覆SPION并且其可进一步用药物、蛋白质或质粒功能化。

在一个实施方案中，可使用经水可分散性油酸(OA)-泊洛沙姆涂覆的氧化铁磁性纳米颗粒(参见例如Jain Mol.Pharm.(2005)2：194-205)来递送药剂。药剂可分配至环绕氧化铁纳米颗粒的OA壳体中并且泊洛沙姆共聚物(例如普朗尼克)赋予制剂以水分散性。

在一些实施方案中，使用具有磷酸盐部分的纳米颗粒来递送本发明所涵盖的药剂(参见例如美国专利第8,828,975号)。纳米颗粒可包含金、氧化铁、二氧化钛、氧化锌、二氧化锡、铜、铝、硒化镉、二氧化硅和/或金刚石。纳米颗粒可在表面上含有PEG部分。

在一些实施方案中，可使用肽和/或其他缀合物来配制本发明所涵盖的药剂以增加细胞(例如巨噬细胞和其他免疫细胞)的渗透。在一个实施方案中，可使用肽(例如但不限于细胞渗透肽和使得能够细胞内递送的蛋白质和肽)来递送药物制剂。可用于本发明所涵盖的药剂的细胞渗透肽的非限制性实例包括附接至多聚阳离子以促进递送至细胞内空间的细胞渗透肽序列，例如HIV源TAT肽、穿膜肽(penetratin)、转膜肽(transportan)或hCT源细胞渗透肽(参见例如Caron等人(2001)Mol.Ther.3：310-318；Langel，Cell-PenetratingPeptides：Processes and Applications(CRC Press，Boca Raton FL，2002)；El-Andaloussi等人(2003)Curr.Pharm.Des.11：3597-35611；和Deshayes等人(2005)Cell.Mol.Life Sci.62：1839-1849)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的药剂还可包含一种或多种增强活性剂(例如siRNA分子)至靶向细胞(例如单核细胞、巨噬细胞等)的递送的缀合物。缀合物可为可并入脂质制剂中以特异性靶向所关注细胞的配体。使用用于脂质颗粒药物递送的配体靶向策略的优点在于潜在地增加了靶标特异性并且无需阳离子脂质来触发细胞内递送。配体可包括使用单核吞噬细胞特性受体表达和吞噬先天性过程的肽、抗体、蛋白质、多糖、糖脂、糖蛋白和凝集素。

在一些实施方案中，缀合配体可为可改进细胞特异性靶向和细胞摄取的细胞靶向肽(CTP)或细胞渗透肽(CPP)。肽的一些实例包括但不限于选择性地与单核细胞缔合的胞壁酰三肽(MTP)、RGD肽、GGP-肽(Karathanasis等人(2009)Ann.Biomed.Engin.37：1984-1992)。巨噬细胞肽靶向剂还可包括从噬菌体展示和测序所鉴定者(参见例如Liu等人(2015)Bioconjug.Chem.26：1811-1817)。在一些实施方案中，配体可为抗体和其片段，对单核细胞和巨噬细胞具有特异性的示例性抗体包括抗VCAM-1抗体、抗CC52抗体、抗CC531抗体、抗CD11c/DEC-205抗体。例如，抗体可偶联至脂质体表面或在远端经由其Fc区偶联至脂质体附接的PEG。

在一些实施方案中，可通过向脂质颗粒中并入凝集素(例如烷基甘露糖苷、Mann-C4-Chol、Mann-His-C4-Chol、Man2DOG、4-氨基苯基-a-D-吡喃甘露糖苷、氨基苯基-α-D-吡喃甘露糖苷和Man3-DPPE)来对纳米颗粒实施甘露糖基化。免疫细胞(包括肺泡巨噬细胞、腹膜巨噬细胞、单核细胞源树突状细胞和库弗氏细胞)组成型表达高水平的甘露糖受体(MR)。因此可经由甘露糖基化脂质纳米颗粒靶向巨噬细胞和DC。

其他配体还可包括马来酰化牛血清白蛋白(MBSA)、O-硬脂酰基支链淀粉(O-SAP)和纤连蛋白(参见例如Ahsan等人(2002)J.Cont.Rel.79：29-40；Vyas等人(2004)Intl.J.Pharm.269：37-49)。

VII.

使用本领域众所周知的方法使本文所述的药剂(例如组合物和制剂)可接触期望目标(例如细胞、无细胞结合伴侣等)和/或施用于生物体。例如，可经由化学方法(例如阳离子脂质体和聚合物)或物理方法(例如基因枪、电穿孔、颗粒轰击、超声波利用和磁转染)将药剂递送至细胞中。

用于接触巨噬细胞的施用方法是本领域众所周知的，这特别是因为巨噬细胞通常存在于各组织类型中(参见Ries等人(2014)Cancer Cell 25：846-859；Perry等人(2018)J.Exp.Med.215：877-893；Novobrantseva等人(2012)Mol.Ther.Nucl.Acids 1：e4；Majmudar等人(2013)Circulation 127：2038-2046；Leuschner等人(2011)Nat.Biotechnol.29：11)。另外，可调整施用方法以靶向所关注的巨噬细胞群体，例如通过使用药剂的局部施用来靶向巨噬细胞的空间受限群体(例如，肿瘤内施用于靶标TAM)(参见Shirota等人(2012)J.Immunol.188：1592-1599；Wang等人(Oct.2016)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.113：11525-11530)。这些不同施用方法可选择性靶向所关注的巨噬细胞群体，同时减小或消除与其他巨噬细胞群体的接触(例如，肿瘤内施用以选择性靶向来自循环巨噬细胞的TAM)。

还可通过任何产生治疗有效结果的途径以有效量来施用药剂。施用途径可包括但不限于经肠(进入肠中)、经胃肠道、硬膜上(进入硬脑膜中)、口服(通过口腔)、透皮、硬膜外、大脑内(进入大脑中)、脑心室内(进入脑心室中)、皮上(施加于皮肤上)、真皮内(进入皮肤本身中)、皮下(在皮肤下面)、经鼻施用(穿过鼻子)、静脉内(进入静脉中)、静脉内浓注、静脉内滴注、动脉内(进入动脉中)、肌内(进入肌肉中)、心脏内(进入心脏中)、骨内输注(进入骨髓中)、鞘内(进入脊椎管中)、腹膜内(输注或注射至腹膜中)、膀胱内输注、玻璃体内(穿过眼睛)、海绵窦内注射(进入病理腔中)、腔内(进入阴茎根部中)、阴道内施用、子宫内、羊膜外施用、透皮(扩散穿过完整皮肤以实现全身性分布)、经粘膜(扩散穿过粘膜)、经阴道、吹入(嗅吸)、舌下、唇下、灌肠剂、滴眼剂(于结膜上)、滴耳剂、经耳(在耳朵中或通过耳)、经颊(指向面颊)、结膜、皮肤、经牙齿(施加至一个或多个牙齿)、电渗透、子宫颈内、窦内、气管内、体外、血液渗析、浸润、经间质、腹内、羊膜内、关节内、胆管内、支气管内、粘液囊内、软骨内(在软骨内)、尾部内(在马尾内)、脑池内(在小脑延髓池内)、角膜内(在角膜内)、牙冠内、冠状动脉内(在冠状动脉内)、阴茎海绵体内(在阴茎海绵体的可扩张空间内)、椎间盘内(在椎间盘内)、导管内(在腺导管内)、十二指肠内(在十二指肠内)、硬膜内(在硬膜内或之下)、表皮内(施加至表皮)、食管内(施加至食管)、胃内(在胃内)、牙龈内(在牙龈内)、回肠内(在小肠的远端部分内)、病灶内(在局部病灶内或直接引入局部病灶中)、管腔内(在管腔内)、淋巴管内(在淋巴内)、骨髓内(在骨的骨髓腔内)、脑膜内(在脑膜内)、心肌内(在心肌内)、眼内(在眼内)、卵巢内(在卵巢内)、心包内(在心包内)、胸膜内(在胸膜内)、前列腺内(在前列腺内)、肺内(在肺或其支气管内)、窦内(在鼻或眼窝窦内)、脊柱内(在脊柱内)、滑膜内(在关节的滑液腔内)、腱内(在肌腱内)、睾丸内(在睾丸内)、鞘内(在脑脊髓轴的任何层面上的脑脊髓液内)、胸腔内(在胸腔内)、小管内(在器官的管内)、肿瘤内(在肿瘤内)、鼓室内(在中耳内)、血管内(在一个或多个血管内)、心室内(在心室内)、离子透入法(利用电流，其中可溶性盐的离子迁移至身体组织中)、冲洗(浸泡或冲洗开放性创伤或体腔)、喉(直接在喉上)、鼻胃(穿过鼻并进入胃中)、封闭敷裹技术(局部途径施用，其然后由封闭所述区域的敷料覆盖)、眼部(施加至外眼)、口咽(直接施加至口腔和咽)、肠胃外、透皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(在呼吸道内，通过经口或经鼻吸入用于局部或全身性作用)、眼球后(脑桥后或眼球后)、心肌内(进入心肌中)、软组织、蛛网膜下、结膜下、粘膜下、局部、经胎盘(通过或穿过胎盘)、经气管(穿过气管壁)、经鼓膜(穿过或通过鼓室)、输尿管(施加至输尿管)、尿道(施加至尿道)、阴道、骶管阻断、诊断、神经阻断、胆灌注、心脏灌注、体外光化学疗法或脊柱。

通常以剂量单位形式配制药剂以便于施用并且实现剂量均匀性。然而，应理解，本发明所涵盖的药剂的总日用量可由主治医生在合理医学判断范围内确定。任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当成像剂量水平取决于多种因素，包括所治疗病症和所述病症的严重程度；所采用具体药剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；所采用具体药剂的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗持续时间；与所采用具体化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。

在一些实施方案中，可以足以递送约0.0001mg/kg至约1000mg/kg、约0.001mg/kg至约0.05mg/kg、约0.005mg/kg至约0.05mg/kg、约0.001mg/kg至约0.005mg/kg、约0.05mg/kg至约0.5mg/kg、约0.01mg/kg至约50mg/kg、约0.1mg/kg至约40mg/kg、约0.5mg/kg至约30mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、或约1mg/kg至约25mg/kg、或约10mg/kg至约100mg/kg、或约100mg/kg至约500mg/kg受试者体重/天(每天一次或多次)的剂量水平来施用本发明药剂，以获得期望治疗、诊断、预防或成像作用。期望剂量可以以下频率来递送：每天三次、每天两次、每天一次、每隔一天、每三天、每周、每两周、每三周或每四周或每两个月。在一些实施方案中，可使用多个施用(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或更多个施用)来递送期望剂量。在采用多次施用时，可使用分开给药方案(例如本文所述者)。

在一些实施方案中，本发明所涵盖的药剂是抗体。如本文所定义，抗体的治疗有效量(即有效剂量)在以下范围内：约0.001mg/kg体重至30mg/kg体重，优选地约0.01mg/kg体重至25mg/kg体重，更优选地约0.1mg/kg体重至20mg/kg体重，和甚至更优选地约1mg/kg体重至10mg/kg体重、2mg/kg体重至9mg/kg体重、3mg/kg体重至8mg/kg体重、4mg/kg体重至7mg/kg体重、或5mg/kg体重至6mg/kg体重。本领域技术人员应了解，某些因素可影响有效治疗受试者所需的剂量，所述因素包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的抗体治疗受试者可包括单一治疗或优选地可包括一系列治疗。在一个优选实例中，使用在约0.1mg/kg体重至20mg/kg体重范围内的抗体来治疗受试者，每周一次并且持续约1至10周、优选地2至8周、更优选地约3至7周和甚至更优选地约4、5或6周。还应了解，可在特定治疗过程中增加或降低用于治疗的抗体的有效剂量。剂量变化可源自诊断测定的结果。

如本文所用，“分开剂量”是将单一单位剂量或总日剂量分成两个或更多个剂量，例如单一单位剂量的两次或更多次施用。如本文所用，“单一单位剂量”是在一个剂量/一次/单一途径/单一接触点(即单一施用事件)中所施用任何治疗剂的剂量。如本文所用，“总日剂量”是在24小时时段内所给予或开具的量。其可以单一单位剂量形式来施用。

在一些实施方案中，剂型可为液体剂型。用于肠胃外施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型可包含本领域通常使用的惰性稀释剂(包括但不限于水或其他溶剂)、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和它们的混合物。在用于肠胃外施用的某些实施方案中，可混合组合物与增溶剂(例如

在某些实施方案中，剂型可为可注射的。可根据已知技术来配制可注射制剂(例如无菌可注射水性或油性悬浮液)并且可包括合适的分散剂、润湿剂和/或悬浮剂。无菌可注射制剂可为于肠胃外可接受的无毒稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如于1，3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂尤其包括但不限于水、林格氏溶液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。通常采用无菌不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。出于该目的，可采用包括合成单甘油酯或二甘油酯的任何温和不挥发性油。在可注射制剂中可使用例如油酸的脂肪酸。可注射制剂可通过例如经由细菌截留过滤器过滤和/或通过并入灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂呈无菌固体组合物形式并且可在使用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。

在一些实施方案中，片剂、糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒剂的固体剂型可制成具有包衣和外壳，例如肠溶包衣和药物配制领域中众所周知的其他包衣。它们可任选地包含遮光剂并且可为任选地以延迟方式仅仅或优先在肠道的某一部分中释放活性成分的组合物。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。在使用例如乳糖(lactose/milk sugar)以及高分子量聚乙二醇的赋形剂的软质和硬质填充明胶胶囊中，可采用相似类型的固体组合物作为填充剂。

可以0.1×10

可以如本文所述的任何合适途径(例如通过输注)来施用细胞。还可在其他抗癌剂之前、同时或之后施用细胞。

可使用本领域通常已知的方法来实现施用。可通过直接注射或通过本领域所用的任何其他方式(包括但不限于血管内、大脑内、肠胃外、腹膜内、静脉内、硬膜外、脊柱内、胸骨内、关节内、滑膜内、鞘内、动脉内、心脏内或肌内施用)来将药剂(包括细胞)引入期望部位。例如，可通过各种途径向所关注受试者植入移植细胞。这些途径包括但不限于静脉内施用、皮下施用、施用于特定组织(例如病灶移植)、注射至股骨骨髓腔中、注射至脾中、施用在胎儿肝的肾囊下方等。在某些实施方案中，将本发明的癌症疫苗经肿瘤内或经皮下注射至受试者中。可以一次输注来施用细胞，或经由连续输注在足以生成期望效应的限定时间段内来施用。用于移植细胞的移植、植入评价和标志物表型分型分析的示例性方法是本领域众所周知的(参见例如Pearson等人(2008)Curr.Protoc.Immunol.81：15.21.1-15.21.21；Ito等人(2002)Blood 100：3175-3182；Traggiai等人(2004)Science 304：104-107；Ishikawa等人，Blood(2005)106：1565-1573；Shultz等人(2005)J.Immunol.174：6477-6489；和Holyoake等人(1999)Exp.Hematol.27：1418-1427)。

可组合并施用两种或更多种细胞类型，例如基于细胞的疗法和干细胞过继性细胞转移、癌症疫苗和基于细胞的疗法等。例如，基于细胞的过继性免疫疗法可与本发明的基于细胞的疗法进行组合。在一些实施方案中，基于细胞的药剂可单独使用或与其他基于细胞的药剂(例如免疫疗法，如过继性T细胞疗法(ACT))组合使用。例如，使用经基因工程化以识别CD19的T细胞来治疗滤泡性B细胞淋巴瘤。用于ACT的免疫细胞可为树突状细胞、T细胞(例如CD8

可通过各种方法中的任一者来评价移植细胞的植入，例如但不限于肿瘤体积、细胞因子水平、施用时间、在移植后一个或多个时间点从受试者获得的所关注细胞的流式细胞术分析等。例如，等待1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28天的基于时间的分析或者可发送肿瘤收获的时间信号。任何这类量度是可根据众所周知的参数进行调节以测定变量对抗癌免疫疗法反应的影响的变量。另外，移植细胞可与其他试剂(例如细胞因子、细胞外基质、细胞培养载体等)共移植。

VII.

本发明还涵盖用于检测和/或调节本文所述的生物标志物的试剂盒。“试剂盒”是包含至少一种用于特异性检测和/或影响本发明标志物的表达的试剂(例如探针或小分子)的任何制品(例如包装或容器)。试剂盒可以用于实施本发明方法的单元形式进行推销、分配或出售。试剂盒可包含一种或多种可用于本发明方法中的药剂的检测、表达、筛选等所需的一种或多种试剂。例如，可在试剂盒中提供可用于检测本发明所涵盖的生物标志物(例如表1和/或表2中所列出的靶标)的药剂组合以检测其生物标志物和调节，这可用于鉴定单核细胞和/或巨噬细胞发炎表型、免疫反应、抗癌功能、对免疫检查点疗法的敏感性等。这些组合可包括一种或多种用以检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种生物标志物(包括所述值，例如至多并且包括本发明所涵盖的所有生物标志物)的药剂。

在一些实施方案中，试剂盒还可包含参考标准物(例如编码不影响或调控控制细胞生长、分裂、迁移、存活或细胞凋亡的信号通路的蛋白质的核酸)。本领域技术人员可设想许多这样的对照蛋白质，包括但不限于常用分子标签(例如绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶)，未通过GeneOntology参照分类为涵盖细胞生长、分裂、迁移、存活或细胞凋亡的任何途径的蛋白质，或普遍性管家蛋白。试剂盒中的试剂可提供于个别容器中或作为两种或更多种试剂的混合物提供于单一容器中。另外，可包括阐述试剂盒内组合物的使用的说明材料。本发明所涵盖的试剂盒还可包括公开或阐述试剂盒或所公开发明的抗体在如本文所提供的所公开发明的方法中的使用的说明材料。试剂盒还可包括其他组分以促进设计试剂盒的特定应用。例如，试剂盒可另外含有检测标记的构件(例如用于酶促标记的酶底物、用以检测荧光标记的过滤器组、适当二级标记(例如绵羊抗小鼠-HRP)等)和对照所需试剂(例如对照生物样品或标准物)。试剂盒可另外包含公认用于所公开发明的方法中的缓冲液和其他试剂。非限制性实例包括用以减少非特异性结合的试剂，例如载体蛋白或洗涤剂。

本发明所涵盖的其他实施方案阐述于下列实施例中。通过下列实施例来进一步阐释本发明，所述实施例不应理解为进一步限制本发明。

实施例

实施例1：原代单核细胞和巨噬细胞系统重现体内单核细胞和巨噬细胞的生物性质

人类巨噬细胞沿从促炎(M1样，在本文中也称为1型)至促肿瘤生成/抗炎(M2样，在本文中也称为2型)的分化谱存在(参见例如Biswas等人(2010)Nat.Immunol.11：889-896；Mosser和Edwards(2008)Nat.Rev.Immunol.8：958-969；Mantovani等人(2009)Hum.Immunol.70：325-330)。沿着该功能谱，巨噬细胞改变其表面标志物的表达和形态并且改变多个其他特性。理解在原代人类巨噬细胞中这些标志物沿该谱如何变化对于理解在给定免疫学环境(例如肿瘤内(肿瘤相关巨噬细胞)和/或发炎组织)中存在何种细胞和理解这些巨噬细胞如何影响这些组织内的免疫反应较为重要。某些细胞表面标志物(包括CD163、CD16和CD206)在传统上用于对巨噬细胞亚型进行分类。除这些表面标志物外，巨噬细胞亚型还显示独特形态。M1巨噬细胞显示树突状细胞样外观并且具有增加的树突突出物。M2巨噬细胞显示更圆形化或纺锤体样形态。

对于本文所述的每个基于单核细胞/巨噬细胞的实验来说，使用原代人类单核细胞/巨噬细胞而非使用细胞系，从而以使用经分离细胞类型的任何体外实验系统所容许的最接近可能方式重现模拟体内现有细胞的生物性质。特定来说，所述系统可研究原代细胞的天然生物性质并且获得源自具有不同基因和环境暴露的不同供体的天然多样性。因此，重要的是，在诠释测定结果时应考虑人类群体中的天然基因和免疫学可变性。

使单核细胞在体外分化成M1样(1型)和/或M2样(2型)表型(Ries等人(2014)Cancer Cell 25：846-859；Vogel等人(2014)Immunobiol219：695-703)。为使单核细胞分化成M1与M2表型，通过Ficoll分离使用RosetteSep

使用FACS缓冲液将经标记细胞洗涤两次并使用PBS+2％低聚甲醛固定以用于Attune

表3：流动抗体

巨噬细胞朝向M2表型的倾斜显示为相对于M1巨噬细胞上调CD163、CD16和CD206(图1A)。除这些经典标志物外，图1B显示，本文所述的新生物标志物(例如CD53、PSGL1和VSIG4)在M2巨噬细胞上也上调。图1C显示存在于巨噬细胞谱内的形态差异，并且重要的是显示存在于原代人类细胞内的可变性。

实施例2：通过靶核酸敲低来验证调节巨噬细胞发炎表型的靶标

为验证本文所述的巨噬细胞相关靶标调节巨噬细胞表型的能力，通过例如使用在原代人类巨噬细胞中设计、验证和测试的靶标特异性siRNA来实施靶标敲低实验。

由AXO Labs(Kulmbach，Germany)来合成siRNA。使用亚磷酰胺技术在固相上采用ABI 394合成器(Applied Biosystems)以10μmol规模来合成寡核糖核苷酸。在由受控孔玻璃(CPG，

在完成固相合成之后，将经干燥固体载体转移至15mL管中并用于甲醇中的甲胺(2M，Aldrich)在45℃下处理180min。在离心之后，将上清液转移至新15mL管中并使用1200μL N-甲基吡咯烷-2-酮(NMP，Fluka，Buchs，Switzerland)洗涤CPG。将洗涤液与甲醇性甲胺溶液合并并添加450μL三乙胺三氢氟酸盐(TEA·3HF，Alfa Aesar，Karlsruhe，Germany)。使该混合物达到65℃并保持150min。在冷却至室温之后，添加0.75mL NMP和1.5mL乙氧基三甲基硅烷(Merck，Darmstadt，Germany)。十分钟后，通过离心收集沉淀的寡核糖核苷酸，弃除上清液，并且将固体重构于1mL缓冲液A(阐述于下文)中。

通过阴离子交换HPLC使用填充有Source Q15的柱(GE Healthcare)和AKTAExplorer系统(GE Healthcare)来纯化粗制寡聚物。缓冲液A是10mM高氯酸钠、20mM Tris、1mM EDTA(pH 7.4)(Sigma Aldrich)并含有20％乙腈。缓冲液B与缓冲液A相同，除了含有500mM高氯酸钠。采用42柱体积(CV)内的22％B至42％B的梯度。记录280nm下的UV迹线。合并适当部分并使用3M NaOAc(pH 5.2)和70％乙醇沉淀。最后，使用70％乙醇洗涤团粒。或者，使用

通过组合等摩尔RNA溶液来将互补链退火。冻干混合物并使用适当体积的退火缓冲液(100mM NaCl，20mM磷酸钠，pH 6.8)重构以实现期望浓度。将该溶液置于75℃水浴中并在2小时内冷却至室温。

在体外使用根据表4的各种细胞系来生成siRNA的剂量反应曲线。

表4：用于siRNA分析的细胞系和条件

简言之，将细胞接种于96孔板中并使用siRNA、

在37℃下培育24小时之后，使用终点测定测量mRNA敲低。对于不含报告基因质粒的靶标，根据制造商说明书(

对于所有剂量反应曲线，应用4参数逻辑模型以测定每一siRNA序列的IC50(表5和图2)。表5和图2中所显示的数据代表一式四份的平均值+/-标准差。

表5：siRNA序列和IC50值

然后将经验证siRNA用于原代人类巨噬细胞测定中以测定靶标敲低改变促肿瘤生成(M2)或促炎(M1)表型的能力，如上文在实施例1中所述。简言之，通过Ficoll分离使用RosetteSep

以50nM的最终浓度在第1天和第3天施用siRNA脂质纳米颗粒。如Novobrantseva等人(2012)Mol Ther.Nucl.Acids 1：e4中所述来配制C12-200脂质纳米颗粒(LNP)。简言之，经由微流体混合在10mM柠檬酸盐缓冲液中一起混合含有摩尔比率为50∶10∶38.5∶1.5的可离子化脂质C12-200(阐述于Love等人(2010)AXO Labs GmbH，K ulmbach，Germany中；在万维网(World Wide Web)上doi.org/10.1073/pnas.0910603106下可用)、二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC，A vanti Polar Lipids，Alabaster AL)、胆固醇(MP Biomedicals，Santa A na CA)和DMPE-PEG2000(1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]，Avanti)的乙醇相与siRNA水相。乙醇∶水性体积比率为1∶3，并且总脂质∶siRNA重量比率为大约9∶1。所得LNP针对1×PBS渗析过夜。经配制LNP具有大约60-70nm的中值粒径，如通过纳米颗粒追踪分析(ZetaView，ParticleMetrix)所测量，并且siRNA囊封效率为大约80-90％，如通过改进型Quant-iT

在培养第6天，使用20ng/ml人类IL-10(Biolegend，San Diego，CA)极化M2巨噬细胞。48小时后，通过刮除从板去除巨噬细胞并且如上所述通过bDNA来评价mRNA水平。图3A显示在M2巨噬细胞中评价的每一个别靶标的相对敲低。图3B显示相同M2巨噬细胞中经由流式细胞术分析测得的靶蛋白(如果其表达于表面上)的敲低。

图3显示来自上述经siRNA处理的M2巨噬细胞的结果，其例如通过使用传统标志物CD163、CD16和CD206的表达的评价以及经由上文实施例1中所述的生物标志物(例如CD53、PSGL1和VSIG4)证实，26种经验证靶标经测定将M2巨噬细胞驱向M1表型和/或进一步沿M2谱。另外，这些靶标显示使这些M2巨噬细胞的形态改变至M1样和/或更像M2的能力。重要的是，这些测定内发生分化的细胞在倾斜条件存在下保留于整个测定中。因此，对于将靶标从M2样驱向M1样的siRNA，其必须在连续强倾斜混合剂存在下方实现这种效应。这对于这些siRNA的功能设定了极高标杆，因为它们不能实现完全敲低，但仍显示显著表型变化。实施例1显示传统巨噬细胞标志物CD163、CD16和CD206以及生物标志物CD53、PSGL1和VSIG4的表达。图1还显示了在个别供体之间这些标志物内的天然和显著可变性。同样，应注意，一些标志物在M1分化细胞与M2分化细胞之间的表达差异小于0.5倍变化(图1A)，从而指示极小表达变化即可具有极显著功能结果。因此，经由siRNA敲低，在最少4个供体中i)经典标志物、ii)新的生物标志物、iii)经典或新的生物标志物的组合或iv)i、ii或iii与形态变化的组合的平均变化为10％或更大时，来自表1和表2的靶标可视为有效的。

实施例3：通过阻断靶蛋白来验证调节巨噬细胞发炎表型的靶标

将巨噬细胞生物优化以诱导或抑制免疫反应。因此，经由siRNA、抗体或其他方式靶向巨噬细胞容许改变免疫反应的开始、抑制和/或永存。

已鉴定和生成如实施例2中所述验证的靶标的抗体。用于本文所述实验中的抗体是源自商业供应商或以重组方式生成。例如，抗体可变区序列是源自已知结合剂，例如下列来源中所述者：美国专利公开第2007/0160601号、美国专利第7,833,530号、美国专利第7,604,802号以及美国专利公开第2017/0190782号。抗体可变区序列在表6中阐述或产生。

表6：抗体可变区序列

所有重组抗体都表示为具有与κ或λ轻链配对的S228P重链突变的人类IgG4嵌合体。将可变重链(HC)和轻链(LC)序列克隆至含有表7中所示的抗体恒定区序列的载体中。

表7：抗体恒定区序列

通过ATUM(Newark，CA)并且通过将含有重链和轻链的专属载体瞬时转染至悬浮液适应性HEK293细胞中来实施蛋白质表达和纯化。通过蛋白质A亲和色谱法(MabSelectSuRe

购买表8中所列出的商业抗体并用于测定中。另外，针对实施例2中所述的经验证靶标来生成表9中所列出的抗体并包括于这些测定中。

表8：商业抗体

表9：ATCC保藏抗体

如实施例2中所述验证的靶标的所生成抗体已用于功能测定中。通过包括以下的读出来测量这些抗体对巨噬细胞分化状态的影响：巨噬细胞状态特异性生物标志物、细胞因子分泌和其他功能特性，例如使协同免疫反应永存于复杂多细胞测定中的能力。

例如，图4显示表6、表8和表9中列出的20种用于巨噬细胞分化测定中的抗体的结果。

简言之，通过Ficoll分离使用RosetteSep

特异性抗体能够逆转朝向M2表型的倾斜，如通过本文(例如在实施例1中)所述的经典和新颖生物标志物所测定。这并非所有抗体针对靶标的泛功能效应，因为并非所有针对给定靶标的mAb都诱导巨噬细胞表型标志物的明显变化。此外，抗体Ab 8和Ab 18能够对所有这些标志物组显示剂量可滴定效应(图4)。如上所述，经由抗体处理，在最少4个供体之间i)经典标志物、ii)新的生物标志物、iii)经典或新的生物标志物的组合或iv)i、ii或iii与形态变化的组合的平均变化为10％或更大时，靶标可视为有效的。

除表型表面标志物外，M1(例如1型)和M2(例如2型)巨噬细胞也产生不同的细胞因子和趋化因子。例如，M1巨噬细胞产生更多促炎性细胞因子(包括但不限于GM-CSF、IL-12和TNFα)，而M2巨噬细胞产生更多促肿瘤生成和免疫抑制性细胞因子(例如VEGF、IL-10和TGFb)。这种效应可见于图4C中，其中与M2巨噬细胞相比，M1分化的巨噬细胞产生高水平的促炎细胞因子。在这些测定中，巨噬细胞经由强力细胞因子IL-10和M-CSF的存在强烈驱向M2表型。在整个分化过程中，添加结合至经验证靶标的mAb能够克服这种强力极化并且将M2巨噬细胞驱向更像M1状态。这可通过不仅经典表型标志物而且新颖生物标志物的变化以及促炎细胞因子产生的功能诱导来证实。

在整个分化和极化过程中添加siRNA或抗体时实现反应的能力已显示于上文中。在疾病环境(例如肿瘤)中，据认为，细胞已沿M2谱分化至一定程度。因此，在图4D-4G中，单核细胞极化成如上文所述的M2，但仅在极化过程的最后两天期间添加抗体。另外，给予1ug/mL而非10ug/mL的抗体77、78和81-84，所有其他mAb都是以上述剂量给予。在该限制窗口期间，mAb 8、18和75-82能够使M2巨噬细胞显著极化至更像M1状态，如通过促炎细胞因子的增加所证实。如实施例2中所证实，一些靶标的下调与siRNA敲低导致巨噬细胞达到更像M2免疫抑制表型。mAb 83和84显示能够经由使用mAb阻断靶标来重现这种功能效应。

这些图证实，经验证靶标的抗体能够逆转M2巨噬细胞的表型以及功能特性以使其更像M1，以及能够将巨噬细胞驱向更具免疫抑制性的M2样表型。

实施例4：使用复杂多细胞测定来验证调节巨噬细胞发炎表型的靶标

为使巨噬细胞诱导肿瘤免疫原性或逆转自身免疫和发炎病症的过程，它们通常应能够诱导或阻断协同免疫反应。这将包括对髓系细胞和淋巴样细胞具有直接和下游作用。需要由来自淋巴样谱系和骨髓样谱系的原代细胞组成的复杂多细胞测定来分析这些效应。

利用若干系统来证实本文所述的经验证靶标产生协同免疫反应的能力，包括葡萄球菌肠毒素B(SEB)测定和混合淋巴细胞反应(MLR)测定。这些测定利用原代人类细胞，所述细胞是用于研究的最天然细胞并且对体内疾病(例如人类疾病)具有最佳预测能力。这些测定在背景活性和反应的幅值方面天然具有高供体间可变性。

对于SEB测定，通过

对于MLR测定，通过首先通过梯度离心在

在这些测定中，经验证靶标的特异性抗体显示能够影响协同多细胞免疫反应。这种协同多细胞反应包括不仅改变髓系细胞的表型和功能(如先前所证实)，而且还改变淋巴样细胞、具体来说T细胞的功能输出。SEB测定的结果显示于图5中。图5A显示IFNγ的T细胞特异性细胞内染色。如可看到，特定经验证mAb能够使IFNγ增加至高于对照水平。图5B和图5C显示来自SEB测定的经分泌细胞因子的水平。使用经验证mAb进行处理可产生骨髓源细胞因子和趋化因子(例如IL-1B、GM-CSF和CCL3.4)和T细胞源细胞因子(例如IL-2、IFNγ和IL-10)。这明确指示，经验证可将巨噬细胞驱向更具促炎性M1样状态的mAb可在多细胞测定中具有一致效应并且增加发炎细胞因子，并且经验证可将巨噬细胞驱向更具免疫抑制性状态的mAb在复杂多细胞测定中重现所述效应。

图6显示来自MLR实验的结果，其中显示两种不同反应。图6A显示来自T细胞的IFNγ和颗粒酶B的细胞内流动染色。如上文所述通过并入固定和渗透步骤来实施细胞内染色。使用BDCytofix/Cytoperm

实施例5：通过与免疫检查点抑制剂治疗相比调节经验证靶标来调节巨噬细胞发炎表型

检查点抑制剂(例如PD-1阻断抗体)是当前的黄金标准免疫肿瘤学治疗剂。在传统上，检查点抑制剂已着眼于阻断直接表达于T细胞上的抑制受体并且由此直接增加针对肿瘤的T细胞活性。上文显示经验证的靶标已显示可首先改变巨噬细胞的表型和功能并且然后导致协同免疫反应(包括T细胞活化)。因此，需要证实这些巨噬细胞相关靶标的功能等于或优于检查点抑制剂或潜在地与检查点抑制剂组合的能力。

经验证靶标相较于检查点抑制剂相等或更佳地发挥作用(包括在检查点抑制剂不发挥作用的情况下)的能力显示于图5中。在这种测定中，显示两种供体。如上述SEB测定中所述来实施测定。例如，供体5中的PD1阻断(例如使用派姆单抗)可增加T细胞特异性反应，如通过IFNg产生所指示，而在供体2中在PD1阻断存在下T细胞活性并不增加。在供体2和供体5中，特异性抗体能够诱导T细胞和髓系细胞特异性反应。另外，PD1阻断与经验证靶标抗体的组合可产生加和反应，表明抗靶标治疗剂应用(单独或与检查点抑制剂组合)的功效。

实施例6：巨噬细胞相关靶标在肿瘤微环境中的表达和功能

测试经验证巨噬细胞相关靶标在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)上的表达(图7)。如上所述来实施流式细胞术。已证实，巨噬细胞相关靶标表达于TAM(例如来自肺肿瘤、肾肿瘤者和来自妇科癌症的腹水液的细胞组分)上(图7B)。这些经验证巨噬细胞相关靶标的一致稳健表达可见于不同肿瘤类型和系统中。

上述体外系统明确显示，这些经验证巨噬细胞相关靶标能够改变巨噬细胞功能以及复杂多细胞测定(包括T细胞)。使用患者肿瘤材料在离体培养系统中进一步证实这些数据。这类系统代表人类体内研究的接近并且通常公认的替代者，因此提供治疗益处的强力证据。使用若干独立系统进一步测试巨噬细胞相关靶标对组织环境中的巨噬细胞生物学的调控。

用于该目的一个系统是解离肿瘤测定。解离肿瘤含有所有存在于肿瘤微环境中的不同细胞群体，包括例如肿瘤细胞、免疫细胞和支持细胞。这些可存活单细胞悬浮液可用于许多应用并且容许每一重复实验内的细胞数量和组合物的归一化。为在获取新鲜肿瘤组织(小于24小时)后实施解离肿瘤实验，使用剪刀和解剖刀从肿瘤样品去除环绕脂肪、纤维区域和坏死区域。将肿瘤切割成2-4mm

用特异性抗体以及派姆单抗

使用第二系统来进一步证实解离肿瘤测定的结果。简言之，解离肿瘤测定的优点在于能够将每一实施条件中的细胞数量归一化。它们还具有损失肿瘤结构和非细胞基质组分的潜在缺点。为解决这个问题并且证实经验证靶标诱导完整肿瘤中的协同免疫反应的能力，实施组织切片培养。在获得新鲜肿瘤组织样品(小于24小时)后，尽可能多地使用剪刀和解剖刀从肿瘤样品去除环绕脂肪、纤维区域和坏死区域。使用4％琼脂糖将组织包埋于组织模具中心。在固化后，移去琼脂糖区块，并且将模具胶粘至Leica VT1000 S切片机组织固持器上并且使用Leica VT1000 S切片机切成300微米至400微米切片。将组织切片转移至细胞培养插入物中并且然后转移至6孔细胞培养板中含有培养基(DMEM，含有L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖和丙酮酸钠(Fisher Scientific)、Gibco

图8显示所选抗体在多个肿瘤类型和供体中的功能。在该图中，组合每一治疗中来自6个不同肿瘤(包括肾、肺和GI肿瘤)的结果。促炎反应的诱导是一致和显著的，由此显示较宽的功能和应用性。这些不同肿瘤是由高度浸润性实例和最小浸润性肿瘤构成，如图10A-C中所显示。这些结果进一步证实，针对经验证靶标的抗体可诱导肿瘤微环境内的强力促炎和很可能抗肿瘤免疫反应。这种效应可等于或大于派姆单抗

图9A-9C显示源自经抗体以及上述经验证siRNA处理的3个单独肿瘤类型的细胞因子产生。在所有3个独立样品中，使用抗体或siRNA调节经验证巨噬细胞相关靶标可诱导促炎免疫反应(包括骨髓样和淋巴样特异性反应)。

图9A和图9B也显示关于PD1阻断的两种不同反应。肺肿瘤测定(图9A)显示派姆单抗

因此，提供至少下列代表性实例：a)在T细胞浸润性肿瘤中，经验证巨噬细胞相关靶标(VTx)单一疗法或组合疗法所产生的T细胞和巨噬细胞活化强于派姆单抗

不受限于理论，据认为，受其发炎状态影响的巨噬细胞调节免疫反应，这是因为其存在并不像其他免疫细胞一样限于抗原特异性相互作用。因此，在所有这些免疫浸润水平中诱发免疫反应的能力证实了在肿瘤类型和免疫状态中的宽适用性。所有人类癌症的约四分之一被视为免疫沙漠，而其余者则由免疫细胞浸润。尽管仅少数的这些肿瘤通过T细胞具有完全免疫监督，但其全部具有监督(促炎)和肿瘤支持(促肿瘤生成)巨噬细胞的显著浸润。图11显示人类癌症的大型公开数据集(TCGA，The Cancer Genome Atlas，2017版，由OmicSoft/Qiagen处理和分配)的癌症类型中的巨噬细胞浸润性肿瘤的分布。通过高于截止值的规范骨髓样标志物CD11b的存在来测量肿瘤浸润。截止值定义为数据集中所有原发性肿瘤中的CD11b mRNA表达分布的第一四分位值。据认为，这些巨噬细胞浸润性肿瘤特别可用于根据本文所述的组合物和方法来调节。

生物保藏

由Verseau Therapeutics，Inc在2019年6月4日和2019年6月20日将本发明的代表性材料保藏于美国模式培养物保藏所(ATCC)中。特定来说，将以具有下列名称：“13H10”(PTA-125944)、“13J19”(PTA-125945)、“18F02”(PTA-125946)和“19I01”(PTA-125943)的个别保藏物保藏并且具有表9和实施例中所示的鉴定特性的单克隆抗体在2019年6月4日由Verseau Therapeutics，Inc.在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约(Budapest Treaty on International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purpose of Patent Procedure)和其细则(布达佩斯条约)的规定下保藏于ATCC中。类似地，将以具有下列名称：“1F01”(PTA-126025)、“3C01”(PTA-126026)、“10M15”(PTA-126027)、“4H23”(PTA-126028)、“7A12”(PTA-126029)和“7F19”(PTA-126030)的个别保藏物保藏并且具有表9和实施例中所示的鉴定特性的单克隆抗体在2019年6月20日由Verseau Therapeutics，Inc.在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约和其细则(布达佩斯条约)的规定下保藏于ATCC中。这确保从保藏日开始维持有效保藏30年。所述保藏物可根据布达佩斯条约的条款从ATCC获得，并且受限于VerseauTherapeutics，Inc.与ATCC之间的协议，所述协议确保在相关美国专利颁布时或在任何美国或外国专利申请向公众公开时(以先发生者为准)，所述保藏物可永久并且不受限制地供公众使用，并且确保由美国专利和商标事务专员(U.S.Commissioner of Patents andTrademarks)根据35U.S.C.第122节和依照其的事务专员规则(包括37 C.F.R.第1.14节，特别参照886 OG 638)确定有权获得者对保藏物的可获得性。

本申请的受让人已同意，如果保藏物丢失或被破坏，则所述材料应在通知后立即用另一相同材料替换。所保藏材料的可获得性不应解释为在违反任何政府当局根据其专利法所授予权利的情形下实践本发明的许可。

通过引用并入

本文所提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容都通过引用并入本文，如同将每一个别出版物、专利或专利申请明确地且个别地指示通过引用并入本文一般。如果出现冲突，则以本申请(包括其中的任何定义)为准。

也通过引用整体引入任何多核苷酸和多肽序列，其可参照与公共数据库中的条目相关的登录号，例如由万维网上的基因组研究所(The Institute for Genomic Research，TIGR)和/或万维网上的国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)所维护者。

等效物和范围

本发明所涵盖的一个或多个实施方案的细节陈述于上述说明中。尽管上文已阐述优选的材料和方法，但任何类似或等效于本文所述者的材料和方法可用于实践或测试本发明所涵盖的实施方案。与本发明相关的其他特征、目标和优点根据本说明书是显而易见的。除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。在冲突的情形下，以上文所提供的本发明书为准。

本领域技术人员仅使用常规实验即可认识到或能够确定本文所述的本发明所涵盖的具体实施方案的许多等效形式。本发明范围并不旨在限于本文所提供的说明书并且这些等效物旨在由所附权利要求书涵盖。

除非指示相反情形或另外从上下文显而易见，否则本文使用冠词“一个”和“一种”来指代该冠词的语法对象中的一个/种或一个/种以上(即指至少一个/种)。举例来说，“一个元件”意指一个元件或一个以上元件。除非指示相反情形或另外从上下文显而易见，否则如果一个、一个以上或所有组成员存在、采用或另外相关于给定产物或过程中，则在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或说明被视为满足的。本发明包括恰好一个组成员存在、采用或另外相关于给定产物或过程中的实施方案。本发明还包括一个以上或全部组成员存在、采用或另外相关于给定产物或过程中的实施方案。

还注意，术语“包含”旨在是开放性的并且允许但未必并入其他要素或步骤。在术语“包含”用于本文中时，由此还涵盖并公开术语“由......组成”。

在给出范围的情形下，包括端点。此外，应理解，除非另外指示或另外根据上下文和本领域技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可在本发明所涵盖的不同实施方案中假设表示所陈述范围内的任何具体值或子范围，直至所述范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指示。

另外，应理解，本发明中在现有技术内的任何特定实施方案可从权利要求中的任何一项或多项明确排除。由于这些实施方案被视为是本领域技术人员已知的，因此它们可排除，即使所述排除未明确陈述于本文中。本发明所涵盖组合物的任何特定实施方案(例如，任何抗生素、治疗或活性成分；任何产生方法；任何使用方法；等等)可出于任何原因从任何一个或多个权利要求排除，不论是否与现有技术的存在相关。

应理解，已经使用的词语是描述性的词语，而不是限制性的词语，并且可以在所附权利要求的范围内进行改变，而不脱离本发明在其更宽泛方面所涵盖的真实范围和精神。

尽管已经相对于若干所描述的实施方案以一定篇幅并使用一定特定性描述了本发明，但是本发明并不旨在限于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，但应参照所附权利要求来解释以鉴于现有技术提供对这些权利要求的最广泛的可能解释，因此有效地涵盖了本发明的预期范围。