在线产物浓缩以降低体积负载流率并提高结合和洗脱层析纯化的生产率

摘要

用于纯化包含目的生物分子和杂质的样品的方法和系统，其包含在生物反应器中表达所述目的生物分子以形成包含所述目的生物分子和杂质的产物样品；对所述产物样品进行单程切向流过滤以形成浓缩产物样品；以及对所述浓缩产物样品进行亲和层析以从所述浓缩产物样品中除去杂质。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年12月20日提交的美国临时申请号62/782,671的优先权权益，其全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及用于纯化包括治疗性抗体和含Fc的蛋白质的生物分子的有效方法和系统。

背景技术

用于制备生物分子(诸如蛋白质，特别是重组蛋白质)的一般方法通常涉及两个主要步骤：(1)在宿主细胞中表达该蛋白质，然后(2)纯化该蛋白质。第一步涉及在生物反应器中生长所需宿主细胞以实现蛋白质的表达。用于此目的的细胞系的一些实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、骨髓瘤(NSO)细菌细胞诸如大肠杆菌(e-coli)和昆虫细胞。一旦蛋白质以所需水平表达，将蛋白质从宿主细胞中移除并收获。通常在下游纯化过程中从含蛋白质的流体中除去悬浮颗粒(诸如细胞、细胞碎片、脂质和其它不溶物)，从而得到含有溶液中的目的蛋白以及其它可溶性杂质的澄清流体。

第二步涉及将收获的蛋白质纯化以除去该方法固有的杂质。收获和下游操作的主要目的是将产物(例如，表达的蛋白质)与可溶性/不溶性杂质分离。杂质的实例包括宿主细胞蛋白(HCP，除所需蛋白或靶蛋白外的蛋白)、核酸、内毒素、病毒、蛋白质变体、蛋白质聚集体和细胞培养基组分/添加剂。此纯化通常涉及多个层析步骤，其可以包括在固体基质(诸如多孔琼脂糖、聚合物或玻璃)或通过基于膜的吸附剂进行的亲和层析、结合/洗脱模式的阳离子交换层析、流通模式(flow through mode)的阴离子交换层析、疏水相互作用等中的一种或多种。

工艺模板(process template)的一个实例包括通过离心的一级澄清、通过过滤的二级澄清，以及涉及结合/洗脱模式的protein-A亲和，随后结合/洗脱模式的阳离子交换，然后流通模式的阴离子交换的层析工艺系列。protein-A柱通过亲和机制捕获目的蛋白或靶蛋白，而大部分杂质则通过柱而被弃。然后通过从柱中洗脱来回收蛋白质。由于大部分目的蛋白的等电点(PI)在碱性范围(8-9)内，并且因此在正常处理条件下(pH低于蛋白质的PI)带正电荷，所以其与第二柱中的阳离子交换树脂结合。其它带正电荷的杂质也结合至该树脂上。然后通过在蛋白洗脱同时杂质保持与树脂结合的条件(pH，盐浓度)，从该柱洗脱来回收目的蛋白。阴离子交换柱通常在流通模式下操作，使得任何带负电荷的杂质结合至树脂上，同时在流通流中回收带正电荷的目的蛋白。在下游纯化过程之后，超滤/渗滤可用于调节缓冲系统，并在最终灌装单元(fill unit)操作之前浓缩产物以完成制备过程。该方法产生高度纯化和浓缩的蛋白质溶液，这一点至关重要，特别是在治疗性蛋白质打算用于人类并且必须由管理机构诸如食品和药品管理局(FDA)批准的情况下。

图3示出了一种常规工艺。该工艺包括细胞收获步骤，该步骤可涉及使用离心从细胞培养肉汤中去除细胞和细胞碎片，然后进行深度过滤。细胞收获步骤之后通常是捕获步骤，诸如蛋白A(Protein A)亲和纯化步骤，然后是病毒灭活。病毒灭活之后通常是一个或多个层析步骤，也称为精制步骤(polishing step)，其通常包括阳离子交换层析和/或阴离子交换层析和/或疏水相互作用层析和/或混合模式层析和/或羟磷灰石层析中的一种或多种。精制步骤之后是病毒过滤和超滤/渗滤，从而完成该工艺。

捕获步骤可使用Protein-A树脂诸如

相对低的结合容量，加上与适合于该应用的层析树脂相关的高成本，要求制造商使用层析介质进行多次结合/洗脱和柱再生循环，以便使这种方法成本有效。由于降低的产物通过量，增加的缓冲剂和清洁剂消耗，验证成本以及增加的资本设备要求，再生过程进一步增加了生产成本。

在层析树脂的动态结合容量(DBC)和体积负载流率之间存在重要的关系，如图1所示。DBC定义为在给定负载下与树脂结合的产物的质量。体积流率与停留时间(未保留的分子通过柱所花费的时间量)成反比。在较低流率下，目标分子扩散到树脂孔结构中的时间较多，因此DBC通常较高。在较高的流率下，大部分负载的产物流过而未结合，且DBC较低。图2描绘了在一定范围的体积流量下未结合产物穿透百分比与质量负载的关系。

蛋白结合容量是层析介质的重要参数；其确定纯化给定量的蛋白质所需的培养基的量。理想地，每个层析柱将在接近树脂的静态结合容量(SBC)(其为树脂的最大容量)的DBC下操作。树脂的SBC与流率无关。DBC与SBC之比为树脂利用率。

从图1和2可以看出，优选以低体积流率运行捕获柱。然而，低体积流率操作并不总是实际的，因为这将导致质量流率的相应降低和生产率的降低(定义为每体积层析树脂和处理时间所处理的质量)。

在多柱捕获方法中，可以使用2-6个等同柱的循环(rotation)，使得至少1个柱总是可用于产物负载(而洗脱和再生在其他一个柱或多个柱中发生)。为了最大化树脂利用率，可以串联负载两个或更多个柱。串联负载方法用于捕获穿透串联中第一柱的未结合产物，从而最大化收率。

在现有的连续生物处理方法中，上游生物反应器直接连接至多柱捕获步骤，并且必须协调这两个步骤的流率。生物反应器收获速率通常决定后续步骤的处理速率，因为降低生物反应器生产速率不是切实可行的选择。为了在常规操作中保持高的蛋白A结合容量，通常使用相对大的柱体积以增加在给定体积流率下的停留时间，和/或增加被循环的柱的数量。然而，增加柱的数量或柱尺寸会对工艺生产率产生负面影响。

因此，需要在连续生物处理操作中优化捕获层析而不对生产率产生有害影响。还期望提供一种用于制造生物分子诸如单克隆抗体(Mab)的系统和方法，其是有效的且具有成本效益。

发明内容

本文公开的实施方案克服了现有技术的问题，其提供了一种用于在生物制造过程中实现低体积流量层析负载而不影响产物质量流率的方法和系统。在某些实施方案中，在线(in-line)产物浓缩在捕获层析的上游进行，诸如通过单程切向流过滤进行。在线浓缩的加入不会影响分配的处理时间，从而允许层析步骤在较低的体积流率下操作(在相同的时间量内处理较少的体积)。此外，因为在线浓缩在成比例地减少体积的同时提高了产物浓度，所以产物质量流率不变。如图1和2所示，这种低体积流量操作提高了目标负载下的DBC，同时减少未结合产物穿透的量。结果是更有效地利用了层析树脂。

本文公开的实施方案包括纯化和分离源自细胞培养液的目的生物分子。在某些实施方案中，所公开的方法和系统包括在线浓缩，随后是下游纯化过程。在某些实施方案中，下游纯化过程可包括通过一个或多个层析柱的连续纯化。

在某些实施方案中，公开了一种用于纯化包含目的生物分子和杂质的样品的方法，该方法包含在生物反应器中表达目的生物分子以形成包含目的生物分子和杂质的产物样品；对该产物样品进行单程切向流过滤以形成浓缩产物样品；以及对该浓缩产物样品进行亲和层析以从其中除去杂质。在某些实施方案中，在进行单程切向流过滤之前，将来自生物反应器的产物样品(例如，收获的细胞培养物)进行一个或多个澄清步骤。该一个或多个澄清步骤可包括离心、切向流过滤、深度过滤和无菌过滤中的一个或多个。在某些实施方案中，在进行亲和层析之前，使离开单程切向流过滤操作的浓缩产物样品通过一个或多个无菌过滤器，或进入罐。

在某些实施方案中，亲和层析使用蛋白A亲和配体。

在某些实施方案中，该方法还包含对浓缩产物样品进行病毒灭活步骤。

在某些实施方案中，该方法包含对浓缩产物样品进行精制步骤，其在通过亲和层析捕获的下游。在一些实施方案中，精制步骤包含阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水相互作用层析中的一种或多种。在一些实施方案中，可以同时进行病毒活化和精制。

在某些实施方案中，生物分子为选自以下的抗体：重组抗体、重组单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体和抗体片段。在一些实施方案中，生物分子为蛋白质。

在某些实施方案中，公开了一种用于纯化目的生物分子的系统，该系统包含生物反应器；在该生物反应器下游的在线单程切向流过滤单元，用于连续浓缩从生物反应器排出的产物样品；串联配置在在线单程切向流过滤单元的下游的至少两个亲和层析柱，其用于接收来自在线单程切向流过滤单元的浓缩产物流；位于该至少两个亲和层析柱下游的病毒灭活过滤器；以及位于该病毒灭活过滤器下游的一个或多个阴离子交换、阳离子交换或疏水相互作用交换层析柱。

在一些实施方案中，该系统包括在生物反应器下游和SPTFF单元上游的离心机、切向流过滤单元、深度过滤单元和无菌过滤单元中的一个或多个。在一些实施方案中，该系统包括SPTFF单元下游和亲和层析柱上游的一个或多个无菌过滤器和/或一个或多个罐或容器。

在一些实施方案中，至少两个亲和层析柱各自包含蛋白A亲和配体。在一些实施方案中，恰好有两个亲和层析柱。

附图说明

图1为在不同进料流率下质量负载vs.动态结合容量(DBC)的图；

图2为在不同进料流率下质量负载vs.未结合产物穿透百分比的图；

图3为工业中使用的常规纯化方法的示意图；以及

图4为根据某些实施方案的纯化系统的示意图。

具体实施方式

在以下描述中，术语“所选生物分子”、“靶生物分子”或“分子”、“靶蛋白”、“生物分子或目的蛋白”或类似术语均指生物分子制造过程的产物。

如可以在本文中互换使用的，术语“污染物”、“杂质”和“碎片”是指任何外来的或不被期望的分子，包括生物大分子诸如DNA，RNA，一种或多种宿主细胞蛋白，内毒素，脂质，蛋白质聚集体以及一种或多种添加剂，其可存在于含有与一种或多种外来或不被期望的分子分离的目的产物的样品中。另外，这种污染物可包括在分离过程之前的步骤中使用的任何试剂。

如本文所用，术语“样品”是指含有待纯化的靶分子(诸如靶蛋白)的任何组合物或混合物。样品可源自生物或其它来源。生物来源包括真核和原核来源，诸如植物和动物细胞、组织和器官。在一些实施方案中，样品包括含有待纯化的目的蛋白的生物药物制剂。在一个具体的实施方案中，样品为含有待纯化的目的蛋白的细胞培养料(feed)。样品还可包括稀释剂、缓冲液、洗涤剂以及发现与靶蛋白或目的蛋白混合的污染物质、碎片等。样品可为“部分纯化的”(即，已经过一个或多个纯化步骤，诸如过滤步骤)或可直接从产生靶分子的宿主细胞或生物体获得(例如，样品可包含收获的细胞培养液)。

如本文所用，术语“结合和洗脱模式”以及“结合和洗脱过程”是指分离技术，其中样品中包含的至少一种靶分子(例如，含Fc区的蛋白质)结合至合适的树脂或介质(例如，亲和层析介质或阳离子交换层析介质)并随后被洗脱。

如本文所用，术语“穿透(break-through)”是指在将含有靶分子的样品上样至填充层析柱或分离单元上的过程中，当靶分子首次出现在柱或分离单元的输出中时的时间点。换句话说，术语“穿透”是靶分子开始损失的时间点。

如本文所用，短语“基本上由…组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及实质上不影响所要求保护的主题的基本和新颖特征的那些。该术语允许包括不会实质上影响所考虑的设备、系统或方法的基本和新颖特性的要素或步骤。因此，表述“基本上由…组成(consists essentially of)”或“基本上由…组成(consisting essentiallyof)”意味着所述实施方案、特征、部件、步骤等必须存在，并且可以存在其它实施方案、特征、部件、步骤等，条件是其存在不会实质上影响所述实施方案、特征、部件、步骤等的性能、特征或效果。允许存在对样品或产物没有实质影响的操作或步骤。例如，一种方法，其基本上由纯化包含目的生物分子和杂质的样品组成，基本上由以下组成：在生物反应器中表达所述目的生物分子以形成包含所述目的生物分子和杂质的产物样品；使产物样品澄清；对所述澄清的产物样品进行单程切向流过滤以形成浓缩产物样品；以及对所述浓缩产物样品进行亲和层析以从所述浓缩产物样品中除去杂质，排除在澄清和单程切向流过滤操作之间进行的其它步骤或单元操作，且排除在单程切向流过滤和亲和层析操作之间进行的其它步骤或单元操作，所述其它步骤或单元操作将实质性改变产物样品的组成。位于SPTFF单元下游和捕获层析上游的无菌过滤步骤或罐或容器不会实质性改变产物样品的组成。

在某些实施方案中，作为该方法的起始材料的样品可根据其生长的细胞系以及其生长和收获的条件而变化。例如，在大多数CHO细胞过程中，细胞将细胞壁外的分子表达到培养基中。为了减少混合物中杂质的量，人们试图在收获期间不使细胞破裂。然而，一些细胞在生长和收获期间可能破裂(由于剪切或其它处理条件)或者死亡并裂解，使其内含物溢出到混合物中。在细菌细胞系统中，生物分子通常与细胞壁保持在一起，或者其实际上可为细胞壁的一部分(蛋白A)。在这些系统中，需要破坏或裂解细胞壁以回收目的生物分子。

待纯化的靶分子可以为任何生物分子，优选蛋白质，特别是在任何宿主细胞中产生的重组蛋白质，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，可从荷兰的Crucell获得的

在某些实施方案中，在下游纯化过程中，使用一系列具有所需化学官能度的纯化介质来实现可溶性杂质的去除，同时产物保留在溶液中并流过纯化介质，从而得到含有产物的纯化流。纯化介质的合适形式包括衍生膜，官能化层析介质，或具有与各种杂质相互作用的所需化学官能度的任何其它多孔材料，使得该介质可通过静电、疏水或亲和相互作用捕获杂质。考虑到杂质的复杂性和变化的性质，具有不同化学官能度的多种纯化介质可以串联布置以去除具有不同化学性质的各种杂质。

在某些实施方案中，公开了一种用于从样品纯化靶分子的方法，其中该方法包含：(a)在生物反应器中表达蛋白质以形成蛋白样品；(b)对该蛋白样品进行在线浓缩步骤以形成浓缩蛋白样品(c)将所得浓缩蛋白样品进行蛋白A亲和层析，其使用一个或多个亲和层析单元。在某些实施方案中，在进行在线浓缩步骤之前，对蛋白样品进行一个或多个澄清步骤。如图4所示，还公开了一种用于从样品中纯化靶分子的系统，其包含生物反应器、在线单程切向流过滤器以及与该在线单程切向流过滤器流体连通的一个或多个蛋白A亲和层析柱。在某些实施方案中，该系统在生物反应器的下游和单程切向流过滤器的上游可包括离心机、切向流过滤器、深度过滤器和无菌过滤器中的一个或多个。在一些实施方案中，该系统在单程切向流过滤器下游和亲和层析柱上游可包括一个或多个无菌过滤器和罐或容器。该罐或容器可为缓冲(surge)罐或容器。在一些实施方案中，一个或多个病毒灭活单元可在亲和层析柱的下游。在一些实施方案中，精制相可在蛋白A亲和层析柱的下游，并且可包括阴离子交换层析柱、阳离子交换层析柱和疏水相互作用层析柱中的一个或多个。在一些实施方案中，该系统可包括在该精制阶段下游的病毒过滤器、无菌过滤器以及浓缩/渗滤装置中的一个或多个。

在一些实施方案中，在系统中的各种装置之间存在连接线。这些装置在线(inline)连接，使得系统中的每个装置与系统中该装置之前和之后的装置进行流体连通。在某些实施方案中，单程切向流过滤单元紧邻一个或多个澄清单元(诸如离心机，切向流过滤单元(例如，一个或多个TFF模块)，深度过滤单元诸如可从MilliporeSigma商购获得的

在一些实施方案中，起始样品为细胞培养物。这种样品可在生物反应器中提供。在某些实施方案中，生物反应器为灌注生物反应器。

根据某些实施方案，在线产物浓缩从进料中除去过量的水和缓冲剂，从而减少在线浓缩下游的上样至一个或多个层析柱的体积。

在一些实施方案中，结合和洗脱层析装置包括至少两个分离单元，每个单元包含相同的层析介质，例如，蛋白A亲和介质。在一个具体的实施方案中，蛋白A介质包含偶联至刚性亲水性聚乙烯醚聚合物基质的蛋白A配体。在其它实施方案中，蛋白A配体可与琼脂糖或受控多孔玻璃偶联。蛋白A配体可基于来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的天然存在的结构域，或者是天然存在的结构域的变体或片段。在一个具体的实施方案中，蛋白A配体源自金黄色葡萄球菌蛋白A的C结构域。分离单元串联连接以使彼此流体连通(connected to be in fluid communication with each other in series)，使得液体可以从一个分离单元流动到下一个。

在其它实施方案中，结合和洗脱层析装置包括至少三个分离单元。这些分离单元串联连接以使彼此流体连通，使得液体可以从一个分离单元流动到下一个。在一些实施方案中，结合和洗脱层析装置包括至少四个分离单元，或至少五个分离单元，或至少六个分离单元，其串联连接以使彼此流体连通。

单程切向流过滤(SPTFF)允许以连续模式单程通过过滤器组件的产物的足够浓度，并且因此不需要渗余物(retentate)返回及以分批模式多程通过过滤器。这可以通过经由与多程TFF相比更低的进料通量和/或更长的通道来增加装置中的膜通道中的流体停留时间来实现。其它优点包括能够使用恒定的进料流量和渗余物压力，以及较小的泵和较小的设备占用面积。适用于SPTFF的膜包括标称分子量极限在1-1000kD范围内的超滤膜。例如，可以使用可从MilliporeSigma购得的

在某些实施方案中，SPTFF装置直接位于捕获层析柱诸如蛋白A层析柱的上游。在其它实施方案中，无菌过滤器和/或罐可位于SPTFF装置和捕获层析柱之间。在某些实施方案中，SPTFF装置紧邻收获的细胞培养物澄清单元操作(诸如一个或多个离心机、切向流过滤模块、深度过滤单元或无菌过滤单元)的下游放置。使用SPTFF装置对目的生物分子进行预浓缩减少了从生物反应器到捕获层析步骤的总处理体积，而不改变总处理时间或产物质量流率。

在某些实施方案中，在亲和层析上游包括单程切向流过滤单元减少了必须串联负载以保持所需收率的亲和层析柱的数量。由于体积流率降低，亲和层析介质(例如，含有蛋白A亲和配体)在较低质量负载下以最小穿透达到目标动态结合容量，从而减少了原本需要的柱的数量。在某些实施方案中，仅需要两个串联的亲和层析柱(例如，含有蛋白A亲和配体)。在一些实施方案中，当缓冲容器等用于在柱洗涤、洗脱和清洁过程中收集负载物质时，仅需要单个亲和层析(例如，含有蛋白A亲和配体)柱。

当使用较少的柱时，柱必须在处理过程中较频繁地循环，这使得终端用户更容易实现层析介质的完全寿命和成本。减少循环柱的数量还降低了诸如降低25％的系统压力，并且降低了系统尺寸和复杂性；需要较少的阀和阀切换。

使用单程切向流过滤装置还能够更有效地利用层析树脂，因此在相同的时间内处理相同量的材料所需的树脂较少，从而提高了生产率并降低了成本。体积流率的降低减轻了系统中泵的负担，从而使得较小的系统能够处理更多的产物质量。