公开/公告号CN113166814A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-07-23
原文格式PDF
申请/专利权人 阿雷斯贸易股份有限公司;
申请/专利号CN201980074992.3
申请日2019-06-26
分类号C12Q1/6888(20060101);
代理机构31100 上海专利商标事务所有限公司;
代理人余颖;陈扬扬
地址 瑞士欧博讷
入库时间 2023-06-19 11:55:48
发明领域
本发明涉及生物学系统,更具体地涉及使用基因组和计算机分析用于生物生产生物分子。具体来说涉及特定细胞谱系和细胞库特征鉴定方法,可用于所述方法中的用于扩增的引物和SNP。
背景技术
对制药行业来说重组治疗剂的生产越来越重要。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系是生产重组蛋白最常用的细胞的部分。在制药行业中熟知和常用的其他细胞系例如NS0或SP2/0。这些细胞已经被监管部门重复地批准。它们可以在悬液中容易地培养,且能产生高滴度的人相容性治疗蛋白。
在通过培养细胞重组生产药物的批准之前和之后,卫生部门都要求进行鉴定测试以确认哺乳动物宿主细胞。例如,需要进行鉴定测试以证明所用细胞库在一段时间内是稳定的且没有交叉污染。传统的测试是基于同工酶分析,可以在电泳凝胶上显示物种特异性的迁移模式。这些测试是基于四种不同同工酶在电泳模式中的差异,能够区分人、鼠和仓鼠物种间的差异。然而这些酶学测试需要的试剂可能变得稀少且实施繁琐。其他缺点包括这些测试的灵敏度不足以符合当前大多数可接受的标准。
因此,需要鉴定特定细胞谱系和细胞库表征的可替代的有效方法。
发明内容
在第一方面,本发明公开了一种用于鉴定培养细胞的特定细胞谱系的方法,其包括以下步骤:1)从所述培养重组细胞中分离的核酸分子中确定在所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少5处不同位置,更有利地至少10处不同位置,甚至更有利地至少20处不同位置的多态性或SNP的存在,2)从步骤1)的确定中获得遗传概况(genetic profile),和3)从所述遗传概况中鉴定所述培养细胞的细胞谱系;其中至少5个基因是:阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1),细胞色素b(Cytb),组蛋白脱乙酰酶 1(Hdac1),富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ (Top2b),并且其中重组细胞产生重组蛋白。
在本发明的第二方面,本文所述的是一种分析方法,其包括以下步骤: 1)分析从培养重组细胞中分离的核酸分子以确定所述核酸分子中包含的至少5个基因内至少5处不同位置,更有利地至少10处不同位置,甚至更有利地至少20处不同位置的多态性或SNP的存在,2)从步骤1)分析中获得遗传概况,和3)从所述遗传概况中确定所述培养重组细胞的物种;其中至少5个基因是:阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1),细胞色素 b(Cytb),组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1),富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1) 和拓扑异构酶IIβ(Top2b),并且其中重组细胞产生重组蛋白。
在第三方面,本发明涉及一种用于培养重组细胞的细胞库表征的方法,其包括以下步骤:1)确定从所述培养重组细胞中分离的核酸分子中的至少5 个基因内至少5处不同位置,更有利地至少10处不同位置,甚至更有利地至少20处不同位置的多态性或SNP的存在,2)从步骤1)分析中获得遗传概况,以及3)从所述遗传概况中表征培养重组细胞的细胞库起源,其中至少5个基因是:阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1),细胞色素 b(Cytb),组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1),富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1) 和拓扑异构酶IIβ(Top2b),并且其中重组细胞产生重组蛋白。
发明详述
本文描述的是允许鉴定细胞的特定细胞谱系和细胞库表征的物种特异性单核苷酸(SNP)组合。得益于这些SNP组合,能够简便地在物种间区分 (例如:小鼠、CHO、人等)。
总之,本方法是基于分析动物物种(例如哺乳动物物种)间5个高保守基因序列上发现的SNP的差异,利用PCR(聚合酶链反应)和测序方法。SNP 的差异允许创建一种物种特异性的模式,通过生物信息学软件分析确认细胞系身份并检测其他物种细胞系的任意污染。本方法的多个优点如下:1) 无同工酶分析试剂,2)稳健性(只需要5个不同基因上的5、10或20个SNP);《类似法医》方法),3)灵敏性,4)鉴定潜在污染及5)成本效益的。
表1显示了根据本发明每个物种可以用于检测的5个基因的一些SNP。这五个基因为阿尔古(Argonaute)RISC催化组分1(Ago1),细胞色素b(Cytb),组蛋白脱乙酰酶1(Hdac1),富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子1(Srsf1)和拓扑异构酶IIβ(Top2b)。来源物种的鉴定是由测试样品中至少5个,更有利地至少10个,甚至更有利地至少20个SNP的存在得出的。
就本发明整体而言,如表1所述的任意SNP的组合中选择优选的至少20 个SNP。实际上,发明人表示使用这些SNP能够非常精确地鉴定/表征细胞系/ 细胞谱系。
NGS=例如焦磷酸测序(PyroSequencing)、Solexa-Illumina、固态或离子激流(Solid or Ion Torrent)或牛津纳米孔(Oxford Nanopore)。
实施例
发明内容:该方法涉及培养分析的细胞系(样品)和准备细胞沉淀。从样品中提取出的基因组DNA经历5个不同的PCR反应,分别使用感兴趣的 5个基因各一对特异性引物。这些引物扩增基因中SNP所在的区域。随后,从纯化的PCR产物开始,制备文库以加载到MiSeq(亿明达(Illumina))测序仪上进行测序。然后使用特定的生物信息学流程分析产生的数据,其允许鉴定样品细胞系的来源,以及任何其他物种细胞系的存在。
本方法可用于分析(非限制性示例):
-用于生产重组蛋白的细胞库
-在病毒安全(Viral Safety)检测中使用的细胞系
-用于增殖病毒并在病毒清除验证(Viral Clearance Validation)研究中用作测试系统的细胞系。
-CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞系),ATCC CCL-61,
-MRC-5(人肺成纤维细胞),ATCC CCL-171,
-Sp2/0-Ag14(小鼠,非分泌杂交瘤),ATCC CRL-1581,
-mAb1细胞,表达,Ab1,基于CHO-S,
-mAb2细胞,表达,Ab1,基于Sp2/0-Ag14。
-QiaAmp DNA Blood试剂盒(凯杰公司(Qiagen))
-RNA酶,无DNA酶(罗氏公司(Roche))
-dNTP(生命技术公司(Life Technologies)或同等产品)
-GeneAmp高保真PCR系统(生命技术公司)
-引物(生命技术公司或同等产品):参见表2
-MinElute PCR纯化试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))
-Nextera XT样品制备试剂盒–盒1和盒2(亿明达(Illumina))
-Nextera XT Index试剂盒(亿明达)
-Qubit dsDNA HS测定试剂盒(生命技术公司)
-Agilent高灵敏度DNA试剂盒(安捷伦(Agilent))
-PhiX对照v3(亿明达)
-MiSeq试剂Nano试剂盒v2(300次循环)(亿明达)由以下组成:
·-MiSeq v2试剂试剂盒300次循环–2盒中的盒1
·-MiSeq试剂Nano试剂盒v2–2盒中的盒2
-MiSeq试剂Micro试剂盒v2(300次循环)(亿明达)由以下组成:
·-MiSeq v2试剂试剂盒300次循环–2盒中的盒1
·-MiSeq试剂试剂盒Micro v2–2盒中的盒2
表2,引物
从各种测试培养物中分离待分析的细胞并沉淀。
从悬浮液中获取细胞沉淀:将细胞在培养基中重悬,然后以1000rpm 在+4℃离心10分钟。然后除去上清。如果需要的话,得到的沉淀可以在-80℃最多储存5年。
从贴壁细胞中产生沉淀:当细胞单层达到融合时,用无菌移液管从烧瓶中吸取培养基。然后用PBS清洗单层。去除PBS后,通过轻轻地移动烧瓶几次(例如12-15次)将胰蛋白酶均匀地分布在单层上。一旦细胞单层完全脱离,细胞重悬在培养基中以阻断胰蛋白酶的作用。然后将细胞以1000 rpm在+4℃离心10分钟。去除上清,如果需要的话,得到的沉淀可以在 -80℃最多储存5年。
在进行细胞沉淀制备之前,检验以下接受标准:细胞活力≥80%。如果细胞活力<80%但在50%和79%之间,在烧瓶内继续培养细胞直到细胞活力增加。如果细胞活力低于50%,弃去培养基中的细胞。
使用Qiagen QiaAmp DNA Blood试剂盒按照试剂盒内提供的说明书提取基因组DNA。一旦提取完成,使用NanoDrop方法定量DNA。每个样品进行两次测量,最终浓度为平均结果。NanoDrop上定量能够通过评估260/280 比值验证每个样品的纯度。为了用于后续测试阶段,样品的基因组DNA应遵循以下:260/280比值必须在1.7-2.1之间(含)。如果样品不满足接受标准,则其不能用于后续测试阶段,且基因组DNA提取只能被重复一次。
样品中提取的基因组DNA经历5个不同的PCR反应,分别使用针对5个基因(Ago1、Cytb、Hdac1、Srsf1和Top2b)的各一对特异性引物。这些扩增使用标准方法。应注意,如果是冻干的,引物在超纯水中重悬。每个PCR 反应包含一个阴性扩增对照,由PCR与水混合组成,而不是基因组DNA。另外,每个样品制备两个重复反应。
扩增混合物中的试剂按照以下最终浓度使用:
-10X PCR缓冲液(来自GeneAmp高保真PCR系统试剂盒)1X
-dNTP 0.2mM
-正向引物0.5μM(参见表XX)
-反向引物0.5μM(参见表XX)
-Taq聚合酶(来自GeneAmp高保真PCR系统试剂盒)2单位
-超纯水Qs*(*足量的超纯水,考虑到要加入的基因组DNA的体积,以达到40μL(当使用Applied Biosystems Veriti热循环仪时)或50μL(当使用PE GeneAmp PCR系统9700热循环仪时)的终体积)。
通过琼脂糖凝胶电泳跑样(根据标准方法制备)检验扩增反应。为了继续进入随后的PCR扩增产物纯化阶段,检验以下接受标准:
·阴性扩增对照无条带
·在具有下列分子的同一样品的两次重复中都存在预期的条带
·质量接受标准范围:预期分子量±10%
各物种各基因的预期条带分子量(bp)示于下表中:
如果结果符合接受标准,则该PCR扩增产物可被纯化。如果某一基因不符合样品PCR反应接受标准,则对该基因的样品重新进行PCR反应,并且只进行一次电泳跑样。
在琼脂糖凝胶上检验PCR反应后,用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒纯化剩余体积的扩增产物,如随试剂盒提供的说明书所述。随后用Qubit dsDNA HS测定试剂盒定量PCR纯化产物。
为了继续进入随后的测试阶段,检验以下接受标准:各样品收获的PCR 纯化产物最低浓度必须≥1ng/μL。如果某个基因的样品没有达到最低纯化产物浓度,重复该基因该样品的PCR反应、电泳跑样和纯化操作。
将样品的5个基因的PCR纯化产物混合以制备样品文库。属于不同样品的文库可以加载到单个流动池上,并作为单个集进行分析测序。使用安装在MiSeq系统上的亿明达实验管理(IEM)软件来证实SNP(即那些允许各样品被唯一识别的核苷酸序列)选择的有效性。一旦选择了SNP,按照试剂盒提供的说明书使用亿明达Nextera XT试剂盒制备文库。对于每个样品,将5个基因的每一个PCR纯化产物根据Qubit测量的定量取到1ng/μL浓度。
在进行后续阶段之前,评估产生的文库的质量。这分两步进行:在Qubit 荧光仪上进行分析(以确定浓度)并在Bioanalyzer上进行毛细管电泳分析 (以确定浓度和大小)。在这两种情况下都使用标准方法。随后,按照试剂盒中的说明使用Agilent高灵敏度DNA试剂盒分析1μl文库。
为了用于随后的测试阶段,对每个样品文库检验以下接受标准:
·文库片段的平均大小≥200bp
·文库平均浓度≥2nM
如果满足接受标准,加载流动池并在MiSeq测序仪上运行。如果某个样品产生的文库不遵循这些标准,重复文库制备。
产生的文库加载到Nano或Micro流动池。根据待测样品的数量选择流动池。Nano流动池用于2个样品,而对于Micro流动池样品数为10。按照 MiSeq测序仪中的说明加载文库并运行。
MiSeq测序仪运行参数遵循以下接受标准:
·密度:600和1900K/mm2;
·%Q30:≥65%;
·簇PF:≥70%;
·分相和预分相:<0.3
如果任何参数在接受标准以外,则重复进行测序。
使用MAGNETO生物信息学流程分析MiSeq测序仪运行产生的数据。
在样品产生的基因组序列中,该生物信息学流程寻找表2中所列的5个基因中分布的22个SNP的概况。分析结束时,根据所鉴定的物种特异性概况,本流程产生包含1个或更多表格的报告。这能够确认测试细胞系来源的物种,并评估任何其他物种细胞的交叉污染。
如果在多个测试阶段中出现以下情况,则该测试被认为有效:
·对照(如果有)有效;
·样品遵循接受标准。
各阶段的对照有效性标准和样品接受标准如上所述。
结果分析由评估MAGNETO生物信息学流程鉴定的物种组成。该流程产生的报告包含样品中鉴定的物种的表格如下:
·仓鼠:已鉴定仓鼠物种
·人:已鉴定人物种
·小鼠:已鉴定鼠物种
因此,根据鉴定的物种,报告可能包含1个、2个或3个表格。
在下列情况下,某一样品的测试结果被视为合规的:
·确认了细胞系来源的物种
·无其他物种细胞系污染
因此,MAGNETO流程产生的样品分析报告应该只包含该样品来源的物种表格。
表3:鉴定的示例概况。
在验证中,为了检验该方法鉴定各种物种细胞系的能力进行测试。具体来说,证明特异性是通过检验:
1.该方法确认人、鼠或仓鼠细胞系的来源物种的能力,
2.该方法确认先前使用“细胞系同工酶分析”方法测试的细胞库来源物种的能力。
在第一项检测中(即该方法确认人、鼠或仓鼠细胞系来源物种的能力),使用以下样品评估特异性:
·CHO-Kl,
·MRC-5,
·Sp2-0/Ag14。
以下是特异性检验的结果,给出了每个样品所鉴定的物种
在第二项测试中(即该方法确认先前使用“细胞系同工酶分析”方法测试的细胞库来源物种的能力),使用以下样品评估特异性:
·mAb1细胞(Sp2-0/Ag14),
·mAb2细胞(CHO-S)。
以下是特异性检验的结果,给出了每个样品所鉴定的物种
根据接受标准(参见主要方法部分),在两项测试中获得的检验方法特异性的结果都是有效的,并且符合接受标准,因为所有测试样品的来源物种都得到了证实。基于这些结果,说明该方法是特异性的。
进行测试的目的是检验检测限,意为该方法能够识别的测试物种(人、小鼠和仓鼠)之间污染的最低百分比。为了检验检测限,制备混合了不同百分比的人(MRC-5)、小鼠(SP2/0-Ag14)和仓鼠(CHO-K1)细胞系的细胞沉淀,如下表4所示。
表4
制备样品,在Micro流动池上测序,并与样品一起分析以检验特异性,参见主要方法部分。使用每个混合物的3个不同细胞沉淀进行3次重复测试。
表5
在包含5%或更多污染物种的混合物中,该污染物种在3次测试中重复鉴定3次(100%成功)。基于这些结果,因此可以得出结论,该方法能够以 5%的可检测最低污染限度(LOD)检测3种不同测试物种(人、小鼠和仓鼠) 的细胞系之间的交叉污染。
评估稳健性,意为尽管在一些认为关键的参数中引入了有意的变化,但该方法仍然保持不变的能力。
具体来说,对该方法的每一个实验阶段进行风险分析,以确定稳健性检验的关键阶段。
被认为关键的实验阶段是:
1.PCR,以及通过琼脂糖凝胶电泳和图像分析对结果分析,
2.文库制备
3.在MiSeq测序仪上加载和运行文库。
关于基因组DNA扩增阶段,PCR(反应中Taq聚合酶的量)和琼脂糖凝胶上获得的条带的可视化(不同的凝胶中DNA嵌入剂,和使用不同的仪器进行凝胶获取和分析)条件是变化的。
在文库制备阶段,起始DNA的量是变化的,片段化DNA所需标签化酶的量也是变化的。
最后,关于文库加载阶段和在MiSeq测序仪上的运行,测序由加载在 Nano流动池上的重组细胞库组成的样品,检验该方法稳健性。
在方法验证过程中,通过评估加载在两种不同类型的测序流动池 (Nano或Micro)上样品的结果,也检验了这一阶段的稳健性。具体来说,证明稳健性是通过检验:
1.该方法确认在Nano或Micro流动池上加载并测序的细胞系来源物种的能力。
2.在Nano或Micro流动池上加载并测序的鼠或仓鼠来源样品中,该方法识别LOD水平存在的污染物种的能力。
1.稳健性检验意为该方法确认在Nano或Micro流动池上加载并测序的细胞系来源物种的能力。根据该方法特异性检验(实施例1)所制备并分析的样品结果评估稳健性。所用样品是:
·CHO-K1、MRC-5和Sp2-0/Ag14,在Micro流动池上加载并测序,
·mAb1细胞和mAb2细胞,在Nano流动池上加载并测序。
检验稳健性的接受标准是在Nano和Micro流动池上加载并测序的样品的来源物种都得到确认。以下是在Micro流动池上加载并测序的样品结果:
以下是在Nano流动池上加载并测序的样品结果:
2.稳健性检验意为在Nano或Micro流动池上加载并测序的鼠和仓鼠来源样品中,该方法识别LOD水平存在的污染物种的能力。使用以下样品评估稳健性:
·由95%的CHO-K1细胞和5%(LOD)的Sp2-0/Ag14细胞组成的混合物
·由95%的Sp2-0/Ag14细胞和5%(LOD)的CHO-K1细胞组成的混合物
根据方法检测限检验(见实施例2)测试试验3的结果,评估该方法识别在Micro流动池上加载并测序的样品中以LOD水平存在的污染物种的稳健性。利用同样的样品,评估该方法识别在Nano流动池上加载并测序的样品中以LOD水平存在的污染物种的稳健性。具体来说,在检验限试验的第三次重复的以LOD水平与Sp2-0/Ag14混合的CHO-K1细胞系的样品的文库,以及以LOD水平与CHO-K1混合的Sp2-0/Ag14细胞系的样品的文库加载在Nano流动池上并测序。
以下是在Micro流动池上加载并测序的样品结果:
以下是在Nano流动池上加载并测序的样品结果:
根据接受标准,两种方法的稳健性检验测试(点1和点2)的所有结果都是有效的,且符合这些标准。因此,可以认为该方法相对于被认为对其表现关键的参数是稳健的。
该方法被归类为“杂质的有限检测”。验证的参数为特异性、检测限 (LOD)和稳健性。
-验证性结果显示该方法是特异性的。
-该方法能够以5%的可检测最低污染限度(LOD)检测3种不同测试物种(人、小鼠和仓鼠)的细胞系之间的交叉污染。
-此外,发现该方法相对于被认为对其表现关键的参数是稳健的。
因此,此“通过下一代测序鉴定哺乳动物细胞系”的方法用于确认细胞系的来源物种并评估任何其他物种细胞的交叉污染,应被认为是有效的。它可以有效地取代常规地用于确定细胞系的来源物种的典型的同工酶分析。
序列表
<110> 阿雷斯贸易股份有限公司(Ares Trading S.A.)
<120> 物种鉴定的新方法
<130> P 18-247
<140> EP 18206755.3
<141> 2018-11-16
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 哺乳动物
<400> 1
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<210> 2
<211> 25
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<400> 2
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<211> 25
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机译: 物种鉴定的新方法
机译: 物种鉴定的新方法
机译: 植物种鉴定方法及植物种鉴定装置