技术领域
本发明属于肿瘤标志物医学技术领域，涉及天然核酸的新用途，尤其涉及mecciND1和mecciND5作为肝细胞癌相关的RNA生物标志物及其应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，是全球第三大致死性癌症。亚洲和非洲是世界上发病率最高的国家，仅我国就占亚洲和非洲病例的一半。由于缺乏及早发现和及时治疗，5年生存率低于20％(McGlynn KA等人，2011；Lee S S等人，2012)。
癌症生物标志物的发现为癌症的早期诊断和治疗提供了可能的解决方法。大多数癌症患者被检测出时多是处于癌症晚期阶段，这主要是由于临床诊断缺少敏感的和特异性的生物标志物。RNA生物标记作为一种新兴的生物标记物，具有高灵敏性和特异性的优势(Xi X等人，2017)。大量研究表明，异常的mRNA和非编码RNA在癌症等疾病的发生和发展中起着重要的作用。环状RNA(circRNA)，是一类特殊的非编码RNA，这类RNA的5’端和3’端共价连接在一起，形成一个闭合环状的结构。具有存在广泛、结构稳定、组织特异性高等特点，并在基因表达调控中发挥重要作用。circRNA在肿瘤组织细胞中会出现明显的表达异常现象，这些特征使其在作为新的临床诊断标记物的开发和应用上面更具有优势。
发明内容
目前本领域研究的circRNA大多来源于细胞核。本发明通过对癌症细胞的线粒体RNA进行高通量测序，以及通过生物信息学分析以及实验验证，筛选到一类新型的环状RNA，由线粒体基因组编码产生，为线粒体环状RNA，命名为mecciRNA。通过实时定量PCR检测到两个在肝细胞癌组织样品中显著高表达mecciRNA，分别命名为mecciND1，mecciND5。其中，mecciND1长116bp，位于线粒体的chrM染色体上，ND1 mRNA之内；而mecciND5长154bp，位于线粒体的chrM染色体上，ND5 mRNA之内。
因此，本发明的目的是提供两种线粒体环状RNA(mecciRNA)作为肝细胞癌生物标志物，这两种mecciRNA分别为mecciND1和mecciND5，针对肝细胞癌均具有较高的灵敏度。
本发明的另一个目的是提供特异性扩增mecciND1和mecciND5的引物。
具体地，在一个方面，本发明提供肝细胞癌生物标志物，其为线粒体环状RNA，mecciND1，所述mecciND1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在一个方面，本发明提供检测上述肝细胞癌生物标志物的试剂在用于制备肝细胞癌诊断产品中的用途。
在一个实施方案中，所述产品选自制剂、芯片或试剂盒。
在一个实施方案中，所述肝细胞癌为人来源的。
在一个实施方案中，所述试剂包括特异性扩增所述mecciND1的引物对。在一个实施方案中，所述引物对包括：
如SEQ ID NO.3所示的正向引物序列；和
如SEQ ID NO.4所示的反向引物序列。
在另一个方面，本发明提供肝细胞癌生物标志物，其为线粒体环状RNA，mecciND5，所述mecciND5的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一个方面，本发明提供检测上述肝细胞癌生物标志物的试剂在用于制备肝细胞癌诊断产品中的用途。
在一个实施方案中，所述产品选自制剂、芯片或试剂盒。
在一个实施方案中，所述肝细胞癌为人来源的。
在一个实施方案中，所述试剂包括特异性扩增所述mecciND5的引物对。在一个实施方案中，所述引物对包括：
如SEQ ID NO.5所示的正向引物序列；和
如SEQ ID NO.6所示的反向引物序列。
如本文所用的，术语“表达”用在mecciRNA的表达的上下文中是指mecciRNA从线粒体基因组编码产生。
附图说明
图1.显示线粒体RNA高通量测序及环状RNA分析结果。其中g-circRNA是基因组环状RNA，HeLa是人宫颈癌细胞系，293T是人肾上皮细胞系，PRE-1是人视网膜色素上皮细胞系，HCC是本发明中的肝细胞癌样本。
图2.显示使用mecciND1和mecciND5特异性筛查引物进行PCR(图2a)以及RNaseR消化验证实验(图2b)的PCR结果图。其中，
图3.显示mecciND1(图3a)和mecciND5(图3b)在肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况。
具体实施方式
提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，由商购所得。
组织样品来源：本发明实施例中所用的所有肝细胞癌患者的癌组织及癌旁组织均来自中国科学技术大学第一附属医院。所有操作均已通过中国科学技术大学伦理委员会的审核，患者及其家属已签署知情同意书。伦理审批号为：USTCEC201700007。其中所述癌组织称为HCC。
HeLa是人宫颈癌细胞系，293T是人肾上皮细胞系，PRE-1是人视网膜色素上皮细胞系(均购自ATCC)。
实施例
实施例1.肝细胞癌患者组织的收集
肝细胞癌患者癌组织和癌旁组织在手术切除离体后半个小时内，从这些组织上切取黄豆大小的组织块，用DEPC水冲洗除去残留血液，迅速放入RNAlater中暂时保存。
实施例2.组织细胞的线粒体分离
1)使用预冷的IBliver-1(225mM甘露醇，75mM蔗糖，0.5％BSA，0.5mM EGTA和30mMTris-HCl pH 7.4)清洗实施例1得到的黄豆大小的组织块。
2)在预冷的IBliver-3(225mM甘露醇，75mM蔗糖和30mM Tris-HCl pH 7.4)溶液内使用剪刀将组织块切成小碎片。
3)去除含血的IBliver-3溶液。
4)使用10mL干净的IBliver-1清洗一次。
5)每克组织内加入4mL IBliver-1缓冲液。
6)将上步中添加了缓冲液的组织转移到玻璃组织匀浆器中匀浆，得到匀浆液。
7)将上步匀浆液再使用Dounce homogenizer(Kontes)匀浆40-50个冲程。
8)4℃，转速1000g离心10分钟，离心2次后，去除含细胞核等的沉淀，收集上清细胞匀浆液。
9)4℃，转速12000g，离心10分钟获得含线粒体沉淀，其中在更加偏黄且稳定的线粒体片状沉淀周围存在呈现大且松的白色环状物质，该白色环状物质为含蛋白的糙面内质网。
10)使用IBliver-2轻轻吹洗沉淀直到白色沉淀消失。
11)使用IBliver-2重悬线粒体。
线粒体分离步骤中所述的预冷温度均为4℃。
得到肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织的线粒体。
实施例3.贴壁细胞的线粒体分离
1)细胞刮收集各自在3板15cm培养皿中贴壁培养的HeLa、293T、PRE-1细胞后使用PBS清洗细胞。
2)室温低速离心，使用4℃预冷的IBcell-1(225mM甘露醇，75mM蔗糖，0.1mM EGTA，30mM Tris-HCl pH 7.4)重悬细胞，冰上静置10min。
3)使用Dounce homogenizer(Kontes)匀浆40-50次冲程，制备均质化细胞。
4)4℃，转速1000g离心10分钟，离心2次后，去除含细胞核等的沉淀，收集上清细胞匀浆液。
5)4℃，转速12000g，离心10分钟获得含线粒体沉淀，其中在更加偏黄且稳定的线粒体片状沉淀周围存在呈现大且松的白色环状物质，为含蛋白的糙面内质网。
6)使用IBcell-2(225mM甘露醇，75mM蔗糖，30mM Tris-HCl(pH 7.4)轻轻吹洗沉淀直到白色沉淀消失，吸走上清，留沉淀。
7)IBcell-2重悬线粒体。
得到HeLa、293T、PRE-1的线粒体。该实验所用试剂均经4℃预冷处理。
实施例4.线粒体RNA抽提
1)将实施例2得到的肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织的线粒体和实施例3中得到的HeLa、293T、PRE-1的线粒体用1ml Trizol充分裂解。
2)加入200μl三氯甲烷，充分混合，室温静置2分钟。
3)4℃，转速12000g离心15min，使溶液分层。
4)离心结束后，可见溶液分为三层，上层为含有RNA的澄清水相。
5)小心吸出上层水相至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，放置在-20℃静置30分钟。该步骤可以帮助RNA沉淀，并保持RNA的完整性。
6)4℃，转速12000g离心15分钟，沉淀RNA。
7)加入75％-80％冰乙醇，清洗两遍，4℃，7500g离心5分钟。
8)倒掉乙醇，晾干10分钟。
9)使用promega公司的无RNA酶的DNA酶消化RNA中的基因组DNA，取39.5μl DEPC水溶解的RNA，加入5μl 10X Reaction Buffer，5μl RQ1 RNase-Free DNase I，0.5μl RNaseInhibitor，37℃消化30分钟。
10)加入5μl Stop Solution，70℃，5分钟，使DNase I失活。
11)加入3M醋酸钠(PH 5.2)和无水乙醇，-80℃，沉淀30分钟以上。
12)4℃，12000g离心15分钟，沉淀RNA。
13)加入75％-80％冰乙醇，清洗两遍，4℃，7500g离心5分钟，室温晾干10分钟，加适量DEPC水溶解RNA。
得到肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织的线粒体RNA，以及HeLa、293T、PRE-1细胞的线粒体RNA。
实施例5.组织和贴壁细胞总RNA抽提
1)组织处理：将黄豆大小的肝细胞癌组织和癌旁组织分别加入到两个无RNA酶的1.5mL EP管中，加入200μl的trizol试剂，用电动匀浆器充分研磨，待研磨充分后再加入800μl trizol，震荡混匀(以上操作均在冰上进行)。
贴壁细胞处理：将培养在10cm培养皿上的293T细胞弃掉培养液，PBS缓冲液洗一遍，用1ml Trizol充分裂解并收集到1.5ml EP管中。
2)加入200μl三氯甲烷，充分混合，室温静置2分钟。
3)4℃，转速12000g离心15min，使溶液分层。
4)离心结束后，可见溶液分为三层，上层为含有RNA的澄清水相。
5)小心吸出上层水相至新的EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，放置在-20℃静置30分钟。该步骤可以帮助RNA沉淀，并保持RNA的完整性。
6)4℃，转速12000g离心15分钟，沉淀RNA。
7)加入75％-80％冰乙醇，清洗两遍，4℃，7500g离心5分钟。
8)倒掉乙醇，晾干10分钟。
9)使用promega公司的无RNA酶的DNA酶消化RNA中的基因组DNA，取39.5μl DEPC水溶解的RNA，加入5μl 10X Reaction Buffer，5μl RQ1 RNase-Free DNase I，0.5μl RNaseInhibitor，37℃消化30分钟。
10)加入5μl Stop Solution，70℃，5分钟，使DNase I失活。
11)加入3M醋酸钠(PH 5.2)和无水乙醇，-80℃，沉淀30分钟以上。
12)4℃，12000g离心15分钟，沉淀RNA。
13)加入75％-80％冰乙醇，清洗两遍，4℃，7500g离心5分钟，室温晾干10分钟，加适量DEPC水溶解RNA。
得到肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织的总RNA，以及293T细胞的总RNA。
实施例6.线粒体RNA高通量测序及环状RNA的生物信息学分析
1)测序的材料为本发明实施例4得到的HeLa细胞，293T细胞，RPE-1细胞以及肝细胞癌组织的线粒体RNA。委托北京诺禾致源公司进行高通量测序，建库类型为普通转录组文库，将线粒体RNA进行随机打断建库。测序平台为HiSeq PE150，测序深度为8G clean data。测序数据使用环状RNA分析软件find-circ程进行分析，参考基因组为hg19。
2)实验结果：参见图1结果，通过find-circ软件对测序结果进行生物信息学分析，鉴定出了一类线粒体来源的环状RNA，命名为mecciRNA。而且各个细胞和肝细胞癌组织的线粒体RNA中mecciRNA的富集程度显著高于基因组环状RNA(g-circRNA)。
实施例7.RNaseR消化
1)取5μg实施例5得到的293T细胞的总RNA。
2)加入0.5μl epicentre公司的RNaseR(对照组加入等量的DEPC水，称为RNaseR-)，加入5μl 10X RNaseR buffer，加水补齐到50μl。
3)37℃消化45分钟。消化结束后，加入3M醋酸钠(PH 5.2)和无水乙醇，-80℃，沉淀2小时以上。
4)4℃，12000g离心15分钟，沉淀RNA。
5)加入75％-80％冰乙醇，清洗两遍，4℃，7500g离心5分钟，室温晾干10分钟，加适量DEPC水溶解RNA。
RNaseR作为核酸外切酶，会消化总RNA中的线性RNA，而保留环状RNA。
得到RNaseR消化的R+293T细胞的环状RNA，以及未经RNaseR消化的R-293T细胞的总RNA。
实施例8逆转录
1)使用promega公司的逆转录试剂盒，取500ng实施例5得到的肝细胞癌组织和癌旁组织的总RNA、293T细胞的总RNA和实施例7得到的RNaseR消化后的293T细胞的环状RNA和RNaseR-的293T细胞总RNA，加入1μl random primer，用DEPC水补齐至10μl。
2)70℃变性5分钟，冰上放置2分钟。
在上述10μl体系中加入：
混匀后放入PCR仪中，按如下程序进行逆转录：
得到肝细胞癌患者的癌组织和癌旁组织的总cDNA，293T的总cDNA，以及R+293T总环状cDNA和R-293T细胞的总cDNA。
3)得到的cDNA可适当稀释，用于后续的PCR实验。
实施例9.常规PCR
1)取适量DNA模板(模板来源于实施例8逆转录所得的293T的三种cDNA以及使用酚氯仿DNA提取法提取的293T的基因组DNA(gDNA))。
2)
a.使用mecciND1和mecciND5特异的筛查引物对293T的总cDNA和293T的基因组DNA(gDNA)进行PCR(结果如图2a所示)，具体筛查引物如下：
针对mecciND1的收敛引物：
正向引物：ACCTCAACCTAGGCCTCCTA(SEQ ID NO.7)；
反向引物：CATATGAGATTGTTTGGGCT(SEQ ID NO.8)；
其发散性引物：
正向引物：TGAGCATCAAACTCAAACTAC(SEQ ID NO.3)；
反向引物：CTAGGCTAGAGGTGGCTAGAA(SEQ ID NO.4)。
针对mecciND5的收敛引物序列：
正向引物：CTCAACTACCTAACCAACAA(SEQ ID NO.9)；
反向引物：TAAGAAGGCCTAGATAGGGG(SEQ ID NO.10)；
其发散性引物：
正向引物：CATCACACACCGCACAATC(SEQ ID NO.5)；
反向引物：AGAATCCGAGTATGTTGGAG(SEQ ID NO.6)。
b.使用mecciND1和mecciND5对应的上述发散引物序列对R+293T总环状cDNA和R-293T细胞的总cDNA以及293T的基因组DNA(gDNA)和H
收敛引物是能够扩增线性DNA，而发散引物仅能扩增环状RNA。
按以下单位反应体系加样：
3)混匀反应体系混合物，简短离心后放入PCR仪中。
4)按照以下程序进行PCR反应：
5)PCR扩增完成后，将PCR产物从PCR仪中取出。取5-8μl PCR产物进行DNA琼脂糖电泳。
6)电泳完成后，在凝胶成像仪内观察PCR产物条带并存取图像。
实验结果参见图2。
图2a显示了分散引物能够在293T细胞的cDNA中扩增出mecciND1和mecciND5的特异性条带，但在293T细胞的gDNA中没有扩增出这样的条带。cDNA中包含了线性RNA和环状RNA逆转录的cDNA，而gDNA中包含细胞核基因组和核糖体基因组DNA(核糖体基因组DNA虽为环状，但因其太长，约16.6kbp，使用本发明的发散引物在本发明所用的PCR条件下不能扩增出特异性条带)，收敛引物在cDNA和gDNA均能扩增出mecciND1和mecciND5对应的条带，证明了mecciND1和mecciND5对应的线性序列在cDNA和gDNA中均存在，发散引物仅在cDNA中扩增出了相应的条带而在gDNA没有得到相应条带，证明了mecciND1和mecciND5是环状RNA。
图2b显示了使用实施例8得到的R+293T总环状cDNA和R-293T细胞的总cDNA作为模板的PCR结果(以293T基因组DNA和H
实施例10.实时定量PCR
1)使用实施例8得到的肝细胞癌患者的癌组织或癌旁组织的总cDNA作为本实施例实时定量PCR的总cDNA模板使用promega公司的
2)将所述实时PCR体系混匀，简短离心后，向Piko PCR Plate的每个孔中加入15μl实时PCR体系，每3个孔为一个重复实验。
3)用热封膜将Piko PCR Plate封好，离心，上机。
4)按如下程序运行实时PCR：
荧光数据采集
其中
针对18S rRNA基因的引物序列为：
正向引物F：CGGCGACGACCCATTCGAAC(SEQ ID NO.11)，
反向引物R：GAATCGAACCCTGATTCCCCGTC(SEQ ID NO.12)；
针对mecciND1基因的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；
针对mecciND5基因的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
5)数据分析：使用pikoreal software 2.2软件分析数据，使用核糖体RNA，18SrRNA作为内参，分别用肿瘤组和癌旁组采集到的CT值减去18S rRNA的CT值，得出的差值Δ1和Δ2，然后分别计算2
6)实验结果：参见图3结果，与癌旁正常肝组织比，肝细胞癌组织中mecciND1和mecciND5的表达显著上升，mecciND1在4/5的肝细胞癌组织中出现高表达特征，其表达量最高能达到癌旁组织的10倍左右，而mecciND5在一半以上的肝细胞癌组织中出现高表达特征，其表达量最高能达到癌旁组织的8倍左右。
如此明显的表达差异展现了mecciND1和mecciND5可以作为肝细胞癌生物标志物的应用前景。
机译： 癌前病变肝细胞癌的早期诊断生物标志物及其应用
机译： 癌前病变肝细胞癌的早期诊断生物标志物及其应用
机译： 生物标志物在肝细胞癌治疗方法中的用途
