伊枯草素家族脂肽在防治害虫中的应用

摘要

本发明公开伊枯草素家族脂肽在防治害虫中的应用，涉及害虫控制技术领域；本发明公开了伊枯草素家族脂肽在害虫防治中的新应用，经过实验证明，伊枯草素家族化合物对同翅目昆虫与鞘翅目昆虫的杀虫活性非常明显，24小时杀虫效果可达90％以上，可以应用于农业害虫的防治中。

说明书

技术领域

本发明涉及害虫控制技术领域，特别是涉及伊枯草素家族脂肽在防治害虫中的应用。

背景技术

伊枯草素(Iturin)家族化合物是Delcambe和Devignat在1957年从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中分离得到,至今已发现了很多属于Iturins家族中的脂肽,比如Iturin A、B、C、D、E，芽孢菌霉素(bacillomycin)D、F、L以及抗霉枯草菌素(mycosubtilin)等。近期研究发现产生iturins家族脂肽的其他菌种还有类芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌等。Iturins家族都是环七肽与长度为14至17个碳的β-氨基脂肪酸链连接。虽然Iturins家族的脂肽也具有很强的溶血性，但是它们所表现出的生物活性与表面活性素不同。它们对多种酵母和真菌具有很强的体外抗性，但对细菌活性较弱，而没有抗病毒活性。在Iturins家族各种脂肽间不同结构与不同功能的比较发现，自由羧基所处位置及长度对其生物活性有影响，并且随着β-氨基脂肪酸链中碳原子数目增多该活性物质的抗菌活性变强。

害虫防治是农业生产中非常重要的组成部分，随着农业生产方式的转变以及科学技术的进步，害虫防治策略先后经历了农业防治、化学防治、综合防治和绿色防治阶段。随着监测预警技术、精准施药技术、生物防治、物理防治和转基因技术等多种害虫防治技术的不断发展，先后极建了以单个作物生产过程和重大致灾害虫为对象的综合防治技术体系，在保障我国粮食产量与食品安全，推动农业害虫绿色防控方面发挥了关键作用。近年来，受全球气候变化、耕作模式变化、产业结构调整和国际贸易交流带来的生物入侵日趋频繁等多种因素的影响，我国农业害虫的发生种类和为害规律也产生了明显变化，农业害虫防治面临新的挑战。

化学防治是目前应用较为广泛的一种措施，但长期使用化学农药带来的农药残留、生物抗药性等问题日益突出。近年来，随着人们对环境生态和食品安全的日益关注，以生态友好为目的的新农药开发成为必然趋势。鉴于Iturins家族脂肽抑真菌谱广、毒性低、易于生物降解、不会引起过敏反应等诸多优点，适合开发为新型害虫防治药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种伊枯草素家族脂肽在防治害虫中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种伊枯草素家族脂肽作为活性成分在防治害虫中的应用。

进一步的，所述伊枯草素家族脂肽为伊枯草素A、伊枯草素B、伊枯草素C、伊枯草素D、伊枯草素E、芽孢菌霉素D、芽孢菌霉素F、芽孢菌霉素L和抗霉枯草菌素中的一种或多种的混合物。

进一步的，所述害虫为同翅目昆虫或鞘翅目昆虫。

进一步的，所述同翅目昆虫为豆蚜、棉蚜、甘蓝蚜和麦长管蚜中的一种或多种。

进一步的，所述鞘翅目昆虫为白星花金龟、暗黑鳃金龟、铜绿丽金龟和小云斑鳃金龟中的一种或多种。

进一步的，所述应用是将伊枯草素家族脂肽配制成药液后处理植物体或泥土以防治害虫。

本发明还提供一种保护种子及后来形成的植物器官免受害虫侵害的方法，所述方法包括利用所述的伊枯草素家族脂肽处理种子。

进一步的，所述的伊枯草素家族脂肽的质量浓度为0.01-100μg/mL。

进一步的，所述种子用包含所述的伊枯草素家族脂肽的包衣剂进行包衣。

进一步的，所述的包衣剂中还包括成膜剂和粘合剂。

本发明公开了以下技术效果：本发明公开了伊枯草素的新的应用，即在害虫防治中的应用。经过实验证明，伊枯草素对同翅目昆虫或鞘翅目昆虫的杀虫活性非常明显，24小时杀虫效果可达90％以上，可以应用于农业害虫的防治中。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

本发明所使用的材料如无特殊说明，均可由商业途径获得；所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域常规实验方法。

实施例1伊枯草素的制备

1.1解淀粉芽孢杆菌来源的伊枯草素家族脂肽的制备

(1)将解淀粉芽孢杆菌WS-8(保藏号为CGMCC No.11787)菌株进行扩大培养，得到发酵液；

(2)取发酵液离心除去菌体，得到无菌上清液；

(3)在无菌上清液中加入Amberlity XAD-7HP大孔树脂吸附，4℃下摇匀12h。

(4)树脂经过滤收集后，用蒸馏水洗涤3次，再用60％乙醇(体积/体积)洗涤，洗脱液浓缩，得到粗提物。

(5)使用高效液相色谱进一步纯化：流动相A为含0.1％(体积比)三氟乙酸的乙腈，流动相B为含0.1％(体积比)三氟乙酸的超纯水。将上述样品加载到WondaSil C18(4.6mm×150mm)、粒径5μm色谱柱中，以10％～90％乙腈为线性梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长为214nm，柱温为30℃。收集25-30min对应的组分，使用质谱检测(表1)，确认得到伊枯草素。

表1纯化产物的质谱检测结果

实施例2伊枯草素的同翅目昆虫的杀虫效果

将实施例1中制备的伊枯草素用甲醇溶解，配成200μg/mL的母液，再用水将母液稀释成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的药液，以清水处理做对照。豆蚜(Aphis craccivora Koch)杀虫实验使用的蚕豆幼茎、棉蚜(Aphis gossypii)杀虫实验使用的棉花幼茎、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)杀虫实验使用的甘蓝嫩叶、麦长管蚜(Macrosiphum avenae)杀虫实验使用的小麦幼茎均浸泡在上述药液10min后用滤纸吸干水分，取出放在垫有滤纸的培养皿后，加入2mL去离子水保湿，再将平皿用保鲜膜覆盖，扎孔，每12h加1mL水。每个浓度下供试蚜虫各50头，3次重复，用毛笔头挑每种各50头年龄大小相近的蚜虫放在准备好的培养皿上饥饿4h，分别加入上述药液处理过的蚕豆幼茎、棉花幼茎、甘蓝嫩叶、和小麦幼茎，每12h更换一次，于25℃培养箱培养过夜，记录蚜虫的死亡头数，计算不同稀释倍数下蚜虫的死亡率。

测定蚜虫的死亡率：蚕豆蚜处理过夜后，用毛笔头触碰蚜虫，若蚜虫不动则视为死亡，统计并记录死亡的蚜虫头数由表2实施数据结果可以看出，伊枯草素对同翅目昆虫有良好的的防治作用。

表2伊枯草素对同翅目昆虫的防治效果

实施例3伊枯草素的鞘翅目昆虫的杀虫效果

将伊枯草素用甲醇溶解，配成200μg/mL的母液，再用水将母液稀释成5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的药液配制药土，以清水配制药土作为对照。用碎花生作为食料，将容量4L的塑料桶作容器，每桶放置混合均匀药土2L，并加入适量等量的食料拌匀。采用药土法，选取虫体大小一致的白星花金龟(Protaetia brevitarsis)、暗黑鳃金龟(Holotrichiaparallela)、铜绿丽金龟(Anomala corpulenta)、小云斑鳃金龟(Polyphyllagracilicornis)三龄幼虫蛴螬，处理重复3次，在相对湿度为50％～70％、温度为25℃～28℃的环境中保持24小后。每处理每种试虫数量各15头，重复3次。接虫后置于室内常温培养，56h后统计死亡率，如表3所示。

表3伊枯草素对不同鞘翅目幼虫的灭杀作用

实施例4

将伊枯草素用甲醇溶解，配成200μg/mL的母液，再用水将母液稀释成0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的药液浸泡花生，以清水浸泡作为对照。将容量4L的塑料桶作容器，每桶放置混合均匀土壤2L，并加入50粒处理花生拌匀。选取虫体大小一致的暗黑鳃金龟(Holotrichia parallela)三龄幼虫蛴螬，处理重复3次，在相对湿度为50％～70％、温度为25℃～28℃的环境中保持24小后。每处理试虫数量各为15头，重复3次。接虫后置于室内常温培养，56h后统计死亡率及花生完整率，如表4所示。

表4伊枯草素处理种子的杀虫及保护作用

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。