一种用于筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物和方法

摘要

本发明公开了一种用于筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物和方法，涉及分子遗传育种技术领域，以水稻的基因组DNA为模板，采用该引物进行扩增，将扩增出的序列与已知等位基因的参考序列比对，根据Pikm1‑TS的插入或者缺失数量的不同来确定新的Pik等位基因。该方法操作简单、成本低廉，能够高效的筛选出所需要的目的Pik新等位基因。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，具体涉及一种用于筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物和方法。

背景技术

水稻对全球粮食安全具有举足轻重的作用，然而，由真菌稻瘟病菌引起的稻瘟病严重影响水稻的生长和产量。稻瘟病菌因其遗传不稳定性和致病性变异而闻名，由于致病变异频繁，导致单一抗性品种的抗性会在种植3～5年时间后逐渐丧失，使得水稻品种抗性快速下降。而传统的化学农药方法在水稻生产过程中造成额外的成本和环境污染问题。因此，挖掘Pik位点广谱抗性基因，延长这种重要作物的抗病寿命，成为近几十年来研究的重点。从筛选的抗性品种中扩增并测序Pik位点的等位基因，分析结构变异并了解Pik位点的等位基因的分子进化进行探讨，证明Pik位点挖掘广谱抗性基因在抗稻瘟病水稻方面的潜力，避开了传统的化学农药方法在水稻生产过程中造成额外的成本和环境污染问题，为减少稻瘟病对水稻生长和产量造成的危害提供了新的方向。

目前，在水稻11号染色体的抗稻瘟病Pik位点上已经发现了多个等位基因，如Pi1、Pik-m和Pik-s等；研究表明，11号染色体长臂上的串联重复区域的基因在我国水稻产区表现出不同程度抗性。这些抗性基因在南方稻作区表现出优异的抗性，而在北方表现出易感性。挖掘将应用于北方水稻产区的广谱抗病基因是一个重要目标，因为在北方地区培育含有多个抗病基因的品种将延缓这一重要水稻种植区对稻瘟病抗性的丧失。因此，对11号染色体长臂串联重复区的Pik-m基因进行新等位基因挖掘，将有助于鉴定更多可在北方水稻产区应用的抗性等位基因。

目前，常规的新等位基因挖掘的方法包括以下步骤：Pik遗传位点的结构分析，功能性分子标记的开发，基因组的DNA克隆，核苷酸序列比对等；试验过程繁琐、工程量大，操作周期比较长，且引物设计复杂，后续核苷酸不易比对，特异性差异也不明显。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了用于筛选分抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物对和方法，能够高效筛选出所需要的目的Pik位点新等位基因，并降低筛选成本。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种用于筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物，所述引物为：

PikQ1P1-F：ACCCATTGCGAGAGGACCGAGAAA(SEQ ID NO.1)；

PikQ1P1-R：GAATAGGTCTGTGTTGCGAAATCT(SEQ ID NO.2)；

或

PikQ2P2-F：ATTGGACTATGGTGGAGACTGGGC(SEQ ID NO.3)；

PikQ2P2-R：CTAGTTCATGGCTACACCTCTCCC(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的方法，具体包括以下步骤：

S1、提取目标水稻的基因组DNA；

S2、以步骤S1所述基因组DNA为模板，使用PikQ1P1-F、PikQ1P1-R或PikQ2P2-F、PikQ2P2-R进行PCR扩增；

S3、对扩增所得产物进行测序、组装，将组装后的序列与Pik-m的序列进行比对，确定其插入或缺失数量并映射到等位基因的DNA序列。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2所述PCR的扩增条件如下：

反应体系：50μL，100ng模板DNA、0.2μL正向引物和0.2μL反向引物、5μL10×LA Taq缓冲液二、8μL dNTP混合物(各2.5mM)和2.5U Taq酶；

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，68℃退火和延伸5min，35个循环；72℃延伸5min；

更进一步地，所述Taq酶为TaKaRa LA Taq。

本发明第三方面提供了含有上述引物对的检测试剂盒，所述检测试剂盒可用于水稻抗稻瘟病等位基因的区分和筛选。

本发明的有益效果为：采用本发明的引物和方法，能够通过扩增目的基因组判定待测水稻材料的Pik位点的基因型，无需酶切，成本低廉、方便快捷；利用本发明的方法进行水稻分子辅助育种，能够实现子代Pik位点新基因型的准确、高效、快速检测，适于商业化大规模育种中对Pik位点新基因型的大量检测以及对水稻种质资源中新等位基因型的鉴定。

附图说明

图1为实施例2中Pik位点新等位基因与Pik-m基因序列比对示意图；

图2为实施例2中Pik位点等位基因的构建系统发育树。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案进行详细的说明，但是本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1

对Pik位点上含有等位基因Pil、Pik-m和Pik-s的供体水稻的亲本材料进行基因组重测序，根据Pik位点的序列信息设计能特异性扩增Pik位点的引物。

以已知不含Pik位点等位基因的水稻品种的序列为阴性参考序列，如日本晴、9311、珍汕97、明恢63在该区段的序列；以已知含有Pik位点等位基因的水稻品种的序列为阳性参考序列，如谷梅4号、C101A51、75-1-127和Tride-1；对设计出的所有引物进行验证，以此保证该引物只能扩增出抗性品种中的功能性pik的同源物，而不能从阴性参考品种中产生PCR扩增物。

需要说明的时候，引物设计过程中，会出现很多不合适的引物，达不到需要的效果，如：出现引物与目标片段结合不明显，也有存在扩增失败的过程。最终得到两组能区分最多等位基因的引物，其序列如下所示：

正向引物

PikQ1P1-F：ACCCATTGCGAGAGGACCGAGAAA(SEQ ID NO.1)；

反向引物

PikQ1P1-R：GAATAGGTCTGTGTTGCGAAATCT(SEQ ID NO.2)；

或

正向引物

PikQ2P2-F：ATTGGACTATGGTGGAGACTGGGC(SEQ ID NO.3)；

反向引物

PikQ2P2-R：CTAGTTCATGGCTACACCTCTCCC(SEQ ID NO.4)。

实施例2

从114个水稻品种中筛选抗稻瘟病Pik位点的新等位基因，具体包括以下步骤：

(1)使用CTAB法从上述不同品种水稻的叶片中提取其基因组DNA，此为现有技术，在此不再赘述。

(2)对上述步骤提取的DNA分别进行PCR扩增，采用DNA测序分析仪对扩增得到的片段序列进行纯化和测序；为了保证准确性，需要对每个基因组DNA片段都进行三次PCR反应，且每次产物都进行测序，当三次序列结果保持一致时，才是可信的，否则重复上述过程。

上述PCR扩增程序具体如下：

反应体系：50μL，100ng模板DNA、0.2μL PikQ1P1-F和0.2μL PikQ1P1-R、5μL 10×LA Taq bufferⅡ、8μL dNTP混合物(各2.5mM)和2.5U TaKaRa LA Taq(RR02MQ，TaKaRa)；

反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，68℃退火和延伸5min，35个循环；72℃延伸5min。退火温度对引物与模板结合的效率有直接影响，实验证明采用两步扩增法时效果最佳。

(3)将每个等位基因扩增得到的所有片段进行组装，将组装后的序列记为与Pik-m基因的参考序列进行比对，以评估其相似性，对插入、缺失计数并映射到所有等位基因的DNA序列。

使用CLUSTALW进行多序列比对，通过对Pik基因的核苷酸多样性(π)进行了滑动窗口分析(如图1所示)，根据序列中的内含子、外显子以及核苷酸的比对结果，找出Pik新等位基因的差异性，再与Pik-m基因(即图1中A)进行比较分析；图1中，黑盒子表示外显子，白盒子表示内含子，起始密码子和终止密码子分别用ATG和TGA标记，单位刻度表示核苷酸的位置。本实施例从上述114个水稻品种中分离出了7个Pik等位基因，如下表1所示。

由于Pikm2-TS比较保守，Pikm2-TS的等位基因只包括SNPs，而Pikm1-TS有插入或缺失的变化，故采用Pikm1-TS对等位基因进行区分。

另外，使用上述7个新的Pik等位基因序列以及已报道的等位基因序列(Pik-m、Pik-s和Pil)进行分析，使用MEGA6.0软件构建系统发育树，具体如图2所示：A为基于测序结果和参考序列构建7个新的Pik等位基因(包括Pik1和Pik2)基因组序列的系统进化树，B为7个新的Pik等位蛋白(包括Pik1和Pik2)及其参照蛋白序列的系统进化树。

表1

需要指出的是，以上的实施例只是对本发明的解释，并非是对发明的限定，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉科技大学

<120> 一种用于筛选抗稻瘟病Pik位点新等位基因的引物和方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acccattgcg agaggaccga gaaa 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaataggtct gtgttgcgaa atct 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

attggactat ggtggagact gggc 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagttcatg gctacacctc tccc 24