黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法

摘要

本发明涉及中药药物分析技术领域，尤其是涉及一种黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法。黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：采用HPLC‑CAD对供试品溶液进行检测，得到含31个共有特征峰的指纹图谱；所述HPLC‑CAD的检测条件包括：以乙腈为流动相A，以含甲酸的水为流动相B，进行梯度洗脱。本发明建立得到的黄芪药材的指纹图谱中，具有31个共有特征峰，可较为全面的表征黄芪药材的物理化学性质，可全面表征黄芪药材、提取物及单味制剂中的皂苷类和黄酮类等成分，并且该方法专属性强，耐用性好，具有良好的重复性与准确度，能够更好的实现对黄芪药材及其制剂的整体质量控制。

说明书

技术领域

本发明涉及中药药物分析技术领域，尤其是涉及一种黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法。

背景技术

中药所含化学成分复杂、结构多样，具有多组分、多靶点的作用特点，中药指纹图谱可通过对中药化学成分的整体特征的描述，整体、宏观对中药质量进行控制，能较全面的反映出其内含化学成分的种类及数量，是从“整体性”角度出发的一种现代中药质量控制方法，对非单一药物的质量控制具有更加全面的特点。

目前，《中国药典》2020版一部收载了HPLC-UV测定黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、HPLC-ELSD测定黄芪药材中黄芪甲苷的含量测定方法，未收载指纹图谱检测方法。与黄芪指纹图谱相关的研究中，目前建立的黄芪药材指纹图谱均倾向于标示单一成分，主要采用的有HPLC-DAD、HPLC-ELSD、LC-MS等技术方法。其中HPLC-DAD可以检测黄酮类成分，不能很好地检测紫外吸收较弱或无紫外吸收的皂苷类成分；HPLC-ELSD虽然作为通用型检测器，黄酮类成分在ELSD检测器下吸收较弱，基本无吸收，灵敏度不高、重现性差等因素限制了其应用；LC-MS虽然具有较高的灵敏度，但其价格昂贵，大大限制了它的普及及使用。总之，由于黄芪中所含化学成分的复杂多样性及检测方法的局限性，不能全面的评价黄芪药材整体质量。

综上所述，现有技术在针对黄芪药材的指纹图谱测定方法中存在诸多缺陷和不足。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法，以解决现有技术中存在的不能全面评价黄芪药材等的整体质量的技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

采用HPLC-CAD对供试品溶液进行检测，得到含31个共有特征峰的指纹图谱；

所述HPLC-CAD的检测条件包括：

以乙腈为流动相A，以0.05vol.％～0.1vol.％的甲酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱方式包括：0～3min内，流动相A的体积分数为14％～16％；3～5min内，流动相A的体积分数由14％～16％变至16.5％～18％；5～8min内，流动相A的体积分数由16.5％～18％变至19％～21％；8～25min内，流动相A的体积分数由19％～21％变至42％～44％；25～35min内，流动相A的体积分数由42％～44％变至59％～61％；35～45min内，流动相A的体积分数由59％～61％变至97％～99％；45～55min内，流动相A的体积分数为97％～99％。

本发明建立得到的黄芪药材、提取物及单味制剂的指纹图谱中，具有31个共有特征峰，可较为全面的表征黄芪药材、提取物及单味制剂的物理化学性质。本发明的方法建立得到的指纹图谱可全面表征黄芪药材、提取物及单味制剂中的皂苷类和黄酮类等成分，并且该方法专属性强，耐用性好，具有良好的重复性与准确度，能够更好的实现对黄芪药材及其制剂的整体质量控制。

在本发明的具体实施方式中，所述梯度洗脱方式包括：0～3min内，流动相A的体积分数为15％；3～5min内，流动相A的体积分数由15％变至17％；5～8min内，流动相A的体积分数由17％变至20％；8～25min内，流动相A的体积分数由20％变至43％；25～35min内，流动相A的体积分数由43％变至60％；35～45min内，流动相A的体积分数由60％变至98％；45～55min内，流动相A的体积分数为98％。

在本发明的具体实施方式中，所述流动相B为0.1vol.％的甲酸水溶液。

在本发明的具体实施方式中，所述HPLC-CAD采用的色谱柱为C18色谱柱，优选为Agilent ZORBAX SB C18柱。Agilent ZORBAX SB C18柱规格150×4.6mm，3.5μm，缩短了采样的时间，可进一步检测得到更多色谱峰。

在本发明的具体实施方式中，所述检测条件还包括：

色谱柱的柱温为30～45℃；

流动相流速为1～2mL/min；

进样量为5～20μL；

CAD参数包括：漂移管温度为35℃或50℃，气体流速为2.2～2.6L/min。

如在不同实施方式中，所述色谱柱的柱温可以为30℃、35℃、40℃、45℃等等，优选为40℃。

如在不同实施方式中，所述流速可以为1mL/min、1.2mL/min、1.4mL/min、1.5mL/min、1.6mL/min、1.8mL/min、2mL/min等等，优选为1.5mL/min。

如在不同实施方式中，进样量可以为5μL、10μL、15μL、20μL等等，如为10μL。

如在不同实施方式中，CAD参数中，气体流速可以为2.2L/min、2.3L/min、2.4L/min、2.5L/min、2.6L/min等等，如2.4L/min。

在本发明的具体实施方式中，所述检测条件为：

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18柱；

色谱柱的柱温为40℃；

流速为1.5mL/min；

进样量为10μL；

漂移管温度为50℃。

在本发明的具体实施方式中，当待测物质为黄芪药材时，所述供试品溶液的制备方法包括：

(a)以含甲醇的液体作为提取溶剂对待测物质(所述黄芪药材)进行超声提取，收集所述超声提取后的液体，浓缩至干得残渣；

(b)以水复溶所述残渣，过SP825层析柱，分别以水和甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱部位，除溶得到固体，采用甲醇水溶液溶解所述固体得溶液。

对于固体剂型或半固体剂型的黄芪提取物、黄芪单味制剂，其指纹图谱的供试品溶液的制备方法同黄芪药材。具体的包括：以含甲醇的液体作为提取溶剂对所述黄芪药材进行超声提取，收集所述超声提取后的液体，浓缩至干得残渣；以水复溶所述残渣，过SP825层析柱，分别以水和甲醇进行洗脱，收集甲醇洗脱部位，除溶得到固体，采用甲醇水溶液溶解所述固体得溶液。

对于液体剂型的黄芪提取物、黄芪单味制剂，可直接取液体提取物或液体制剂作为供试品溶液进行分析。

在本发明的具体实施方式中，所述黄芪单味制剂包括黄芪注射液、黄芪精、黄芪精口服液、黄芪颗粒、黄芪片、黄芪精颗粒、北芪片中的任一种。其中，黄芪颗粒、黄芪精颗粒、黄芪片、北芪片为固体制剂，黄芪注射液、黄芪精口服液、黄芪精为液体制剂。

下述以黄芪药材为例对供试品溶液的制备条件进行说明：

在本发明的具体实施方式中，所述超声提取的时间为45～120min；所述超声的功率为400～500W，所述超声的频率为38～40kHz。

在本发明的具体实施方式中，所述超声提取的时间为45～60min。

在本发明的具体实施方式中，所述提取溶剂为体积分数为70％～90％的甲醇水溶液。

如在不同实施方式中，所述提取溶剂中甲醇的体积分数可以为70％、75％、80％、85％、90％等等，优选为75％～85％，如80％。

在本发明的具体实施方式中，所述黄芪药材与所述提取溶剂的比例为1g﹕(20～30)mL。

如在不同实施方式中，以1g黄芪药材计，所述提取溶剂的用量可以为20mL、22mL、24mL、25mL、26mL、28mL、30mL等等，优选为24～26mL，如25mL。

在实际操作中，步骤(a)中，采用过滤方式收集所述超声提取后的液体，并用甲醇冲洗滤渣。

在本发明的具体实施方式中，以1g所述黄芪药材计，所述复溶采用的水为2～3mL。

在实际操作中，所述SP825层析柱的规格可以为内径1cm，长10cm，采用常规方式装柱处理即可。

在本发明的具体实施方式中，所述洗脱采用的水与所述复溶采用的水的体积比为(10～15)﹕1；所述洗脱采用的甲醇与所述复溶采用的水的体积比为(10～15)﹕1。进一步的，所述洗脱采用的水与所述复溶采用的水的体积比为(11.5～12.5)﹕1，如为12﹕1；所述洗脱采用的甲醇与所述复溶采用的水的体积比为(11.5～12.5)﹕1，如为12﹕1。

在实际操作中，将样品上样至层析柱后，先以水进行洗脱，再以甲醇进行洗脱。

在本发明的具体实施方式中，步骤(b)中，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为70％～90％。

如在不同实施方式中，所述甲醇水溶液中，甲醇的体积分数可以为70％、75％、80％、85％、90％等等，优选为75％～85％，如80％。

在本发明的具体实施方式中，以1g所述黄芪药材计，步骤(b)中所述甲醇水溶液的用量为2～3mL。

在本发明的具体实施方式中，所述供试品溶液的制备还包括：将所得溶液经微孔滤膜过滤，取续滤液作为所述供试品溶液。

在实际操作中，采用粉末状的黄芪药材进行所述超声提取。进一步的，所述粉末状的黄芪药材为过4号筛的粉末。

在本发明的具体实施方式中，以21号峰为参照峰，所述31个共有特征峰的相对保留时间和相对峰面积分别如下：

1号峰：相对保留时间为0.17～0.19，相对峰面积为0.21～0.94；

2号峰：相对保留时间为0.28～0.30，相对峰面积为0.01～0.19；

3号峰：相对保留时间为0.33～0.35，相对峰面积为0.14～1.86；

4号峰：相对保留时间为0.40～0.42，相对峰面积为0.07～0.47；

5号峰：相对保留时间为0.44～0.46，相对峰面积为0.01～0.13；

6号峰：相对保留时间为0.45～0.47，相对峰面积为0.01～0.09；

7号峰：相对保留时间为0.47～0.49，相对峰面积为0.12～0.86；

8号峰：相对保留时间为0.50～0.52，相对峰面积为0.11～1.17；

9号峰：相对保留时间为0.52～0.54，相对峰面积为0.02～0.17；

10号峰：相对保留时间为0.52～0.54，相对峰面积为0.05～0.82；

11号峰：相对保留时间为0.54～0.56，相对峰面积为0.01～0.12；

12号峰：相对保留时间为0.56～0.58，相对峰面积为0.01～1.97；

13号峰：相对保留时间为0.58～0.60，相对峰面积为0.01～0.79；

14号峰：相对保留时间为0.70～0.72，相对峰面积为0.04～0.30；

15号峰：相对保留时间为0.74～0.76，相对峰面积为0.01～0.25；

16号峰：相对保留时间为0.75～0.77，相对峰面积为0.06～0.19；

17号峰：相对保留时间为0.80～0.82，相对峰面积为0.13～0.63；

18号峰：相对保留时间为0.83～0.85，相对峰面积为0.26～0.50；

19号峰：相对保留时间为0.85～0.87，相对峰面积为0.09～0.40；

20号峰：相对保留时间为0.88～0.90，相对峰面积为0.01～0.12；

21号峰：相对保留时间为1.00，相对峰面积为1.00；

22号峰：相对保留时间为1.04～1.06，相对峰面积为0.06～0.18；

23号峰：相对保留时间为1.17～1.19，相对峰面积为0.01～0.20；

24号峰：相对保留时间为1.19～1.21，相对峰面积为0.01～0.90；

25号峰：相对保留时间为1.30～1.32，相对峰面积为0.16～0.85；

26号峰：相对保留时间为1.45～1.47，相对峰面积为0.01～0.10；

27号峰：相对保留时间为1.52～1.55，相对峰面积为0.03～0.20；

28号峰：相对保留时间为1.53～1.56，相对峰面积为0.10～1.43；

29号峰：相对保留时间为1.59～1.61，相对峰面积为0.22～2.73；

30号峰：相对保留时间为1.64～1.66，相对峰面积为0.08～0.57；

31号峰：相对保留时间为1.65～1.67，相对峰面积为0.04～0.56。

在本发明的具体实施方式中，所述指纹图谱中，1号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，4号峰为芒柄花苷，7号峰为美的紫檀苷，8号峰为黄芪异黄烷苷，15号峰为黄芪甲苷，16号峰为芒柄花素，17号峰为7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷，18号峰为黄芪皂苷Ⅱ，20号峰为异黄芪皂苷Ⅱ，21号峰为黄芪皂苷Ⅰ，22号峰为异黄芪皂苷Ⅰ。

本发明对指纹图谱中的11个共有特征峰对应的化学成分进行了指认，其中皂苷类成分指认5个，黄酮类成分指认6个。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明建立得到的黄芪药材的指纹图谱中，具有31个共有特征峰，可全面表征黄芪药材中的皂苷类和黄酮类等成分；

(2)本发明的方法专属性强，耐用性好，具有良好的重复性与准确度，能够更好的实现对黄芪药材及其制剂的整体质量控制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1测得的黄芪药材的指纹图谱；

图2为本发明实施例2测得的不同黄芪药材的指纹图谱和对照图谱；

图3为本发明不同提取方法对应得到的色谱图；

图4为本发明不同提取溶剂对应得到的色谱图；其中，A-提取溶剂为60vol.％甲醇水溶液，B-提取溶剂为80vol.％甲醇水溶液，C-提取溶剂为纯甲醇；

图5为本发明不同提取时间对应得到的色谱图；其中，A-提取时间45min，B-提取时间60min，C-提取时间120min；

图6为未经SP825层析柱处理的样品以及经SP825层析柱处理的样品得到的色谱图；其中，A-未经SP825层析柱处理，B-经SP825层析柱处理；

图7为本发明实施例7在不同洗脱条件下的色谱图；

图8为比较例1和比较例2分别对应得到的色谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

具体实施方式中的对精密度、重复性、稳定性等项目的验证，按照现行版《中华人民共和国药典》附录中有关的指导原则进行方法学验证。

本发明具体实施例中采用的材料、仪器及试剂等信息可以如下：

材料：黄芪药材样品购自不同产地，经鉴定为蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.Mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根，具体黄芪药材样品来源信息见下表1：

表1 黄芪药材样品来源信息表

仪器：Thermo U3000高效液相色谱仪(Corona Veo型CAD电喷雾检测器)，MettlerToledo XSE205DU电子分析天平(Mettler Toledo,瑞士)；数控超声清洗机(KQ-500DE型，昆山超声仪器有限公司)；Milli-Q纯水机(Millipore,美国)。

试剂：乙腈(色谱纯，默克，美国)；甲醇(色谱纯，默克，美国)；其它化学试剂为分析纯；

毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201606，纯度97.6％，中国食品药品检定研究院)、黄芪甲苷(批号：110781-201717，纯度96.9％，中国食品药品检定研究院)、芒柄花素(批号：3523，纯度98.2％，施丹德生物科技有限公司)、7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷(批号：Y31D10H107318，纯度98％，上海源叶生物科技有限公司)、黄芪皂苷Ⅰ(批号：6107，纯度99.0％，施丹德生物科技有限公司)、黄芪皂苷Ⅱ(批号：3258，纯度100.0％，施丹德生物科技有限公司)、美的紫檀苷(批号：P21N9F75533，纯度98％，上海源叶生物科技有限公司)、芒柄花苷(批号：PS000671，纯度：98％，成都普斯生物科技有限公司)、黄芪异黄烷苷(批号：P31D10F107320，纯度：98％，上海源叶生物科技有限公司)、异黄芪皂苷Ⅰ(批号：PS020461，纯度：98％，成都普斯生物科技有限公司)、异黄芪皂苷Ⅱ(批号：PS001047，纯度：98％，成都普斯生物科技有限公司)。

实施例1

本实施例提供了黄芪药材的指纹图谱的建立方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、芒柄花素和7,2’-二羟基-3’,4’-二甲氧基异黄烷、美的紫檀苷、芒柄花苷、黄芪异黄烷苷、异黄芪皂苷Ⅰ、异黄芪皂苷Ⅱ各对照品适量，精密称定，分别以80vol.％甲醇水溶液配制成每1mL中含有各对照品0.1mg的对照品溶液，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，即可。

(2)供试品溶液的制备

精密称取S1黄芪药材粉末2g(过4号筛)，置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入80vol.％甲醇水溶液50mL，超声提取1小时，滤过，滤渣以甲醇20mL冲洗，回收滤液，蒸干，残渣以纯水5mL复溶，加入已处理好的SP825柱(内径1cm，长10cm)上，以纯水和甲醇各60mL进行洗脱，分别收集洗脱液，蒸干，将甲醇洗脱部位以80vol.％甲醇水溶液溶解并定容至5mL量瓶中，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

(3)检测条件

色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；

柱温：40℃；

流速：1.5mL/min；

流动相：乙腈(A)-0.1vol.％甲酸水(B)；梯度洗脱，洗脱条件(体积分数)：0～3min，15％A；3～5min，15％→17％A；5～8min，17％→20％A；8～25min，20％→43％A；25～35min，43％→60％A；35～45min，60％→98％A；45～55min，98％A；

进样量：10μL；

CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速2.4L/min。

(4)检测步骤

分别精密量取所述对照品溶液和所述供试品溶液各10μL，分别进样，按照步骤(3)的检测条件进行检测，记录色谱图。本实施例测得的指纹图谱如图1所示。

实施例2

本实施例参考实施例1的方法，分别对表1中记载的其余22批黄芪药材进行检测，得到22个指纹图谱。

将22个指纹图谱与实施例1得到的指纹图谱一并导入“中药指纹图谱相似度评价软件”，合成对照图谱。

图2为23批黄芪药材的指纹图谱以及对照图谱R。

实施例3

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：供试品溶液的制备方法中，提取方法不同。

本实施例的供试品溶液的制备方法如下：

精密称取黄芪药材粉末2g(过4号筛)，置于100mL具塞锥形瓶中，精密加入80vol.％甲醇水溶液50mL，加热回流提取2h，滤过，滤渣以甲醇20mL冲洗，回收滤液，蒸干，残渣以纯水5mL复溶，加入已处理好的SP825柱(内径1cm，长10cm)上，以纯水和甲醇各60mL进行洗脱，分别收集洗脱液，蒸干，将甲醇洗脱部位以80vol.％甲醇水溶液溶解并定容至5mL量瓶中，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

本实施例的供试品溶液与实施例1对应的色谱图分别如图3中所示。

采用超声提取和回流提取时，色谱图中各峰响应值及分离度无显著差别，基于方法简便及节省时间进行考虑，可选择超声提取方法进行提取。

实施例4

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：供试品溶液的制备方法中，提取溶剂不同。本实施例的提取溶剂为60vol.％甲醇水溶液。

本实施例的供试品溶液对应的色谱图如图4中的A所示。

实施例5

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：供试品溶液的制备方法中，提取溶剂不同。本实施例的提取溶剂为纯甲醇。

本实施例的供试品溶液对应的色谱图如图4中的C所示。

根据图4，通过对比不同提取溶剂提取样品峰个数及各峰分离度，80vol.％甲醇水溶液作为提取溶剂时，峰个数较多，分离度较好，因此，选择80vol.％甲醇为提取溶剂。

实施例6

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：供试品溶液的制备方法中，提取时间不同。本实施例的超声提取时间为45min。

本实施例的供试品溶液对应的色谱图如图5中的A所示。

实施例7

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：供试品溶液的制备方法中，提取时间不同。本实施例的超声提取时间为120min。

本实施例的供试品溶液对应的色谱图如图5中的C所示。

根据图5可知，采用不同提取时间提取的样品，色谱图中峰个数及分离度无显著性差别，因此，可选择超声60min作为提取时间。

实施例8

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：供试品溶液的制备方法不同，本实施例中供试品溶液的制备未采用SP825层析柱对样品进行纯化。

本实施例的供试品溶液的制备方法中，在参考实施例1得到残渣后直接以80vol.％甲醇水溶液溶解并定容至5mL量瓶中，摇匀，以0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

本实施例的供试品溶液对应的色谱图如图6中的A所示。

根据图6可知，黄芪药材过SP825层析柱前后色谱图无显著变化，但经过层析柱纯化后的样品个别色谱峰相应值更高，因此，采用SP825层析柱对样品进行纯化。

实施例9

本实施例参考实施例1的方法，区别仅在于：色谱检测条件不同。

本实施例的色谱检测条件如下：

色谱柱：Agilent SB-C18(150mm×4.6mm，3.5μm)；

柱温：35℃；

流速：1.0mL/min；

流动相：0.05vol.％甲酸乙腈(A)-0.05vol.％甲酸水(B)；

梯度洗脱条件(体积分数)：0～3min，20％A；3～8min，20％A→25％A；8～18min，25％A→36％A；18～38min，36％A→43％A；

进样量：20μL；

CAD参数：漂移管温度50℃，气体流速50psi/min。

本实施例的供试品溶液对应的色谱图如图7所示。本实施例的色谱图相较于实施例1的色谱图的色谱峰个数少，不能更全面的反应黄芪药材中的化学成分。图7中，1号峰为毛蕊异黄酮葡萄糖苷，2号峰为黄芪甲苷，3号峰为芒柄花素，4号峰为7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷，5号峰为黄芪皂苷Ⅱ，6号峰为黄芪皂苷Ⅰ。

比较例1

比较例1采用HPLC-UV方法对按照实施例1的方法制得的供试品溶液进行检测，记录色谱图，如图8所示。

其中，HPLC-UV方法的条件为：紫外检测波长254nm，其他色谱条件参考实施例1的方法。

比较例2

比较例2采用HPLC-ELSD方法对按照实施例1的方法制得的供试品溶液进行检测，记录色谱图，如图8所示。

其中，HPLC-ELSD方法的条件为：HPLC-ELSD漂移管温度70℃，载气流量1.5L·min

本发明的方法相较于HPLC-ELSD及HPLC-UV具有更高的灵敏度以及更多的色谱峰。

实验例1

方法学考察

精密度实验：制备一份S12号黄芪药材供试品溶液，按实施例1的方法连续进样6次，计算31个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值。

重复性实验：精密称取S12号黄芪样品6份，按实施例1的方法制备供试品溶液，按实施例1的色谱条件测定。以31个共有峰的相对保留时间及相对峰面积计算RSD值。

稳定性实验：取S12号黄芪药材，按实施例1中的方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、36h后进样分析。计算31个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值。

方法学考察结果如下：

精密度实验：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，计算31个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果31个共有峰的相对保留时间RSD均小于1.0％，相对峰面积的RSD值均小于5.0％，表明仪器精密度良好，具体结果见表2、表3。

重复性实验：精密吸取供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，重复6份样品，计算31个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果31个共有峰的相对保留时间RSD均小于1.0％，相对峰面积的RSD值均小于5.0％，表明本法重复性良好，具体结果见表2、表3。

稳定性实验：取S12号黄芪药材，按实施例1中的方法制备供试品溶液，分别于0、4、8、12、24、36h后进样分析，计算31个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD值，结果31个共有峰的相对保留时间RSD均小于1.0％，相对峰面积的RSD值均小于5.0％，表明本法重复性良好，具体结果见表2、表3。

表2 方法学验证共有峰相对保留时间结果(n＝6)

表3 方法学验证共有峰相对峰面积结果(n＝6)

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。