一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽及其制备方法

摘要

本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽及其制备方法。本发明的牦牛骨肽的制备方法包括如下步骤：牦牛骨预处理、两步酶解法、酶解产物超滤、多肽粗液凝胶层析、反相高效液相色谱分离纯化。该方法制得的牦牛骨肽的小分子肽含量高；水溶性好，易被人体吸收，无不良气味，食用安全；具有很强的DPP‑IV抑制活性、降血糖活性，抗氧化能力强，可应用于食品工业、制药工业、饲料工业等。

说明书

技术领域

本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽及其制备方法。

背景技术

牦牛骨肽所蕴含的人体必需氨基酸，人体中共有8种氨基酸不能自身合成，必须依赖于外源性的补充，否则生命就不能得到健康的延续。牦牛骨肽内恰恰含有这几种必须氨基酸。通过肽的载体作用与特有的参与全身代谢的生理功能，牦牛骨肽在提高免疫力、辅助特殊病人强壮身体、强健骨骼、针对胶原病变均有很好的营养食疗作用。

近年来，许多研究者从不同的原料中分离纯化出多种活性肽。由于活性肽具有较高的特异性和效价，以及较低的毒性，在长期服用的治疗中极具潜力。降血糖和抗氧化肽是活性肽中的一种，它能够降低高血糖患者的血糖，且对正常血糖的人无影响，此外较强的抗氧化能力在食品和化妆品领域也有很好的应用前景。现有的研究有CN105624251B《一种牡丹籽降血糖肽及其纯化方法和应用》采用超声搅拌提取蛋白，使用胰蛋白酶超声辅助酶解即可得到牡丹籽降血糖肽。CN102428832A《一种具有降血糖功效的真菌药性菌质及其制备方法》选用具有降血糖功效的药性基质和真菌菌种作为双向发酵获得具有明显的降低血糖又不增加胰岛素浓度的作用的药性菌质。CN109336953A《一种苦荞抗氧化肽及其制备方法和应用》以苦荞粉为原料制备苦荞清蛋白粉末，然后将苦荞清蛋白粉末进行酶解得到苦荞清蛋白酶解肽，苦荞清蛋白酶解肽经分离纯化得到苦荞抗氧化肽。CN105748426A《一种松子源抗氧化肽肠道定位释放片及其制备方法》以分子量小于1000Da的松子源抗氧化肽冻干粉为原料进行高压脉冲电场处理，提高其抗氧化活性，并制成松子源抗氧化肽冻干粉，通过赋形、制粒、混合、压片等操作制备松子源抗氧化肽肽片。然而从牦牛骨中分离纯化得到的肽既有降血糖功能又有抗氧化功能，是一种双功能肽。它不仅能够降低牦牛骨的浪费率，同时增加了牦牛骨的附加值，增加牦牛骨的经济价值。

畜禽骨经酶解后生成的小分子肽有利于人体的消化吸收，还具有功能特性。由此开发骨蛋白制品和功能性食品，不仅可以产生很高的经济效益，同时解决了资源浪费和环境污染的问题，形成一个健康、持续发展的产业。

牦牛骨中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分。这些都对具有特定功能的牛骨肽的开发造成较大困难。现有技术中的牦牛骨肽很多并不具有特定的功能，同时具有较好的降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽更是甚少。

发明内容

本发明的目的是提供一种牦牛骨肽，该牦牛骨肽同时具有降血糖和抗氧化的功能。本发明的另一目的是提供该牦牛骨肽的制备方法。

本发明以开发同时具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽为研究目标，针对牦牛骨的原料特性和成分组成特点，开发以牦牛骨为原料生产具有降血糖和抗氧化功能的制备工艺。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示具有DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽。

具体地，本发明提供具有DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨肽，其氨基酸序列为PYPYEPYEPYPY的肽。

第二方面，本发明提供DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法，通过以下方法制备得到：以牦牛骨为原料，经破碎，100-125℃蒸煮3-4小时，获得牦牛骨蛋白液，，所述牦牛骨蛋白液经两步酶解：第一步中性蛋白酶酶解，和第二步复合蛋白酶酶解获取降血压肽酶解液，高温灭活，离心并超滤所述降血压肽酶解液，得牦牛骨蛋白肽粗品；其中，所述复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶，二者质量比例(2-4):1。

所述中性蛋白酶的酶活为：300,000-550,000U/g；所述胰蛋白酶的酶活为：300,000-500,000U/g；所述和风味蛋白酶的酶活为：150,000-200,000U/g。

在本发明提供的制备方法中，所述原料经破碎后，于100-125℃蒸煮3-4小时。

在本发明提供的制备方法中，不调节pH值，两步酶解时第一步酶解反应的温度为50～65℃，中性蛋白酶添加量为0.2～0.5wt％，反应时间为1.75～2.25h；第二步酶解反应的温度为55～65℃，复合蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶用量比例是2-4:1)添加量为0.2～0.5wt％，反应时间为1.0～2.0h；两步酶解完成后，高温灭活的温度为95～105℃，时间为15～20min。

在本发明提供的制备方法中，经灭活后的DPP-IV抑制活性和抗氧化功能肽酶解液，在8000～10000rpm转速下离心10～20min后，使用3000Da以下的超滤膜过滤。

本发明提供的制备方法中，SephadexG-25凝胶柱进行分离时，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；反相高效液相色谱分离纯化时，检测波长为220nm，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9～12min中的肽洗脱液。

作为本发明的优选方案，所述牦牛骨肽的制备方法包括如下步骤：

(1)预处理，牦牛骨破碎后，在100-125℃条件下蒸煮3-4小时，获得牦牛骨蛋白液；

(2)两步酶解法，加入占蛋白重量0.3wt％的中性蛋白酶，55℃下酶解2h，向第一步酶解反应产物中加入0.3wt％复合蛋白酶55℃下酶解2h，100℃灭酶15min；

(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(8000r,4℃,15min)，超滤膜为截留分子量为3000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；

(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm；

(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到IC

(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性最高的组分进行结构和序列的鉴定。

本发明还提供一种功能性多肽，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明通过实验验证，如SEQ ID NO.1-3任一所示的功能性多肽具有较好的降低血糖和抗氧化功能。

本发明还提供所述牦牛骨肽或所述功能性多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。

优先地，所述药品或所述食品具有抑制DPP-IV活性和抗氧化功能的功能。

本发明还提供含有所述牦牛骨肽或所述功能性多肽的药品、食品或食品添加剂。

所述药品、食品或食品添加剂除含有所述牦牛骨肽或所述功能性多肽外，还可含有药品或食品领域允许的辅料。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明所述制备方法所用原料为骨料废弃物牦牛骨，在高原地区产量高。

(2)本发明所述制备方法采用双酶法对牦牛骨进行酶解，酶解效果好，能有效地将牦牛骨蛋白酶解成抑制DPP-IV活性和抗氧化功能的肽。

(3)本发明所述牦牛骨DPP-IV活性和抗氧化功能肽食用安全性高，在体外具有很强的DPP-IV抑制活性外，还具有很强的体内降血糖活性，对自C57小鼠没有副作用。

(4)在HepG2细胞氧化损伤的保护实验中，首先确定了肽PYPYEPYEPYPY对HepG2细胞氧化损伤模型有保护作用。

(5)本发明所述牦牛骨肽可应用食品工业、制药工业、饲料工业等；本发明的制备方法操作简单，便于工业化生产。

附图说明

图1为降血糖和抗氧化和抗氧化肽段初次柱层析纯化的色谱图。

图2为降血糖和抗氧化肽段反相液相纯化的色谱图。

图3为降血糖和抗氧化肽段纯品的质谱图。

图4为降血糖和抗氧化肽段对自小鼠的降血糖效应。Sitagliptin(西格列汀)和Metformin(二甲双胍)为阳性对照组，Control为空白对照组，PY-12为肽样品组。

图5为降血糖和抗氧化肽段在HePG2细胞中的抗氧化作用。

A:浓度为10-600μM的肽对细胞的细胞毒性。B：多肽对受损细胞的保护作用。肽对细胞内ROS含量的影响。D:HepG-2细胞荧光图像。不同字母表示肽活性存在显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明实施例所用的复合蛋白酶为胰蛋白酶(酶活为：300,000-500,000U/g)和风味蛋白酶(酶活为：150,000-200,000U/g)的组合，二者的质量比为(2-4):1。

实施例1具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法(1)

本实施例提供一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法，具体如下：

(1)预处理，200g牦牛骨破碎，110℃蒸煮4小时；

(2)两步酶解法，加入占牦牛骨重量0.3wt％的中性蛋白酶，55℃下酶解2h，向第一步酶解反应产物中加入牦牛骨0.3wt％复合蛋白酶(胰蛋白酶为牦牛骨0.2wt％和风味蛋白酶为牦牛骨0.1wt％)55℃下酶解2h，100℃灭酶15min；

(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(8000r,4℃，15min)，超滤膜为截留分子量为3000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；

(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰。柱层析纯化的质谱图见图1；

(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到IC

(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性IC

实施例2具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法(2)

本实施例提供一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法，具体如下：

(1)预处理，600g牦牛骨破碎，120℃蒸煮3.5小时；

(2)两步酶解法，加入占牦牛骨重量0.4wt％的中性蛋白酶，60℃下酶解2.2h，向第一步酶解反应产物中加入牦牛骨0.4wt％复合蛋白酶(胰蛋白酶为牦牛骨0.3wt％和风味蛋白酶为牦牛骨0.1wt％)60℃下酶解2h，100℃灭酶15min；

(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(9000r,4℃,15min)，超滤膜为截留分子量为2000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；

(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；

(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到的功能性最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化，分离条件：进样体积，100μL；流速，1mL/min；洗脱液，A液:0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.1％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0～10min,0～5％B；10～20min,5％～19％B；20～29min,19％～90％B；29～40min,90％～0％B；柱温：35℃；检测波长，220nm，收获9～12min收集得到的的肽液；色谱图与图2类似。

(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性IC

实施例3具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法(3)

本实施例提供一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽的制备方法，具体如下：

(1)预处理，1000g牦牛骨破碎，125℃蒸煮3小时；

(2)两步酶解法，加入占牦牛骨重量0.5wt％的中性蛋白酶，65℃下酶解2.2h，向第一步酶解反应产物中加入牦牛骨0.5wt％复合蛋白酶(胰蛋白酶为牦牛骨0.4wt％和风味蛋白酶为牦牛骨0.1wt％)60℃下酶解2h，100℃灭酶15min；

(3)超滤，将灭活后的肽酶解液离心(10000r,4℃,20min)，超滤膜为截留分子量为2000Da以下的超滤膜，得到多肽粗液，浓缩、冻干；

(4)凝胶层析，冻干后的粉末配成溶液选用Sephadex G-25凝胶柱进行分离，分离条件为：玻璃柱(1.5cm×100cm)，上样浓度为200mg/mL，上样量400μL，流速为60mL/h，灵敏度为1.0，吸光度为220nm，收集第2个洗脱峰；

(5)反相高效液相色谱分离，将凝胶层析分离得到的功能性最强的组分溶于水中，配成蛋白浓度1mg/mL的溶液用反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分离纯化，分离条件：进样体积，100μL；流速，1mL/min；洗脱液，A液:0.1％TFA(三氟乙酸)水溶液；B液:0.1％TFA乙睛溶液；线性洗脱梯度，0～10min,0～5％B；10～20min,5％～19％B；20～29min,19％～90％B；29～40min,90％～0％B；柱温：35℃；检测波长，220nm，收获9～12min收集得到的肽液；色谱图与图2类似。

(6)质谱测序，分离纯化结束后用ESI-MS-MS和MALDI-TOF-MS对活性最高的组分进行结构和序列的鉴定；经过质谱的鉴定后，分析得肽纯品的序列为Pro-Tyr-Pro-Tyr-Glu-Pro-Tyr-Glu-Pro-Tyr-Pro-Tyr。根据凝胶色谱峰G2面积与总峰面积之比，以及RP-HPLC峰F5面积与总峰面积之比，粗略估算出该肽的PYPYEPYEPYPY含量为0.18％。

实验例1牦牛骨肽对二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制活性检测

试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨肽。DPP-IV抑制能力按照如下方法进行：

1、牦牛骨肽PYPYEPYEPYPY

用DPP-IV抑制剂筛选试剂盒(MAK203，sigma)按照制造商的说明书进行检测，西他列汀(sitagliptin)为阳性对照。

(1)样品制备：配制4×的肽水溶液，用DPP-IV分析缓冲液将样品稀释4倍至最终测试浓度，吸取25μL加入96孔板中。样品来源于实施例1、2、3所得到的氨基酸序列为PYPYEPYEPYPY的牦牛骨肽(溶于双蒸水)

(2)抑制反应液：将DPP-IV酶与DPP-IV分析缓冲液按体积比1:49稀释。反应体系中每孔加50μL，吹打混匀后37℃孵育10min。空白组加入50μL DPP-IV分析缓冲液。

(3)酶反应液：DPP-IV底物DPP-IV分析缓冲液与按体积比2:23稀释。孵育完成后反应体系中每孔加入25μL，吹打混匀后检测荧光值。用Bioeksynergy2(BioTek，美国)360nm的激发波长和460nm的发射波长记录荧光强度，每分钟测量一次，连续检测30min。

(4)结果计算：在结果图的线性范围内选择两个时间点(T1和T2)，测定荧光值(FLU1和FLU2)，并用此确定图的斜率(Δflu/minute)。

Slope＝(FLU2–FLU1)/(T2–T1)＝ΔFLU/minute

抑制率＝(SlopeEC–SlopeSM)/SlopeEC×100％

其中，SlopeSM为样品的斜率；SlopeEC为对照的斜率

结果分析：

实施例1所得序列为PYPYEPYEPYPY的牦牛骨肽对DPP-IV抑制有较高的活性其IC

2、多肽粗液冻干粉的DPP-IV抑制效果

用DPP-IV抑制剂筛选试剂盒(MAK203，sigma)按照制造商的说明书进行检测，西他列汀(sitagliptin)为阳性对照。

(1)样品制备：配制4×的肽水溶液，用DPP-IV分析缓冲液将样品稀释4倍至最终测试浓度，吸取25μL加入96孔板中。样品溶液来源于实施例1、2、3步骤(3)超滤后得到的多肽粗液的冻干粉(溶于双蒸水)

(2)抑制反应液：将DPP-IV酶与DPP-IV分析缓冲液按体积比1:49稀释。反应体系中每孔加50μL，吹打混匀后37℃孵育10min。空白组加入50μL DPP-IV分析缓冲液。

(3)酶反应液：DPP-IV底物DPP-IV分析缓冲液与按体积比2:23稀释。孵育完成后反应体系中每孔加入25μL，吹打混匀后检测荧光值。用Bioeksynergy2(BioTek，美国)360nm的激发波长和460nm的发射波长记录荧光强度，每分钟测量一次，连续检测30min。

(4)结果计算：在结果图的线性范围内选择两个时间点(T1和T2)，测定荧光值(FLU1和FLU2)，并用此确定图的斜率(Δflu/minute)。

Slope＝(FLU2–FLU1)/(T2–T1)＝ΔFLU/minute

抑制率＝(SlopeEC–SlopeSM)/SlopeEC*100％

其中，SlopeSM为样品的斜率；SlopeEC为对照的斜率

结果分析：

实施例1的步骤(3)所得粗肽溶液对DPP-IV抑制有较高的活性其IC

(注：因为粗肽溶液无法得知分子量大小，所以只能用单位mg/mL表示，而肽PYPYEPYEPYPY知道其分子量大小所以可以用单位μM表示)

实验例2降血糖和抗氧化肽动物降血糖实验

试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨肽。

从北京维通利华实验动物技术有限公司(中国)购买了20只雌性小鼠(18～20g)。每只C57小鼠在25±4℃的温度和40±6％的湿度下定期接受饲料和纯净水。适应一周后，将C57小鼠随机分为四组，每组6只小鼠进行实验。通过口服葡萄糖耐量实验(OGTT)测量C57小鼠的血糖变化，以确定肽PYPYEPYEPYPY在体内的降血糖作用。OGTT前将小鼠禁食14h。分别将肽PYPYEPYEPYPY，阳性药西格列汀和二甲双胍溶解在蒸馏水中，配制浓度为样品组(100mg/kg BW)和阳性对照组(100mg/kg BW)。0.9％盐水用作阴性对照组。每天给药1次，给药前禁食不禁水空腹14h，在给药后0min，15min，30min，60min，120min剪鼠尾取血，使用Glutest血糖仪(Sanwa Kagaku公司，日本名古屋)在37℃下测量测量DPP-IV抑制剂对C57小鼠的作用。测定之前，将小鼠在38℃条件下保温，每次重复测定5次，取平均值即为C57小鼠的血糖值。

结果分析：为了测定体内肽PYPYEPYEPYPY的降血糖作用，通过口服后2h内C57小鼠的血糖变化来确定降血糖作用。阴性对照组(0.9％盐溶液)的血糖在口服2h后无明显变化(图4)。C57小鼠的最终血糖为6.5±0.26mmol/L。但是，样品组(肽，100mg/kg)和阳性对照组(西格列汀和二甲双胍，100mg/kg)显著降低了C57小鼠的血糖。该肽在口服1h内仍具有明显的降血糖作用。口服后在第1h出现最大的降血糖活性，血糖为10.28±0.47mmol/L。值得注意的是，100mg/kg肽的最大降血糖速率比西格列汀的100mg/kg(1h)更快，这表明PYPYEPYEPYPY在体内的效果可能优于西格列汀。此外，当口服剂量为100mg/kg时，样品组和阳性对照组的最大血糖降低分别为10.27和9.33mmol/L，表明肽和西格列汀的降血糖能力在体内和体外均起作用且在体内不是完全成比例的。有趣的是，100mg/kg肽的降血糖作用与阳性对照(二甲双胍，100mg/kg)整体趋势相同，这表明PYPYEPYEPYPY是预防和治疗降血糖的潜在药物。

实验例3抗氧化细胞实验

试验样品：实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨肽1.HepG2细胞培养和细胞毒性实验

配制DMEM完全培养基，将细胞在DMEM培养基(10％牛血清FBS；1％青霉素链霉素P/S)中培养，并保持在37％的含5％二氧化碳的培养箱中培养。

在DMEM培养基中以2×10

2.牦牛骨肽对HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用

用不同浓度的肽(20、40、80、160μM)加入HepG2细胞中培养24h，这些肽浓度已证明对细胞无毒性。随后，去除旧培养基，并添加含有800μM H

3.牦牛骨肽对细胞内ROS水平的影响

利用二氯荧光素(DCF)的荧光减弱来研究细胞抗氧化活性。将细胞接种于密度为2×10

4.结果分析：

(1)牦牛骨肽对HepG2细胞毒性的影响

样品对细胞活力的影响在细胞毒性实验中起着重要作用，该实验通常验证样品是否促进细胞生长。图5的A显示了不同浓度的肽对HepG2细胞的细胞毒性影响。当添加浓度从10到200μM时，这种促进增殖的作用从95.9％增加到106.2％，表明肽PYPYEPYEPYPY可以促进HepG2细胞的生长。浓度为600μM时，显示出轻微的细胞抑制，并且增殖率为92.9％。这可能是由于细胞超过了最佳生长浓度并产生了轻微的毒性。

(2)牦牛骨肽对HepG2细胞氧化应激损伤的保护作用

图5的B所示，肽PYPYEPYEPYPY对H

(3)牦牛骨肽对细胞内ROS水平的影响

细胞中ROS的含量是确定样品抗氧化剂的重要指标之一。ROS含量的变化通常是由于DCFH-DA被细胞膜上的酯酶消化成DCFH所致。DCFH可以自由通过细胞膜并与细胞ROS特异性结合，结合后会产生荧光。通过测量荧光强度的变化确定ROS含量的变化。由肽在细胞中产生的ROS含量示于图5的C和图5的D。当肽浓度为20～40μM时，ROS含量连续降低，而当浓度为160μM时，ROS含量最高，这可能是因为高浓度的肽导致受体结合性降低。但是，所有浓度的ROS含量均低于H

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽国肽生物科技有限公司

<120> 一种具有降血糖和抗氧化功能的牦牛骨肽及其制备方法

<130> KHP211112405.7

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Tyr Pro Tyr Glu Pro Tyr Glu Pro Tyr Pro Tyr

1 5 10