OsDREB1C及其编码基因在提高水稻光合效率中的应用

摘要

本发明公开了OsDREB1C及其编码基因在提高水稻光合效率中的应用。OsDREB1C，其序列为序列表中序列1，其编码基因序列为序列表中序列2。实验证明，本发明的OsDREB1C及其相关的生物材料可以提高植物的光合作用效率，可以促进氮吸收与转运并提高植物及籽粒中的氮含量，可以促进提前抽穗，还可以提高产量和品质，本发明的OsDREB1C及其相关的生物材料具有重要的生物学意义和产业价值，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，OsDREB1C及其编码基因在提高水稻光合效率中的应用。

背景技术

未来随着人口增长和经济发展，我国的粮食需求仍呈快速增长势头。在耕地面积持续减少和粮食种植面积扩大潜力有限的形势下，大面积提高作物单产来增加总产是保障我国粮食安全的唯一选择。因此，在粮食安全需求压力下，高产是农业生产不懈追求的目标。从二十世纪50年代中期开始兴起的“绿色革命”，通过作物品种遗传改良和栽培管理技术的提高，实现了作物产量潜力的大幅度提升。然而近年来，作物单产呈现停滞不前甚至下降的态势，如何提高作物单产需要新的策略和途径。

在农业生产中，通过施用氮肥一直是农作物增产的重要措施之一。持续大量的氮肥投入不仅增加了种植成本，还导致了气候变化、土壤酸化及水体富营养化等日益严重的环境污染问题。此外，大量施用氮肥会导致作物“贪青晚熟”现象，影响后茬作物播种；如何减少农业生产中的氮肥投入并持续提高作物产量，已成为当前我国农业可持续发展亟待解决的重大问题。探索作物大幅度增产和资源高效利用协同的调控机制与技术途径是我国农业可持续发展的当务之急。

抽穗期是作物重要的农艺性状之一，决定着水稻的季节、区域适应性以及产量。适宜的抽穗期是作物稳产高产的保障。选育早熟高产新品种一直是作物遗传育种研究的主攻方向之一。“高产不早熟、早熟不高产”即所谓“优而不早、早而不优”现象，是作物品种培育的重大难题。

目前研究人员从作物育种、栽培管理措施以及功能基因挖掘方面开展了相关探索和研究，也取得了一些重要进展，但针对上述作物生产中高产与资源高效、高产与早熟两大难题，尚未有有效解决方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的光合作用。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物光合作用；

D2)制备调控植物光合作用产品；

D3)调控植物光合作用与氮吸收或转运；

D4)制备调控植物光合作用与氮吸收或转运产品；

D5)调控植物光合作用与氮含量；

D6)制备调控植物光合作用与氮含量产品；

D7)调控植物光合作用与开花时间；

D8)制备调控植物光合作用与开花时间产品；

D9)调控植物光合作用、氮吸收或转运与开花时间；

D10)制备调控植物光合作用、氮吸收或转运与开花时间产品；

D11)调控植物光合作用、氮含量与开花时间；

D12)制备调控植物光合作用、氮含量与开花时间产品；

D13)植物育种；

所述蛋白质(其名称为OsDREB1C)为如下A1)、A2)、A3)或A4)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)来源于水稻、谷子、玉米、高粱、山羊草、小麦或二穗短柄草且与序列1具有64％或以上同一性并与A1)所述蛋白质具有相同功能的蛋白质；

A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有64％或64％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有64％或64％以上同一性为具有64％、具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的蛋白质。

本发明还提供了与OsDREB1C相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物光合作用；

D2)制备调控植物光合作用产品；

D3)调控植物光合作用与氮吸收或转运；

D4)制备调控植物光合作用与氮吸收或转运产品；

D5)调控植物光合作用与氮含量；

D6)制备调控植物光合作用与氮含量产品；

D7)调控植物光合作用与开花时间；

D8)制备调控植物光合作用与开花时间产品；

D9)调控植物光合作用、氮吸收或转运与开花时间；

D10)制备调控植物光合作用、氮吸收或转运与开花时间产品；

D11)调控植物光合作用、氮含量与开花时间；

D12)制备调控植物光合作用、氮含量与开花时间产品；

D13)植物育种；

所述生物材料为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码OsDREB1C的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低OsDREB1C表达量或敲除OsDREB1C编码基因的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列3的第3001-4131位所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有73％或73％以上同一性，且编码OsDREB1C的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsDREB1C的cDNA分子或DNA分子；

B2)所述表达盒为如下b21)或b22)或b23)：

b21)序列表中序列3所示的DNA分子；

b22)与b21)限定的核苷酸序列具有73％或73％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

b23)在严格条件下与b21)或b22)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码OSDREB1C蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的OSDREB1C蛋白质的核苷酸序列73％或者更高同一性的核苷酸，只要编码OSDREB1C蛋白质且具有OSDREB1C蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有73％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO

上述73％或73％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码OSDREB1C蛋白质的核酸分子的表达盒(OSDREB1C基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OSDREB1C蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动OSDREB1C基因转录的启动子，还可包括终止OSDREB1C基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I

可用现有的表达载体构建含有所述OSDREB1C基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pBWA(V)HS载体或含psgR-Cas9-Os质粒。

B3)所述重组载体具体可为pBWA(V)HS-OsDREB1C。所述pBWA(V)HS-OsDREB1C为在pBWA(V)HS载体的BsaI(Eco31I)酶切位点处插入序列表中序列2所示的OsDREB1C编码基因得到的重组载体。所述pBWA(V)HS-OsDREB1C能在CaMV 35S启动子的驱动下过表达OsDREB1C基因所编码的蛋白质(即序列1所示的OsDREB1C蛋白质。

B8)所述重组载体可为利用crisper/cas9系统制备的可以降低OSDREB1C含量的重组载体。所述重组载体可表达靶向B1)所述核酸分子的sgRNA。所述sgRNA的靶序列可为序列表中序列2的第356-374位。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如发根农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)培育光合作用增强植物的方法，包括使受体植物中表达OsDREB1C，或提高受体植物中OsDREB1C的含量或活性，得到光合作用增强的目的植物；

X2)培育光合作用增强且氮吸收或转运能力增强植物的方法，包括使受体植物中表达OsDREB1C，或提高受体植物中OsDREB1C的含量或活性，得到光合作用增强且氮吸收或转运能力增强的目的植物；

X3)培育光合作用增强且氮含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达OsDREB1C，或提高受体植物中OsDREB1C的含量或活性，得到光合作用增强且氮含量增加的目的植物；

X4)培育光合作用增强且开花时间提前植物的方法，包括使受体植物中表达OsDREB1C，或提高受体植物中OsDREB1C的含量或活性，得到光合作用增强且开花时间提前的目的植物；

X5)培育光合作用增强、氮吸收或转运能力增强且开花时间提前增强植物的方法，包括使受体植物中表达OsDREB1C，或提高受体植物中OsDREB1C的含量或活性，得到光合作用增强、氮吸收或转运能力增强且开花时间提前增强的目的植物；

X6)培育光合作用增强、氮含量增加增加且开花时间提前植物的方法，包括使受体植物中表达OsDREB1C，或提高受体植物中OsDREB1C的含量或活性，得到光合作用增强、氮含量增加且开花时间提前增加的目的植物。

上述方法中，X1)-X6)所述方法可通过向所述受体植物中导入OsDREB1C的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述OsDREB1C的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述OsDREB1C的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述OsDREB1C的编码基因可利用含有所述OsDREB1C的编码基因的重组表达载体导入受体植物。所述重组表达载体具体可为所述pBWA(V)HS-OsDREB1C。

所述重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)。

所述目的植物理解为不仅包含OsDREB1C蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明还提供了具有如下D1)-D6)中任一的功能的产品，所述产品含有OsDREB1C或所述生物材料：

D1)调控植物光合作用；

D2)调控植物光合作用与氮吸收或转运；

D3)调控植物光合作用与氮含量；

D4)调控植物光合作用与开花时间；

D5)调控植物光合作用、氮吸收或转运与开花时间；

D6)调控植物光合作用、氮含量与开花时间。

上文中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)单子叶植物或双子叶植物；

M2)禾本科植物；

M3)水稻。

上文中，所述光合作用可体现在光合速率、净光合速率、热耗散NPQ、最大羧化效率和/或最大电子传递速率上；

所述氮转运可体现在根部向地上部的转运，或向籽粒中的转运上；

所述氮含量可为植株或器官中氮含量；

所述开花时间可体现在抽穗期上。

所述器官可为所述植物的根、茎、叶片和/或籽粒。

所述调控可为增强或抑制，或促进或抑制，或提高或降低。

OsDREB1C或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明的OsDREB1C及其相关的生物材料可以提高植物的光合作用效率，可以促进氮吸收与转运并提高植物及籽粒中的氮含量，可以促进提前抽穗，还可以提高产量和品质。本发明从协同提高作物光合效率、氮素利用效率和抽穗期出发，在实现作物产量大幅提升的同时实现了氮素利用效率的协同提升，另外还为作物高产和早熟矛盾提供了解决方案。因此，本发明对于进一步大幅提高作物产量潜力和氮肥利用效率，实现“高产高效”；另一方面，高产早熟矛盾的解决对于对解决直播稻和粮经、粮菜、粮油连作稻、双季稻的早熟丰产以及亚种间杂交稻“超亲晚熟”等问题具有重要的应用潜力。

附图说明

图1为序列比对结果。

图2为转基因水稻中OsDREB1C基因的相对表达水平检测和基因敲除水稻材料目标区域的序列检测结果。(A)OsDREB1C基因的相对表达水平；(B)OsDREB1C基因敲除水稻的基因编辑位点。

图3为野生型和转基因水稻植株的光合作用参数。A-光合日变化；B-NPQ日变化；C-光响应曲线；D-CO

图4为野生型和转基因水稻植株的氮素吸收利用检测结果。A-地上部

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的pBWA(V)HS载体(Zhao et al.,DEP1 is involved inregulating the carbon-nitrogen metabolic balance to affect grain yield andquality in rice(Oriza sativa L.),PLOS ONE,March 11,2019,https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213504)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的含psgR-Cas9-Os质粒(胡雪娇，杨佳，程灿，周继华，牛付安,王新其，张美良，曹黎明，储黄伟.利用CRISPR/Cas9系统定向编辑水稻SD1基因.中国水稻科学，2018，32(3):219-225；Mao Y,Zhang H,Xu N,Zhang B,Gou F,Zhu J K.Application ofthe CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants.Mol Plant,2013,6(6):2008-2011.)，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、OsDREB1C具有提高水稻光合效率、促进氮吸收、促进提前抽穗和提高产量的作用

本实施例提供了一种来源于日本晴水稻的蛋白质，其具有提高水稻光合作用效率、促进氮吸收、促进提前抽穗和提高产量的功能，该蛋白质的名称为OsDREB1C，其序列为序列表中序列1，在日本晴中，OsDREB1C的编码基因序列为序列2，基因组序列为序列3的第3001-4131位。序列3中，第1-3000位为日本晴基因组DNA中OsDREB1C基因的启动子。

将水稻OsDREB1C与其它植物中同源蛋白的进行序列比对，发现其与谷子、玉米、高粱、山羊草、小麦、二穗短柄草的同一性分别为73.52％、64.06％、66.52％、66.05％、66.05％、65.88％(图1)。

1、重组载体的构建

过表达载体的构建：通过PCR从水稻日本晴cDNA中扩增得到含有OsDREB1C基因全长CDS的PCR产物，对所得到的PCR产物利用BsaI(Eco31I)进行单酶切，将所得到的酶切产物与pBWA(V)HS载体经过BsaI(Eco31I)单酶切得到的载体骨架相连，将得到的序列正确的重组载体记为pBWA(V)HS-OsDREB1C。pBWA(V)HS-OsDREB1C为在pBWA(V)HS载体的BsaI(Eco31I)酶切位点处插入序列表中序列2所示的OsDREB1C编码基因得到的重组载体，pBWA(V)HS-OsDREB1C能在CaMV 35S启动子的驱动下过表达OsDREB1C基因所编码的蛋白质(即序列1所示的OsDREB1C蛋白质。

所用引物序列如下：

OsDREB1C-F：5′-CAGTGGTCTCACAACATGGAGTACTACGAGCAGGAGGAGT-3′；

OsDREB1C-R：5′-CAGTGGTCTCATACATCAGTAGCTCCAGAGTGTGACGTCG-3′。

基因敲除载体的构建：根据在线设计网站(http://skl.scau.edu.cn/)设计sgRNA及引物，确定靶点序列为5′-AGTCATGCCCGCACGACGC-3′(序列2的第356-374位)。将OsDREB1C-sgRNA-F与OsDREB1C-sgRNA-R进行退火，将得到的产物利用BsaI酶切，将得到的酶切产物与含psgR-Cas9-Os质粒经过BsaI酶切得到的载体骨架相连，得到的序列正确的重组载体即为OsDREB1C基因敲除载体，记为OsU3-sgRNA-OsUBI-Cas9-OsDREB1C，该重组载体中，OsU3启动子驱动sgRNA，OsUBI启动子驱动Cas9。

其中，所使用引物序列如下：

OsDREB1C-sgRNA-F：5′-TGTGTGGCGTCGTGCGGGCATGACT-3′；

OsDREB1C-sgRNA-R：5′-AAACAGTCATGCCCGCACGACGCCA-3′。

2、转基因植株的构建

将水稻粳稻品种日本晴的成熟种子消毒后诱导得到胚性愈伤组织，将步骤1得到的pBWA(V)HS-OsDREB1C和OsU3-sgRNA-OsUBI-Cas9-OsDREB1C分别导入农杆菌EHA105中后，利用农杆菌介导的水稻遗传转化方法对愈伤组织进行侵染共培养，利用抗性筛选得到转基因植株，筛选到的由pBWA(V)HS-OsDREB1C得到的转基因水稻即为OsDREB1C转基因水稻，由OsU3-sgRNA-OsUBI-Cas9-OsDREB1C得到的转基因水稻即为OsDREB1C基因敲除水稻材料。

利用水稻粳稻品种日本晴(WT)作为对照，用qRT-PCR方法检测OsDREB1C转基因水稻以及OsDREB1C基因敲除水稻中OsDREB1C基因在RNA水平上的的相对表达水平，所用引物为：5′-CATGATGATGCAGTACCAGGA-3′，5′-GATCATCAGTAGCTCCAGAGTG-3′；内参基因为水稻Ubiqutin，内参基因引物为：5′-AAGAAGCTGAAGCATCCAGC-3′，5′-CCAGGACAAGATGATCTGCC-3′。

结果显示，OsDREB1C转基因水稻的3个株系(OE1、OE2和OE5)中OsDREB1C基因的相对表达水平均显著高于野生型(WT)，这三个株系均为过表达OsDREB1C水稻材料(图2中A)。OsDREB1C基因敲除水稻材料的3个株系(KO1、KO2和KO3)中OsDREB1C基因序列中存在碱基缺失或插入，造成移码突变，导致失去OsDREB1C蛋白的正常功能(图2中B)。

利用能扩增靶点序列及其上下游的引物对对OsDREB1C基因敲除水稻材料的3个株系(KO1、KO2和KO3)进行PCR扩增并测序，结果显示这三个株系的靶点序列的变化情况如图2中B所示，KO1、KO2均发生了一个核苷酸的缺失，KO3发生了一个核苷酸的插入，三个株系的目标基因均发生了移码突变。

3、转OsDREB1C基因水稻光合作用效率的提升

检测大田生长水稻的光合作用指标，待测水稻：野生型日本晴水稻(WT)，过表达OsDREB1C水稻(OE1/OE2/OE5)，OsDREB1C基因敲除水稻(KO1/KO2/KO3)。

将处于抽穗期的待测水稻剑叶，用LICOR-6400XT便携式光合仪(LI-COR，美国)分别测定反映植物光合能力的光合日变化、光响应曲线及CO

结果表明，过表达OsDREB1C水稻的光合效率(也即光合作用效率)在白天均显著高于野生型，在中午光强最高时差异达到最大，并达到显著水平，可较野生型提高29.5-43.3％，同时用于消耗过多吸收光能的热耗散NPQ显著低于野生型(图3中A、B，表1和表2)，差异均达到显著水平，说明更多的光能用于参与光合作用。进一步测定光响应曲线和CO

表1、光合作用效率(μmol CO

表1中，与同年份同地点WT相比*表示差异达到显著水平(p＜0.05)，**表示差异达到极显著水平(p＜0.01)。

表2、NPQ的检测结果

表2中，与同年份同地点WT相比，*表示差异达到显著水平(p＜0.05)，**表示差异达到极显著水平(p＜0.01)。

表5、最大羧化效率(V

表5中，与同年份同地点WT相比，*表示差异达到显著水平(p＜0.05)，**表示差异达到极显著水平(p＜0.01)。

4、转OsDREB1C基因水稻氮素利用效率的提高

检测水稻的氮利用效率，待测水稻：野生型日本晴水稻(WT)，过表达OsDREB1C水稻(OE1/OE2/OE5)，OsDREB1C基因敲除水稻(KO1/KO2/KO3)。

温室里营养液水培生长3周的待测水稻幼苗，提前置于不含氮(无(NH

另取在北京田间生长的成熟待测水稻植株，分别收获单株叶片、秸杆及籽粒，置于105℃杀青30分钟，70℃烘干3天。样品研磨粉碎后，用IsoPrime 100稳定同位素比例质谱仪(Elementar，德国)分别测定氮含量，并计算氮在不同部位的分配比例。

所用营养液如下：

营养液：木村B营养液(0.5mM(NH

含0.5mM K

结果表明，

表6、温室中培养的水稻的指标检测结果

表6中，与同地点同处理WT相比，*表示差异达到显著水平(p＜0.05)，**表示差异达到极显著水平(p＜0.01)。

表7、大田中培养的水稻的指标检测结果

表7中，与同年份同地点WT相比，*表示差异达到显著水平(p＜0.05)，**表示差异达到极显著水平(p＜0.01)。

5、转OsDREB1C基因水稻的抽穗期提前

检测水稻的抽穗期，待测水稻：野生型日本晴水稻(WT)，过表达OsDREB1C水稻(OE1/OE2/OE5)，OsDREB1C基因敲除水稻(KO1/KO2/KO3)。

在北京田间种植条件下分别统计各待测水稻的抽穗期。统计方法为：每种待测水稻均种植3个小区重复，随机排列，以小区内50％植株的穗由剑叶叶鞘露出1/2时记为抽穗，抽穗期为从播种到抽穗所经历的天数。

结果表明(表8)，过表达OsDREB1C水稻的抽穗期较野生型大幅提前，2018年提前13-17天，2019年提前17-19天，而OsDREB1C基因敲除水稻的抽穗期分别较野生型延迟6-8天和3-5天，水稻籽粒灌浆成熟期也相应的提前或者推迟。说明，OsDREB1C及其编码基因可以调控水稻的抽穗期。

表8、野生型和转基因水稻在北京田间条件下的抽穗期(天)

表8中，**表示与同年份同地点WT相比，差异达到极显著水平(p＜0.01)。

6、转基因水稻在大田的产量、品质及收获指数大幅提高

检测水稻的地上部干重和籽粒产量，待测水稻：野生型日本晴水稻(WT)，过表达OsDREB1C水稻(OE1/OE2/OE5)，OsDREB1C基因敲除水稻(KO1/KO2/KO3)。

在北京和海南两地进行的大田实验，每种待测水稻均种植3个小区重复，随机排列，在水稻籽粒成熟后测量单株籽粒产量，小区籽粒产量，地上部秸杆干重，并计算收获指数，收获指数为水稻单株籽粒产量与地上部生物量(地上部秸杆干重和单株籽粒产量之和)的比值。

地上部秸杆干重的测量方法如下：水稻成熟后，单株秸秆去除籽粒后，装入尼龙网袋中于80℃烘干至恒重，对样品进行称重。每个水稻材料取20-30个单株重复用于统计分析。

籽粒产量的测量方法如下：水稻单株稻穗脱粒并去除瘪粒后称籽粒重量即为单株籽粒产量，每个水稻材料取20-30个单株重复用于统计分析。统计小区产量时去除边行，取中间的30株水稻测定籽粒重量计为一个小区产量，3个小区重复用于统计分析。

稻米品质的测定方法如下：取2019年北京田间实验收获的水稻籽粒自然储藏3个月后用于稻米品质分析，测定方法参照农业部行业标准NY/T 83-2017米质测定方法。结果表明，过表达OsDREB1C水稻的籽粒产量较野生型大幅提升，差异达到显著水平，同时其地上部秸杆重量显著低于野生型，使得收获指数较野生型显著提高。

由产量结果来看(表9)，在北京和海南，转基因水稻其单株产量分别较野生型提高45.1-67.6％和7.8-16％，小区产量提高41.3-68.3％和11.9-27.4％。同时，地上部秸秆较野生型降低12.1-24.7％和17.5-25.8％，最终导致转基因水稻的收获指数(HI)较野生型显著提升，在北京HI的增幅可达10.3-55.7％。同时转基因水稻的稻米品质也较野生型有不同程度提高(表10)，其中糙米率、精米率、整精米率均较野生型显著增加，垩白度和垩白粒率降低，改善了外观品质，而直链淀粉和蛋白含量则无显著影响。OsDREB1C基因敲除水稻的单株产量和小区产量均较野生型显著降低，同时地上部生物量增加，直接导致收获指数较野生型大幅降低22.4-37.7％。说明在水稻中转入OsDREB1C基因后，可大幅提高转基因水稻的产量、稻米品质以及收获指数，OsDREB1C及其编码基因可以调控水稻的籽粒产量、稻米品质和收获指数。

各指标的结果如表9和表10所示。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> OsDREB1C及其编码基因在提高水稻光合效率中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 214

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

Met Glu Tyr Tyr Glu Gln Glu Glu Tyr Ala Thr Val Thr Ser Ala Pro

1 5 10 15

Pro Lys Arg Pro Ala Gly Arg Thr Lys Phe Arg Glu Thr Arg His Pro

20 25 30

Val Tyr Arg Gly Val Arg Arg Arg Gly Pro Ala Gly Arg Trp Val Cys

35 40 45

Glu Val Arg Glu Pro Asn Lys Lys Ser Arg Ile Trp Leu Gly Thr Phe

50 55 60

Ala Thr Ala Glu Ala Ala Ala Arg Ala His Asp Val Ala Ala Leu Ala

65 70 75 80

Leu Arg Gly Arg Gly Ala Cys Leu Asn Phe Ala Asp Ser Ala Arg Leu

85 90 95

Leu Arg Val Asp Pro Ala Thr Leu Ala Thr Pro Asp Asp Ile Arg Arg

100 105 110

Ala Ala Ile Glu Leu Ala Glu Ser Cys Pro His Asp Ala Ala Ala Ala

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Ser Ala Ala Ala Val Glu Ala Ser Ala Ala Ala Ala

130 135 140

Pro Ala Met Met Met Gln Tyr Gln Asp Asp Met Ala Ala Thr Pro Ser

145 150 155 160

Ser Tyr Asp Tyr Ala Tyr Tyr Gly Asn Met Asp Phe Asp Gln Pro Ser

165 170 175

Tyr Tyr Tyr Asp Gly Met Gly Gly Gly Gly Glu Tyr Gln Ser Trp Gln

180 185 190

Met Asp Gly Asp Asp Asp Gly Gly Ala Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Asp

195 200 205

Val Thr Leu Trp Ser Tyr

210

<210> 2

<211> 645

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 2

atggagtact acgagcagga ggagtacgcg acggtgacgt cggcgccgcc gaagcggccg 60

gcggggagga ccaagttcag ggagacgagg cacccggtgt accgcggcgt gcggcggcgg 120

gggcccgcgg ggcggtgggt gtgcgaggtc agggagccca acaagaagtc ccgcatctgg 180

ctcggcacct tcgccaccgc cgaggccgcc gcgcgcgccc acgacgtcgc cgcgctcgcc 240

ctccgcggcc gcggcgcgtg cctcaacttc gccgactcgg cccgcctcct ccgcgtcgac 300

ccggccaccc tcgccacccc cgacgacatc cgccgcgccg ccatcgagct cgccgagtca 360

tgcccgcacg acgccgccgc cgccgccgcc tccagctccg ccgccgccgt cgaggcctcc 420

gccgccgccg cgcccgccat gatgatgcag taccaggacg acatggcggc gacgccgtcc 480

agctacgact acgcgtacta cggcaacatg gacttcgacc agccgtccta ctactacgac 540

gggatgggcg gcggcggcga gtaccagagc tggcagatgg acggcgacga cgatggtggc 600

gccggcggct acggcggcgg cgacgtcaca ctctggagct actga 645

<210> 3

<211> 4134

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 3

cccgtaatat tgattttgat tttttcttat gttgtttgac cattcgtctt aatcaagaaa 60

ctttgaaatt attatttatt ttatttatat cttactttat tatccaaagt actttaagca 120

taatttttta ttttttatat ttgcacaaat tttttgaata agaagagtgg tcaaacagtg 180

taaaaaaagt caaaatcact tatattatgg gatggaggga gtatgtgttt acctaaagta 240

gtactctatt catattattt actaggaaca aaaaaatgcc gtcgactttt tattaacatt 300

tgatcaatcg tcttattcaa aatttatgtg taaatataaa agtatttatg tcatgcttta 360

aaaacatttg aagataaatc aagtcataat aaaataaatg ataaaataag acgaatggtc 420

aagcgttgta aagttaacgg cgttatatat taaaatacga agagagtact gcatcagtat 480

catactagaa gaagtaatac cagtactaaa cagctttgat attttcgcta gtagcccgca 540

tatatcctca gttaatttgt tgctttagtt aaattgtgtt aagagtgaat tgcaccttga 600

tctgagtatc tttttttttg ttatcgtagt tttactttag atcacctctt aattcatggt 660

ttttacttta aaactaggga atgttacatt ttctagaata gatggtccaa aatgaagctc 720

tggaataaaa tatagcccaa tgtataattc attaataaga atagtagtat aaaaatctcc 780

atgtaaaatt attttcagtt gattagtact caacaaggta tattgtgtca cgtagaccat 840

aagatattgt cttgtaggga tgtaagtgga caatctcact acccatataa agcctcactt 900

gccaattact ttctcaaaac tttaaaagaa aaaaaattaa ctagaacagg taaaagggaa 960

aaaaaatccc gcttgtccgc ttcccttggc atctggatgg tcacgtggca ggaaagaact 1020

tgtacagtag tagtacgtgc tagggtttga agtaggagcg cgtgtcaatc accaaaaaaa 1080

aaaaacaaaa aaaggcacag cagcgagtgg aaaggagtcg atgggatttt atgcccaaaa 1140

ccgcgagaga tccaccgctg tttgatgggt tcgttgggac ttgggaagga atccatcggc 1200

gaatcgccgc gcggctccga tccggggcgc aagcgcaagg ccaccggccc acgtactcca 1260

ctactcctac tccgtagaga ggcgacgcgt ttgcgcgggc ggcgccgcgg ccgcccaacc 1320

caaccgtcgc tgcctccgtc tccgtagtcc gtactgcctg tgtctgcctc tgctactgct 1380

gctgcctgag agcaggtacc atagcatagc aggctacaaa ccagctacaa acatatttta 1440

aaaaaataaa taaggagaga gaatggtagc aggctacaga tttatagcca gctgtagcac 1500

ggacttcaag acacagtgtg tatgacagat gggaccatat attaatagtg taatatgtaa 1560

ctattatatg aatgagctat tatattggct atagatgaat ggtagttatt agttggctat 1620

actattgaac ttgccagaga ccaaccagct actccctcac gtgcggctgg attaaataaa 1680

cattaatcaa ttaattaatt atagagacaa tcagttgcca cttgccaatt aaggaagaag 1740

gcataagtac tgtagcactg cagccgcaca ctccacgtct ccattgggag gaaatggaaa 1800

atagtttttc ttttttttaa aaaaaaatag aaaatagtgc tccttccgtt ttatattata 1860

aatcgtttga tatttttctt agtcaaaatt tattaggttt gatcaaatat atagaaaaaa 1920

agaaacatgt acaacatcaa atttcattaa atttaacatt gtatatattt taatataatg 1980

tttattttat attaaaaaac attactatat tttgcttaaa gtttgactta aaaaaatctc 2040

tactattata aaattgaaga tgtttttgcc ggtattctag tacatcatct gtgtatgagt 2100

cggtttttaa gtttgtttgc ttttgaaaat atatatccgt atttgagttg gtttgtaaga 2160

tcgttcactt ttgtatgata caaaaggaat catataagaa atctgtttaa aataactcac 2220

atgctaaatt gagacgatcg gattccaaac tttagctcat gattttctaa aaatatatat 2280

atccaagtga actcccacag tgaattttat cttaactaaa ctatataatt aaaatagatt 2340

tcacccgttg caacgcacga tattttttct agtactccct ccgtttcata atgtaagact 2400

tcaaacattg gttatattca tatatgtgtt aatgaatcta gacacacata tatatctaga 2460

ttcattaaca tctatatgaa tatggacaat actagaaaga cttacattat aaaacagagg 2520

aagtaactca taaatacgga acgaaggggt agaaatatcc gcatctcata cacacacaga 2580

agtggtcagc cgccgcccaa aagcttgcct ttgtcgccat ctccacgtgg ccacccccat 2640

atactattgc ttaacgctgt cacctcaccc tctcgcggtt tgagttttcc acttccacgg 2700

ttccaccccg acacctagcg aagtactcgt agtaatccga atcccaccgt tccatccgtc 2760

gcggacgcca cgctctcggc tctcagctca cgtgacgtca accccgccaa aacgcgttat 2820

tgccgtagta ctacgcctct tcttccacct ccatctcccc ctccgacatc tccagccaat 2880

tccagctcag ctctcgccgc cctcccctct cccgccacgt gcgcgccgcc cctcctccaa 2940

atctcctttt cttttccttt tctataaata aatcaaaatt cacacaccaa atcctatata 3000

aacttcttcc tctccatccc cttcccgctc aaactcaaac accaacacct tcttcctctt 3060

cttcttcttc cagcagcagc aacacacact actgacatgg agtactacga gcaggaggag 3120

tacgcgacgg tgacgtcggc gccgccgaag cggccggcgg ggaggaccaa gttcagggag 3180

acgaggcacc cggtgtaccg cggcgtgcgg cggcgggggc ccgcggggcg gtgggtgtgc 3240

gaggtcaggg agcccaacaa gaagtcccgc atctggctcg gcaccttcgc caccgccgag 3300

gccgccgcgc gcgcccacga cgtcgccgcg ctcgccctcc gcggccgcgg cgcgtgcctc 3360

aacttcgccg actcggcccg cctcctccgc gtcgacccgg ccaccctcgc cacccccgac 3420

gacatccgcc gcgccgccat cgagctcgcc gagtcatgcc cgcacgacgc cgccgccgcc 3480

gccgcctcca gctccgccgc cgccgtcgag gcctccgccg ccgccgcgcc cgccatgatg 3540

atgcagtacc aggacgacat ggcggcgacg ccgtccagct acgactacgc gtactacggc 3600

aacatggact tcgaccagcc gtcctactac tacgacggga tgggcggcgg cggcgagtac 3660

cagagctggc agatggacgg cgacgacgat ggtggcgccg gcggctacgg cggcggcgac 3720

gtcacactct ggagctactg atgatcgcga gttggagcta gcagttttga gctcaaccag 3780

ctttgctcct cctatacagc taaatactgt aggagaaatt aatggagatt ttttccttct 3840

ttattttttt tatatttttt ccaagataaa atggctgagc tggtagggag ttctagaagg 3900

aggaaataaa gattacgaga tttgtaatac tactacgagg gacagcatgc aaaaaagaag 3960

tataattgct atgctctctc tctctctctc tctcttttgt gtggagtgga ataaaatgcc 4020

agctctgctt atggtcagat tttcactttt ttttggagtg ttaagacaaa tgaaagctcc 4080

agataaatta gtgagtgcta ctgcttatct gaataaatga gatcattcat catc 4134