一种鉴定稻水象甲特异引物对及其应用

摘要

本发明提供了一种用特异性PCR引物检测稻水象甲的方法。该方法是在RAPD技术获得稻水象甲序列基础上，设计出成对的、可用于快速鉴定该物种的特异性引物。利用该对引物建立PCR检测体系，扩增出370bp左右单一的、稻水象甲特有的DNA条带。该方法具有鉴定准确、操作方便、特异性好等优点，可实现对稻水象甲的快速分子鉴定，提高检测检疫工作的效率。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种稻水象甲特异引物及其快速鉴定方法。

背景技术

稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)，属鞘翅目(Coleoptera)、象虫科(Curculionidae)，原产于美国南部的德克萨斯州地区。该害虫在短短几十年间迅速在全球扩散蔓延，现已成为一种世界性的重要的水稻害虫，被国际自然保护联盟列为全球100种最具威胁性的外来入侵生物之一，也是全国植物检疫性害虫。稻水象甲于1988年首次在我国河北省唐山市唐海县发现，目前已有河北、天津、北京、辽宁、山东、浙江、吉林、安徽、湖南、山西、陕西、贵州、新疆等23个省(自治区、直辖市)报道该害虫的发生。稻水象甲主要为害水稻，成虫取食叶片，幼虫蛀食稻根，导致水稻减产。其还具有孤雌生殖、抗逆性强等特点，可迅速成为当地的优势种群，因此需要对其进行严格的检疫检测。

目前对稻水象甲的种类鉴定，主要依靠外部形态学特征进行。在我国绝大部分水稻田中经常出现近缘种，如稻象甲(Echinocnemus squameus Billberg)等。两者都营水生生活，成虫形态特征极为相似，在田间识别有一定的困难，需要昆虫分类专业人员和显微设备才能鉴别。而对于卵、幼虫、蛹等样本，形态学鉴定具有极大的难度，还需待其成虫后才能准确鉴定，不利于第一时间掌握该虫入侵的动态。这就需要新的快速鉴定方法的建立。

随着分子生物学的快速发展，分子鉴定方法有了长足的进步。该类方法不受环境、害虫样本及人为因素的影响，具有较高的特异性和准确性，将有助于检验检疫的快速开展。RAPD(randomamplified polymorphic DNA)即随机扩增多态性DNA技术，该方法通过人工合成的随机引物，对不同物种的DNA 的进行PCR(Polymerase Chain Reaction)，会可能得到不同的带谱。对于某一特定模板中出现的特异条带就可作为该模板的分子标记。RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。RAPD具有无需专门设计PCR扩增反应引物，无需知道被研究生物基因组的信息，易于得到PCR产物等优势，但也存在PCR产物不特异、结果不稳定、重复性差等缺点，给分子学鉴定带来一定的困难。目前还需要对鉴定方法进行进一步改进，实现稻水象甲快速和准确的分子鉴定。

发明内容

基于上述背景，本发明的目的为：提供一种稻水象甲特异引物对及快速鉴定方法，通过该特异性引物对可以实现稻水象甲的快速分子鉴定。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了由SEQ ID NO：1所示的上游引物和SEQ ID NO：2所示的下游引物组成检测稻水象甲的特异性引物对。该特异性引物对是在RAPD技术获得稻水象甲序列基础上设计而来的。

本发明还提供了该特异性引物对在鉴定稻水象甲的应用，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA；

(2)以所述待测样品的DNA为模板，采用本发明提供的特异性引物对DNA模板进行PCR扩增；

(3)对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定样品中DNA模板是否来源于稻水象甲；若电泳结果显示在370bp处有单一DNA条带，则该样品为稻水象甲；若未扩增出370bp 的序列片段，则样品为其它物种。

所述的引物对PCR扩增的反应体系为：待测样品DNA 1μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5 μL；2×Taq PCR MasterMixⅡ 12.5μL；无菌水10.5μL。其中待测样品DNA的浓度不小于400 pg/μL；上游引物和下游引物的摩尔浓度为10μM。

所述的引物对PCR扩增的反应条件：95℃3min；95℃30s，59℃45s；72℃30s，共35个循环； 72℃2min，4℃保存PCR产物

本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种可检测稻水象甲的特异性引物，并建立PCR检测体系，实现了稻水象甲快速的分子鉴定，具有操作简便、准确性高、耗时短等优点。

(2)与现有技术相比，本发明可针对各个发育阶段昆虫样本进行鉴定，无须等待其发育至成虫；本发明也降低了对鉴定人昆虫分类的相关知识要求，使得稻水象甲检测检疫可以更加广泛开展。

附图说明

图1随机引物Tube F-12对稻水象甲和稻象甲的PCR扩增片段。M:Marker；1：阴性空白对照； 2-8：稻水象甲DNA样本1-7；9-13：稻象甲DNA样本1-5。稻水象甲DNA样本1-7均可扩增获得550 bp的条带，而稻象甲DNA样本1-5并无此条带。

图2特异性引物对在稻水象甲和稻象甲中PCR扩增结果。M:Marker；1-3：稻水象甲DNA样本； E:卵；YL：早期幼虫；OL：老熟幼虫；P：蛹；AM：雄性成虫；FM：雌性成虫；4-7：稻象甲DNA样本。稻水象甲各个发育阶段的DNA样本均可扩增获得特异性370bp的条带，而稻象甲DNA样本并无此特异性条带。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件、操作技术流程，或按照试剂生产商所建议的实验条件和操作步骤；所用试剂均为市售商品。

实施例1样品DNA提取

稻水象甲及稻象甲的基因组DNA提取采用试剂盒方法，所用试剂盒为Ezup柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒；购买自生工生物工程股份有限公司。具体操作步骤如下：

(1)无水乙醇浸泡保存的昆虫样本，将单头虫体分出后，使用无菌水浸洗2次，并置于无菌水中24 小时，彻底去除乙醇残留。之后虫体置于灭菌滤纸上晾干；

(2)将晾干的样品放入新的1.5mL的灭菌离心管中，入消化液并用电动研磨器将样品充分研磨后，依据DNAEzup柱式动物基因组抽提试剂盒操作手册进行DNA提取；

(3)当进行至最后一步样品DNA处于吸附柱上时，加入50μL灭菌去离子水静置3min溶解DNA，经离心机12000rpm离心2min后，获得样品DNA。

(4)样品DNA经过nanodrop仪器测定浓度后，选用浓度高于或等于400pg/μL的样品-20℃保存，以备后用。

实施例2：样品DNA的RAPD扩增

根据RAPD的原理，选用华大基因随机引物组RAPD 10-mer Set F的20条引物对稻水象甲及稻象甲的DNA样品进行PCR筛选。

采用天根2×Taq PCR MasterMixⅡ试剂进行PCR扩增反应，总反应体系25μL，包括：待测样品 DNA 1μL；随机引物1μL；2×Taq PCR MasterMixⅡ 12.5μL；无菌水10.5μL。其中待测样品DNA的浓度不小于400pg/μL；随机引物的摩尔浓度为10μM。PCR程序为：95℃3min；95℃30s， 40℃45s；72℃1min，共35个循环；72℃2min，4℃保存PCR产物。3μL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果。其中琼脂糖凝胶为1.0％，所用电压为180V，并使用凝胶成像系统拍照。结果表明：对于所有稻水象甲样本而言，随机引物Tube F-12均可扩增获得大小约550bp的PCR产物；而稻象甲并无此条带(图1)。PCR产物送往生工生物工程股份有限公司进行双向碱基序列测定。

实施例3：稻水象甲特异性引物设计与鉴定

对所获得的碱基序列进行分析，使用Primer Premier 5软件设计特异引物。上游引物序列：SEQ ID NO：1：ATGTGCCCACCTCTGTTCTT，下游引物序列：SEQ ID NO：2：ACTGCATCGTCAGTAACTAT。所述引物送往生工生物工程股份有限公司合成。

对现有的稻水象甲不同发育阶段的样本DNA(卵、早期幼虫、老熟幼虫、蛹、雌性成虫和雄性成虫)及稻象甲DNA进行扩增鉴定。采用天根2×Taq PCR MasterMixⅡ试剂进行PCR扩增反应，总反应体系25μL，包括：待测样品DNA 1μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；2×Taq PCR MasterMixⅡ 12.5μL；无菌水10.5μL。其中待测样品DNA的浓度不小于400pg/μL；引物的摩尔浓度为10μM。PCR程序为：95℃3min；95℃30s，59℃45s；72℃30s，共35个循环；72℃2min， 4℃保存PCR产物。3μL PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳检测物种鉴定结果。电泳条件同上。结果表明：对于所有稻水象甲不同发育阶段的样本，特异性引物对均可扩增获得大小为370bp的特异性PCR 产物；稻象甲在此处并无条带(图2)。表明上游引物SEQ ID NO：1，下游引物SEQ ID NO：2引物对具有稻水象甲种特异性，可以用于稻水象甲不同发育阶段样本的快速鉴定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的描述。

序列表

<110> 山西省植物保护植物检疫总站

榆次区农业技术推广中心

平遥县农业农村局

<120> 一种鉴定稻水象甲特异引物对及其应用

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<160> 2

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<210> 1

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<212> DNA

<213> Lissorhoptrus oryzophilus

<400> 1

atgtgcccac ctctgttctt 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> Lissorhoptrus oryzophilus

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