一种脑组织中内源性代谢物的原位分析方法

摘要

本发明公开了一种脑组织中内源性代谢物的原位分析方法。本发明脑组织中内源性代谢物的原位分析方法，包括如下步骤：将待测的离体的脑组织切片样本进行质谱成像，获取脑组织中内源性代谢物的种类、离子强度和/或空间分布特征。本发明基于超高分辨质谱的AFADESI‑MSI质谱成像技术，建立了一种适用于脑组织中各种内源性代谢物全面分析的原位代谢组学分析方法，旨在系统研究各种内源性代谢物在脑组织不同区域的分布特征，获取与糖尿病脑病发生的生物标志物，并深入探讨糖尿病脑病的发病机制。本发明为糖尿病脑病发病机制和药物开发提供新的研究策略与技术手段，为糖尿病脑病的诊断、预防和治疗提供有重要价值的参考信息。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，尤其涉及一种脑组织中内源性代谢物的原位分析方法。

背景技术

我国现有糖尿病患者超过9000万，其中90％为2型糖尿病患者，发病人数占全球糖尿病患者的近1/3，并且有不断增加的趋势。糖尿病患者体内代谢紊乱和血糖控制不佳，可导致各种大血管和微血管并发症，对肾脏、眼、外周神经和脑等靶器官造成损伤。脑组织消耗氧和葡萄糖的量占全身消耗量的五分之一，因此各种急、慢性高血糖或低血糖均可能对脑组织造成损伤。早在1922年，研究者就认识到糖尿病病人体内存在不同程度的认知功能障碍，并于20世纪60年代提出糖尿病脑病的概念(Diabetic Encephalopathy，DE)，用于描述糖尿病引起的中枢神经系统功能障碍，并在以后的临床和实验动物模型中不断得到证实。研究表明，约40％的长期或血糖控制不佳的糖尿病患者会发展为糖尿病脑病。糖尿病脑病病人主要表现轻、中度认知功能障碍，1型糖尿病脑病患者主要表现思维和行动变慢，如注意力不集中、行动迟缓等，2型糖尿病脑病患者主要表现在学习和记忆功能受损，可能存在记忆提取过程的缺陷。这些症状虽然并不十分明显而未引起足够重视，但却会显著影响患者的生活质量，给家庭和社会带来沉重的负担。另外，糖尿病脑病是一种慢性进展性疾病，与痴呆尤其是阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的发病密切相关，并在分子水平上有诸多相似之处，因此糖尿病被认为是AD的独立危险因素，糖尿病病人痴呆的发生率是非糖尿病病人的1.5～2.5倍。

糖尿病脑病发病机制包括很多因素，如胰岛素抵抗，慢性炎症，血管损伤，线粒体功能紊乱、血脑屏障破坏，氧化应激，神经递质代谢失调，β-淀粉样蛋白表达异常等，这些因素之间相互联系，相互影响，导致糖尿病脑病的病理生理机制极其复杂。目前，人类对糖尿病脑病的认识还十分有限，尚不能完全阐明其发病机理，更缺乏有效的诊断、预防和治疗措施。鉴于我国糖尿病患者基数庞大，且发病人数不断增加，糖尿病脑病可能会造成严重的健康和社会问题。因此，开展糖尿病脑病发病机制和防治方法的研究具有重要的意义。

糖尿病脑病作为一种复杂的代谢性疾病，与小分子化合物代谢异常密切相关。目前发现的与糖尿病脑病、中度认知障碍和痴呆相关的代谢通路的变化主要有糖代谢(戊糖磷酸途径)，氨基酸代谢(谷氨酸，色氨酸)，胆碱代谢(乙酰胆碱)，脂类代谢(甘油磷脂，缩醛磷脂，鞘磷脂)，辅酶代谢(NAD，NADP)，激素代谢(烯醇酮，黄体酮，睾酮等)，有机酸代谢(牛磺酸，2,4-二羟基丁酸)等。例如，烟酸，尼克酰胺是辅酶NAD和NADP的重要组成部分，具有抗氧化应激、抗炎和神经保护作用，Song等采用代谢组学方法研究了中度认知功能障碍发展过程中糖尿病小鼠体内代谢物水平的变化，发现尿液中烟酸和尼克酰胺与中度认知功能障碍的发展密切，随着疾病的进展其含量不断降低。

质谱成像(Mass Spectrometry Imaging，MSI)作为一种免标记的新型分子成像技术是目前质谱研究中的前沿和热点领域。该技术将成像处理软件与质谱的离子扫描技术相结合，可在分子水平上对生物组织进行可视化分析，实现多种分子同时检测并获得其在组织上的结构、含量和空间分布信息，这对动物病理生理状态监测、疾病标志物发现、药物有效成分原位表征等具有十分重要的意义。目前，MSI技术主要包括以下三大类型：需要在真空条件下进行离子化的二次离子质谱(SIMS)和基质辅助激光解吸电离(MALDI)质谱。其中，SIMS成像技术主要应用于样品表面的元素分析。MALDI-MSI是最成熟、应用最为广泛的质谱成像技术，尤其适用于蛋白质、多肽等生物大分子的成像分析。由于低质量端易受到基质峰的干扰，其在小分子代谢物分析中的应用受到一定限制。

如何通过质谱成像获取脑组织中的小分子代谢物的空间分布信息，建立一种适用于脑组织中各种内源性代谢物全面分析的原位代谢组学分析方法，是当前需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种脑组织中内源性代谢物的原位分析方法，该方法基于敞开式空气动力辅助离子化(Air Flow Assisted Desorption Electrospray Ionization,AFADESI)-MSI质谱成像技术，获取了各种内源性代谢物在脑组织不同区域的空间分布信息。

本发明提供的一种脑组织中内源性代谢物的原位分析方法，包括如下步骤：将待测的离体的脑组织切片样本进行质谱成像，获取脑组织中内源性代谢物的种类、离子强度和/或空间分布特征。

上述的方法中，所述质谱成像所用的离子源可为空气动力辅助解析电喷雾(AFADESI)离子源。

所述质谱成像中用于贴附所述待测的脑组织切片样本的载玻片可为正电荷防脱载玻片。

所述待测的脑组织切片样本的厚度可为8μm。

所述质谱成像所用的喷雾溶剂可由体积比为8：2的乙腈和水组成；所述喷雾溶剂的流速可为7μL/min。

所述质谱成像的质量分辨率可为120,000。

上述的方法中，所述脑组织中内源性代谢物的空间分布特征为所述脑组织中内源性代谢物在整个脑部及不同区域的空间分布特征，如按照下列组织学结构分成的八个区域：杏仁核(AM)，胼胝体(CC)，大脑皮层(CTX)，海马(HP)，丘脑(TH)，内囊(IC)，中腹核(MN)，下丘脑和黑质(HY-SN)的空间分布特征。

本发明脑组织中内源性代谢物的原位分析方法为非诊断目的的脑组织中内源性代谢物的原位分析方法。本发明脑组织中内源性代谢物的原位分析方法以离体的脑组织样本为对象，以获取脑组织中内源性代谢物的种类、离子强度和空间分布特征为直接目的，无法直接获得疾病诊断结果或健康状况。

本发明进一步提供了一种脑组织中内源性代谢物的原位分析系统，包括仪器、试剂和可读性载体；

所述仪器包括所述可读性载体中涉及的用于质谱成像的仪器；

所述试剂包括所述可读性载体中涉及的用于质谱成像的试剂；

所述可读性载体中记载有如下对脑组织中内源性代谢物进行原位分析的步骤：将待测的离体的脑组织切片进行质谱成像，获取脑组织中内源性代谢物的种类、离子强度和/或空间分布特征。

上述的系统中，所述可读性载体可为说明书，所述对脑组织中内源性代谢物进行原位分析的步骤印刷在卡片上；

所述可读性载体可为计算机可读性载体。

上述的系统中，所述仪器包括质谱仪；所述质谱仪的离子源可为空气动力辅助解析电喷雾(AFADESI)离子源。

上述的系统中，所述仪器包括用于贴附所述待测的脑组织切片样本的载玻片；所述载波片为正电荷防脱载玻片。

上述的系统中，所述试剂包括喷雾试剂；所述喷雾溶剂由体积比为8：2的乙腈和水组成。

上述的系统中，所述可读性载体中还记载有如下质谱成像的条件：脑组织切片样本的厚度为8μm；喷雾溶剂流速为7μL/min；质量分辨率为120,000。

上述的系统中，所述可读性载体中，所述脑组织中内源性代谢物的空间分布特征为所述脑组织中内源性代谢物在整个脑部及不同区域的空间分布特征，如按照下列组织学结构分成的八个区域：杏仁核(AM)，胼胝体(CC)，大脑皮层(CTX)，海马(HP)，丘脑(TH)，内囊(IC)，中腹核(MN)，下丘脑和黑质(HY-SN)的空间分布特征。

本发明还提供了上述脑组织中内源性代谢物的原位分析系统在下述A1-A8中至少一种中的应用：

A1、制备中枢神经系统疾病原位分析产品；

A2、制备用于获取中枢神经系统疾病的生物标志物的产品；

A3、制备用于诊断或辅助诊断中枢神经系统疾病的产品；

A4、制备用于区分或鉴别中枢神经系统疾病的产品；

A5、制备糖尿病脑病原位分析产品；

A6、制备用于获取糖尿病脑病的生物标志物的产品；

A7、制备用于诊断或辅助诊断糖尿病脑病的产品；

A8、制备用于区分或鉴别糖尿病脑病的产品。

本发明具有如下有益效果：

本发明基于超高分辨质谱的AFADESI-MSI质谱成像技术，建立了一种适用于脑组织中各种内源性代谢物全面分析的原位代谢组学分析方法，旨在系统研究各种内源性代谢物在脑组织不同区域的分布特征，获取与糖尿病脑病发生的生物标志物，并深入探讨糖尿病脑病的发病机制。本发明为糖尿病脑病发病机制和药物开发提供新的研究策略与技术手段，为糖尿病脑病的诊断、预防和治疗提供有重要价值的参考信息。

附图说明

图1为不同载玻片种类对于脑组织AFADESI-MSI正离子检测的影响，普通载玻片I，正电荷防脱载玻片II和SuperFrost plus载玻片III；其中，图1A为不同种类载玻片的总离子强度柱形图，图1B为不同种类载波片的总离子数目的柱形图。

图2为大脑中代表性代谢物在不同种类载玻片(I,II,III)下的AFADESI-MSI正离子检测成像图和离子强度柱形图，普通载玻片I，正电荷防脱载玻片II和SuperFrost plus载玻片III；其中图2A为代表代谢物成像图，图2B为谷氨酰胺的离子强度柱形图，图2C为L-肉碱16:1(L-Carnitine C16:1)的离子强度柱形图，图2D为磷脂酰胆碱(40:6)(PC(40:6))的离子强度柱形图，比例尺为2mm。

图3为不同切片厚度对于脑组织AFADESI-MSI正离子检测的影响，其中，图3A为不同切片厚度的总离子强度的柱形图，图3B为不同切片厚度的总离子数目柱形图。

图4为大脑中代表性代谢物在不同切片厚度(8μm，10μm和12μm)下的AFADESI-MSI正离子检测成像图和离子强度柱形图，其中，图4A为代表性代谢物的成像图，图4B为谷氨酰胺的离子强度的柱形图，图4C为L-肉碱16:1(L-Carnitine C16:1)的离子强度柱形图，图4D为磷脂酰胆碱(40:6)(PC(40:6))的离子强度的柱形图，比例尺：2mm。

图5为不同喷雾溶剂体系对于脑组织AFADESI-MSI正离子检测的影响，其中图5A为总离子强度柱形图，图5B为总离子数目柱形图。

图6为大脑中代表性代谢物在不同喷雾溶剂体系下的AFADESI-MSI正离子检测成像图和离子强度柱形图，其中，图6A为代表性代谢物成像图，图6B为谷氨酰胺的离子强度柱形图，图6C为L-肉碱16:1(L-Carnitine C16:1)的离子强度柱形图，图6D为磷脂酰胆碱(40:6)(PC(40:6))的离子强度柱形图，比例尺：2mm。

图7不同喷雾溶剂流速对于脑组织AFADESI-MSI正离子检测的影响，其中图7A为总离子强度柱形图，图7B为总离子数目柱形图。

图8为大脑中代表性代谢物在不同喷雾溶剂流速下的AFADESI-MSI正离子检测成像图和离子强度柱形图，其中，图8A为代表性代谢物成像图，图8B为谷氨酰胺的离子强度柱形图，图8C为L-肉碱16:1(L-Carnitine C16:1)的离子强度柱形图，图8D为磷脂酰胆碱(40:6)(PC(40:6))的离子强度柱形图，比例尺：2mm。

图9不同质量分辨率对于脑组织AFADESI-MSI正离子检测的影响，其中，图9A为总离子强度柱形图，图9B为总离子数目柱形图。

图10AFADESI-MSI的质量分辨率从15,000增加至240,000分析脑组织中m/z接近的代谢物(m/z 788.4637和m/z 788.4999)的成像图，R，分辨率，比例尺：2mm。

图11为在质量分辨率为120000的条件下AFADESI-MSI可以区分m/z相近(m/z790.5380和m/z 790.5536)、空间分布互补的代谢物，相近m/z的质谱成像图，比例尺：2mm。

图12为AFADESI-MSI方法稳定性考察中，六个具有不同m/z值的代表性代谢物6天的质谱成像图，比例尺：2mm。

图13糖尿病组和对照组的生化指标水平，其中，图13A为血清FBG的柱形图，图13B为GLU柱形图，图13C为HbA1c柱形图，图13D为CHOL柱形图，图13E为TG柱形图，糖尿病模型组的水平升高；通过独立学生的t检验计算P值，与对照组比较，*P≤0.05；**P≤0.01；CHOL：胆固醇；FBG：空腹血糖；GLU：血糖；HbA1c：糖化血红蛋白；TG：甘油三酯。

图14为生理和Morris水迷宫(MWM)分析结果，其中，图14A为两组大鼠体重随时间的动态变化柱形图，图14B为大鼠脑组织重量柱形图，图14C为脑/体重比柱形图，图14D为脑组织苏木精-伊红(H&E)染色组织的显微照片，图14E为冠状面上大脑的组织结构图，图14F和图14G分别为MWM实验中大鼠的逃逸潜伏期和特征性游泳轨迹；与对照组比较，*P≤0.05；**P≤0.01。AM，杏仁核；CC，胼胝体；CTX，大脑皮层；HP，海马；HY-SN，下丘脑-黑质，IC，内囊；MN，中嗅核；TH，丘脑；比例尺：2mm。

图15对照组和糖尿病组大鼠不同脑区获得的AFADESI-MSI正(C，D)、负离子(A，B)数据构建的OPLS-DA模型得分图。

图16对照组和糖尿病组大鼠不同脑区获得的AFADESI-MSI正离子数据构建的OPLS-DA模型得分图。

图17对照组和糖尿病组大鼠不同脑区获得的AFADESI-MSI负离子数据构建的OPLS-DA模型得分图。

图18为19种与糖尿病脑病密切相关的差异代谢物在大鼠脑组织中的空间分布特征及其变化趋势图。

具体实施方式

对此，本发明提供的脑组织中内源性代谢物的原位分析方法，包括如下步骤：将待测的离体的脑组织切片样本进行质谱成像，获取脑组织中内源性代谢物的种类、离子强度和/或空间分布特征。

本发明提供的脑组织中内源性代谢物的原位分析系统，包括仪器、试剂和可读性载体；仪器包括可读性载体中涉及的用于质谱成像的仪器；试剂包括可读性载体中涉及的用于质谱成像的试剂；可读性载体中记载有如下对脑组织中内源性代谢物进行原位分析的步骤：将待测的离体的脑组织切片样本进行质谱成像，获取脑组织中内源性代谢物的种类、离子强度和/或空间分布特征。

本发明基于超高分辨质谱的AFADESI-MSI质谱成像技术，建立了一种适用于脑组织中各种内源性代谢物全面分析的原位代谢组学分析方法及分析系统，旨在系统研究各种内源性代谢物在脑组织不同区域的分布特征，获取与糖尿病脑病发生的生物标志物，并深入探讨糖尿病脑病的发病机制。本发明为糖尿病脑病发病机制和药物开发提供新的研究策略与技术手段，为糖尿病脑病的诊断、预防和治疗提供有重要价值的参考信息。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、AFADESI-MSI分析方法的建立及优化

一、AFADESI-MSI分析方法的建立

按照如下步骤对大鼠脑组织中的内源性代谢物进行分析：

大脑组织样本制备：将大鼠脑组织从-80℃冰箱转移至CM 1860冷冻切片机(操作温度为-20℃)，制备厚度为8μm的大鼠脑组织切片，并粘附于载玻片上，置于真空干燥器中干燥30min后，进行AFADESI-MSI分析。

AFADESI-MSI实验是在配有AFADESI离子源(Rapid Commun.Mass Spectrom.2011,25,843–850，Acta Pharmaceutica Sinica B 2020；10(6):1083e1093)的Q-OT-qIT混合质谱仪(Orbitrap Fusion Lumos；Thermo Fisher Scientific，USA)上进行的。AFADESI-MSI分析通过在x方向以200μm/s的速率连续扫描脑组织切片，y方向的间隔步长为200μm。采用正负离子全扫描模式，扫描范围为100～1000Da，质量分辨率设为120000，AGC target为1×10

AFADESI-MSI数据处理：经AFADESI-MSI分析后获得原始数据.raw文件，使用Xcalibur软件转换为.cdf格式，然后导入MassImager软件进行图像重构、背景扣除。依据邻近切片的H&E染色图，在某一离子的成像图中用鼠标圈定感兴趣的区域(ROI)，精确提取ROI的质谱图，包括来源于组织切片中此区域的内源性代谢物的信息。进一步将此质谱数据保存为.txt格式的文件，该.txt的文件为二维数据矩阵(m/z-intensity)。另外，可同时获得选定区域的平均质谱图，可将其保存为.tif或.jpg格式。将多个提取的ROI区域的数据文件导入MarkerView

二、AFADESI-MSI分析方法的优化

载破片的选择：对三种不同的载玻片进行了考察，包括普通载玻片I(Cat#1027105P，世泰，中国江苏省)，正电荷防脱载玻片II(Cat#188105，世泰，中国江苏省)和SuperFrost plus载玻片III(Cat#4951PLUS-001，Thermo Scientific，美国新罕布什尔州)。将相邻的大脑切片(8μm)贴附在三种载玻片上，进行AFADESI-MSI分析。从图1所示，在AFADESI-MSI正离子检测模式下，三种载玻片检测到的总离子数目基本一致，但是正电荷防脱载玻片II下检测到的总离子强度显著高于其他两种。从图2可以看出，三种代表性代谢物谷氨酰胺(Glutamine,m/z 169.0584)、L-肉碱(L-Carnitine C16:1,m/z 398.3265)、磷脂酰胆碱(PC(40:6),m/z 872.5566)均在正电荷防脱载玻片II下的离子强度最高且离子图像空间分辨率也较好，所以最终选择正电荷防脱载玻片(Cat#188105，世泰，中国江苏省)作为本研究中所用的载玻片。

切片厚度的考察与优化：本研究中，制备8μm，10μm和12μm的脑组织冷冻切片，对切片厚度进行了考察和优化。如图3所示，在AFADESI-MSI正离子检测模式下，与10μm和12μm的厚度相比，厚度为8μm的组织切片的总离子信号强度最高，且检测到的总离子数目最多，从图4可以看出，在切片厚度为8μm时，三种代表性代谢物谷氨酰胺(Glutamine,m/z169.0584)、L-肉碱(L-Carnitine C16:1,m/z 398.3265)、磷脂酰胆碱(PC(40:6),m/z872.5566)的离子强度最高且离子图像空间分辨率也较好，这可能是由于组织切片厚度较薄时，代谢产物可以完全暴露出来。

由于厚度小于8μm时，难以制备具有良好物理形态的冷冻组织切片，因此未进一步评价厚度小于8μm的组织切片。最终选择的脑组织冷冻切片厚度为8μm。

喷雾溶剂体系的考察与优化：本研究采用AFADESI-MSI系统，制备相邻的大鼠脑切片(8μm)，考察了不同比例的乙腈-水体系作为喷雾溶剂时对大鼠脑组织中内源性代谢物的解析能力和离子化效果，六种喷雾溶剂体系为：ACN/H

喷雾溶剂流速的考察与优化：本研究以大鼠脑组织切片(8μm)为研究对象，考察了5μL/min、7μL/min、10μL/min、15μL/min 4种不同喷雾溶剂流速下AFADESI-MSI系统对脑组织中内源性代谢物的检测灵敏度。由图7可以看出，喷雾溶剂流速在7μL/min时，总离子强度最高，虽然10μL/min、15μL/min的流速下检测到的离子数比7μL/min多，但是由于喷雾溶剂的流速和雾化气的强度直接影响喷雾液滴的尺寸和速度，进而影响解析和电离效率。喷雾溶剂流速越高，空间分辨率也随之下降，如图8，在喷雾溶剂流速为7μL/min时，三种代表性代谢物谷氨酰胺(Glutamine,m/z169.0584)、L-肉碱(L-Carnitine C16:1,m/z 398.3265)、磷脂酰胆碱(PC(40:6),m/z872.5566)的离子强度均最高且离子图像空间分辨率也最好，综合考虑节约溶剂和空间分辨率等因素，本研究最终选定喷雾溶剂流速为7μL/min。

质量分辨率的考察与优化:质量分辨率AFADESI-MSI分析的分离能力，灵敏度和空间分辨率有很大影响。如图9所示，随着质量分辨率从15,000增加到240,000，通过AFADESI-MS分析检测到的离子数量增加了，但是总离子流的强度却相对减小。这可能是因为质量分辨率的提高会增强精确质量相近的代谢物质谱分离，但由于扫描速度的降低，也会导致总体灵敏度降低。此外，随着质量分辨率的提高，MS图像的分离能力也得到了显着提高。如图10所示，当质量分辨率低于60,000时，AFADESI-MSI无法分离m/z 788.4637和m/z 788.4999处的代谢物，但在质量分辨率下高于120,000时，可以观察到这两个代谢物在大鼠脑中的空间分布是互补的。因此，最终选择了质量分辨率为120,000进行AFADESI-MSI分析。如图11可以看出，120,000的质量分辨率可以将具有相似m/z值的代谢物进行精确区分，并且灵敏度较高。

方法的重复性考察：为了评估AFADESI-MSI分析脑组织切片方法稳定性，制备同一大鼠大脑的相邻脑组织切片6片，在负离子检测模式下，进行连续六天的AFADESI-MSI分析。六个具有不同m/z值的代表性代谢物的质谱成像图如图12所示，牛磺酸(Taurine，m/z124.0075)，抗坏血酸(Ascorbic acid，m/z 175.0254)，葡萄糖(Glucose，m/z 215.0335)，脂肪酸(FA(22:6)，m/z 327.2343)，磷脂酸(PA(P-36:2/PA(O-36:3)，m/z 726.5487)和磷脂酰丝氨酸PS(40:6)(m/z 834.5381)使用总离子流(TIC)进行归一化后，6天中这些代谢物的空间分布和信号强度一致，这表明本研究针对脑组织冷冻切片所建立的AFADESI-MSI方法稳定性良好，可用于空间分辨代谢组学的分析。

通过上述考察和优化，最终建立适用于大鼠脑组织中内源性代谢物的AFADESI-MSI分析方法。最终确定脑组织切片厚度为8μm，贴附于正电荷防脱载玻片上，采用的AFADESI-MSI分析系统的关键参数的如表1所示。

表1、AFADESI分析关键参数

实施例2、脑组织内源性代谢物作为生物标志物在制备诊断糖尿病脑病的产品中的应用

动物实验：选用7～9周龄，180～240g的雄性Wistar大鼠，正常对照组(空白对照组)12只给予正常饲料，其余动物为糖尿病模型组，饲喂4周高脂饲料(HFD12492高脂饲料，美国Research Diets)，禁食(自由饮水)后腹腔注射链脲佐菌素STZ(购自Sigma Aldrich美国密苏里州圣路易斯，35mg/kg)，正常对照组腹腔注射给予新鲜配置的柠檬酸钠溶液(0.1mol/L，PH 4.4)，造模2h后给予10％蔗糖水2天。第7天尾静脉取血，测定血糖浓度，以连续3天血糖浓度大于16.7MMOL/L。并出现尿糖强阳性，尿量大于对照组50％以上为造模成功。继续饲养12周。在试验中持续观察动物的体征，定期测定体重、摄食量、饮水量、血糖、血液生化等指标，在12周进行Morris水迷宫实验，观察大鼠认知功能的变化。水迷宫实验结束后，大鼠腹腔注射2.0％的戊巴比妥钠进行麻醉，(麻醉剂量为40～50mg/kg)，等大鼠完全麻醉后，腹主动脉放血处死，然后进行解剖。小心取出大鼠大脑，用生理盐水冲洗干净后，滤纸吸取多余水分，迅速置于液氮中固定，随后在-80℃冰箱中冻存。

生化分析和组织病理学染色。使用血糖仪(瑞士巴塞尔罗氏)测量FBG浓度。使用Quo-Test HbA1c分析仪(QUOTIENT Diagnostics Ltd.Walton-on-Thames,Surrey,UK)测量糖化血红蛋白(HbA1c)浓度。使用AU480自动化学分析仪(Beckman Coulter公司，美国加利福尼亚州布雷亚)测定血糖(GLU)、胆固醇和甘油三酯(TG)水平。

使用Leica CM1860冷冻切片机(德国Leica Microsystem Ltd.)在-20℃下制备8μm厚的大脑组织切片，粘附载玻片上进行苏木精和伊红(H&E)染色以显示组织病理学损伤。

水迷宫实验：使用SMG-2水迷宫设备(中国医学科学院药物研究所，北京)来评估大鼠的空间学习能力和记忆。此迷宫是直径为120cm，高度为50cm的黑色圆形水池。池中水深30cm，水温为24℃±2℃。在迷宫的东南象限中心的水面以下2cm处，设有一个直径为15cm的圆形逃生平台，由跟踪系统测量大鼠的逃避潜伏期和记录到达平台的路径。

在本研究中，大鼠从饲养室取出后，在实验室适应30min。设定好计算机控制条件，水迷宫数据传输线与计算机相连，接通电源。将大鼠的头部朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录大鼠找到水下平台的时间(s)。在前几次训练中，如果大鼠在最长60s内找不到隐藏的平台，则操作员将引导其到达平台上并记录为60s。让动物在平台上停留10s后，再将大鼠移开、擦干，放回笼内。每只大鼠每天训练1次，连续训练2～5天。最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始90s的探查训练。将大鼠由原先平台象限的对侧放入水中。记录大鼠在目标象限(原先放置平台的象限)所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。

FBG、GLU、HbA1c、TG和CHOL的结果总结在图13中。与对照组相比，糖尿病大鼠的FBG水平显著升高(P<0.01)，并在12周的观察期内保持稳定。糖尿病大鼠HbA1c、TG水平明显高于对照组(P<0.05)。糖尿病组CHOL水平略高于对照组(P>0.05)。这些结果符合糖尿病的临床特点，说明成功建立了糖尿病大鼠模型。

体重、脑重量、脑/体重比以及H&E染色脑组织的代表性显微照片如图14所示。糖尿病大鼠的体质量和脑质量均显著低于对照组(P<0.05)。H&E染色脑组织的组织学检查表明糖尿病组出现脑萎缩。糖尿病大鼠在Morris水迷宫实验中的逃逸潜伏期明显长于对照组(P<0.05)。这些结果表明，高血糖会影响糖尿病大鼠的脑组织形态以及学习记忆能力。

糖尿病脑病大鼠不同脑区代谢物的变化

脑作为大鼠最复杂的器官，具有高度异质性。根据神经结构，化学特性和组织的连通性，大脑可以细分成数千个区域。本研究将大脑冠状面大致分为八个区域进行分析，其对应的组织学结构如图14E所示分别是杏仁核(AM)，胼胝体(CC)，大脑皮层(CTX)，海马(HP)，丘脑(TH)，内囊(IC)，中腹核(MN)，下丘脑和黑质(HY-SN)。

为了研究糖尿病脑病模型大鼠大脑不同区域的代谢变化，通过AFADESI-MSI获得了对照组和糖尿病大鼠大脑冠状切片的空间分辨的代谢组轮廓。在AFADESI-MSI正离子检测模式下，分别在整个脑部(WHOLE)，AM，CC，CTX，HP，HY-SN，IC，MN和TH检测到1158、1249、968、1062、1157、1264、907、1200和1106个特征。在负离子模式下，分别在整个脑部(WHOLE)，AM，CC，CTX，HP，HY-SN，IC，MN和TH检测到1044、1013、772、1043、956、978、749、964和885个特征。

为了观察不同脑区的代谢物是否有区别，对整个脑(WHOLE)以及8个脑区得到的数据进行OPLS-DA分析，以实现最大程度的分离。结果见图15，从正离子(C，D)和负离子(A，B)检测模式下的OPLS-DA模型的散点图可以看出，WHOLE，AM，CC，CTX，HP，HY-SN，IC，MN和TH之间有明显分离的趋势，表示这些形态区域之间的化学成分明显不同，其代谢谱有明显的差异。与对照组相比，糖尿病组不同脑区的代谢谱也都发生了变化。

为了获得糖尿病组大鼠和对照组大鼠的差异代谢物，对正、负离子检测模式获得的各个脑区的数据进行了OPLS-DA分析，结果见图16和图17。可以看到，糖尿病组和对照组之间不同脑区(WHOLE，AM，CC，CTX，HP，HY-SN，IC，MN和TH)之间都具有明显的分组趋势，这表明在糖尿病大鼠的这些区域中发生了显着的代谢改变。

进一步筛选分组贡献大的变量(VIP>1)，随后经过Student’s t检验(P<0.05)，在正负离子检测模式下，共在WHOLE，AM，CC，CTX，HP，HY-SN，IC，MN和TH中筛选了27，98、27、19、43、118、61和28个差异变量。随后对差异代谢物进行了结构鉴定，最终初步鉴定出19种差异代谢物(表2)。这些差异代谢物与糖酵解、磷酸戊糖途径、谷氨酸/γ-氨基丁酸-谷氨酰胺循环和三羧酸循环、核苷酸代谢；脂质代谢；肉碱代谢；牛磺酸代谢、抗坏血代谢酸、组氨酸代谢，胆碱代谢密切相关。这些差异代谢物在糖尿病大鼠脑组织中的分布及其变化趋势见图18。从图中可以看，这些代谢物在大鼠脑组织中具有独特的分布特征，并且在糖尿病脑病模型大鼠脑组织的分布与对照组大鼠有显著差异。这些结果提示，糖尿病脑病模型大鼠脑组织中发生了糖酵解和磷酸戊糖途径活性增强，线粒体代谢紊乱，腺嘌呤能、谷氨酸能、多巴胺能、胆碱能和组胺能神经传导系统失调和透调节、抗氧化系统紊乱和脂质代谢紊乱，并且这些变化具有区域特异性。这些差异代谢物有望发展成为具有组织特异性的糖尿病脑病生物标志物。

表2、通过AFADESI-MSI正负离子分析获得的糖尿病组与对照组的差异代谢物

本发明基于超高分辨质谱的AFADESI-MSI质谱成像技术，建立了一种适用于脑组织中各种内源性代谢物全面分析的原位代谢组学分析方法，旨在系统研究各种内源性代谢物在脑组织不同区域的分布特征，获取与糖尿病脑病发生的生物标志物，并深入探讨糖尿病脑病的发病机制。本发明为糖尿病脑病发病机制和药物开发提供新的研究策略与技术手段，为糖尿病脑病的诊断、预防和治疗提供有重要价值的参考信息。