一种双层微流控芯片、包含该芯片的乳腺癌miRNA检测试剂盒及制备方法、检测方法

摘要

本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种用于核酸检测的双层微流控芯片、包含该芯片的检测试剂盒及其制备方法、检测方法。一种双层微流控芯片，包括上层的阀门控制层、中间的流道层和功能化基底，所述流道层设有微腔、与所述微腔连接的微流道、以及进样口和出样口；所述的阀门控制层包括控制阀、与所述控制阀连接的阀门进样口；所述功能化基地分为检测区和反应区，所述检测区与所述微腔对应，所述反应区与所述微流道对应。本发明还提供一种乳腺癌miRNA检测试剂盒。本发明的双层微流控芯片结构简单、易于制备，采用该芯片和试剂盒对乳腺癌miRNA检测进行检测，耗时短、步骤简单、灵敏度高、检测样品需求量少，能够实现乳腺癌miRNA的快速、高效检测。

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，涉及一种用于核酸检测的双层微流控芯片、包含该芯片的检测试剂盒及其制备方法、检测方法。

背景技术

乳腺癌作为女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响女性的生命健康安全，其发病率呈现上升并且具有年轻化的趋势。2011年最新调查发现，乳腺癌在影响全球女性恶性肿瘤死亡率方面位居首位。由于乳腺癌初期表现症状不明显，多数病人就诊时已经发展到中晚期，而乳腺癌的早期诊断在缓解病人后续治疗痛苦及延长患者生命时间等方面具有重要价值。因此，提高乳腺癌早期检测水平，探索良好的早期诊断指标具有重要意义。传统意义上，对于乳腺癌的早期诊断主要采用Qrt- PCR技术、蛋白免疫印迹等，这些方法具有低的检测灵敏度、长的时间消耗以及高的样本消耗等不足，因此很少被应用于临床癌症的早期诊断。

MiRNA是一种长度在19-23 bp非编码蛋白的单链RNA，参与动植物内转录后基因的表达调控，在动植物中起重要的调节作用。许多研究表明miRNA在生物体内可以参与不同的生物过程，如发育、血管生成、分化、免疫细胞的功能、增殖、凋亡等，同时其表达水平在不同个体内是不同的，即使在同一个体内，健康和有疾病时的表达量也是不同的。正因为表达水平的差异，miRNA可以被用作标记物，来检测生物体的异常。Mostafa Azimzadeh等人采用电化学生物传感器对乳腺癌miR-155基因进行了检测，此基因可以被作为乳腺癌的标记基因；Kseniia Boriachek等人采用电化学方法对miR-21基因进行了检测，体现出了正常和患者之间的表达量的差异。miRNA以其特有的优势，如可稳定存在于血清/血浆中，采样时无创口等，在癌症的早期检测中具有潜在的应用价值。

miRNA的发现为癌症的早期检测提供了新的方法，目前基于miRNA的检测方法一般是基于核苷酸杂交和扩增的原理，其主要包括PCR、Northern印迹和微阵列芯片等，这些方法将miRNA杂交信号转化为可测量的信号从而达到定量或定性的目的。但这些方法在使用过程中存在很多问题，如Northern blotting技术耗时长、操作繁琐、样品需求量大等；PCR技术需要对目标物进行扩增，然后再通过凝胶电泳进行结果判断，检测过程耗费时间较长，步骤繁琐。因此，为了充分利用miRNA在癌症检测时表现出的优势，有必要发展一种快速、高效、准确度高的基于miRNA 癌症早期检测方法，为乳腺癌的早期发现提供技术支持。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种耗时短、高灵敏度、检测样品需求量少，用于乳腺癌早期诊断的双层微流控芯片、试剂盒及其制备方法。

本发明解决其技术问题首先采用的一种技术方案是：一种双层微流控芯片，包括上层的阀门控制层、中间的流道层和功能化基底，所述流道层上设有微腔、与所述微腔连接的微流道、以及进样口和出样口；所述的阀门控制层包括控制阀、与所述控制阀连接的阀门进样口；所述功能化基底分为检测区和反应区，所述检测区与所述微腔对应，所述反应区与所述微流道对应。

作为本发明的一种优选方式，所述的反应区修饰有纳米氧化石墨烯或纳米石墨烯材料，检测区修饰多聚赖氨酸。

进一步优选的地，所述的反应区固定有检测探针。

作为本发明的一种优选方式，所述微腔控制阀设置在所述微腔的入口处，所述的微流道控制阀设置在所述微流道和出样口之间。

本发明解决其技术问题，还提供一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，该试剂盒包括所述的双层微流控芯片、乳腺癌miRNA标准品和荧光标记的miRNA探针。

作为本发明的一种优选方式，所述的乳腺癌miRNA标准品分别是以乳腺癌标志物miR-125、miR-126、miR-155、miR-191、miR-21为模板合成的产物。

进一步优选地，还包括稀释试剂，所述的稀释试剂包括1M TE Buffer和RNA保护液，用于对乳腺癌miRNA标准品或探针进行稀释。

本发明进一步提供了一种乳腺癌miRNA检测试剂盒的制备方法，包括：

双层微流控芯片的制备；

乳腺癌miRNA标准品的合成；

荧光探针的合成。

进一步优选地，所述的双层微流控芯片的制备步骤为：

（1）采用RTV 615A和RTV 615 B两种试剂，分别制备阀门控制层和流道层；

（2）制备功能化基底；

（3）将阀门控制层和流道层合并，然后与功能化基底键合；

（4）在功能化基底的反应区铺设荧光探针。

本发明还提供了采用所述的试剂盒对乳腺癌miRNA进行检测的方法，包括：

（1）将乳腺癌miRNA标准品稀释成梯度浓度，分别将各浓度的miRNA标准品溶液，注入到已经铺设荧光探针的双层微流控芯片的进样口，采用氮气从进样口将其吹入到微流道内；

（2）在微流道内孵育20-30 min；采用氮气从进样口将微流道内液体吹入到微腔中，并采用冲洗试剂对微流道进行冲洗，将其冲入到微腔中；

（3）液体在微腔内孵育10-15 min；

（4）然后将芯片整体浸在3% BSA中，并将基底上面的双层PDMS揭掉，基底浸泡10-15min进行封闭；

（5）封闭后的基底依次用100% PBS、50% PBS、超纯水浸泡，吹干进行荧光检测；

（6）将不同浓度和荧光值的对数进行线性拟合，制作标准曲线；

（7）对待测样本中miRNA进行荧光检测，根据标准曲线，将测量的荧光值带入，得到待测样本中miRNA的含量。

本发明的有益效果是：提供一种用于乳腺癌miRNA检测的双层微流控芯片、包含该芯片的试剂盒、试剂盒的制备方法及应用，本发明的双层微流控芯片结构简单、易于制备，使用方便，采用该芯片和试剂盒对乳腺癌miRNA检测进行检测，耗时短、步骤简单、灵敏度高、检测样品需求量少，能够实现快速、高效的检测，为乳腺癌的早发现和早诊断，提供了技术平台。

附图说明

图1为本发明实施例中一种双层微流控芯片的结构示意图；

图2为本发明实施例中一种双层微流控芯片的俯视图；

图3为阀门控制层结构图；

图4为流道层结构示意图；

图5为功能化基底结构示意图；

图6为本发明实施例中乳腺癌血清miRNA检测试剂盒对不同浓度miR-125检测的荧光值图；

图7为本发明实施例中绘制乳腺癌血清miRNA浓度对荧光值的标准曲线图；

图8为本发明实施例中乳腺癌血清miRNA检测试剂盒及检测方法的实际浓度检测结果与理论浓度的对比图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

本发明提供的第一个实施例是：一种双层微流控芯片，该芯片的结构图1和图2所示，从上到下依次为阀门控制层1、流道层2、功能化基底3。

如图2和3所示，在阀门控制层1上设有阀门进样口4、微腔控制阀5、微流道控制阀6，阀门进样口4分别通过微流道与微腔控制阀5、微流道控制阀6连接。

如图2和4所示，在流道层2上，设有微腔8、进样微流道10，出样微流道9。进样微流道一端与微腔8连接，另一端以进样口11连接。出样微流道9一端与进样微流道靠近微腔端处连接，另一端连接出样口7。

如图2所示，微腔控制阀5位于微腔8的出口通道上，用于控制微腔的液体出入。微流道控制阀位于出样微流道9上方，用于控制出样微流道的通断。

如图5所示，流道层2的下方是功能化基底3，在功能化基底3上分为反应区和检测区，其中，反应区对应流道层2上的进样微流道10区域，反应区内修饰有纳米氧化石墨烯，并且，在反应区内通过纳米氧化石墨烯的吸附作用固定有用于检测乳腺癌miRNA标志物的荧光探针，如图所示，乳腺癌标记物探针分子12上标记有FAM荧光基团分子13。检测区对应流道层2上的微腔8区域，修饰有多聚赖氨酸，用于结合固定乳腺癌miRNA标志物的荧光探针与miRNA结合形成的双链，用于后续荧光检测。

本发明的第二和实施例是，提供一种乳腺癌miRNA检测试剂盒，该试剂盒包括上述实施例中提供的双层微流控芯片、检测试剂、检测探针、稀释试剂、冲洗试剂。其中，检测试剂用来对微流控芯片进行标定，稀释试剂用来对乳腺癌miRNA标准品进行稀释，包括1M TEBuffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0）和RNA保护液。冲洗试剂用于对流道进行冲洗，包括1M TE Buffer（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH=8.0）。

本实施例的试剂盒中，检测试剂包括5种乳腺癌miRNA标准品、封闭液（3% BSA）、清洗液（100% PBS，50% PBS，超纯水）。

乳腺癌miRNA标准品：试剂盒内的乳腺癌miRNA标准品是合成的乳腺癌标志物，该标志物是根据microRNA数据库上报的核苷酸序列miR-125、miR-126、miR-155、miR-191、miR-21为模板，由TakaRa公司设计合成，其序列见表1。

表 1 miRNA标志物序列

miRNA标志物在合成后处于粉末状态，使用之前需要进行稀释：（1）稀释之前请勿打开小管盖子，将小管放置于4 ℃低温离心机（3000 rpm）离心一段时间，；（2）避光环境下，加入v(μl)= nmol数x10的1M TE buffer；（3）4℃低温离心机（3000rpm）离心一段时间，取出，-20℃环境下保存。MiRNA标志物在稀释后还需要加入一定量的RNA保护液。

封闭液的制备：采用PBS将BSA按一定比例进行稀释即可。

本实施例的试剂盒中，检测探针包括miR-125、miR-126、miR-155、miR-191、miR-21上述5个乳腺癌标志物的探针。在探针的3′端修饰荧光基团 ，如FAM，Cy3等。探针的序列、Tm值见表2。

表 2 乳腺癌标记物探针的序列、Tm值

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，具体步骤为：

（1）双层微流控芯片阀门控制层的制备

采用RTV 615A和RTV 615 B两种试剂，并将两种试剂按照一定比例混合后，倒入到具有阀门控制层图案的模具中，80℃环境下，烘烤1-2h，冷却至室温后，从模具上取下即可。

（2）双层微流控芯片中间流道层的制备

采用RTV 615A和RTV 615 B两种试剂，并将两种试剂按照一定比例混合后，倾倒在具有中间流道层图案的模具上，并采用匀胶仪（3000rpm，1-2min）将上述混合试剂均匀覆盖到模具上，70℃环境下，烘烤30-40 min，取出，室温下放置10-20 min后，保存。

（3）双层微流控芯片功能化基底的制备

将干净基底进行划线处理，区分出检测功能区和反应功能化区域；将上述基底在食人鱼溶液中预处理后采用去离子水清洗干净；Plasma处理基底表面（10-20min）；在基底表面生长偶联剂APTMS后用去离子水清洗；在基底反应功能化区生长氧化石墨烯，生长后取出，并用去离子水清洗；在检测功能区生长修饰多聚赖氨酸，生长后取出，并用去离子水清洗，最后吹干、至此，双层微流控芯片功能化基底制备完成。

（4）双层微流控芯片阀门控制层和中间流道层合并：将已经制备好的阀门控制层，在显微镜下与流道层贴合后，在70℃环境下，烘烤1-2h，冷却至室温。

（5）将上述两层的合并体与功能化基底键合。

（6）采用稀释试剂对荧光探针试剂进行稀释

将探针试剂在未开盖的情况下，离心一段时间（4℃，3000 rpm）；避光无菌环境下将瓶盖打开，取一定量的稀释试剂（液体量：ul=nmol数x100）加入到探针试剂瓶中，并进行离心（4℃，3000 rpm）。

（7）在双层微流控芯片反应功能区铺设标记物探针

取1-2ul稀释后的探针试剂，加入到双层微流控芯片的进样口11；将微腔控制阀5关闭，微流道控制阀6开启，采用氮气将进样口11中的探针试剂经进样微流道10和出样微流道9吹入到出样口7；关闭微流道控制阀6，保持微腔控制阀5状态不变，孵育30-40 min；开启微流道控制阀6，保持微腔控制阀5状态不变，从出样口7将进样微流道10内多余的液体吸出；至此，标记物探针铺设完成，检测芯片制备完成。

本发明还提供了采用上述实施例中的试剂盒，检测乳腺癌miRNA的方法，以检测乳腺癌血清中miR-125为例，具体步骤如下：

1、提取血液中的血清：采用抗凝管抽取一定量的血液后，放在室温下，无菌环境中，静置5个小时左右，取最上层淡黄色液体。将此液体在4 ℃环境下低温离心一段时间；取上层液体，放入EP管中，-80 ℃保存，备用。

2、制作标准曲线

（1）采用稀释试剂将粉末状态的miR-125标记物标准品稀释成液体状态；采用1M TEBuffer将液体状态的miR-125标记物稀释成梯度浓度，分别为：10

（2）微腔控制阀5关闭，微流道控制阀6开启，分别取2 μl各浓度的miRNA标准品溶液，注入到已经铺设miR-125荧光探针（浓度10

（3）将微腔控制阀5开启，微流道控制阀6关闭，采用氮气从进样口11将进样微流道10内液体吹入到微腔8中，并采用冲洗试剂对进样微流道10进行冲洗，将其冲入到微腔8中；

（4）将微腔控制阀5关闭，微流道控制阀6状态不变，液体在微腔8内孵育10-15 min；（5）将双层微流控芯片整体浸在封闭液（3% BSA）中，并将基底上面的PDMS揭掉，浸泡10-15min；

（6）封闭后的芯片依次用100% PBS浸泡；50% PBS浸泡；超纯水多次浸泡；吹干，进行荧光检测；

（7）对荧光信号进行检测，分析荧光值；对荧光值取log，与浓度进行线性拟合，制作标准曲线，以miR-125为例，拟合公式为lg[f (x)]=5.60+0.19lgx，如图6、7所示。

3、检测血清中的miRNA

取2μl的血清注入到芯片的进样口11；采用氮气从进样口11将血清吹入到进样微流道10内；将微流道控制阀6关闭，微腔控制阀5状态不变，血清在进样微流道10内孵育20-30min；将微腔控制阀5开启，微流道控制阀6关闭，采用氮气从进样口11将进样微流道10内的液体吹入到微腔8中，并采用冲洗试剂对进样微流道10进行冲洗，将其冲入到微腔8中；将微腔控制阀5关闭，微流道控制阀6状态不变，液体在微腔8内孵育10-15 min；将芯片整体浸在3% BSA中，并将基底上面的PDMS揭掉，玻璃基底浸泡10-15 min；然后依次用100% PBS浸泡；50% PBS浸泡；超纯水多次浸泡；吹干，进行荧光检测。

（4）计算：根据标准曲线得到的荧光值与浓度的关系式，将测量的荧光值带入，得到待测血清中miRNA的含量。

对本发明的试剂盒检测结果的准确性进行验证试验：通过采用本发明的试剂盒和方法对不同浓度的标准品溶液进行实际检测，并将检测结果与标准品溶液的真实浓度进行对比，如图8所示，两者误差较小，说明本发明提供的试剂盒和检测方法准确度高。