一种水曲柳高效遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种水曲柳高效遗传转化方法，选取水曲柳种子浸泡24h，去掉外种皮，表面消毒后进行预培养，在预培养时加柠檬酸钾，将预培养之后的成熟合子胚子叶部分及胚根部分切去，剩余的下胚轴放入WY4培养基中，密封好后，放入超声波清洗机中超声90s，把WY4培养基倒掉，将下胚轴与OD600＝0.6的农杆菌菌液混合后密封好，放入真空装置中，真空泵开启后约3min，真空压力达到0.8Mpa，在此压力下持续10‑15min，关闭真空泵开关，打开阀门，2min后恢复为标准大气压，在超净工作台中将下胚轴取出，无菌滤纸吸去多余菌液后，将下胚轴接入不定芽诱导培养基中，之后按照常规方法进行共培养、脱菌、选择培养、PCR检测，确定转基因植株。该方法的建立，一方面可用于提高水曲柳的转化效率，达到遗传转化的要求；其次，可以用于水曲柳遗传转化辅助育种；第三，也可以通过遗传转化筛选突变体，获得优良品种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水曲柳高效遗传转化方法，所属的技术领域为植物生物技术。

背景技术

水曲柳(Fraxinus mandschurica Rupr.)木犀科，白蜡树属，高大落叶乔木，是我国东北素有“三大硬阔”之称的珍贵树木之一，木材材质优良，纹理美观，广泛应用于各领域。水曲柳繁殖主要以种子繁殖，目前对水曲柳种子初生休眠和次生休眠的解除方法已有一定研究,但水曲柳种子萌发也必须经过长达6个月的春化处理，否则需要2-3年才能自然萌发。水曲柳体胚繁殖过程中伴随着外植体的褐化现象，并且水曲柳体胚大部分都产生在褐化的外植体上，以未成熟子叶为外植体，形成体细胞胚需60d，体细胞胚发生率为37.2％,产生体胚的920个外植体中共有842个外植体发生褐化(占发生体胚外植体总数的91.5％)。褐化现象普遍被认为是阻碍组织培养的。因此，这些问题都阻碍了水曲柳体细胞胚的大量繁殖以及在实际中的应用。目前通过对采穗母树、扦插基质、生根粉等方面的研究，已经探索出了各种影响水曲柳生根的因素。但是扦插的效率依然不是非常高，无法满足大规模生产，造成水曲柳育种速度迟缓。

遗传转化辅助育种可以精准的获得需要的良种，提高林木抗性，缩短育种周期，提高育种效率。目前常用的遗传转化法包括聚乙二醇(PEG)法、电穿孔法、微注射法、基因枪法等。遗传转化辅助育种已在多种农林植物中应用，然而在水曲柳中还未见成功的报道，主要原因是一直没有合适的水曲柳不定芽再生体系。发明人在前期研究中建立了通过不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法，为水曲柳转基因研究提供了技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的水曲柳遗传转化方法。该方法可以获得抗性苗，提高遗传转化效率。从而为水曲柳精准育种、获得速生和珍贵新品种，缩短育种周期提供重要的技术支持。

为了达到上述目的，本发明选取水曲柳下胚轴为外植体，将下胚轴经过柠檬酸钾预培养之后，放在超声仪中超声，超声结束后与培养好的农杆菌混合，放在真空装置中进行真空渗透，之后按照常规的转基因方法进行共培养、脱菌、选择培养，获得抗性苗再通过分子生物学技术进行检测，确定转基因植株。

一种高效的水曲柳遗传转化方法，关键点在于利用超声加真空渗透辅助进行农杆菌侵染，该辅助方法既可以使下胚轴表面受伤增加不定芽的分化率，又可以增加农杆菌进入下胚轴的概率。

一种高效的水曲柳遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)遗传转化受体的准备：通过双重表面杀菌，获得无菌外植体，对外植体经柠檬酸钾预培养，以待备用；

(2)农杆菌的培养：将有目标基因的载体转化根癌农杆菌菌株LBA4404后，利用YEB培养基进行活化和扩大培养，以待备用；所述YEB培养基上含有50mg/L卡那霉素(Kan)和50mg/L利福平(Rif)；

(3)农杆菌重悬液的制备：将培养好的农杆菌菌液分装于50ml离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清，用重悬液重悬菌体沉淀，以待备用；

(4)水曲柳遗传转化受体侵染：采用超声加真空渗透法对水曲柳下胚轴进行农杆菌侵染。将预培养之后的下胚轴切去子叶和胚根后放入WY4培养基中，密封好后放入超声波清洗机中超声90s，把培养基倒出，将超声后的下胚轴与OD

(5)共培养：将(4)中侵染之后的下胚轴接种在WY4培养基上，放在黑暗条件下，25℃培养3d；

(6)脱菌：将共培养后的下胚轴，在无菌条件下用无菌水洗3次，接种在含有500mg/L头孢噻肟钠的WY4培养基中，连续脱菌3d；

(7)选择培养：将脱菌后的下胚轴，在无菌条件下接种在含有500mg/L头孢噻肟钠和30mg/L卡那霉素(Kan)的WY4培养基中，按照下胚轴直接出芽的诱导方法进行培养，直到获得抗性芽；

(8)抗性苗检测：将选择培养获得的抗性芽进行DNA提取和PCR检测，根据是否扩增出目的片段，确定是否为转基因植株。

本发明的有益效果

1、超声真空辅助遗传转化可以提高转化率；2、获得带有目标基因的水曲柳；3、起到精准育种的作用；4、筛选突变体。

附图说明

图1水曲柳下胚轴

图2共培养之后的下胚轴

图3超声真空后下胚轴形成的芽原基

图4下胚轴形成不定芽

图5选择培养后非转基因下胚轴死亡

图6选择培养后转基因下胚轴获得的抗性芽

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明采用的植物培养基以WPM为基础培养基，成分包括：NH

下胚轴预培养培养基为：WPM+10-30g·L

不定芽诱导培养基为WY4：WPM+1.0mg·L

农杆菌培养基为YEB：1.0g·L

采用的菌种为专业领域人员熟知的也是通用的农杆菌LBA4404，因此不需要进行菌种保存。

本发明按照以下步骤进行：

(1)遗传转化受体的准备：按照不定芽直接萌发途径获得水曲柳再生植株的方法中外植体的表面消毒、预培养方法进行操作，将健康饱满无损害的水曲柳种子浸泡24h，去掉外种皮，用70％的酒精消毒30s后、转入10％的次氯酸钠溶液中消毒13min，无菌水冲洗5-6次，吸干水分后用刀切开种子，取出合子胚，接种在下胚轴预培养培养基中，在温度为25℃下暗培养1-7d；

(2)农杆菌的培养：将有目标基因的载体转化根癌农杆菌菌株LBA4404后，接种到固体YEB培养基上，28℃培养箱中培养2d；挑取单菌落至5ml液体YEB培养基中，28℃、180rpm/min振荡培养12h后，取100ul加入到100ml液体YEB培养基中，28℃、180rpm振荡培养至适宜，以待备用；所述YEB培养基上含有50mg/L卡那霉素(Kan)和50mg/L利福平(Rif)；

(3)农杆菌重悬液的制备：将培养好的农杆菌菌液分装于50ml离心管中，5000rpm离心10min，弃去上清，用重悬液重悬菌体沉淀，分光光度计测量OD

(4)水曲柳的遗传转化：

采用三种方法对水曲柳下胚轴进行农杆菌侵染：

第一种方法：仿照农杆菌叶盘转化法，在超净工作台上将预培养3d的水曲柳成熟合子胚子叶部分及胚根部分切去，剩余的下胚轴浸泡在OD

第二种方法：将子叶节-胚轴纵切之后侵染，在超净工作台中将预培养3d的水曲柳成熟合子胚子叶中部以上及胚根部分切除，将剩余部分垂直于子叶方向纵向切开，将切开的子叶节-胚轴放在OD

第三种方法：超声加真空渗透法，在超净工作台中将预培养3d的水曲柳成熟合子胚子叶部分及胚根部分切去，剩余的下胚轴(图1)放入WY4培养基中，密封好后，放入超声波清洗机中超声90s，把WY4培养基倒掉，将下胚轴与OD

(5)共培养：将(4)中接种后的下胚轴放在黑暗条件下，25℃培养3d；

(6)脱菌：将共培养后的下胚轴(图2)，在无菌条件下用无菌水洗3次，接种在含有500mg/L头孢噻肟钠的WY4培养基中，连续脱菌3d；

(7)选择培养：将脱菌后的下胚轴，在无菌条件下接种在含有500mg/L头孢噻肟钠和30mg/L卡那霉素(Kan)的WY4培养基中，按照下胚轴直接出芽的培养条件进行培养；

(8)抗性苗检测：将选择培养获得的抗性芽进行DNA提取和PCR检测，根据是否扩增出目的片段，确定是否为转基因植株；

按照第一种方法仿照农杆菌叶盘转化法进行农杆菌侵染的实验结果显示：在选择培养基中培养20d后，不定芽出现褐化和白化现象，不定芽并不能伸长，逐渐死亡，说明转化未成功。

按照第二种方法将子叶节-胚轴纵切之后进行农杆菌侵染的实验结果显示：下胚轴出现不定芽，经过2-3个继代选择培养之后，获得的抗性芽也褐化死亡，说明转化未成功。

按照第三种方法超声加真空渗透法进行农杆菌侵染的实验结果显示：下胚轴出现大量的芽原基(图3)，进而形成不定芽(图4)。经过2-3个继代选择培养之后，获得健壮、绿色的抗性芽(图6)。共接种107个下胚轴，经过选择培养获得14个抗性芽，转化率为13.08％。非转基因的下胚轴在选择培养基上培养20d后褐化死亡(图5)，说明所使用的选择培养基能够筛选转化和非转化的植株。对抗性芽进行DNA提取，PCR检测，获得目的片段，说明转化成功。

与现有技术相比，本发明选择水曲柳下胚轴为外植体，利用下胚轴直接出芽再生体系，通过三种农杆菌侵染方法的对比，筛选出超声加真空渗透进行农杆菌侵染后，遗传转化率最高，说明该方法可以提高水曲柳的转化效率，达到遗传转化的要求，为后期利用遗传转化辅助育种等提供技术支持。

以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。