一种用于人粪便病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法

摘要

本发明公开了一种用于人粪便病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法。本发明的用于人粪便中的病原微生物基因组建库的核酸提取试剂盒，包括：核酸释放剂Lysis A、增强剂Lysis Enhancer、去抑制剂IRT、结合液Binding Buffer、洗涤液1和洗涤液2。本发明对核酸提取环节进行了优化，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下，下游试验的正常进行。同时对PCR扩增条件进行优化，降低了DNA建库的起始量，提高了建库成功率，降低了PCR扩增偏向性，缩短了建库周期，克服了现有建库方法对模板起始量要求高，容易出现偏向性，建库周期长等痛点。

说明书

技术领域

本发明属于DNA提取和建库领域，具体涉及一种用于人粪便病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法。

背景技术

传统的诊断病人感染性疾病的临床模式是由医生制定鉴别诊断，然后进行一系列测试，试图找出病因。临床样品中病原体常规检测的范围包括鉴定培养中生长的微生物(例如，通过生化表型检测或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间质谱法)，检测生物体特异性生物标记物(例如抗原用乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体试验或用PCR对单个试剂进行核酸试验。这些通常包括与确定的临床综合征有关的最常见病原体，如脑膜炎和脑炎、急性呼吸道感染、败血症或腹泻病。

虽然分子诊断分析为诊断最常见的感染提供了一种相当经济有效和快速的方法(通常＜2h的周转时间)。然而，目前使用的几乎所有常规微生物试验一次只能检测一种或有限的病原体，或者要求从临床样本中成功培养微生物。

幸运的是，全新的病原学诊断技术mNGS(宏基因组学二代测序)将有望解决这一难题，mNGS是一种对临床样本中的所有核酸进行测序，然后与各个物种的基因组序列对比，从而寻找可能病原体的方法。mNGS不仅可以大大缩短标本周转时间，还能及时为临床提供准确有利的诊疗依据。

目前，mNGS作为最重要的分子生物学分析方法之一，不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。自2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的高通量测序技术的相继诞生和发展。mNGS实现测序，通常通过下面三个步骤：1)通过PCR扩增技术获得含待测定区域的核酸分子；2)在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测定文库；3)通用引物扩增连接产物，达到测序要求的量。

但是，对于一些珍贵的样本往往提取获得的核酸量非常有限，常常经过去宿主等步骤处理，样本核酸量无法满足上机要求，通过PCR扩增，增加PCR循环数，加重扩增偏向性，导致对于部分GC含量高的细菌的鉴定，出现严重问题，菌种丰度比例严重失衡。同时，部分建库试剂盒存在周期过长等问题。

鉴于此，现有技术中仍亟需一种新的快速的适用于微量临床建库方法简化实验步骤，提高建库效率。

发明内容

本发明提供一种用于人粪便中的病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法，本发明对核酸提取环节进行了优化，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下，下游试验也能正常进行。同时对PCR扩增条件进行优化，降低了DNA建库的起始量，提高了建库成功率，降低了PCR扩增偏向性，缩短了建库周期，克服了现有建库方法对模板起始量要求高，容易出现偏向性，建库周期长等痛点。

本发明的第一个目的是提供一种用于人粪便中的病原微生物基因组建库的核酸提取试剂盒，其包括：核酸释放剂Lysis A、增强剂Lysis Enhancer、去抑制剂IRT、结合液Binding Buffer、洗涤液1和洗涤液2；

所述的核酸释放剂Lysis A包括20mM～40mM EDTA、40mM～80mMTri-HCl、2％～5％PVP-40(质量分数)、溶剂为DEPC水，PH值为9-10；

所述的增强剂Lysis Enhancer包括12％～15％SDS(质量分数)、4％～8％PVP-40(质量分数)、溶剂为DEPC水。

优选，所述的核酸释放剂LysisA包括20mM EDTA、50mM Tri-HCl、2％PVP-40(质量分数)、溶剂为DEPC水，所述的增强剂Lysis Enhancer包括15％SDS(质量分数)、5％PVP-40(质量分数)，溶剂为DEPC水。

优选，所述的去抑制剂IRT包括：120mM NH

优选，所述的结合液Binding Buffer包括：3M异硫氰酸胍、16.7％异丙醇(V/V)、2％Triton X100(V/V)、10mM EDTA、5mM Tris-HCl,溶剂为DEPC水,PH值6.0-7.0；

所述的洗涤液1包括：20％乙醇(V/V)、20％异丙醇(V/V)、70mM氯化钠、20mMTris-HCl，溶剂为DEPC水，PH值6.0-7.0；

所述的洗涤液2包括：70％乙醇(V/V)、20mM Tris-HCl,溶剂为DEPC水,PH值6.0-7.0。

本发明的第二个目的是提供用于人粪便中的病原微生物基因组建库的片段化处理与末端修饰部分试剂盒，包括AC Buffer、AC Enzymes；

所述的AC Buffer包括：500mM Tris-HCl、200mM KCl、100mM MgCl2、1mM DTT、10mMATP、10mM dATP、2mM dTTP、2mM dGTP、2mM dCTP、0.1％Triton X-100(v/v),溶剂为DEPC水；

所述的AC Enzymes包括：1.5U/ul T4 Polynucleotide Kinase(Enzymatics，Y9040L)、1U/ul T4 DNA Polymerase(Enzymatics，P7080L)、0.5U/ul Klenow Fragment(Enzymatics，P7060L)、1U/ul Taq-B DNA Polymerase(Enzymatics，P7250L)、4mM Tris-HCl、5mM KCl、0.8mM DTT、0.2mM EDTA、22％(质量分数)Glycerol、0.5％Triton X-100(v/v)，溶剂为DEPC水。

本发明的第三个目的是提供用于人粪便中的病原微生物基因组建库的接头连接与富集部分的试剂盒，包括Ligation XP、AD Buffer；

所述的Ligation XP包括：14％Glycerol(v/v)、20％PEG-6000(质量分数)、25％1,2-Propanediol(v/v)、40mM Tris-HCl、10mM MgCl2、10mMATP、10mM DTT、80U/ul RapidT4DNALigase(EnzyValley)，溶剂为DEPC水；

所述的AD Buffer包括：10mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、50mMNaCl，溶剂为DEPC水。

本发明的第四个目的是提供一种人粪便中的病原微生物基因组建库的核酸提取方法，其包括以下步骤：

核酸释放：转移粪便样品至研磨珠的珠磨管中，加入核酸释放剂LysisA和增强剂Lysis Enhancer至样品中，涡旋打散样品，孵育，将研磨管放进珠磨仪中进行珠磨；

抑制剂去除：转移全部上清液至离心管中，加入去抑制剂IRT至上清液中，涡旋混匀，然后离心；

过柱吸附:转移上清液至离心管中，加入结合液Binding Buffer至上清液中，颠倒混匀得到混合液,把纯化柱装在收集管中，转移混合液至柱子中，离心弃流出液，把柱子装回收集管中；

脱盐：加入洗涤液1至柱子中，离心，倒弃滤液，把柱子装回收集管中，加入洗涤液2至柱子中，离心，重复若干次洗涤液2的操作，倒弃滤液，把柱子装回收集管中，离心；

核酸洗脱：将柱子装在离心管中，加入灭菌水至柱子的膜中央，室温放置，然后再离心，获得核酸。

本发明的第五个目的是提供一种人粪便中的病原微生物基因组的建库方法，其包括以下步骤：

A.DNA片段化：

在50ul打断管中配制打断体系，根据打断体系的不同选择相应的打断时间：

B.末端修复(A-Tailed Conversion):

在0.2mL PCR管中配制末端修复反应体系：

吹打至少10次或涡旋振荡混匀，短暂离心以收集管/孔壁上的液体；

将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为80℃，并运行以下程序：

·20℃ 30min；

·65℃ 30min；

·4℃ Forever

C.连接接头：

准备连接反应前5min，根据下表配制Adapter工作液，置于冰上待用：

向末端修复反应体系中直接加入以下试剂：

将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为Off，20℃温育20min；

D.片段选择及纯化

将Fapon DNA clean Beads取出静置至室温，涡旋混匀备用；

向1.5mL管或八联管中加入30μL ddH

将1.5mL管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清；

小心吸取上清液到新的1.5mL EP管或八联管，加15μL Fapon DNA clean Beads，混合均匀，室温放置5min；

将EP管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，弃去上清液；

向EP管或八联管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，1.5mL管旋转一圈，八联管静置30s后弃去上清液；

重复上述步骤，尽量去除上清；

将1.5mL管或八联管置于磁力架上，室温静置10min至磁珠干裂或者将管子开盖放于45℃金属浴上，待磁珠表面无水光；

将离心管从磁力架上移开，并加入22μL ddH2O重悬磁珠，涡旋或吹打混匀后，瞬离收集管壁液体，室温放置2min；

将EP管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，转移20μL上清液到新的PCR管中，用于下一步扩增；

C、文库扩增：

在冰盒上配制文库扩增反应体系：

设置文库扩增反应程序：

循环数参考如下：

D、扩增产物纯化：

将Fapon DNA clean Beads涡旋，使其重新悬浮；

将PCR产物转移至新的1.5mL管或八联管中，加入0.8×40μL Fapon DNA cleanBeads，涡旋混匀，瞬离收集管壁液体，室温放置5min；

将1.5mL管或八联管放在磁力架上，静置2min，待管中溶液澄清；

小心吸取并弃去上清液体，往管内添加200μL新配的80％乙醇，于磁力架上旋转管子，待溶液澄清后，弃上清；

重复上述步骤，尽量去除上清；

将1.5mL管或八联管置于磁力架上，室温静置10min至磁珠干裂或者将管子开盖放于45℃金属浴上，待磁珠表面无水光；

向EP管或八联管中加入28μL ddH2O，吹打混匀，静置2min，将EP管放到磁力架上，直至液体变澄清；

吸取25μL上清液至新的1.5mL EP管中，并于管壁粘贴文库标签，用Qsep400质检合格，放置-20℃专用文库存放位置保存。

本发明对核酸提取环节进行了优化，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下，下游试验的正常进行。同时对PCR扩增条件进行优化，降低了DNA建库的起始量，提高了建库成功率，降低了PCR扩增偏向性，缩短了建库周期，克服了现有建库方法对模板起始量要求高，容易出现偏向性，建库周期长等痛点。

附图说明：

图1和图2是文库上机前Qsep400质检；

图3是测序数据生信分析结果。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有定义或说明，本专利所述的科学技术术语与本领域普通技术人员所理解具有相同的含义。

实施例1：

一、试剂盒核酸提取部分试剂配制：

核酸释放剂Lysis A：20mM EDTA、50mM Tri-HCl、2％PVP-40(质量分数)、溶剂为DEPC水。

增强剂Lysis Enhancer：15％SDS(质量分数)、5％PVP-40(质量分数)，溶剂为DEPC水。

去抑制剂IRT：120mM NH

结合液Binding Buffer：3M异硫氰酸胍、16.7％异丙醇(V/V)、2％Triton X100(V/V)、10mM EDTA、5mM Tris-HCl，溶剂为DEPC水，PH值7.0；

洗涤液1：20％乙醇(V/V)、20％异丙醇(V/V)、70mM氯化钠、20mMTris-HCl，溶剂为DEPC水，PH值6.4；

洗涤液2：70％乙醇(V/V)、20mMTris-HCl，溶剂为DEPC水，PH值6.4；

配制方法：将各成分按其含量加入，混合均匀，调节PH值，采用0.22um滤膜(生工，F513134-0001)过滤除菌；

二、试剂盒核酸提取部分提取方法：

核酸释放：转移2-3颗黄豆大小粪便样品至2ml含研磨珠的珠磨管中。立即加入800ul核酸释放剂Lysis A和100ul增强剂Lysis Enhancer至样品中，最高涡旋1min充分打散样品，65℃孵育20min。将研磨管放进珠磨仪中进行珠磨，强度为30m/s，时间15s，重复3次。

抑制剂去除：转移全部上清液至1.5ml离心管中，加入100ul去抑制剂IRT至上清液中，涡旋混匀，4℃放置5min,12,000x g离心1min；

过柱吸附：转移全部上清液(约1ml)至2ml离心管中，加入1ml结合液BindingBuffer至上清液中，颠倒混匀,把纯化柱(生工，B615025-1000)装在2ml收集管中。转移700μl混合液至柱子中。12,000x g离心30～60s。倒弃流出液，把柱子装回收集管中；

脱盐：倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500uL洗涤液1至柱子中，8,000xg离心1min，倒弃滤液，把柱子装回收集管中。加入500uL洗涤液2至柱子中。8,000xg离心1min，重复2次洗涤液2的操作，倒弃滤液，把柱子装回收集管中。8,000xg离心3min；

核酸洗脱：将柱子装在1.5ml离心管中。加入30-50μl预热至70℃的灭菌水至柱子的膜中央，室温放置3min。12,000x g离心1min。

三、竞品试剂盒：Magen粪便DNA提取试剂盒(货号D3141)和翊圣粪便DNA提取试剂盒(货号18820ES50)

提取步骤如下：

核酸释放：转移2-3黄豆大小粪便样品至2ml含研磨珠的珠磨管中。立即加入600μLBufferATL/PVP-10至样品中，将研磨管放进珠磨仪中进行珠磨，强度为30m/s，时间15s，重复3次，65℃孵育10min；13,000x g离心10min，转移500μl上清液至2ml离心管中，加入20μlProteinase K和500μl Buffer AL至上清液中。颠倒混匀，70℃消化10min。冷却至室温，加入500μl无水乙醇至混合液，涡旋混匀15s。

过柱吸附：把HiPure DNA Mini ColumnⅡ装在2ml收集管中。转移700μl混合液至柱子中。12,000x g离心30～60s。倒弃流出液，把柱子装回收集管中，剩余混合液按照上面步骤进行离心，直至转移完毕。

脱盐：加入500μL经乙醇稀释的Buffer GW1至柱子中。静置2min，12,000x g离心30～60s。倒弃流出液，把柱子装回收集管中；加入650μL经乙醇稀释的Buffer GW2至柱子中。静置2min，12,000x g离心30～60s。倒弃流出液，把柱子装回收集管中；12,000x g离心2min甩干柱子。

核酸洗脱：将柱子装在1.5ml离心管中。加入30-50μl预热至70℃的灭菌水至柱子的膜中央，室温放置3min。12,000x g离心1min。

所提DNA浓度及OD值检测

采用Nandrop 300对本发明试剂盒及竞品试剂盒提取的DNA进行浓度及OD检测表

注：A和B为本发明试剂盒提取部分结果，C和D为竞品提取试剂盒1(Magen，D3141)结果，E和F为竞品提取试剂盒2(翊圣，18820ES50)

从结果来看，相同体积量的标本，用本发明的试剂盒，按照本发明的提取方法获得的核酸浓度都高于竞品试剂盒，且纯度也优于竞品试剂盒。

四、试剂盒建库部分配制如下：

AC Buffer：500mM Tris-HCl、200mM KCl、100mM MgCl2、1mM DTT、10mM ATP、10mMdATP、2mM dTTP、2mM dGTP、2mM dCTP、0.1％Triton X-100(v/v)，溶剂为DEPC水；

AC Enzymes：1.5U/ul T4 Polynucleotide Kinase(Enzymatics，Y9040L)、1U/ulT4 DNA Polymerase(Enzymatics，P7080L)、0.5U/ul Klenow Fragment(Enzymatics，P7060L)、1U/ul Taq-B DNA Polymerase(Enzymatics，P7250L)、4mM Tris-HCl、5mM KCl、0.8mM DTT、0.2mM EDTA、22％Glycerol(质量分数)、0.5％Triton X-100(v/v)，溶剂为DEPC水；

Ligation XP：14％Glycerol(v/v)、20％(质量分数)PEG-6000、25％1,2-Propanediol(v/v)、40mM Tris-HCl、10mM MgCl

AD Buffer：10mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、50mMNaCl，溶剂为DEPC水；

配制方法：将各成分按其含量加入，混合均匀，采用0.22um滤膜(生工，F513134-0001)过滤除菌；

试剂盒核酸建库部分建库方法：

前端提取核酸产物A和B等体积混合为样本1,前端提取产物C和D等体积混合为样本2,前端提取核酸产物E和F等体积混合为样本3,三个样本进入下游实验；

A.DNA片段化(DNAFragment)：

在50ul打断管中配制打断体系，根据打断体系的不同选择相应的打断时间：

注：

B.末端修复(A-Tailed Conversion):

在0.2mL PCR管中配制末端修复反应体系：

吹打(至少10次)或涡旋振荡混匀，短暂离心以收集管/孔壁上的液体；

将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为80℃，并运行以下程序：

·20℃ 30min；

·65℃ 30min；

·4℃ Forever

C.连接接头(Adapter Ligation)：

准备连接反应前5min，根据下表配制Adapter工作液(Adapter，illumina平台序列，稀释使用AD Buffer)，置于冰上待用：

向末端修复反应体系中直接加入以下试剂：

将反应体系置于PCR仪上，设置热盖温度为Off，20℃温育20min；

D.片段选择及纯化(Post-Ligation Clean-up)

注：以下纯化步骤以300bp为例

将Fapon DNA clean Beads取出静置至室温，涡旋混匀备用；

向1.5mL管或八联管中加入30μL ddH

将1.5mL管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清。

小心吸取上清液到新的1.5mL EP管或八联管(注意：不要弃上清)，加15μL FaponDNA clean Beads，混合均匀，室温放置5min；

注意：此步操作保留上清，转移过程中不要接触到管壁上的磁珠；

将EP管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，弃去上清液；

注意：此步操作应保留磁珠。

向EP管或八联管中加入200μL新鲜配制的80％乙醇，1.5mL管旋转一圈，八联管静置30s后弃去上清液；

重复上述步骤，尽量去除上清；

将1.5mL管或八联管置于磁力架上，室温静置10min至磁珠干裂或者将管子开盖放于45℃金属浴上，待磁珠表面无水光；

将离心管从磁力架上移开，并加入22μL ddH2O重悬磁珠，涡旋或吹打混匀后，瞬离收集管壁液体，室温放置2min；

将EP管或八联管放在磁力架上，待管中溶液澄清，转移20μL上清液到新的PCR管中，用于下一步扩增。

文库扩增(LibraryAmplification)：

在冰盒上配制文库扩增反应体系：

设置文库扩增反应程序：

循环数参考如下：

扩增产物纯化：

将Fapon DNA clean Beads涡旋，使其重新悬浮；

将PCR产物转移至新的1.5mL管或八联管中，加入0.8×(40μL)Fapon DNA cleanBeads，涡旋混匀，瞬离收集管壁液体，室温放置5min；

将1.5mL管或八联管放在磁力架上，静置2min，待管中溶液澄清；

小心吸取并弃去上清液体，往管内添加200μL新配的80％乙醇，于磁力架上旋转管子，待溶液澄清后，弃上清；

重复上述步骤，尽量去除上清；

将1.5mL管或八联管置于磁力架上，室温静置10min至磁珠干裂或者将管子开盖放于45℃金属浴上，待磁珠表面无水光。

向EP管或八联管中加入28μL ddH2O，吹打混匀，静置2min，将EP管放到磁力架上，直至液体变澄清；

吸取25μL上清液至新的1.5mL EP管中，并于管壁粘贴文库标签，用Qsep400质检合格，放置-20℃专用文库存放位置保存。

所得文库上机前质检(Qsep400)及测序结果

图1和图2为文库上机前Qsep400质检，编号LR201015-0100(A1)为竞品提取试剂盒(Magen，D3141)和竞品建库试剂盒(