一种精子DNA碎片化荧光检测方法、检测试剂盒及其应用

摘要

本发明属于精子定量检测分析技术领域，尤其涉及一种精子DNA碎片化数目荧光检测方法、检测试剂盒及其应用。本申请基于目前SDF检测方法的缺陷以及评价指标DFI的不完备，针对当前缺少一种能直接测定DNA损伤，实现方便快速、要求简单的针对精子DNA碎片化程度的精确定量评价这一领域现状，面向国家需求，本申请独创性地应用精子DNA断裂位点个数作为评价精子DNA完整性的指标并引入PCR检测平台，开发了一种基于酶辅助的精子DNA断点个数荧光检测试剂盒及检测方法。

说明书

技术领域

本发明属于精子定量检测分析技术领域，尤其涉及一种精子DNA碎片化数目荧光检测方法、检测试剂盒及其应用。

背景技术

受老龄化、生活方式、环境和工作压力等多重因素影响，我国的不孕不育患者比例正在逐年上升，发生率大约在10％至15％左右，其中男方因素大约占40％左右。同时，男性的精液质量也一直在逐年下降。随着不育症发病率的增高，准确合理地评估男性的精液质量和生育能力愈发重要且迫切。

目前常规精液分析指标主要集中在评估精液的一般性状(精液量、颜色和透明度、气味等)以及精液显微镜检查(如精子计数、活动力、形态等)等方面，能够在一定程度上反映最基本的精液质量。但常规检查易受实验室条件与人工因素影响，多次检查之间变异较大，重复性差；另一方面检查局限于精液基本物理性状，完全无法对精子的生化物质、分子遗传等方面进行评估。因此，常规精液分析仅为形态学观察，受精能力评价的准确程度和受精潜能预测的效果均不佳。基于上述分析，单纯应用精液常规检查已不足以满足临床上对于男性生殖力的诊断、辅助生殖技术的选精、精子库优质精子的筛选等要求。研究人员逐渐将注意力转向了精子功能测试。

在精子功能测试中，精子DNA完整性是正常受精、着床和胚胎发育的必要条件，精子DNA碎片(SDF)检测相比常规精液检查具有受精能力评估准确、对妊娠结局和辅助生殖结果预测精确、检查结果稳定性高等优势。精子DNA碎片化检测作为常规精液分析的重要补充，在全世界范围内的生殖实验室中具有越来越高的重要性，目前被推荐应用于精索静脉曲张患者、不育患者、反复流产患者、宫腔内人工授精(IUI)失败患者、体外受精或卵胞浆内单精子注射失败患者等多领域，具有大量的检测需求，在《WHO(人类)精液实验室检测指南，第五版》中，精子DNA完整性被列为评价精子质量首要指标之一。目前的SDF检测方法通常分为直接检测与间接检测。直接检测法指通过直接使用探针和染料来测定精子DNA碎片化程度，包括精子染色质扩散实验(SCD)、精子染色质结构分析法(SCSA)。间接检测法指测定精子DNA对变性的敏感程度间接反映其碎片化程度，主要为末端脱氧核苷转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)。精子染色质扩散实验(SCD)利用的原理是没有DNA碎片的精子在经过酸变性和去掉核蛋白后，DNA扩散形成特征性的晕环，而带有DNA碎片化的精子不会产生这种特征性的晕环。该方法根据晕环的有无和大小判断精子的DNA碎片化程度，它简便、快速、价格低廉，但光晕是否存在及其大小的判断易受操作者主观因素影响，难以标准化。而精子染色质结构分析法(SCSA)则是应用染料吖啶橙与双链DNA结合发红色荧光，与单链DNA结合发绿色荧光。该方法通过流式细胞仪测量荧光信号并判断精子是否发生DNA断裂，从而克服了操作者主观因素的干扰。但是，流式细胞仪价格昂贵，操作复杂，维护成本高，因而难以大规模推广应用。此外，该方法只能检测单链DNA断裂，无法检测到对受精能力影响更大的双链DNA断裂。SCD与SCSA都属于间接检测，而末端脱氧核苷转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)则是直接对DNA断裂点进行测量。它的基本原理是利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记了荧光基团(FITC)的dUTP转移至DNA损伤分子的3’-OH末端，然后通过显微镜或流式细胞仪分析。尽管该方法是直接检测法，但是该方法操作复杂，耗时长且易受未洗净非结合标志物干扰，且大分子量物质与高度浓缩核染色质的结合效率低，并未得到广泛应用。不难看出目前的SDF检测方法在复杂度、成本上均有所欠缺。

同时值得注意的是上述的SDF检测方法无一例外均以精子DNA碎片化指数(DFI)，即发生DNA断裂的精子占全部精子的百分比，作为精子DNA完整性的评估指标。即目前DNA碎片化程度的检测方法都聚焦在对于单精子层面的断裂程度的“全或无”分型，缺少对于精子具体DNA碎片化程度的更加精细的检测方法。目前临床上通常以15％和30％作为DFI的实验室参考值，依据DFI＜15％，DFI介于15％和30％之间，DFI＞30％将精子DNA完整性依次定性划分为良好、一般、较差，而由于SDF检测标准值的缺乏，因此通过设定DFI阈值的定性分析并不能全面而客观的评估精子质量和生殖结局。

综上所述，现有方法均无法直接定量检测精子DNA碎片化程度，是生殖临床检测领域内的一大空白。因此，创造精子DNA碎片化程度的定量评价指标代替定性评价指标DFI是SDF检测的一个重要的改进方向。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种精子DNA碎片化数目荧光检测方法、检测试剂盒及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。

基于上述的目前SDF检测方法的缺陷以及评价指标DFI的不完备，针对当前缺少一种能直接测定DNA损伤，实现方便快速、要求简单的针对精子DNA碎片化程度的精确定量评价这一领域现状，面向国家需求，本申请独创性地应用精子DNA断裂位点个数作为评价精子DNA完整性的指标并引入PCR检测平台，开发了一种基于酶辅助的精子DNA断点个数荧光检测试剂盒及检测方法。

本发明是这样实现的，一种非诊断目的的精子DNA碎片化数目荧光检测方法，包括以下步骤：

精子基因组DNA的提取；

精子DNA断点延长：使用末端脱氧核苷酸转移酶识别精子DNA发生碎片化产生的断裂位点处3’羟基末端，聚合dATP在3’羟基末端延伸出多聚poly-A序列；

荧光探针检测：采用L001探针对DNA断裂末端延长的多聚T尾进行识别，检测荧光信号；

数据分析：根据各条信号图像计算荧光信号上升速率，借助荧光信号上升速率与底物浓度的标准曲线计算每个精子样本对应的末端位点浓度，换算得每条完整精子DNA链平均断裂个数。

进一步地，精子DNA断点延长的具体操作为2μL 10x TdT Buffer，2μL dATP，2μLDNA浓度为20ng/μL的精子DNA溶液，TdT酶2.5μL，无菌去离子水5.5μL；PCR程序37℃30min，75℃20min孵育。

进一步地，dATP浓度为10-50mM；TdT酶浓度为200-2000U/ml。

进一步地，荧光探针检测的具体操作为：向孵育后的体系中加入L001探针4μL，Endo IV酶2μL，设置PCR仪程序37℃120min，检测荧光信号。

进一步地，L001探针浓度为0.5-5μM，Endo IV酶浓度为10-100U/ml。

本发明还提供了一种精子DNA碎片化数目荧光检测试剂盒，包括：TdT Buffer，dATP，TdT酶，L001探针，Endo IV酶。

本发明还提供了如上述的一种非诊断目的的精子DNA碎片化数目荧光检测方法，或上述的一种精子DNA碎片化数目荧光检测试剂盒在非诊断目的的精子DNA碎片化程度检测中的应用。

本发明还提供了如上述的一种非诊断目的的精子DNA碎片化数目荧光检测方法，或上述的一种精子DNA碎片化数目荧光检测试剂盒在非诊断目的的精子质量评估中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

1.相比于传统精子SDF的间接检测方法如SCD、SCSA与单细胞凝胶电泳(SCGE)等，本方法由于利用了TdT直接对精子DNA发生碎片化时3’，5’-磷酸二酯键打开而产生的3’-羟基进行识别，因此不需要经过对精子DNA的变性过程，简单便捷，可同时检测单链DNA和双链DNA的断裂情况，可以真实的反应出精子DNA的损伤程度。

2.相比于传统精子SDF的直接检测方法如TUNEL法，TUNEL法操作复杂，大分子量物质与高度浓缩核染色质物质结合效率低导致耗时长且易受未洗净非结合标志物干扰，本方法优选Endo IV构建了二次放大检测平台，操作简便快速，并且检测灵敏度高、特异性强，具有良好临床应用能力。

3.传统精子SDF检测主要在显微镜平台或流式细胞仪平台上开展，而这两个平台都有各自固有的缺陷。利用显微镜平台如彗星实验法依赖人员手工操作与肉眼识别，结果波动性大；而利用流式细胞仪平台如SCSA操作复杂，所需试剂和仪器设备昂贵，限制了临床上的开展，不利于精子碎片化检测的普及推广，且染色结果与染色质量、时间、程序等多步骤有关，灰区细胞染色结果判定较困难，在结果分析设门过程存在主观性误差。本方法首次在精子碎片化检测领域引入荧光PCR平台，既利用PCR平台实现了高通量样本处理、数据采集分析的标准化过程从而减少人员操作误差，提升数据稳定性，解决了显微镜平台的效率缺陷与数据稳定性问题，同时该平台对比目前常用的流式细胞仪平台价格低廉，大大降低仪器设备成本、试剂成本、人员培训成本，极大地有利于针对精子DNA完整性这一评价精子质量首要指标的检测在全国地区的广泛推广。

4.本方法独创性应用精子DNA断裂位点数作为报告指标，可同时检测单双链断裂，碎片化程度与荧光速率正相关，可给出精子DNA碎片化程度的平均值。而传统精子DFI检测中只能给出精子DNA碎片化指数DFI，即发生一定程度以上碎片化精子占总体精子的比例，本方法通过评估断裂程度弥补了DFI仅能评估精子是否存在断裂的缺陷，以信号强度作为精确定量衡量指标取代了DFI划分信号阈值评价的定性指标，实现了对于SDF的精确定量评价，解决了目前暂无精确定量检测精子DNA碎片化程度的评价手段这一领域空白，在评估临床用药疗效等应用上具有更高的评价能力与参考价值。

综上所述，本方法通过末端脱氧核苷转移酶的末端延伸性质实现对于精子DNA单链断裂或双链断裂的断裂位点定位，合用内切酶IV完成荧光信号的产生并实现二次放大，从而使得精子DNA碎片化程度与荧光速率正相关，达到高灵敏度与选择性的检测能力，并可定量评估精子DNA碎片化程度的平均水平。本检测体系的优势为直接测量真正DNA损伤，可衡量精子DNA的具体碎片化程度，可作为预后治疗等效果的评估。且耗时较短，操作简单，采用二次放大检测平台，理论检测限好，灵敏度高。本体系在达到高灵敏度、选择性的同时兼顾了检测体系的成本与复杂度，对仪器要求不高，有利于临床应用的普及推广。可广泛应用于男性生殖力评估，检查男性不育症的原因及其疗效观察；辅助诊断男性生殖系统疾病；法医学鉴定；婚前检查；为人类精子库和人工授精筛选优质精子等多种领域，具有大量检测需求，有广泛丰富的应用前景。

附图说明

图1是本方法检测精子碎片化程度的原理图；

图2是使用本方法检测单链DNA的检测限图，检测限LOD依据3σ/k计算可得为0.01367nM；

图3是应用本检测方法实际检测图(括号中为SCSA法流式细胞仪所得DFI值)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。

本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。

本发明披露了一种精子DNA断裂点数目荧光检测方法及其应用，具体如下实施例所示。

实施例1

本发明本实施例中提供的精子DNA断裂点数目荧光检测方法包括四个步骤：精子基因组DNA的提取、精子DNA断点延长、荧光探针检测、数据处理。具体如下所示：

一、精子基因组DNA的提取

按照天根细胞基因组提取试剂盒说明书的提取方式，进行DNA提取，为了进一步提高精子DNA的提取纯度和提取量，在提取过程中的部分环节做了优化：

(1)将200μL精子12000rpm离心1分钟加入200μL Solution A混匀。混匀，12000rpm，离心1分钟。

(2)弃掉上清，重复上述步骤一次。

(3)弃掉上清，EP管底部留取约50μL Solution A，用移液器吹打均匀。

(4)加入250μL Solution B和10μL Solution C，用移液器吹打均匀，70℃孵育30分钟。

(5)加人200μL无水乙醇，充分振荡混匀15sec，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

(6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(9)重复操作步骤7。

(10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

(11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。

二、精子DNA断点延长

本专利面向DNA断点个数的定量检测，发明了酶辅助的精子DNA碎片化荧光检测试剂盒和检测方法。末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)为一种无需模板的聚合酶，可将脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)随机添加到DNA的3’末端，广泛应用于快速检测靶DNA。本方法通过TdT的该特性识别精子DNA发生碎片化产生的断裂位点处3’羟基末端，并聚合体系中的dATP在3’羟基末端延伸出多聚poly-A序列，为后续反应提供基础。具体操作流程如下：

(1)用无菌的去离子水调整精子DNA浓度为20ng/μL。

(2)总体系为14μL，加入TdT Buffer(10x)2μL。

(3)加入dATP 2μL。

(4)加入经去离子水调整浓度后的精子DNA溶液2μL。

(5)加入无菌的去离子水5.5μL，震荡混匀。

(6)加入TdT酶2.5μL。

(7)设置PCR仪程序37℃30min，75℃20min。将上述体系共14μL放入孵育。

三、荧光探针检测。

采用L001探针对DNA断裂末端延长的多聚T尾进行识别和检测，检验原理为：参照图1，发生了碎片化的精子DNA每一个断裂位点处的3’羟基由于步骤二中TdT延伸产生一条特征性的poly-A序列，该序列与探针链poly-T序列互补，发生延伸链与信号链的配对结合，从而形成适宜于Endo iv工作的双链结构。在Endo iv的催化下原本位于探针链中间的无嘌呤嘧啶位点被切开，探针断裂并游离，使得标记在探针两端的荧光FAM基团与猝灭BHQ-1基团分开远离，进而产生可被检测的荧光信号。且由于之前被断裂的探针链游离后poly-A序列可继续与新的探针链结合，因此使得本体系具有二次放大的效果。具体操作流程如下：

(1)将完成步骤二反应的体系取出，加入L001探针4μL。

(2)加入Endo IV酶2μL。

(3)设置PCR仪程序37℃120min，将上述体系共20μL放入检测荧光信号。

注意：本方法所指L001探针序列为(5’-3’)PO

四、数据处理。

本方法所用软件为LineGene 1640for research分析软件。

实施例2

本实施例中对不同精子质量的人精液标本进行精子DNA检测，包括如下基本步骤：

(1)收集了13份经过手淫法采集的人精液标本，常规精液分析显示其中8份为正常精子样本，5份为弱精精子样本。正常精子即标本同时符合《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》中规定的精液量≥1.5ml，精子浓度≥15×106/mL，精子前向运动≥32％，精子活力≥40％，的参数标准，且本试验中所取正常样本的DFI≤30％。弱精精子样本：精液量≥1.5ml，精子浓度≥15×106/mL，精子前向运动＜32％，精子活力＜40％，且本试验中所选取弱精样本的精子DFI＞30％。

(2)采用天根精子DNA提取试剂盒提取精子基因组DNA，对于每一份标本，采用无菌的去离子水来调整精子DNA浓度为20ng/μL。

(3)对于收集到的每一份标本，依次加入TdT Buffer(10x)2μL，dATP(10-50mM)2μL，经去离子水调整浓度后的精子DNA溶液2μL，无菌的去离子水5.5μL，震荡混匀，然后加入TdT酶(200-2000U/ml)2.5μL。

(4)设置PCR仪程序37℃30min，75℃20min。将上述体系共14μL放入孵育。

(5)将孵育完后的体系取出，依次加入L001探针(0.5-5μM)4μL，Endo IV酶(10-100U/ml)2μL。设置PCR仪程序37℃120min，将上述体系共20μL放入PCR仪检测荧光信号。

(6)数据处理：根据各条信号图像计算荧光信号上升速率，带入图2所示的检测限拟合曲线，计算每个精子样本对应的末端位点浓度，可换算得每条完整精子DNA单链平均断裂个数n个，计算范例如下：

1)荧光信号上升速率计算方法：

由于本方法应用二次放大检测平台，因此PCR仪最终呈现的纵坐标为荧光强度(a.u.)横坐标为时间(min)的图像中，荧光信号理论应呈现为如图3所示的先以斜率基本不变的直线上升随后保持平齐不变的图像，本方法所述荧光信号上升速率即指该上升段中相对稳定的斜率拟合值(a.u./min)。

2)图2标准曲线绘制方法：

操作过程同实施例1中步骤二、三、四，其中精子DNA溶液被替换为已知浓度的DNA单链溶液使得体系中浓度依次为2.0nM、1.0nM、0.1nM、0.01nM、0nM，以各自浓度下的荧光信号上升速率为纵坐标，对应浓度为横坐标进行拟合，形成图2所示标准曲线。

3)末端位点浓度对应每条完整精子DNA单链平均断裂个数计算方法：

将精子DNA个数与末端位点浓度相对应，例如精子DNA个数与末端位点浓度1nM个数相当，设每条完整精子DNA断裂为n个，则：

n*40*10

加入的精子DNA总共碱基个数：40*10

加入的精子DNA链个数：(40*10

设每条完整精子DNA单链断裂个数为n个，则加入的精子DNA断裂位点总个数：n*(40*10

(其中，碱基平均分子量325；每条完整的精子DNA单链碱基数为15*10

13份样品的检测图见图3(图下注释为SCSA法流式细胞仪所得DFI值)，结果如表1所示。

表1：13份精子样品的平均完整DNA单链断裂个数

由表1中的数据可知：

以DFI值30％作为临界点，考察大于和小于30％的组别平均每条完整精子DNA断裂个数是否具有差异，t＝5.8309，P＜0.001,差异具有明显差异.因此，该技术可以更好的评估正常精子和异常精子的DNA断裂情况。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。