同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法、试剂盒及其应用

摘要

本发明提供同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法、试剂盒及其应用，属于医药检测技术领域。本发明通过优化样本前处理方法并同高效液相色谱‑串联质谱方法相结合，从而成功建立一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法，该方法具有样本处理简单、灵敏度高通量高、结果可靠等优点，可实现对人体相关抗生素血药水平的实时监测，因此具有良好的实际应用之价值。

说明书

技术领域

本发明属于血药浓度监测技术领域，具体涉及一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

万古霉素(vancomycin)属于三环糖肽类抗菌药物，临床上主要用于敏感革兰阳性菌，特别是严重耐药的金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌所致心内膜炎、骨髓炎、肺炎等感染性疾病，全球仅9株金黄色葡萄球菌耐药，被誉为抗生素最后一道防线。革兰阳性(G

去甲万古霉素为我国首创的糖肽类抗生素，其抗菌谱、相互作用和临床应用都与万古霉素相近，但其对大多数金葡菌作用强于万古霉素，已成为治疗严重甲氧西林耐药葡萄球菌及耐药革兰阳性球菌的首选用药。但其耳、肾毒性和血栓性静脉炎等严重不良反应与血药浓度相关，因此对其进行血药浓度监测也是非常有意义。

现有技术中虽然已经有对万古霉素和去甲万古霉素的检测方法的报道，但是发明人发现，现有前处理方法获得待测液，通常检测灵敏度欠佳，从而导致在低灵敏度的LC-MS上的检测信号较低，信号不稳定。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法、试剂盒及其应用，本发明通过优化样本前处理方法并同高效液相色谱-串联质谱方法相结合，从而成功建立一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法，该方法具有样本处理简单、灵敏度高通量高、结果可靠等优点，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法，所述方法包括采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)对前处理后的待测样品进行检测；

其中，所述前处理过程包括：

向待测血液样品中加入至甲醇/乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出氮吹吹干，流动相复溶后，获得待测上机样品；

本发明针对血清中存在的万古霉素与去甲万古霉素进行前处理，可以去除样品杂质，降低基质效应，从而对万古霉素与去甲万古霉素进行同时检测。

本发明的第二个方面，提供同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的试剂盒，所述试剂盒包括：万古霉素与去甲万古霉的标准品溶液；

含有内标和0.01～0.1％(优选为0.05％，w/w)硫酸锌的甲醇与乙腈的混合液；

其中，甲醇与乙腈的体积比为2～3:1～2，优选为3:2。

含0.05～0.5％(优选0.1％)甲酸的水溶液；

含0.05～0.5％(优选0.1％)甲酸的甲醇溶液。

本发明的第三个方面，提供上述同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉的方法和/或试剂盒在抗生素血药浓度监测中的应用。

与现有技术相比，上述一个或多个技术方案存在如下有益技术效果：

上述技术方案通过对样本前处理方法和高效液相色谱-串联质谱方法结合，建立了一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法，采用改良优化后的蛋白沉淀剂对血样进行前处理，采用本发明可以同时检测人血清中万古霉素与去甲万古霉素，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、灵敏度高通量高、结果可靠的检测方法。

上述技术方案使用的提取方法，可以去除样品杂质，降低基质效应，检测灵敏度，稳定性高，且操作简单快捷，检测结果精确。通过定量测定血清或血浆药物浓度指导用药剂量优化，已经成为对患者进行精神药物治疗的很有价值的工具。在患者用药依从性难以判断、药物耐受性不佳、治疗剂量下无效以及可能存在药代动力学药物－药物相互作用等情况下，测定药物浓度是很有用的。

上述技术方案首次实现了应用液相色谱串联质谱技术对一份血清样本中的万古霉素与去甲万古霉素同时检测的目的，用特异性离子对进行定量，保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速分析，通量高、成本低，可实现对人体血药水平的实时监测。

上述技术方案的方法针对万古霉素与去甲万古霉素的相对保留时间、定性离子和对应内标对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例的万古霉素色谱图；

图2为本发明实施例的去甲万古霉素色谱图；

图3为本发明实施例的万古霉素标准曲线图；

图4为本发明实施例的去甲万古霉素标准曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。

本发明的一个具体实施方式中，提供一种同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的方法，所述方法包括采用高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)对前处理后的待测样品进行检测；

本发明的又一具体实施方式中，所述前处理过程包括：

向待测血液样品中加入至甲醇/乙腈的混合液中，震荡离心，将离心后的上清液取出氮吹吹干，流动相复溶后，获得待测上机样品；

本发明针对血清中存在的万古霉素与去甲万古霉素进行前处理，可以去除样品杂质，降低基质效应，从而对万古霉素与去甲万古霉素进行同时检测。

本发明的又一具体实施方式中，所述血液样品是血浆或血清，优选为血清；

所述甲醇/乙腈的混合液为含有0.01～0.1％(优选为0.05％，w/w)硫酸锌的甲醇与乙腈的混合液；由于待测血液样本中含有蛋白等其他复杂成分，会影响对万古霉素与去甲万古霉素的检测，因此，本发明选用适合的蛋白沉淀剂对血液样品中的蛋白进行沉淀，通过试验对比硫酸锌、甲酸和盐酸三种蛋白沉淀剂，发现上述三种蛋白沉淀剂均可有效降低万古霉素、去甲万古霉素的蛋白结合率，其中添加0.05％硫酸锌效果最佳，因此选择硫酸锌作为蛋白沉淀剂，从而有效改善基质效应，提高回收率。同时，后续进一步使用氮吹进行浓缩，可进一步提高检测信号。

本发明的又一具体实施方式中，甲醇与乙腈的体积比为2～3:1～2，优选为3:2。

本发明的又一具体实施方式中，所述HPLC-MS/MS对待测样品进行检测具体方法为：

液相色谱条件包括：

采用梯度洗脱，流动相A相：含0.05～0.5％(优选0.1％)甲酸的水溶液，流动相B相：含0.05～0.5％(优选0.1％)甲酸的甲醇溶液；通过优化流动相，从而提高检测结果准确性。

色谱柱为C18色谱柱；流动相流速为200～500μl/min(优选为300μl/min)；柱温为35～45℃(优选为40℃)；进样量1～15μL(优选为10μL)；

具体的，所述色谱柱为飞诺美kinetex C18色谱柱，经研究发现，其对上述抗生素具有良好的保留作用。

梯度洗脱方式具体为：0～1min，10％流动相B；1.5～3min，95％流动相B；3.5～5min，10％流动相B。

质谱条件包括：

离子源：采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，雾化气：60kPa，加热气：50kPa，气帘气：20kPa，喷雾电压：4500V，去溶剂温度：550℃。

MRM质谱参数如下表：

本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法还包括：采用标准品制作标准曲线定量，和采用质控品进行质控。

本发明的又一具体实施方式中，采用标准品制作标准曲线定量包括：以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应药物峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中万古霉素与去甲万古霉素的浓度；

本发明的又一具体实施方式中，所述采用质控品进行质控具体为采用低、中、高三个浓度质控品进行质控，所述质控品由活性炭净化的血清空白样本添加混合药物标准物质制得，并通过检测确定靶值。

本发明的又一具体实施方式中，提供同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉素的试剂盒，所述试剂盒包括：万古霉素与去甲万古霉的标准品溶液；

含有内标和0.01～0.1％(优选为0.05％，w/w)硫酸锌的甲醇与乙腈的混合液；

其中，甲醇与乙腈的体积比为2～3:1～2，优选为3:2。

含0.05～0.5％(优选0.1％)甲酸的水溶液；

含0.05～0.5％(优选0.1％)甲酸的甲醇溶液；

本发明的又一具体实施方式中，上述试剂优选为色谱纯试剂；

本发明的又一具体实施方式中，所述试剂盒还包括质控品，所述质控品由活性炭净化的血清空白样本添加混合药物标准物质制得。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述同时检测血液样品中万古霉素与去甲万古霉的方法和/或试剂盒在抗生素血药浓度监测中的应用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

(1)制备待测样本

将血清加入至含有0.05％硫酸锌的甲醇与乙腈的混合液(甲醇/乙腈体积比为3/2，含有内标)中，震荡离心，将离心后的上清液取出氮吹吹干后流动相复溶，获得待测样品。

本实施例对比了硫酸锌、甲酸、盐酸三种添加剂，浓度分别为0.05％硫酸锌、2％甲酸、2％乙酸，经试验证明，均对降低万古霉素、去甲万古霉素的蛋白结合率有明显效果，各添加剂浓度在对比实验前进行优化，选取各自的最佳浓度参与对比，效果见下表1。获取的待测上清氮吹与否，对信号的影响，见下表2，可以看到氮吹可以提高万古霉素、去甲万古霉素的信号响应。

表1蛋白沉淀剂的成分效果对比

表2氮吹对信号响应的影响

(2)标准工作液的配制：以经活性炭净化的血清空白样本配制一系列浓度的标准溶液建立校正工作曲线；

万古霉素与去甲万古霉素标曲各点浓度见下表：

(3)高效液相色谱-质谱检测

将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离后，采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，对待测物质进行定性与定量检测；

应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应药物峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中万古霉素与去甲万古霉素的浓度。

上述方法中包括质控品：含有三个水平的低、中、高浓度质控血清，质控品由活性炭净化的血清空白样本添加混合药物标准物质制得，并通过检测确定靶值。

液相色谱参考条件：

色谱柱：C18柱(Phenomenex 2.6um Polar C18 50*2.1mm)

柱温：40℃

进样体积：20μl

流速：300μl/min

流动相A：含0.1％甲酸的HPLC级水

流动相B：含0.1％甲酸的甲醇

梯度洗脱条件：

质谱参数参考条件：

采用正离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式；

雾化气：60kPa

加热气：50kPa

气帘气：20kPa

喷雾电压：5000V

去溶剂温度：550℃

MRM质谱参数：

(4)计算结果

标准工作液的配制：以水配制100μg/mL各标准品储备液，然后以经活性炭净化的血清空白样本制备6个梯度的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用，标准品需参与样本提取。

应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中万古霉素和去甲万古霉素的浓度。

万古霉素标准曲线如图3所示，用本发明方法测定1.25～50μg/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本万古霉素含量为21.5μg/mL。

去甲万古霉素标准曲线如图4所示，用本发明方法测定2.5～100μg/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本去甲万古霉素含量为37.2μg/mL。

(5)检测方法的性能指标验证结果

以下为本方法的定量下限，检测限，精密度及可检测的线性范围等指标验证结果：

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。