SERPINA1 iRNA组合物及其使用方法

摘要

本发明涉及靶向Serpina1基因的RNAi试剂例如双链RNAi试剂，和使用这类RNAi试剂来抑制Serpina1表达的方法以及治疗患有Serpina1相关疾病如肝脏病症的受试者的方法。

说明书

本申请是申请日为2014年5月22日、申请号为2014800393668、发明名称为“SERPINA1 iRNA组合物及其使用方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请

本申请要求2013年5月22日提交的美国临时申请号61/826,125、2013年12月1日提交的美国临时申请号61/898,695、2014年4月15日提交的美国临时申请号61/979,727、2014年5月6日提交的美国临时申请号61/989028的优先权权益。本申请涉及2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710和2012年11月16日提交的PCT/US2012/065601。前述申请的每个的全部内容特此通过引用结合在此。

序列表

本申请包含已经以电子方式以ASCII格式提交并且特此通过引用以其全文结合的序列表。创建于2014年5月20日的所述ASCII副本被命名为121301-00620_SL.txt并且大小为199,204个字节。

发明背景

Serpinal编码α-1-抗胰蛋白酶，该酶主要与由肝细胞、单核单细胞、肺泡巨噬细胞、肠细胞以及髓样细胞产生的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶复合并抑制其活性。具有Serpinal基因的一个或两个拷贝的变异的受试者可能罹患α-1-抗胰蛋白酶缺乏，并且有患肺气肿和/或慢性肝病的危险，因为肺和肝脏中的弹性蛋白酶活性大于正常的弹性蛋白酶活性。

在受影响的受试者中，α-1-抗胰蛋白酶的缺乏是野生型功能性α-1-抗胰蛋白酶的缺乏。在一些情况下，具有Serpina1基因的一个或两个拷贝的变异的受试者携带无效等位基因。在其他情况下，具有Serpina1基因的一个或两个拷贝的变异的受试者携带缺乏的等位基因。

例如，具有Serpina1的缺乏等位基因如PIZ等位基因的受试者可以产生错误折叠蛋白，这些错误折叠蛋白不能从合成位点转运到身体内的作用位点。这类受试者典型地有患肺病和/或肝病的危险。具有Serpina1无效等位基因如PINULL(Granite Falls)的受试者典型地仅具有患肺病的危险。

由α-1抗胰蛋白酶缺乏导致的肝病是肝细胞中产生的错误折叠的且因此不易于从细胞中转运出来的变异形式的α-1-抗胰蛋白酶的结果。这导致错误折叠蛋白在肝细胞中积聚，并且可引起肝脏的一种或多种疾病或病症，包括但不限于慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌。

目前用于治疗患有由α-1-抗胰蛋白酶缺乏引起的肝病的患者的选择非常有限，包括肝炎疫苗接种、支持性医护以及回避有害药剂(如酒精和NSAID)。虽然置换α-1-抗胰蛋白酶疗法是可用的，但这种治疗对这些受试者中的肝病没有效果，虽然肝移植可以是有效的，但这个过程是困难、昂贵且冒险的并且肝器官不是容易获得的。

因此，本领域需要针对Serpina1相关疾病，如慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌的有效治疗。

发明概述

如以下更详细地描述，在此披露了包含靶向Serpina1的试剂，例如单链和双链多核苷酸，例如RNAi试剂例如双链iRNA试剂。在此还披露了使用本发明的组合物用于抑制Serpina1表达以及用于治疗Serpina1相关疾病例如慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌的方法。

因此，在一方面，本发明提供了用于抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂。该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中该有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，

其中该有义链的基本上所有的核苷酸和该反义链的基本上所有的核苷酸是修饰的核苷酸，并且其中该有义链被缀合到在3'-末端处附接的一个配体上。

在一个实施例中，该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。在一个实施例中，该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均是修饰的核苷酸。

在一个实施例中，该有义链和该反义链包含一个互补区，该互补区包含与表1、表2、表5、表7、表8以及表9中的任一个列出的序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。

在一个实施例中，这些修饰的核苷酸中的至少一个是选自下组，该组由以下各项组成：3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸。

在一个实施例中，至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3'突出端。

在另一个实施例中，至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3'突出端。

在另一方面，本发明提供了能够抑制细胞中Serpina1的表达的RNAi试剂，例如双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中该反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

p、p’、q以及q′各自独立地是0-6；

各N

各N

各n

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上。

在一个实施例中，Na’包含1-25个核苷酸，并且其中这1-25个核苷酸中在从5’端起的位置2-9中的一个处的一个核苷酸是核苷酸错配。在一个实施例中，该错配碱基是通用碱基。

在一个实施例中，i是0；j是0；i是1；j是1；i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在一个实施例中，k是0；l是0；k是1；l是1；k和l两者都是0；或k和l两者都是1。

在一个实施例中，XXX与X′X′X′互补，YYY与Y′Y′Y′互补，并且ZZZ与Z′Z′Z′互补。

在一个实施例中，YYY基序存在于该有义链的裂解位点处或附近。

在一个实施例中，Y′Y′Y′基序存在于该反义链的从5'端起的11、12以及13位置处。

在一个实施例中，Y′是2'-O-甲基。

在一个实施例中，式(III)由式(IIIa)表示：

有义：5'n

反义链：3'n

在另一个实施例中，式(III)由式(IIIb)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中各N

在又另一个实施例中，式(III)由式(IIIc)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中各N

在一个实施例中，式(III)由式(IIId)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中各N

在一个实施例中，该双链区的长度是15-30个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区的长度是17-23个核苷酸对。在又另一个实施例中，该双链区的长度是17-25个核苷酸对。在一个实施例中，该双链区的长度是23-27个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区的长度是19-21个核苷酸对。在另一个实施例中，该双链区的长度是21-23个核苷酸对。在一个实施例中，每条链具有15-30个核苷酸。在另一个实施例中，每条链具有19-30个核苷酸。

在一个实施例中，核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-脱氧、2’-羟基、及其组合。在另一个实施例中，核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰。

在一个实施例中，该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。在另一个实施例中，该配体是

在一个实施例中，该配体附接到该有义链的3′端上。

在一个实施例中，该RNAi试剂根据以下示意图中所示与该配体缀合：

其中X是O或S。在一个特定的实施例中，X是O。

在一个实施例中，该试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。

在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的3'-末端处。在一个实施例中，该链是该反义链。在另一个实施例中，该链是该有义链。

在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的5'-末端处。在一个实施例中，该链是该反义链。在另一个实施例中，该链是该有义链。

在一个实施例中，该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的5'-末端和3'-末端这两者处。在一个实施例中，该链是该反义链。

在一个实施例中，RNAi试剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且该有义链在或者5’-末端或者3’-末端处包含至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。

在一个实施例中，该双链体的反义链的5′端的1位置处的碱基对是一个AU碱基对。

在一个实施例中，这些Y核苷酸含有2′-氟代修饰。

在一个实施例中，这些Y′核苷酸含有2′-O-甲基修饰。

在一个实施例中，p′>0。在另一个实施例中，p′＝2。

在一个实施例中，q’＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出核苷酸与该靶mRNA互补。在另一个实施例中，q’＝0，p＝0，q＝0，并且p’突出核苷酸与该靶mRNA不互补。

在一个实施例中，该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。

在一个实施例中，至少一个n

在一个实施例中，所有n

在一个实施例中，该RNAi试剂选自下组，该组具有在表1、表2、表5、表7、表8以及表9中列出的RNAi试剂。

在一个实施例中，该RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-58681、AD-59054、AD-61719以及AD-61444。

在另一方面，本发明提供了用于抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂。该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中该有义链包含与SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该有义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

在一个实施例中，该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。在一个实施例中，该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

在一个实施例中，所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸均包含一种修饰。

在另一方面，本发明提供了能够抑制细胞中Serpina1的表达的RNAi试剂，例如双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中该反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

p、p’、q以及q′各自独立地是0-6；

各N

各N

各n

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上。

在又另一方面，本发明提供了能够抑制细胞中Serpina1的表达的RNAi试剂，例如双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中该反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

各N

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上。

在另一方面，本发明提供了能够抑制细胞中Serpina1的表达的RNAi试剂，例如双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中该反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

各N

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

在另一方面，本发明提供了能够抑制细胞中Serpina1的表达的RNAi试剂，例如双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中该反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

各N

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且

其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

在又另一方面，本发明提供了能够抑制细胞中Serpina1的表达的RNAi试剂，例如双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中该反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中该双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

YYY和Y'Y'Y'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且

其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

在一个实施例中，Na’包含1-25个核苷酸，并且其中这1-25个核苷酸中在从5’端起的位置2-9中的一个处的一个核苷酸是核苷酸错配。在一个实施例中，该错配碱基是通用碱基。

本发明还提供了包含本发明的双链RNAi试剂的细胞、载体、宿主细胞以及药物组合物。

在一个实施例中，本发明提供了RNAi试剂，该RNAi试剂选自下组，该组具有在表1、表2、表5、表7、表8以及表9中列出的RNAi试剂。

本发明还提供了一种包含修饰的反义多核苷酸试剂的组合物。该试剂包含与选自下组的一个有义序列互补的一个序列，该组具有在表1、表2、表5、表7、表8以及表9中的任一个中列出的序列，其中该多核苷酸的长度是约14个至约30个核苷酸。

一方面，本发明提供了一种含有本发明的双链RNAi试剂的细胞。

在一些实施例中，该RNAi试剂使用一种药物组合物给予。

在优选实施例中，该RNAi试剂在一种溶液中给予。在一些这样的实施例中，该siRNA在一种非缓冲溶液中给予。在一个实施例中，该siRNA在水中给予。在其他实施例中，该siRNA与一种缓冲溶液(如一种乙酸盐缓冲液、一种柠檬酸盐缓冲液、一种醇溶谷蛋白缓冲液、一种碳酸盐缓冲液或一种磷酸盐缓冲液或其任何组合)给予。在一些实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

在一个实施例中，该药物组合物进一步包含一种脂质配制品。在一个方面，本发明提供了抑制细胞中Serpina1表达的方法。该方法包括使该细胞与本发明的RNAi试剂例如双链RNAi试剂、组合物、载体或药物组合物接触；并且维持步骤(a)中产生的该细胞维持足以获得Serpina1基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制该细胞中该Serpina1基因的表达。

在一个实施例中，该细胞是在一个受试者内。

在一个实施例中，该受试者是人。

在一个实施例中，Serpina1表达被抑制至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。

在一方面，本发明提供了治疗患有Serpina1相关疾病的受试者的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的RNAi试剂例如双链RNAi试剂、组合物、载体或药物组合物，从而治疗该受试者。

在一方面，本发明提供了治疗患有Serpina1相关病症的受试者的方法。这些方法包括向该受试者皮下给予治疗有效量的一种双链RNAi试剂，从而治疗该受试者，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中该有义链包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中该有义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该有义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

在一个实施例中，该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。在一个实施例中，该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均包含一种修饰。

在一个实施例中，该Serpina1相关疾病是肝脏病症，例如慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌。

在一个实施例中，向该受试者给予该RNAi试剂使得肝硬化、纤维化和/或肝脏中的Serpina1蛋白累积减轻。在另一个实施例中，向该受试者给予该RNAi试剂使得，例如进一步使得肺部炎症减轻。

在一个实施例中，该受试者是人。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约50mg/kg、约10mg/kg至约30mg/kg、约10mg/kg至约20mg/kg、约15mg/kg至约20mg/kg、约15mg/kg至约25mg/kg、约15mg/kg至约30mg/kg、或约20mg/kg至约30mg/kg的剂量给予的。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是皮下或静脉内给予的。

在又另一方面，本发明提供了抑制具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的RNAi试剂例如双链RNAi试剂、组合物、载体或药物组合物，从而抑制该受试者中肝细胞癌的发展。

在另一方面，本发明提供了抑制具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展的方法。这些方法包括向该受试者皮下给予治疗有效量的一种双链RNAi试剂，从而抑制该具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中该有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中该有义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该有义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

在一个实施例中，该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。在一个实施例中，该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均包含一种修饰。

在一个实施例中，该受试者是灵长动物或啮齿动物。在另一个实施例中，该受试者是人。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予的。在另一个实施例中，该双链RNAi试剂是以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予的。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是以约3mg/kg的剂量给予的。在另一个实施例中，该双链RNAi试剂是以约10mg/kg的剂量给予的。在又另一个其他实施例中，该双链RNAi试剂是以约0.5mg/kg的剂量每周两次给予的。在又另一个实施例中，该双链RNAi试剂是以约10mg/kg的剂量每隔一周给予的。在又另一个实施例中，该双链RNAi试剂是以约0.5至约1mg/kg的剂量每周一次给予的。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是每周两次给予的。在另一个实施例中，该RNAi试剂是每隔一周给予的。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是皮下或静脉内给予的。

在另一方面，本发明提供了用于减少具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的RNAi试剂例如双链RNAi试剂、组合物、载体或药物组合物，从而减少该受试者的肝脏中错误折叠的的Serpina1的累积。

在另一方面，本发明提供了减少具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积的方法。这些方法包括向该受试者皮下给予治疗有效量的一种双链RNAi试剂，从而减少该具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积，其中该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中该有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，其中该反义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中该有义链的基本上所有的核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，其中该有义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中该有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

在一个实施例中，该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。在一个实施例中，该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

在一个实施例中，该有义链的所有核苷酸和该反义链的所有核苷酸均包含一种修饰。

在一个实施例中，该受试者是灵长动物或啮齿动物。在另一个实施例中，该受试者是人。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予的。在另一个实施例中，该双链RNAi试剂是以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予的。

在一个实施例中，该RNAi试剂例如双链RNAi试剂是皮下或静脉内给予的。

本发明由以下详细说明和附图进一步展示。

本发明还涉及以下项目：

1.一种用于抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，该双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且该反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，

其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸和所述反义链的基本上所有的这些核苷酸是修饰的核苷酸，并且

其中所述有义链被缀合到在3'-末端处附接的一个配体上。

2.如项目1所述的双链RNAi试剂，其中该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。

3.如项目2所述的双链RNAi试剂，其中该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

4.如项目1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均是修饰的核苷酸。

5.如项目1所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链和所述反义链包含一个互补区，该互补区包含与表1、表2、表5、表7、表8以及表9中的任一个列出的序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。

6.如项目1-5中任一项所述的双链RNAi试剂，其中所述修饰的核苷酸中的至少一个是选自下组，该组由以下各项组成：3’-末端脱氧-胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟代修饰的核苷酸、2'-脱氧-修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基-修饰的核苷酸、2'-烷基-修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含核苷酸的非天然碱基、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、以及连接到胆固醇基衍生物或十二烷酸二癸酰胺基团上的末端核苷酸。

7.如项目1所述的双链RNAi试剂，其中至少一条链包含具有至少1个核苷酸的3'突出端。

8.如项目1所述的双链RNAi试剂，其中至少一条链包含具有至少2个核苷酸的3'突出端。

9.一种能够抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

p、p’、q以及q′各自独立地是0-6；

各N

各N

各n

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上。

10.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中Na’包含1-25个核苷酸，并且其中这1-25个核苷酸中在从5’端起的位置2-9中的一个处的一个核苷酸是核苷酸错配。

11.如项目10所述的双链RNAi试剂，包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

12.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中i是0；j是0；i是1；j是1；i和j两者都是0；或i和j两者都是1。

13.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中k是0；l是0；k是1；l是1；k和l两者都是0；或k和l两者都是1。

14.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中XXX与X'X'X'互补，YYY与Y'Y'Y'互补，并且ZZZ与Z'Z'Z'互补。

15.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。

16.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中该Y'Y'Y'基序出现在该反义链的从5'-端起的11、12以及13位置处。

17.如项目16所述的双链RNAi试剂，其中该Y'是2'-O-甲基。

18.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIIa)表示：

有义：5'n

反义：3'n

19.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIIb)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中各N

20.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIIc)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中各N

21.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中式(III)由式(IIId)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中各N

22.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是15-30个核苷酸对。

23.如项目22所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是17-23个核苷酸对。

24.如项目22所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是17-25个核苷酸对。

25.如项目22所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是23-27个核苷酸对。

26.如项目22所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是19-21个核苷酸对。

27.如项目22所述的双链RNAi试剂，其中该双链区的长度是21-23个核苷酸对。

28.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有15-30个核苷酸。

29.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中每条链具有19-30个核苷酸。

30.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的修饰选自下组，该组由以下各项组成：LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-氟代、2′-脱氧、2’-羟基、及其组合。

31.如项目30所述的双链RNAi试剂，其中在这些核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰。

32.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

33.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中该配体是

34.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中该配体被附接到该有义链的3′端上。

35.如项目34所述的双链RNAi试剂，其中该RNAi试剂被缀合到如以下示意图中所示的配体上

其中X是O或S。

36.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中所述试剂进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。

37.如项目36所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的3'-末端处。

38.如项目37所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。

39.如项目37所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该有义链。

40.如项目36所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的5'-末端处。

41.如项目40所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。

42.如项目40所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该有义链。

43.如项目36所述的双链RNAi试剂，其中该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联是在一条链的5'-末端和3'-末端这两者处。

44.如项目43所述的双链RNAi试剂，其中所述链是该反义链。

45.如项目36所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键联。

46.如项目45所述的双链RNAi试剂，其中该反义链包含5’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和3’-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且该有义链包含5’-末端抑或3’-末端处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。

47.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中在该双链体的该反义链的5′-端的1位置处的碱基对是一个AU碱基对。

48.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中这些Y核苷酸含有一个2′-氟代修饰。

49.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中这些Y′核苷酸含有一个2′-O-甲基修饰。

50.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中p’>0。

51.如项目9所述的双链RNAi试剂，其中p’＝2。

52.如项目51所述的双链RNAi试剂，其中q'＝0，p＝0，q＝0，并且p'突出核苷酸与该靶mRNA互补。

53.如项目51所述的双链RNAi试剂，其中q'＝0，p＝0，q＝0，并且p'突出核苷酸与该靶mRNA不互补。

54.如项目51所述的双链RNAi试剂，其中该有义链具有总共21个核苷酸，并且该反义链具有总共23个核苷酸。

55.如项目50-54中任一项所述的双链RNAi试剂，其中至少一个n

56.如项目55所述的双链RNAi试剂，其中所有n

57.如项目1或9所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂选自下组，该组具有在表1、表2、表5、表7、表8以及表9中的任一个中列出的RNAi试剂。

58.如项目1或7所述的双链RNAi试剂，其中所述RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-58681、AD-59054、AD-61719以及AD-61444。

59.一种抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，

其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，

其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，

其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，

其中所述反义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且

其中所述有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

60.如项目59所述的双链RNAi试剂，其中该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。

61.如项目60所述的双链RNAi试剂，其中该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

62.如项目59所述的双链RNAi试剂，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均包含一种修饰。

63.一种能够抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

p、p’、q以及q′各自独立地是0-6；

各N

各N

各n

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上。

64.一种能够抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

各N

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上。

65.一种能够抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

各N

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

66.一种能够抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

各N

XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序；并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

N

其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且

其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

67.一种能够抑制细胞中Serpina1的表达的双链RNAi试剂，其中该双链RNAi试剂包含与一条反义链基本上互补的一条有义链，其中所述反义链包含与编码Serpina1的mRNA的一部分互补的一个区，其中每条链的长度是约14个至约30个核苷酸，其中所述双链RNAi试剂由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

其中：

各n

p、q以及q′各自独立地是0-6；

n

各N

YYY和Y'Y'Y'各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序，并且其中这些修饰是2′-O-甲基或2′-氟代修饰；

其中该有义链包含至少一个硫代磷酸酯键联；并且

其中该有义链被缀合到至少一个配体上，其中该配体是通过一个二价或三价支链接头附接的一种或多种GalNAc衍生物。

68.如项目63-67中任一项所述的双链RNAi试剂，其中Na’包含1-25个核苷酸，并且其中这1-25个核苷酸中在从5’端起的位置2-9中的一个处的一个核苷酸是核苷酸错配。

69.如项目68所述的双链RNAi试剂，包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

70.一种RNAi试剂，该RNAi试剂选自下组，该组具有在表1、表2、表5、表7、表8以及表9中的任一个中列出的RNAi试剂。

71.一种包含修饰的反义多核苷酸试剂的组合物，其中所述试剂能够抑制细胞中Serpina1的表达，并且包含与选自下组的一个有义序列互补的一个序列，该组具有在表1、表2、表5、表7、表8以及表9中的任一个中列出的序列，其中该多核苷酸的长度是约14个至约30个核苷酸。

72.一种载体，含有如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂。

73.一种细胞，含有如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂。

74.一种药物组合物，包含如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂。

75.如项目74所述的药物组合物，其中以一种无缓冲的溶液给予RNAi试剂。

76.如项目75所述的药物组合物，其中所述无缓冲的溶液是盐水或水。

77.如项目74所述的药物组合物，其中所述siRNA与一种缓冲溶液一起给予。

78.如项目77所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。

79.如项目78所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

80.一种抑制细胞中Serpina1表达的方法，该方法包括：

(a)使该细胞与如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂、如项目71所述的组合物、如项目72所述的载体、或如项目74-79中任一项所述的药物组合物接触；并且

(b)使在步骤(a)中产生的该细胞维持足以获得Serpina1基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制该细胞中该Serpina1基因的表达。

81.如项目80所述的方法，其中所述细胞是在一个受试者内。

82.如项目81所述的方法，其中该受试者是人。

83.如项目80-82中任一项所述的方法，其中该Serpina1表达被抑制至少约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％或约100％。

84.一种治疗患有Serpina1相关疾病的受试者的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂、如项目71所述的组合物、如项目72所述的载体、或如项目74-79中任一项所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。

85.一种治疗患有Serpina1相关病症的受试者的方法，该方法包括向该受试者皮下给予治疗有效量的一种双链RNAi试剂，从而治疗该受试者，

其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，

其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，

其中所述反义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，

其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中所述有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

86.如项目85所述的方法，其中该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。

87.如项目86所述的方法，其中该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

88.如项目85所述的方法，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均包含一种修饰。

89.如项目84或85所述的方法，其中该受试者是人。

90.如项目84或85所述的方法，其中该Serpina1相关疾病是一种肝脏病症。

91.如项目90所述的方法，其中该肝脏病症选自下组，该组由以下各项组成：慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌。

92.如项目84或85所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。

93.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。

94.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约3mg/kg的剂量给予。

95.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约10mg/kg的剂量给予。

96.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约0.5mg/kg的剂量每周给予两次。

97.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约10mg/kg的剂量每隔一周给予一次。

98.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约0.5-1mg/kg的剂量每周给予一次。

99.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂皮下给予。

100.如项目92所述的方法，其中将该双链RNAi试剂静脉内给予。

101.如项目92所述的方法，其中将所述RNAi试剂在两个或更多个剂量中给予。

102.如项目101所述的方法，其中将所述RNAi试剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：每隔约12小时一次、每隔约24小时一次、每隔约48小时一次、每隔约72小时一次以及每隔约96小时一次。

103.如项目101所述的方法，其中将所述RNAi试剂每周给予两次。

104.如项目101所述的方法，其中将所述RNAi试剂每隔一周给予一次。

105.一种抑制具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂、如项目71所述的组合物、如项目72所述的载体、或如项目74-79中任一项所述的药物组合物，从而抑制该受试者中的肝细胞癌发展。

106.一种抑制具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展的方法，该方法包括向该受试者皮下给予治疗有效量的一种双链RNAi试剂，从而抑制该具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展，

其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，

其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，

其中所述反义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，

其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中所述有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

107.如项目106所述的方法，其中该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。

108.如项目107所述的方法，其中该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

109.如项目106所述的方法，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均包含一种修饰。

110.如项目105或106所述的方法，其中该受试者是灵长动物或啮齿动物。

111.如项目105或106所述的方法，其中该受试者是人。

112.如项目105或106所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。

113.如项目112所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。

114.如项目112所述的方法，其中将所述RNAi试剂在两个或更多个剂量中给予。

115.如项目112所述的方法，其中将所述RNAi试剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：每隔约12小时一次、每隔约24小时一次、每隔约48小时一次、每隔约72小时一次以及每隔约96小时一次。

116.如项目112所述的方法，其中将所述RNAi试剂每周给予两次。

117.如项目112所述的方法，其中将所述RNAi试剂每隔一周给予一次。

118.如项目112所述的方法，其中将该双链RNAi试剂皮下给予。

119.如项目112所述的方法，其中将该双链RNAi试剂静脉内给予。

120.一种减少具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的如项目1、9、59和63-70中任一项所述的双链RNAi试剂、如项目71所述的组合物、如项目72所述的载体、或如项目74-79中任一项所述的药物组合物，从而减少该受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积。

121.一种减少具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积的方法，该方法包括向该受试者皮下给予治疗有效量的一种双链RNAi试剂，从而减少该具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积，

其中所述双链RNAi试剂包含形成一个双链区的一条有义链和一条反义链，

其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:11的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，并且所述反义链包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、或SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、或SEQ ID NO:25的核苷酸序列中的任一个相差不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，

其中所述反义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述反义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联和在3'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，

其中所述有义链的基本上所有的这些核苷酸包含选自下组的一种修饰，该组由以下各项组成：2'-O-甲基修饰和2'-氟代修饰，

其中所述有义链包含在5'-末端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，并且其中所述有义链被缀合到一种或多种GalNAc衍生物上，这些GalNAc衍生物通过一个支链二价或三价接头附接在3'-末端处。

122.如项目121所述的方法，其中该反义链的核苷酸序列中的3个核苷酸差异中的一个是在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配。

123.如项目122所述的方法，其中该反义链包含在该错配的核苷酸处的通用碱基。

124.如项目121所述的方法，其中所述有义链的所有这些核苷酸和所述反义链的所有这些核苷酸均包含一种修饰。

125.如项目120或121所述的方法，其中该受试者是灵长动物或啮齿动物。

126.如项目120或121所述的方法，其中该受试者是人。

127.如项目120或121所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约0.5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。

128.如项目127所述的方法，其中将该双链RNAi试剂以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予。

129.如项目127所述的方法，其中将所述RNAi试剂在两个或更多个剂量中给予。

130.如项目127所述的方法，其中将所述RNAi试剂每周给予两次。

131.如项目127所述的方法，其中将所述RNAi试剂每隔一周给予一次。

132.如项目127所述的方法，其中将所述RNAi试剂以选自下组的时间间隔给予，该组由以下各项组成：每隔约12小时一次、每隔约24小时一次、每隔约48小时一次、每隔约72小时一次以及每隔约96小时一次。

133.如项目127所述的方法，其中将该双链RNAi试剂皮下给予。

134.如项目127所述的方法，其中将该双链RNAi试剂静脉内给予。

附图简要说明

图1是示出在表达Z-AAT形式的人AAT的转基因小鼠中指示的siRNA的体内功效和反应持续时间的图。

图2A-2B示出具有低IC50值的五种siRNA的体内功效。在第0天向表达人Z-AAT等位基因的转基因小鼠注射10mg/kg的siRNA双链体，并且在剂量后接着给予血清人AAT持续21天(图2A)。每个点表示三只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。图2B示出每个组的归一化为GAPDH的肝脏hAAT mRNA水平。这些条反映平均值并且误差条反映标准偏差。

图3A-3C示出剂量响应方式的持久的AAT抑制。图3A明确示出了功效曲线，该功效曲线示出在皮下给予转基因小鼠的不同AD-59054剂量下实现的血清hAAT蛋白水平的最大敲低。每个点是三只小鼠的平均值，并且误差条表示标准偏差。在0.3、1、3或10mg/kg单剂量的AAT siRNA之后的敲低的持续时间示于图3B中。对于每只动物，将hAAT水平归一化为三个前血值的平均值。PBS组充当对照以反映血清hAAT水平的可变性。每个数据点是三只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。在图3C中，每周两次向动物给予0.5mg/kg剂量的AD-59054。每个数据点是来自四只小鼠的平均相对血清hAAT，并且误差条反映标准偏差。

图4A-4D示出随Z-AAT减少而降低的肿瘤发生率。图4A示出研究设计，借此向具有纤维化肝的老龄小鼠每隔一周一次(Q2W)皮下给予PBS或10mg/kg的siRNA双链体AD58681，持续11个剂量，并且在最后一次剂量之后7天处死。图4B示出对照组和治疗组中的肝脏hAATmRNA水平。图4C示出对照组和治疗组中的肝脏Col1a2 mRNA水平。图4D示出对照组和治疗组中的肝脏PtPrc mRNA水平。

图5A-5C示出随Z-AAT减少而降低的肿瘤发生率。从根据图4A的研究设计治疗的小鼠中收集血清样品，以监测hAAT抑制的程度。图5A示出首次剂量之后的血清hAAT蛋白水平。图5B和图5C示出来自用PBS抑或AAT siRNA治疗的两只同窝仔畜的肝脏部分的PAS染色。深颜色的点表示球体或Z-AAT聚集体。

图6示出指示的化合物的体内功效。

图7A和7B是示出在1mg/kg(7A)或3mg/kg(7B)剂量的AD-59054、AD-61719或AD-61444之后在非人类灵长动物中的AAT的敲低的持续时间的图。每个数据点是三只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。

图8A示出智人Serpina1，转录变体1(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列；图8B示出智人Serpina1，转录变体3(SEQ ID NO:2)的核苷酸序列；图8C示出智人Serpina1，转录变体2(SEQ ID NO:3)的核苷酸序列；图8D示出智人Serpina1，转录变体4(SEQ ID NO:4)的核苷酸序列；图8E示出智人Serpina1，转录变体5(SEQ ID NO:5)的核苷酸序列；图8F示出智人Serpina1，转录变体6(SEQ ID NO:6)的核苷酸序列；图8G示出智人Serpina1，转录变体7(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列；图8H示出智人Serpina1，转录变体8(SEQ ID NO:8)的核苷酸序列；图8I示出智人Serpina1，转录变体9(SEQ ID NO:8)的核苷酸序列；图8J示出智人Serpina1，转录变体10(SEQ ID NO:10)的核苷酸序列；图8K示出智人Serpina1，转录变体11(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列；图8L示出猕猴Serpina1(SEQ ID NO:12)的核苷酸序列；图8M示出猕猴Serpina1，转录变体6(SEQ ID NO:13)的核苷酸序列；图8N示出猕猴Serpina1，转录变体4(SEQ ID NO:14)的核苷酸序列；图8O示出SEQ ID NO:1的反向互补序列(SEQ IDNO:15)；图8P示出SEQ ID NO:2的反向互补序列(SEQ ID NO:16)；图8Q示出SEQ ID NO:3的反向互补序列(SEQ ID NO:17)；图8R示出SEQ ID NO:4的反向互补序列(SEQ ID NO:18)；图8S示出SEQ ID NO:5的反向互补序列(SEQ ID NO:19)；图8T示出SEQ ID NO:6的反向互补序列(SEQ ID NO:20)；图8U示出SEQ ID NO:7的反向互补序列(SEQ ID NO:21)；图8V示出SEQID NO:8的反向互补序列(SEQ ID NO:22)；图8W示出SEQ ID NO:9的反向互补序列(SEQ IDNO:23)；图8X示出SEQ ID NO:10的反向互补序列(SEQ ID NO:24)；图8Y示出SEQ ID NO:11的反向互补序列(SEQ ID NO:25)；图8Z示出SEQ ID NO:12的反向互补序列(SEQ ID NO:26)；图8AA示出SEQ ID NO:13的反向互补序列(SEQ ID NO:27)；并且图8AB示出SEQ ID NO:14的反向互补序列(SEQ ID NO:28)。

本发明的详细说明

本发明提供了包含靶向Serpina1的试剂，例如单链和双链多核苷酸，例如RNAi试剂例如双链iRNA试剂。在此还披露了使用本发明的组合物用于抑制Serpina1表达以及用于治疗Serpina1相关疾病诸如肝脏病症，例如慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌的方法。

I.定义

为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应该注意的是，每当列举一个参数的一个值或取值范围时,目的是表明这些列举的值的中间值和范围也意在成为本发明的部分。

在此处使用的冠词“一个”和“一种(“a”和“an”)是指一个或超过一个(即，至少一个)该冠词的语法宾语。通过举例，“一个元素”是指一个元素或超过一个元素，例如多个元素。

在此使用术语“包括(including)”意指短语“包括但不限于”，并且与该短语可互换使用。

在此使用术语“或(or)”意指术语“和/或”，并且与该术语可互换使用，除非上下文清楚地另外指明。

如在此所使用，“Serpina1”是指丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)肽酶抑制剂，进化枝A，成员1基因或蛋白。Serpina1还被称为α-1抗胰蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶、AAT、蛋白酶抑制剂1、PI、PI1、抗弹性蛋白酶以及抗胰蛋白酶。

术语Serpina1包括人Serpina1，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号GI:189163524(SEQ ID NO:1)、GI:189163525(SEQ ID NO:2)、GI:189163526(SEQ ID NO:3)、GI:189163527(SEQ ID NO:4)、GI:189163529(SEQ ID NO:5)、GI:189163531(SEQ IDNO:6)、GI:189163533(SEQ ID NO:7)、GI:189163535(SEQ ID NO:8)、GI:189163537(SEQ IDNO:9)、GI:189163539(SEQ ID NO:10)和/或GI:189163541(SEQ ID NO:11)中找到；恒河猴Serpina1，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号GI:402766667(SEQ ID NO:12)、GI:297298519(SEQ ID NO:13)和/或GI:297298520(SEQ ID NO:14)中找到；小鼠Serpina1，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号GI:357588423和/或GI:357588426中找到；以及大鼠，其氨基酸和核苷酸序列可以在例如GenBank登录号GI:77020249中找到。另外的Serpina1 mRNA序列的实例使用例如GenBank和OMIM可易于获得。

已鉴定到Serpina1的超过120个等位基因，并且“M”等位基因被认为是野生型或“正常”等位基因(例如，“PIM1-ALA213”(也称为PI、M1A)、“PIM1-VAL213”(也称为PI、MIV)、“PIM2”、“PIM3”以及“PIM4”)。另外的变体可以在例如A(1)ATVar数据库(参见，例如塞米都(Zaimidou)S.等人(2009)人类突变(Hum Mutat.)230(3):308-13和www.goldenhelix.org/A1ATVar)中找到。

如在此所使用，术语“Serpina1缺乏等位基因”是指产生未正确折叠并且可能在细胞内聚集并且因此未从肝脏中的合成位点正确转运至身体内的作用位点的蛋白的变异等位基因。

示例性Serpina1缺乏等位基因包括“Z等位基因”“S等位基因”、“PIM(Malton)等位基因”以及“PIM(Procida)等位基因”。

如在此所使用，术语“Z等位基因”、“PIZ”以及“Z-AAT”是指Serpina1的其中在蛋白的342位置处的氨基酸因为相关密码子从GAG变成AAG而从谷氨酰胺变成赖氨酸的变异等位基因。为Z等位基因的纯合子的受试者可以被称为“PIZZ”。Z-AAT突变导致95％的Serpinal缺乏患者，并且据估计存在于100,000美国人中，并且在世界范围内存在于约三百万人中。该Z等位基因在白种人中实现多态频率，而在亚洲人和黑人中稀少或不存在。纯合的ZZ表型与肺气肿和肝病两者的高风险相关联。Z-AAT蛋白在内质网中未正确折叠，引起聚集并减少分泌的环片型聚合物、引发解折叠蛋白应答、细胞凋亡、内质网过载应答、自噬、线粒体应激以及改变的肝细胞功能。

如在此所使用，术语“PIM(Malton)”和“M(Malton)-AAT”是指Serpinal的其中在成熟蛋白的位置51或52处的相邻氨基苯丙酸残基中的一个缺失的变异等位基因。这一个氨基酸的缺失缩短了β-折叠B6的一个链，阻止了肝脏中的正常加工和分泌，这与肝细胞夹杂以及从肝脏的蛋白分泌受损相关联。

如在此所使用，术语“PIS”是指Serpina1的其中位置264处的谷氨酸被缬氨酸取代的变异等位基因。虽然这种变异蛋白大部分在细胞内讲解，但在白种人群中存在高频率的PIS等位基因，并且因此具有Z或无效等位基因的化合物复合杂合子是频繁的。

如在此所使用，“靶序列”是指在Serpina1基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的一个连续部分，包括作为原代转录产物的RNA加工的产物的mRNA。

如在此所使用，术语“包含序列的链”是指包含一个核苷酸链的寡核苷酸，该核苷酸链通过使用标准核苷酸命名法提到的顺序来描述。

“G”、“C”、“A”以及“U”每一者通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在此可互换使用并且是指其中核碱基是胸腺嘧啶如脱氧核糖胸腺嘧啶(deoxyribothymine)、2’-脱氧胸苷或胸苷的脱氧核糖核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员应很好地意识到，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤以及尿嘧啶可以被其他部分置换而基本上不改变一种寡核苷酸(包括一种具有这种置换部分的核苷酸)的碱基配对特性。例如，而不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸发生碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明的核苷酸序列中被一种包含例如肌苷的核苷酸所置换。包含此类置换部分的序列是本发明的实施例。如在此可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi试剂”、“iRNA试剂”、“RNA干扰试剂”是指含有作为在此定义的所述术语的RNA的试剂，并且该试剂通过一种RNA诱导沉默复合体(RISC)途径介导RNA转录物的靶向裂解。iRNA通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程引导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节(例如，抑制)细胞(例如，受试者如哺乳动物受试者内的细胞)中Serpina1的表达。

在一个实施例中，本发明的RNAi试剂包括与靶RNA序列例如Serpina1靶mRNA序列相互作用的一个单链RNA，以便引导靶RNA的裂解。不希望受理论约束，认为通过称为Dicer的III型核酸内切酶来将引入到细胞中的长双链RNA分解成siRNA(夏普(Sharp)等人，(2001)基因与发育(Genes Dev.)15:485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)使dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3'突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(伯恩斯坦(Bernstein)等人，(2001)自然(Nature)409:363)。然后将siRNA结合到一种RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一种或多种螺旋酶使siRNA双链体展开，从而能够实现互补反义链导引靶标识别(尼卡能(Nykanen)等人，(2001)细胞(Cell)107:309)。当结合至适当的靶mRNA时，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以便诱导沉默(巴希尔(Elbashir)等人，(2001)基因与发育15:188)。因此，在一个方面，本发明涉及促进实现靶基因(即Serpina1基因)沉默的RISC复合体形成的、产生于细胞内的单链RNA(siRNA)。所以，术语“siRNA”还可以在此用作指代以上所述的RNAi。

在另一个实施例中，该RNAi试剂可以是引入到细胞或生物体中以便抑制靶mRNA的单链siRNA。单链RNAi试剂结合到RISC核酸内切酶Argonaute 2上，该核酸内切酶然后裂解该标靶mRNA。这些单链siRNA通常是15-30个核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和检测描述于美国专利号8,101,348中，以及利马(Lima)等人,(2012)《细胞》(Cell)150:883-894中，特此将它们各自的全部内容通过引用结合在此。在此描述的任何反义核苷酸序列可以被用作如在此所描述或如通过描述于利马(Lima)等人，(2012)细胞150；:883-894中的方法化学修饰的单链siRNA。

在又另一个实施例中，本发明提供了靶向Serpina1的单链反义寡核苷酸分子。“单链反义寡核苷酸分子”与靶mRNA(即，Serpina1)内的一个序列互补。单链反义寡核苷酸分子能以化学计量的方式通过与该mRNA碱基配对并且物理性地阻碍翻译装置来抑制翻译，参见蒂尔斯(Dias)N.等人，(2002)分子癌症治疗学(Mol.Cancer Ther.)1:347-355。可替代地，该单链反义寡核苷酸分子通过与靶标杂交以及经由一种RNaseH切割事件切割该靶标来抑制靶mRMA。该单链反义寡核苷酸分子的长度可以是约10至约30个核苷酸并且具有与靶序列互补的序列。例如，该单链反义寡核苷酸分子可以包括以下这样一个序列：该序列是来自在此所述的反义核苷酸序列中任一个的至少大约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸，例如表1、2、5、7、8或9中的任一个中提供的序列，或者结合在此所述的靶位点中的任一个。这些单链反义寡核苷酸分子可以包含修饰的RNA、DNA或其组合。

在另一个实施例中，用于本发明的组合物、用途以及方法中的“iRNA”是双链RNA，并且在此称为“双链RNAi试剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA试剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合体，该复合体具有包含两条反平行和基本上互补的核酸链的双链体结构，称为相对于靶RNA即Serpina1基因具有“有义”和“反义”取向。在本发明的一些实施例中，双链RNA(dsRNA)通过在此称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机理来引发靶RNA例如mRNA的降解。

通常，dsRNA分子的每条链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两条链的每一者或两者还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸。另外，如在此说明中所使用，“RNAi试剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi试剂可以包括在多个核苷酸处的实质性修饰。此类修饰可以包括在此披露的或在本领域中已知的所有类型的修饰。如在siRNA型分子中使用的，任何这样的修饰出于本说明书和权利要求书的目的都由“RNAi试剂”涵盖。

形成双链体结构的两条链可以是一个更大的RNA分子的不同部分，或它们可以是单独的RNA分子。当这两条链是一个更大的分子的部分时，并且因此通过一条链的3’-端与形成双链体结构的对应的另一条链的5’-端之间的不间断核苷酸链来连接，连接的RNA链称为“发夹环”。当这两条链通过除了一条链的3’-端与形成双链体结构的对应的另一条链的5’-端之间的不间断核苷酸链以外的方式共价连接时，连接的结构称为“接头”。这些RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双链体中的任何突出端。除了该双链体结构之外，一种RNAi试剂还可以包含一个或多个核苷酸突出端。

在一个实施例中，本发明的RNAi试剂是与靶RNA序列例如Serpina1靶mRNA序列相互作用的具有24-30个核苷酸的dsRNA，以便引导靶RNA的裂解。不希望受理论约束，通过称为Dicer的III型核酸内切酶来将引入到细胞中的长双链RNA分解成siRNA(夏普等人(2001)基因与发育15:485)。Dicer(核糖核酸酶-III样酶)使dsRNA加工成具有特征性的两个碱基3'突出端的19-23个碱基对短干扰RNA(伯恩斯坦等人，(2001)自然409:363)。然后将siRNA结合到一种RNA诱导沉默复合体(RISC)中，其中一种或多种螺旋酶使siRNA双链体展开，从而能够实现互补反义链导引靶标识别(尼卡能等人，(2001)细胞107:309)。当结合至适当的靶mRNA时，RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解该靶标以便诱导沉默(巴希尔等人，(2001)基因与发育15:188)。如在此所使用，一个“核苷酸突出端”是指当一种RNAi试剂的一条链的一个3'端延伸超出另一条链的5'端时从该RNAi试剂的双链体结构突出的一个或多个不成对的核苷酸，或反之亦然。“平端”或“平末端”意指在该双链RNAi试剂的那端处不存在不成对的核苷酸，即无核苷酸突出端。“平端”RNAi试剂是在其整个长度上是双链的dsRNA，即，在分子的任一端处没有核苷酸突出端。本发明的RNAi试剂包括在一端处具有核苷酸突出端(即，具有一个突出端和一个平端的试剂)或在两端处都具有核苷酸突出端的RNAi试剂。

术语“反义链”是指一种双链RNAi试剂的、包括与一种靶序列(例如一种人Serpina1 mRNA)基本上互补的一个区的链。如在此所使用，术语“与一种编码Serpina1的mRNA的一部分互补的区”是指该反义链上的与一种Serpina1 mRNA序列的一部分基本上互补的一个区。在该互补性区域不与该靶序列完全互补的情况下，错配在末端区域是最为可容忍的，并且如果出现错配，它们通常在末端的一个或多个区域，例如5’和/或3’末端的8、7、6、5、4、3、或2个核苷酸之内。

如在以下工作实例中所说明的，已经出人意料地发现在此披露的RNAi试剂的反义链的种子区中的单核苷酸错配对于除了C意外的所有碱基是耐受的。该“种子区”是RNAi试剂的反义链中的负责识别靶mRNA并且响应于例如该反义链的从5’端起的核苷酸2-8的区域。在该种子区退火后，Argonaute使引入的反义链的从5’端起的互补mRNA序列10核苷酸经受核溶解降解，导致靶mRNA裂解。因此，在一个实施例中，本发明的RNAi试剂的反义链包含在该反义链的种子区中的一个核苷酸错配，例如在该反义链的从5’端起的位置2-8中的任一个处的一个错配。

如在此所使用，术语“有义链”指的是含有与反义链区域基本上互补的区域的dsRNA链。

如在此所使用，术语“裂解区”是指位于紧邻裂解位点处的一个区。裂解位点是在其上发生裂解的靶标上的位点。在一些实施例中，该裂解区包含三个在该裂解位点的任一端上并且与其紧紧相邻的碱基。在一些实施例中，该裂解区包含两个在该裂解位点的任一端上并且与其紧紧相邻的碱基。在一些实施例中，该裂解位点具体来说存在于由该反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且该裂解区包含核苷酸11、12以及13。

如在此所使用，并且除非另外指明，当用来描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，术语“互补”是指包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并且形成双链体结构的能力，如技术人员将理解。这样的条件可以例如是严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl，40mMPIPES pH 6.4，1mM EDTA，50℃或70℃持续12-16小时，接着洗涤。可以应用其他条件，比如可以在有机体中遇到的生理学相关条件。例如，互补序列足以允许核酸例如RNAi的相关功能进行。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定最适宜于检验两个序列的互补性的条件集合。

当该第一核苷酸序列的核苷酸与该第二核苷酸序列的核苷酸在该第一和该第二核苷酸序列的整个长度上存在碱基配对时，序列可以相对于每一者“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交时形成一个或多个，但是总体上不多于4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。然而，当两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，此类突出端不应该被认为是关于互补性确定的错配。例如，出于在此描述的目的，以下这样一种dsRNA也可以称作“完全互补”：该dsRNA包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中该更长的寡核苷酸包括一个与该更短的寡核苷酸完全互补的21核苷酸序列。

如在此所使用，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非沃森-克里克碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非沃森-克里克碱基对包括但不限于G:U摇摆碱基配对或Hoogstein碱基配对。

本文的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsRNA的有义链与反义链之间，或dsRNA的反义链与靶序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。

如在此所使用，与信使RNA(mRNA)的“至少部分基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如，编码Serpina1的mRNA)的一个连续部分(包括5'UTR，开放阅读框(ORF)或者3'UTR)基本互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码Serpina1的mRNA的一个非中断部分基本上互补，多核苷酸与Serpina1mRNA的至少一个部分互补。

如在此所使用，术语“抑制”，可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语交替使用，并且包括任何水平的抑制。

如在此所使用，短语“抑制Serpina1的表达”包括抑制任何Serpina1基因(如例如小鼠Serpina1基因、大鼠Serpina1基因、猴Serpina1基因、或人Serpina1基因)以及Serpina1基因的变体(例如天然存在的变体)或突变体的表达。因此，该Serpina1基因可以是野生型Serpina1基因、变异Serpina1基因、突变Serpina1基因、或在遗传操纵的细胞、细胞群组或生物体情形下的转基因Serpina1基因。

“抑制Serpina1基因表达”包括任何水平的Serpina1基因的抑制，例如至少部分抑制Serpina1基因的表达，如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。

基于与Serpina1基因表达相关的任何变量水平，例如Serpina1 mRNA水平、Serpina1蛋白水平、或血清AAT水平，可以评估Serpina1基因的表达。抑制可通过这些变量中的一个或多个与对照水平相比的绝对或相对水平的减少来评估。该对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。

如在此所使用，短语“使细胞与双链RNAi试剂接触”包括通过任何可能手段使细胞接触。使细胞与双链RNAi试剂接触包括使细胞在体外与该RNAi试剂接触或使细胞在体内与该RNAi试剂接触。该接触可以直接或间接地进行。因此，例如RNAi试剂可通过执行该方法的个体与细胞的物理接触，或者可替代地，RNAi试剂可进入许可或导致它后来接触到该细胞的一种情况。

在体外接触细胞可通过例如用该RNAi试剂孵育该细胞来进行。体内接触细胞可以通过以下进行，例如通过将RNAi试剂注入该细胞所在的组织或其附近，或通过将RNAi试剂注入另一个区域(血流或皮下空间)，使得该试剂将随后到达待接触的细胞所在的组织。例如，该RNAi试剂可以含有和/或偶联到将该RNAi试剂导向到感兴趣的部位(例如肝脏)的配体(例如，GalNAc3配体)。体外和体内接触方法的组合也是可能的。结合本发明的这些方法，细胞还可以在体外与RNAi试剂接触并且随后被植入受试者中。

如在此使用的，“患者”或“受试者”旨在包括人类或者非人类动物，优选哺乳动物，例如猴。最优选地，该受试者或患者是人。

如在此所使用，“Serpina1相关疾病”旨在包括任何与Serpina1基因或蛋白相关联的疾病、病症或病状。这种疾病可以例如由Serpina1蛋白的错误折叠、Serpina1蛋白(例如，错误折叠的Serpina1蛋白)的细胞内累积、Serpina1蛋白的过量产生、由Serpina1基因变异、由Serpina1基因突变、由Serpina1蛋白的异常裂解、由Serpina1与其他蛋白质或其他内源或外源物质之间的异常相互作用引起。Serpina1相关疾病可以是一种肝病和/或一种肺病。

如在此所使用，“肝病”包括影响肝脏和/或其功能的疾病、病症或病状。肝脏病症可能由肝脏和/或肝细胞中的Serpinal蛋白累积引起。肝脏病症的实例包括由以下引起的肝脏病症：病毒感染、寄生虫感染、遗传易感性、自身免疫性疾病、辐照暴露、肝毒性化合物暴露、机械性损伤、不同的环境毒素、酒精、醋氨酚、酒精和醋氨酚的组合、吸入麻醉药、烟酸、化疗药物、抗生素、镇痛药、止吐药和草本补充剂卡瓦药，及其组合。

例如，与Serpina1缺乏相关联的肝脏病症可能更经常在具有某些等位基因(例如，PIZ、PiM(Malton)和/或PIS等位基因)的一个或多个拷贝的受试者中发生。不希望收理论限制，认为与发展α-1抗胰蛋白酶肝病的更大风险相关联的等位基因编码经受错误折叠并且未从肝细胞正确分泌的Serpinal形式。针对这些错误折叠蛋白的细胞应答可以包括解折叠蛋白应答(UPR)、内质网相关讲解(ERAD)、细胞凋亡、ER过载应答、自噬、线粒体应激以及改变的肝细胞功能。肝细胞损伤可以导致多种症状，如但不限于炎症、胆汁淤积、纤维化、肝硬化、长时间的阻塞性黄疸、增加的转氨酶、门静脉高压和/或肝细胞癌。不希望收理论限制，这种疾病的高度可用的临床病程暗示调节物或“二次击中”是症状发展或严重性升级的促成因素。

例如，具有PIZ等位基因的受试者可能对丙型肝炎感染或酒精滥用更敏感，并且如果暴露于这类因素更有可能患肝脏病症。另外，携带PIZ等位基因的囊性纤维化(CF)受试者患具有门静脉高压的严重肝病的危险更大。Serpina1缺乏也可以导致或促使早期发作的肺气肿、坏死性脂膜炎、支气管扩张和/或长时间的新生儿黄疸的发展。当具有受α-1-抗胰蛋白酶缺乏影响的家族成员时，通过筛选对患有α-1-抗胰蛋白酶缺乏或有危险患有α-1-抗胰蛋白酶缺乏的一些患者进行鉴定。

示例性的肝脏病症包括但不限于肝部炎症、慢性肝病、肝硬化、肝纤维化、肝细胞癌、肝坏死、脂肪变性、胆汁淤积和/或肝细胞功能的减少和/或损失。

“肝硬化”是与慢性肝损害相关联的病理状况，其包括在肝脏中的广泛纤维化和再生结节。

“纤维化”是肝脏中成纤维细胞的增殖和瘢痕组织的形成。

短语“肝功能”是指通过肝脏来进行的许多生理功能中的一个或多个。这类功能包括但不限于调节血糖水平、内分泌调节、酶系统、代谢物(例如，酮体、固醇和类固醇以及氨基酸)的相互转换；制造血蛋白，如纤维蛋白原、血清白蛋白和胆碱脂酶；生血功能、去毒、胆汁形成、以及维生素储存。检查肝功能的若干种测试是本领域已知的，包括例如：测量丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶、胆红素、凝血素以及白蛋白。

如在此所使用，“治疗有效量”旨在包括当向患者给予用于治疗一种Serpina1相关疾病时足以实现该疾病的治疗(例如通过削弱、改善或维持该现有疾病或一种或多种疾病症状)的RNAi试剂的量。该“治疗有效量”可以取决于该RNAi试剂、该试剂如何给予、该疾病及其严重度、和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、由Serpina1表达介导的病理过程的阶段、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的患者的其他个体特征而变化。

如在此所使用，“预防有效量”旨在包括当给予尚末经历过或显示出一种Serpina1相关疾病的症状但可能易患该疾病的受试者时足以预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状的RNAi试剂的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或减少后发疾病的严重度。该“预防有效量”可以取决于该RNAi试剂、该试剂如何给予、该疾病的风险程度、和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前或伴随治疗(如果有的话)的类型、以及待治疗的患者的其他个体特征而变化。

“治疗有效量”或“预防有效量”还包括在适用于任何治疗的合理利益/风险比下产生某种所希望的局部或全身效应的RNAi试剂的量。本发明的方法中所用的RNAi试剂可以按足以产生适用于这样的治疗的合理利益/风险比的量给予。

如在此所使用，术语“样品”包括从受试者体内分离的类似的流体、细胞、或组织，以及受试者体内存在的流体、细胞、或组织的一个集合。生物流体的实例包括血液、血清以及浆膜液、血浆、尿液、淋巴液、脑脊液、眼内液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可源自肝脏(例如，整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如，肝细胞)。在优选实施例中，“源自受试者的样品”是指从该受试者中取出的血液或血浆。在其他实施例中，“源自受试者的样品”是指源自该受试者的肝脏组织(或其亚成分)。

II.本发明的iRNA

在此描述的是改进的抑制在细胞如患有Serpina1相关病症(例如肝病，例如慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌)的受试者(例如哺乳动物，如人)体内的细胞中Serpina1基因的表达的双链RNAi试剂。

因此，本发明提供了具有化学修饰的能够在体内抑制靶基因(即，Serpina1基因)的表达的双链RNAi试剂。在本发明的某些方面中，本发明的iRNA的基本上所有的核苷酸均是修饰的。在本发明的其他实施例中，本发明的iRNA的所有核苷酸均是修饰的。其中“基本上所有的核苷酸是修饰的”本发明的iRNA是大部分但不是全部修饰的，并且可以包括不多于5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。

该RNAi试剂包含一条有义链和一条反义链。该RNAi试剂的每条链的长度可以在12-30个核苷酸范围内。例如，每条链的长度可以在14-30个核苷酸之间、17-30个核苷酸之间、19-30个核苷酸之间、25-30个核苷酸之间、27-30个核苷酸之间、17-23个核苷酸之间、17-21个核苷酸之间、17-19个核苷酸之间、19-25个核苷酸之间、19-23个核苷酸之间、19-21个核苷酸之间、21-25个核苷酸之间或21-23个核苷酸之间。

该有义链和该反义链典型地形成一种双链体双链RNA(“dsRNA”)，在此又称为“RNAi试剂”。RNAi试剂的双链体区的长度可以是12-30个核苷酸对。例如，该双链体区的长度可以在14-30个核苷酸对之间、17-30个核苷酸对之间、27-30个核苷酸对之间、17-23个核苷酸对之间、17-21个核苷酸对之间、17-19个核苷酸对之间、19-25个核苷酸对之间、19-23个核苷酸对之间、19-21个核苷酸对之间、21-25个核苷酸对之间或21-23个核苷酸对之间。在另一个实例中，该双链体区的长度是选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26以及27个核苷酸。

在一个实施例中，该RNAi试剂可以在一条或两条链的3’-端、5’-端或两端处含有一个或多个突出端区和/或封端基团。该突出端的长度可以是1-6个核苷酸，例如2-6个核苷酸、1-5个核苷酸、2-5个核苷酸、1-4个核苷酸、2-4个核苷酸、1-3个核苷酸、2-3个核苷酸或1-2个核苷酸。这些突出端可以是一条链比另一条链更长的结果，或具有相同长度的两条链交错的结果。该突出端可以与靶mRNA形成错配，或它可以与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。第一链和第二链还可以例如通过另外的碱基连接以形成一个发夹或通过其他非碱基接头连接。

在一个实施例中，该RNAi试剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是一个被修饰或未被修饰的核苷酸，包括但不限于被2'-糖修饰的，如2-F、2'-O-甲基、胸苷(T)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5Ceo)及其任何组合。例如，TT可以是任一链上的任一端的一个突出端序列。该突出端可以与靶mRNA形成错配，或它可以与被靶向的基因序列互补或可以是另一个序列。

在该RNAi试剂的有义链、反义链或这两条链处的5’-突出端或3’-突出端可以被磷酸化。在一些实施例中，一个或多个突出端区含有两个在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的核苷酸，其中这两个核苷酸可以是相同或不同的。在一个实施例中，该突出端存在于有义链、反义链或这两条链的3’端处。在一个实施例中，这个3’-突出端存在于反义链中。在一个实施例中，这个3’-突出端存在于有义链中。

该RNAi试剂可以仅含有单个突出端，该突出端可以加强该RNAi的干扰活性而不影响其总稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3’-末端处，或替代地位于反义链的3’-末端处。该RNAi还可以具有位于该反义链的5’-端(或该有义链的3’-端)处的平端，或反之亦然。一般来说，该RNAi的反义链在3'-端处具有核苷酸突出端，并且5'-端是平的。虽然不希望受理论约束，但该反义链的5’-端处的不对称平端和该反义链的3’-端突出端有利于引导链加载到RISC过程中。

本发明中表征的任何核酸可以通过本领域充分建立的方法合成和/或修饰，如在“核酸化学实验室指南(Current protocols in nucleic acid chemistry)”，博凯奇(Beaucage)S.L.等人(编辑)，约翰威利国际出版公司(John Wiley&Sons,Inc.)，纽约，纽约州，美国中描述的那些方法，所述文献特此通过引用结合在此。修饰包括，例如，末端修饰，例如，5’-端修饰(磷酸化、缀合、倒置键联)或3’-端修饰(缀合、DNA核苷酸、倒置键联等)；碱基修饰，例如，置换为稳定性碱基、去稳定性碱基或与扩充的配伍物库发生碱基配对的碱基、移除碱基(脱碱基核苷酸)、或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2’位置或4’位置)或糖的置换；和/或骨架修饰，包括磷酸二酯键联的修饰或置换。有用于在此所描述的这些实施例的iRNA化合物的具体实例包括，但不限于含有修饰的骨架或无天然核苷间键联的RNA。具有修饰的骨架的RNA包括在骨架中不具有磷原子的那些，连同其他。出于本说明书的目的和如有时本领域中谈及，也可以将在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰RNA视为寡核苷。在一些实施例中，修饰的iRNA将在其核苷间骨架中具有磷原子。

修饰的RNA骨架包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺酯，包括3'-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'键的硼烷磷酸酯、这些酯的2'-5'连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位为3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。还包括不同盐、混合盐以及游离酸形式。

教授制备以上含磷键联的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；以及美国专利RE39464，前述专利的每个的全部内容特此通过引用结合在此。

其中不包含磷原子的修饰的RNA骨架具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的骨架。这些包括具有以下结构的那些：吗啉代键联(从核苷的糖部分中部分地形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；含烯的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲亚氨基和亚甲肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH

教授制备以上寡核苷的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，前述专利的每个的全部内容特此通过引用结合在此。

在其他实施例中，构思了用于iRNA的适合的RNA模拟物，其中核苷酸单位的糖和核苷间键联即骨架被置换为新基团。维持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的低聚化合物(已经显示具有优异杂交特性的RNA模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含有酰胺的骨架置换，具体是氨基乙基甘氨酸骨架。这些核碱基得以保持并且直接或间接地结合至该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子上。教授制备以上PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，前述专利的每个的全部内容特此通过引用结合在此。适合用于本发明的iRNA中的另外PNA化合物被描述于例如尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)，1991，254，1497-1500中。

本发明中表征的一些实施例包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA和具有杂原子骨架的寡核苷，并且尤其上文所参考的美国专利号5,489,677的--CH

修饰的RNA还可以含有一个或多个取代的糖部分。在此表征的iRNA(例如dsRNA)可以在2'位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基以及炔基可以是被取代的或未被取代的C

其他修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH

iRNA还可以包括核碱基(在本领域中经常简称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成核碱基和天然核碱基，如脱氧-胸腺嘧啶(dT)；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶；2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶；5-炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮基尿嘧啶、6-偶氮基胞嘧啶和6-偶氮基胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤代(具体地5-溴代)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括披露于美国专利号3,687,808中的那些；披露于生物化学中的修饰核苷(Modified Nucleosides in Biochemistry)，生物技术与医药(Biotechnology and Medicine)，海瑞德威景(Herdewijn)P.编著威立-VCH，2008中的那些；披露于聚合物科学与工程的简明百科全书(The ConciseEncyclopedia Of Polymer Science And Engineering)，第858-859页，克奥赤威兹(Kroschwitz)J.L编著约翰威立国际出版公司，1990中的那些；由英格力士(Englisch)等人，应用化学(Angewandte Chemie)，国际版，1991，30，613披露的那些；以及由桑格威(Sanghvi)Y S.，第15章，dsRNA研究与应用(dsRNA Research and Applications)，第289-302页，克鲁克(Crooke)S.T.和黎布鲁(Lebleu)B.编著，CRC出版社，1993披露的那些。这些核碱基中的某些特别有用于提高在本发明中体现的低聚化合物的结合亲和力。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及N-2、N-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃-1.2℃(桑格威Y.S.、克鲁克S.T.和黎布鲁B.编著，dsRNA研究与应用，CRC出版社，波卡拉顿(Boca Raton)，1993，第276-278页)并且是示例性碱基取代，甚至更具体地当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。

教授制备以上修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基中的某些的代表性美国专利包括但不限于上述的美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；以及7,495,088，前述专利的每个的全部内容特此通过引用结合在此。

iRNA的RNA还可以被修饰成包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中该核糖部分包含连接2’碳和4’碳的额外的桥。这个结构有效地将该核糖“锁”在3'-内切结构构象中。向siRNA添加锁核酸已经显示增加血清中的siRNA稳定性并且减少脱靶效应(埃尔曼(Elmen),J.等人,(2005)核酸研究(Nucleic Acids Research)33(1):439-447；穆克(Mook),OR.等人,(2007)分子癌症疗法(Mol Canc Ther)6(3):833-843；格伦韦勒(Grunweller),A.等人,(2003)核酸研究(Nucleic Acids Research)31(12):3185-3193)。

教授制备锁核酸核苷酸的代表性美国专利包括但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；以及7,399,845，前述专利的每个的全部内容特此通过引用结合在此。

对RNA分子的末端的潜在的稳定化修饰可包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAC)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAC)、胸苷-2'-0-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二醇基(docosanoyl)-尿苷-3"-磷酸酯、反向dT(idT)及其他。这种修饰的披露可以在PCT公开号WO 2011/005861中找到。

A.包含本发明的基序的修饰iRNA

在本发明的某些方面中，本发明的双链RNAi试剂包括具有化学修饰的试剂，如在例如2011年11月18日提交的美国临时申请号61/561,710中或在2012年11月16日提交的PCT/US2012/065691中所披露，这些参考文献中的每一个的全部内容通过引用结合在此。

正如在此和在临时申请号61/561,710中显示，可以通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到RNAi试剂的一条有义链和/或反义链中、特别是在裂解位点处或附近而获得一种优越结果。在一些实施例中，该RNAi试剂的有义链和反义链可以别的方式完全修饰。这些基序的引入中断了该有义链和/或反义链的修饰模式(如果存在的话)。该RNAi试剂可以任选地与例如在该有义链上的GalNAc衍生物配体缀合。所得到的RNAi试剂呈现优越的基因沉默活性。

更确切地说，出人意料地发现，当该双链RNAi试剂的该有义链和反义链被修饰成在RNAi试剂的至少一条链的裂解位点处或附近具有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，该RNAi试剂的基因沉默活性被卓越地增强。

在一个实施例中，该RNAi试剂是具有19个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置7、位置8、位置9处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序。该反义链在从5’端起的位置11、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。

在另一个实施例中，该RNAi试剂是具有20个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置8、位置9、位置10处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序。该反义链在从5’端起的位置11、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。

在又另一个实施例中，该RNAi试剂是具有21个核苷酸长度的双端平物，其中该有义链在从5'端起的位置9、位置10、位置11处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序。该反义链在从5’端起的位置11、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。

在一个实施例中，该RNAi试剂包含21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中该有义链在从5'端起的位置9、位置10、位置11处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-F修饰的至少一个基序；该反义链在从5'端起的位置11、位置12、位置13处含有在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序；其中该RNAi试剂的一端是平的，而另一端包含2个核苷酸的突出端。优选地，该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’-端处。当该2个核苷酸的突出端在该反义链的3’-端处时，在末端的三个核苷酸之间可以存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着该突出核苷酸的配对的核苷酸。在一个实施例中，该RNAi试剂在该有义链的5’-端和在该反义链的5’-端处均另外地具有在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括作为基序的一部分的核苷酸)是修饰的核苷酸。在一个实施例中，每个残基独立地被例如交替基序中的2’-O-甲基或3’-氟代修饰。任选地，该RNAi试剂进一步包含一个配体(优选地GalNAc

在一个实施例中，该RNAi试剂包含有义链和反义链，其中该RNAi试剂包含一条第一链和一条第二链，该第一链具有至少25个和至多29个核苷酸的长度，该第二链具有至多30个核苷酸与从5’端起在位置11、位置12、位置13处在三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序；其中该第一链的3’端和该第二链的5’端形成一个平端并且该第二链在其3’端处比该第一链长1-4个核苷酸，其中双链体区的长度是至少25个核苷酸，并且沿着该第二链长度的至少19个核苷酸，该第二链与靶mRNA充分互补，以便当该RNAi试剂被引入到哺乳动物细胞中时减少靶基因表达，并且其中RNAi试剂的dicer裂解优选产生包含该第二链的3’端的siRNA，从而在该哺乳动物中减少靶基因的表达。任选地，该RNAi试剂进一步包含一个配体。

在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序，其中这些基序中的一个出现在该有义链中的裂解位点处。

在一个实施例中，该RNAi试剂的反义链也可以含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序，其中这些基序中的一个出现在该反义链中的裂解位点处或附近。

对于具有长度是17-23个核苷酸的双链体区的RNAi试剂，反义链的裂解位点典型地在从5’-端起的10、11和12位置周围。因此，具有三个相同修饰的这些基序可以出现在反义链的9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或13、14、15位置，计数从反义链的5’-端起从第一个核苷酸开始，或计数从反义链的5’-端起从双链体区内的第一个配对的核苷酸开始。该反义链中的裂解位点还可以根据该RNAi的从5’端起的双链体区的长度而变化。

该RNAi试剂的有义链可以含有在该链的裂解位点处的在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序；并且该反义链可以具有在该链的裂解位点处或附近的在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序。当该有义链和该反义链形成一种dsRNA双链体时，该有义链和该反义链可以被如此对准，以使得在该有义链上具有三个核苷酸的一个基序和在该反义链上具有三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即该有义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者与该反义链中的该基序的三个核苷酸中的至少一者形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸均可以重叠。

在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链可以含有在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的多于一个基序。第一基序可以出现在该链的裂解位点处或附近并且其他基序可以是翼修饰。术语“翼修饰”在此是指出现在链的与同一链裂解位点处或附近的基序分开的另一个部分处的一个基序。该翼修饰或者与该第一基序相邻，或者被至少一个或多个核苷酸分隔。当这些基序与彼此紧紧相邻时，则这些基序的化学性质不同于彼此，并且当这些基序被一个或多个核苷酸分隔时，则化学性质可以是相同或不同的。可以存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以存在于相对于在裂解位点处或附近的该第一基序的一端处或该前导基序的任一侧上。

如同有义链，该RNAi试剂的反义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序，这些基序中的至少一者出现在该链的裂解位点处或附近。这条反义链也可以在一个比对中含有一个或多个与可以在有义链上存在的翼修饰类似的翼修饰。

在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链或反义链上的翼修饰典型地在该链的3’端、5’端或两端处不包括前一个或两个末端核苷酸。

在另一个实施例中，该RNAi试剂的有义链或反义链上的翼修饰典型地在该链的3’端、5’端或两端处的双链体区内不包括前一个或两个配对的核苷酸。

当该RNAi试剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，这些翼修饰可以落在双链体区的同一端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。

当该dsRNA试剂的有义链和反义链各自包含至少两个翼侧修饰时，该有义链和该反义链可以被比对为使得各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的一个重叠；各自来自一条链的两个修饰落在该双链体区的另一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在该前导基序的任一侧上，在该双链体区具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。

在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括作为基序的一部分的核苷酸)可以被修饰。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰来修饰，这些修饰可以包括：一个或两个非连接磷酸氧的一个或多个改变和/或一个或多个连接磷酸氧的改变；核糖糖的一种组分的改变，例如，核糖糖上的2′羟基的改变；用“脱磷酸”接头完全置换磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或置换；以及核糖-磷酸酯骨架的置换或修饰。

由于核酸是亚单位的聚合物，因此许多修饰出现在核酸内重复的一个位置处，例如一种碱基或一种磷酸酯部分或一种磷酸酯部分的一个非连接O的修饰。在一些情况下，该修饰将出现在该核酸中的所有标的位置处，但在许多情形下它不会这样。例如，一个修饰可以仅出现在3’或5’末端位置处，可以仅出现在一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或在最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处。修饰可以出现在双链区、单链区或两者中。修饰可以仅出现在RNA的双链区中或可以仅出现在RNA的单链区中。例如，一个非连接O位置处的一个硫代磷酸酯修饰可以仅存在于一个或两个末端处，可以仅存在于一个末端区中，例如在一条链的一个末端核苷酸上或最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中的一个位置处，或可以存在于双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5’端可以被磷酸化。

为了增强稳定性，可能的是例如在突出端中包括特定碱基或在单链突出端中(例如，在一个5’或3’突出端或两者中)包括被修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可以希望在突出端中包括嘌呤核苷酸。在一些实施例中，一个3’或5’突出端中的全部或一些碱基可以用例如在此描述的修饰进行修饰。修饰可以包括例如使用核糖的2’位置处的修饰与本领域中已知的修饰，例如使用2’-脱氧-2’-氟代(2’-F)或2’-O-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基中的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不必与靶序列同源。

在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧、2’-羟基或2’-氟代修饰。这些链可以含有多于一个修饰。在一个实施例中，有义链和反义链的每个残基独立地被2’-O-甲基或2’-氟代修饰。

至少两个不同修饰典型地存在于有义链和反义链上。那两个修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟代修饰或其他修饰。

在一个实施例中，N

交替基序中所包含的修饰的类型可以是相同或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示针对核苷酸的一种修饰类型，那么交替模式(即每隔一个核苷酸上的修饰)可以是相同的，但有义链或反义链中的每一者可以选自交替基序内的修饰的若干种可能，例如“ABABAB……”“ACACAC……”、“BDBDBD……”或“CDCDCD……”等。

在一个实施例中，本发明的RNAi试剂包含：用于有义链上的交替基序的修饰模式相对于用于反义链上的交替基序的修饰模式移位。该移位可以是如此以使得有义链的修饰的核苷酸组对应于反义链的被不同地修饰的核苷酸组，并且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从该链的5’-3’起由“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从该链的5’-3’起由“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从该链的5'-3'起由“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从该链的5'-3'起由“BBAABBAA”开始，以使得在该有义链与该反义链之间存在修饰模式的完全或部分移位。

在一个实施例中，该RNAi试剂包含起初在有义链上具有2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序模式，该模式相对于起初在反义链上具有2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序模式具有移位，即有义链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2’-F修饰的核苷酸碱基配对，并且反之亦然。该有义链的1位置可以由2’-F修饰开始，并且该反义链的1位置可以由2’-O-甲基修饰开始。

将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到有义链和/或反义链中断了存在于该有义链和/或反义链中的初始修饰模式。通过将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入到有义链和/或反义链而使该有义链和/或反义链的修饰模式的这一中断出人意料地增强了对靶基因的基因沉默活性。

在一个实施例中，当将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的基序引入到这些链中的任一个时，紧挨着该基序的核苷酸的修饰是与该基序的修饰不同的修饰。例如，包含该基序的序列的一部分是“……N

该RNAi试剂可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。该硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰可以存在于有义链或反义链或这两条链的该链的任何位置中的任何核苷酸上。例如，该核苷酸间键联修饰可以存在于该有义链和/或该反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键联修饰可以以交替模式存在于该有义链和/或该反义链上；或者该有义链或反义链可以含有交替模式的两个核苷酸间键联修饰。该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以与该反义链相同或不同，并且该有义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式可以相对于该反义链上的核苷酸间键联修饰的交替模式具有移位。

在一个实施例中，该RNAi在突出端区中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联修饰。例如，该突出端区可以含有两个在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联的核苷酸。还可以进行核苷酸间键联修饰以使突出核苷酸与双链体区内的末端配对的核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有的突出核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联来连接，并且任选地，可以存在将突出核苷酸与紧挨着该突出核苷酸的一个配对的核苷酸连接的另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键联。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，并且第三个是紧挨着该突出核苷酸的配对的核苷酸。这些末端三个核苷酸可以在该反义链的3’-端处、该有义链的3’-端处、该反义链的5’-端处和/或该反义链的5’端处。

在一个实施例中，该2个核苷酸的突出端是在该反义链的3’-端处，并且在末端的三个核苷酸之间存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键联，其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着该突出核苷酸的配对的核苷酸。任选地，该RNAi试剂在该有义链的5’端和在该反义链的5’端处都可以另外具有在末端三个核苷酸之间的两个硫代磷酸酯核苷酸间键联。

在一个实施例中，该RNAi试剂在双链体内包含与靶标的一个或多个错配、或其组合。“错配”可以是非规范的碱基配对或除了规范的核苷酸配对以外的配对。该错配可以出现在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔融的倾向来分等级(例如对于一个具体配对的缔合或解离自由能，最简单的方法是基于个别对检查这些对，但也可以使用紧接着的相邻物或类似分析)。就促进解离而言：A:U优选于G:C；G:U优选于G:C；并且I:C优选于G:C(I＝肌苷)。错配例如非规范的配对或除了规范以外的配对(如在此其他地方所描述)优选于规范的(A:T、A:U、G:C)配对；并且包括通用碱基的配对优选于规范的配对。“通用碱基”是展示出置换这四个正常碱基(G、C、A和U)中的任一个，而不显著去稳定相邻碱基对相互作用或破坏修饰的寡核苷酸的预期功能性生物化学效用的能力的碱基。通用碱基的非限制性实例包括2'-脱氧肌苷(次黄嘌呤脱氧核苷酸)或其衍生物、硝基叠氮类似物、以及疏水性芳香族非氢键合碱基。

在一个实施例中，该RNAi试剂包含从该反义链的5’端起在该双链体区内的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，这些碱基对选自下组，该组由以下各项组成：A:U、G:U、I:C，以及错配配对，例如非规范的配对或除了规范的配对以外的配对或包括通用碱基的配对，以便促进在该双链体的5’端处的反义链的解离。

在一个实施例中，该双链体区内从该反义链中的5’端起的1位置处的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：A、dA、dU、U以及dT。可替代地，从该反义链的5’端起在该双链体区内的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从该反义链的5’-端起在该双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。

在另一个实施例中，在该有义链的3’-端处的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)。在另一个实施例中，在该反义链的3’-端处的核苷酸是脱氧-胸腺嘧啶(dT)。在一个实施例中，在有义链和/或反义链的3’-端上存在脱氧-胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如两个dT核苷酸。

在一个实施例中，有义链序列可以由式(I)表示：

5'n

其中：

i和j各自独立地是0或1；

p和q各自独立地是0-6；

各N

各N

各n

其中Nb和Y不具有相同修饰；并且

XXX、YYY以及ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。优选地YYY全是2’-F修饰的核苷酸。

在一个实施例中，N

在一个实施例中，该YYY基序出现在该有义链的裂解位点处或附近。例如，当该RNAi试剂具有长度是17-23个核苷酸的一个双链体区时，该YYY基序可以出现在有义链的裂解位点处或附近(例如：可以出现在位置6、位置7、位置8、位置7、位置8、位置9、位置8、位置9、位置10、位置9、位置10、位置11、位置10、位置11、位置12或位置11、位置12、位置13处)，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始。

在一个实施例中，i是1且j是0，或i是0且j是1，或i和j两者都是1。该有义链因此可以由以下式表示:

5'n

5'n

5'n

当该有义链由式(Ib)表示时，N

当该有义链表示为式(Ic)时，N

当该有义链表示为式(Id)时，各N

X、Y和Z各自可以是彼此相同或不同的。

在其他实施例中，i是0且j是0，并且该有义链可以由下式表示：

5'n

当该有义链由式(IA)表示时，各N

在一个实施例中，该RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：

5'n

其中：

k和l各自独立地是0或1；

p’和q’各自独立地是0-6；

各N

各N

各n

其中N

并且

X′X′X′、Y′Y′Y′以及Z′Z′Z′各自独立地表示在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。

在一个实施例中，N

Y'Y'Y'基序出现在该反义链的裂解位点处或其附近。例如，当该RNAi试剂具有长度是17-23个核苷酸的一个双链体区时，该Y′Y′Y′基序可以出现在有义链的位置9、位置10、位置11；位置10、位置11、位置12；位置11、位置12、位置13；位置12、位置13、位置14；或位置13、位置14、位置15处，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始；或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始。优选地，该Y'Y'Y'基序出现在位置11、12、13处。

在一个实施例中，Y’Y’Y’基序全是2’-OMe修饰的核苷酸。

在一个实施例中，k是1且l是0，或k是0且l是1，或k和l两者都是1。

该反义链因此可以由以下式表示：

5'n

5'n

5'n

当该反义链由式(IIb)表示时，N

当该反义链表示为式(IIc)时，N

当该反义链表示为式(IId)时，各N

在其他实施例中，k是0且l是0，并且该反义链可以由下式表示：

5'n

当该反义链表示为式(IIa)时，各N

X'、Y'和Z'各自可以是彼此相同的或不同的。

该有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地由以下各项修饰：LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基、或2’-氟代。例如，该有义链和反义链的每个核苷酸独立地由2’-O-甲基或2’-氟代修饰。具体地说，各X、Y、Z、X’、Y’以及Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟代修饰。

在一个实施例中，该RNAi试剂的有义链可以含有YYY基序，当双链体区是21个核苷酸时，该YYY基序出现在该链的9、10和11位置处，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始；并且Y表示2’-F修饰。该有义链可以另外含有在双链体区的相反端作为翼修饰的XXX基序或ZZZ基序；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。

在一个实施例中，该反义链可以含有出现在该链的位置11、12和13处的Y′Y′Y′基序，计数从5’-端起从第一个核苷酸开始，或任选地，计数从5’-端起在该双链体区内的第一个配对的核苷酸处开始；并且Y’表示2’-O-甲基修饰。该有义链可以另外含有在双链体区的相反端作为翼修饰的XXX基序或ZZZ基序；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。

由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)以及(Id)中任一项表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)以及(IId)中任一项表示的反义链形成了一个双链体。

因此，用于本发明的这些方法中的RNAi试剂可以包含一条有义链和一条反义链，每条链具有14至30个核苷酸，该RNAi双链体由式(III)表示：

有义：5'n

反义：3'n

(III)

其中：

i、j、k以及l各自独立地是0或1；

p、p'、q以及q'各自独立地是0-6；

各N

各N

其中

各n

XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、以及Z'Z'Z'各自独立地表示三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个基序。

在一个实施例中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者均是0；或i和j两者均是1。在另一个实施例中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l两者均是0；或k和l两者均是1。

形成RNAi双链体的该有义链和反义链的示例性组合包括下式：

5'n

3'n

(IIIa)

5'n

3'n

(IIIb)

5'n

3'n

(IIIc)

5'n

3'n

(IIId)

当该RNAi试剂由式(IIIa)表示时，各N

当该RNAi试剂由式(IIIb)表示时，各N

当该RNAi试剂表示为式(IIIc)时，各N

当该RNAi试剂表示为式(IIId)时，各N

式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)以及(IIId)中的X、Y和Z各自可以是彼此相同或不同的。

当该RNAi试剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)以及(IIId)表示时，这些Y核苷酸中的至少一个可以与这些Y’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些Y核苷酸中的至少两个与相应的Y’核苷酸形成碱基对；或这些Y核苷酸中的全部三个都与相应的Y’核苷酸形成碱基对。

当该RNAi试剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，这些Z核苷酸中的至少一个可以与这些Z’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些Y核苷酸中的至少两个与相应的Y’核苷酸形成碱基对；或这些Y核苷酸中的全部三个都与相应的Y’核苷酸形成碱基对。

当该RNAi试剂表示为式(IIIc)或(IIId)时，这些X核苷酸中的至少一个可以与这些X’核苷酸中的一个形成碱基对。可替代地，这些X核苷酸中的至少两个与相应的X’核苷酸形成碱基对；或这些X核苷酸中的全部三个都与相应的X’核苷酸形成碱基对。

在一个实施例中，Y核苷酸上的修饰不同于Y’核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z’核苷酸上的修饰，和/或X核苷酸上的修饰不同于X’核苷酸上的修饰。

在一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIId)表示时，N

在另一个实施例中，当该RNAi试剂由式(IIIa)表示时，N

在一个实施例中，该RNAi试剂是一种多聚体，该多聚体含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体，其中这些双链体通过一种接头来连接。该接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体中的每个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每个可以靶向两个不同靶位点处的相同基因。

在一个实施例中，该RNAi试剂是一种多聚体，该多聚体含有由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的三个、四个、五个、六个或更多个双链体。该接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地，该多聚体进一步包含一个配体。这些双链体中的每个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些双链体中的每个可以靶向两个不同靶位点处的相同基因。

在一个实施例中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两种RNAi试剂在5’端和这些3’端中的一个或两个处彼此连接，并且任选地缀合到一个配体上。这些试剂中的每个可以靶向相同基因或两个不同基因；或这些试剂中的每个可以靶向两个不同靶位点处的相同基因。

不同公开物描述了可以在本发明的这些方法中使用的多聚体RNAi试剂。此类公开物包括WO2007/091269、美国专利号7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887以及WO2011/031520，所述公开物的每一个的全部内容特此通过引用结合在此。

含有一个或多个碳水化合物部分与一种RNAi试剂的缀合的RNAi试剂可以最佳化该RNAi试剂的一种或多种性质。在许多情况下，该碳水化合物部分将附接到该RNAi试剂的一个被修饰的亚单位。例如，一种dsRNA试剂的一个或多个核糖核苷酸亚单位的核糖可以被另一个部分(例如，一个碳水化合物配体所附接的一个非碳水化合物(优选环状)载体)置换。其中亚单位的核糖已经如此被置换的核糖核苷酸亚单位在此被称为核糖置换修饰亚单位(RRMS)。一种环状载体可以是一个碳环系统，即所有环原子均是碳原子，或一个杂环系统，即一个或多个环原子可以是一个杂原子，例如氮、氧、硫。该环状载体可以是一个单环系统，或可以含有两个或更多个环，例如稠合环。该环状载体可以是一个完全饱和的环系统，或它可以含有一个或多个双键。

该配体可以经由一个载体附接到多核苷酸上。这些载体包括(i)至少一个“骨架附接点”、优选两个“骨架附接点”，以及(ii)至少一个“系拴附接点”。如在此所使用，“骨架附接点”是指一个官能团(例如一个羟基基团)，或通常，可供用于并且适用于将该载体结合到一种核糖核酸的骨架(例如含硫骨架)中的一个键(例如磷酸酯或修饰的磷酸酯)。在一些实施例中，“系栓附接点”(TAP)是指该环状载体的、连接一个选择的部分的一个组成环原子，例如一个碳原子或一个杂原子(相异于提供骨架附接点的原子)。该部分可以是例如一种碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖以及多糖。任选地，该选择的部分通过一个介入系拴物连接到该环状载体上。因此，该环状载体将经常包括一个官能团(例如氨基基团)，或通常提供适用于将另一个化学实体(例如一个配体)结合或系拴到组成型环上的一个键。

这些RNAi试剂可以经由一个载体缀合到一个配体上，其中该载体可以是环状基团或非环状基团；优选地，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基以及十氢萘；优选地，非环状基团选自丝氨醇骨架或二乙醇胺骨架。

在某些具体的实施例中，用于本发明的这些方法中的RNAi试剂是选自下组的一种试剂，该组具有在表1、表2、表5以及表7中的任一个中列出的试剂。

这些试剂可以进一步包含一个配体。

A.配体

本发明的双链RNA(dsRNA)试剂可以任选地缀合到一个或多个配体上。该配体可以在3’端、5’端或两端处附接到有义链、反义链或两条链上。例如，该配体可以缀合到该有义链上。在优选实施例中，该配体缀合到该有义链的3’端上。在一个优选实施例中，该配体是一个GalNAc配体。在特别优选的实施例中，该配体是GalNAc

在一些实施例中，该配体例如GalNAc配体附接到该RNAi试剂的3′端上。在一个实施例中，该RNAi试剂缀合到配体(例如，GalNAc配体)上，如以下示意图中所示：

其中X是O或S。在一个实施例中，X是O。

多种多样的实体可以偶联到本发明的RNAi试剂。优选的部分是优选地直接地或经由一个介入系栓物间接地共价偶联的配体。

在优选实施例中，一种配体改变了它所并入的分子的分布、靶向或寿命。在优选实施例中，一种配体例如与缺乏这样一种配体的一个种类相比对选定靶标提供了增强的亲和力，选定的靶标例如是分子、细胞或细胞类型、区室、受体，例如身体的一个细胞区室或器官区室、组织、器官或区域。对一种选定靶标提供增强的亲和力的配体也被称为靶向配体。

一些配体可以具有内体溶解特性。该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质的运载。该内体溶解配体可以是一种显示出pH依赖性膜活性和融合性的多阴离子肽或肽模拟物。在一个实施例中，该内体溶解配体在内体pH下呈现其活性构象。“活性”构象是其中该内体溶解配体促进内体的溶解和/或本发明的组合物或其组分从内体向细胞的细胞质运输的构象。示例性内体溶解配体包括GALA肽(苏巴拉奥(Subbarao)等人，生物化学(Biochemistry)，1987,26:2964-2972)、EALA肽(沃格尔(Vogel)等人，美国化学学会志(J.Am.Chem.Soc.)，1996,118:1581-1586)以及它们的衍生物(特克(Turk)等人，生物化学与生物物理学学报(Biochem.Biophys.Acta)，2002,1559:56-68)。在一个实施例中，该内体溶解组分可以包含将响应于pH变化而经历电荷变化或质子化的一种化学基团(例如一种氨基酸)。该内体溶解组分可以是直链或支链的。

配体可以改进运载、杂交以及特异性特性，并且还可以改进所得天然或被修饰的寡核糖核苷酸或包括在此描述的单体的任何组合的一种聚合分子和/或天然或被修饰的核糖核苷酸的核酸酶抗性。

一般配体可以包括例如用于增强摄取的治疗性调节物；例如用于监测分布的诊断性化合物或报告基因基团；交联剂；以及赋予核酸酶抗性的部分。一般实例包括脂质、类固醇、维生素、糖、蛋白质、肽、多胺以及肽模拟物。

配体可以包括一种天然存在的物质，如一种蛋白质(例如人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)或球蛋白)；一种碳水化合物(例如一种右旋糖酐、支链淀粉、甲壳质、壳聚糖、菊糖、环糊精或透明质酸)；或一种脂质。该配体还可以是一种重组或合成分子，如一种合成聚合物，例如一种合成聚氨基酸、一种寡核苷酸(例如一种适体)。聚氨基酸的实例包括作为一种聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨基甲酸酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪的聚氨基酸。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、肽模拟聚胺、树枝状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。

配体还可以包括靶向基团，例如与指定的细胞类型如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑激素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化的聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸盐、维生素B12、生物素、RGD肽、RGD肽模拟物或适体。

配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶或螯合剂(例如EDTA)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰)石胆酸、O3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪肽缀合物(例如，触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]

配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对一种共配体具有一种特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合一种指定细胞类型(如一种癌细胞、内皮细胞或骨细胞)的一种抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类种类，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖或适体。该配体可以是例如脂多糖，p38 MAP激酶的活化剂或NF-κB的活化剂。

该配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架(例如通过破坏细胞微管、微丝和/或中间丝)增加iRNA试剂摄入到细胞中的物质，例如药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素A、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)A、茚满诺星(indanocine)或myoservin。

该配体可以通过例如活化炎症应答来增加寡核苷酸摄取到该细胞中。将具有这种作用的示例性配体包括肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素-1β或γ干扰素。

在一方面，该配体是一种脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。结合HSA的配体允许缀合物分布至一个靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，该靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抗性，(b)增加靶向或运输到靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。

基于脂质的配体可以用来调节(例如，控制)缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能靶向肾并且因此较不可能从身体清除。与HSA较不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使缀合物靶向肾。

在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合HSA。优选地，它以足够的亲和力结合HSA，以使得该缀合物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，以使得HSA-配体结合不能逆转。

在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合HSA，这样使得缀合物将优选地分布至肾。作为基于脂质的配体的替代或除它之外，还可以使用靶向肾细胞的其他部分。

另一方面，该配体是由靶细胞(例如正在增殖的细胞)摄取的部分，例如维生素。这些特别可用于治疗以不希望的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、E和K。其他示例性维生素包括是B维生素，例如，叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或由癌细胞摄取的其他维生素或营养素。还包括HAS、低密度脂蛋白(LDL)以及高密度脂蛋白(HDL)。

另一方面，该配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋细胞渗透剂。优选地，该试剂是两亲的。一种示例性试剂是肽如tat或触角足蛋白。如果该试剂是肽，则它可以被修饰，包括肽酰基模拟物、反转异构体、非肽键联或假肽键联和D-氨基酸的使用。该螺旋剂优选地是一种α-螺旋剂，该α-螺旋剂优选具有一个亲脂性相和一个疏脂性相。

该配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长的，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代中，该肽部分可以包含疏水性膜转位序列(MTS)。一种含有疏水性MTS的示例性肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:29)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:30))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一个“递送”肽，该递送肽可以携带大的极性分子，包括肽、寡核苷酸和跨细胞膜的蛋白。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白的序列(GRKKRRQRRRPPQ；SEQ ID NO:31)和果蝇触角足蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK；SEQ ID NO:32)能够作为递送肽发挥作用。肽或肽模拟物可以通过DNA的随机序列来编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(拉姆(Lam)等人，自然，354:82-84,1991)。优选地，经由一个并入的单体单元系拴到一种iRNA试剂的肽或肽模拟物是一种细胞靶向肽，如一种精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在从约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用以下描述的结构修饰中的任一个。RGD肽部分可以用来靶向肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(齐茨曼(Zitzmann)等人，癌症研究(Cancer Res.)，62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进一种iRNA试剂靶向多种其他组织(包括肺、肾脏、脾脏或肝脏)的肿瘤(青木(Aoki)等人，癌症基因治疗(Cancer Gene Therapy)8:783-787,2001)。优选地，RGD肽将促进iRNA试剂靶向肾。该RGD肽可以是线性的或环状的，并且可以被修饰(例如糖基化或甲基化)以促进靶向特定组织。例如，糖基化的RGD肽可以递送iRNA试剂至表达α

“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。一种微生物细胞渗透肽可以是例如一种α-螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、一种含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或细菌素)或一种仅含有一种或两种主要氨基酸的肽(例如PR-39或吲哚力西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二重的两亲性肽，如MPG，该肽来源于HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(斯米尼(Simeoni)等人，核酸研究，31:2717-2724，2003)。

在一个实施例中，一种靶向肽可以是一种两亲α-螺旋肽。示例性两亲α-螺旋肽包括但不限于,天蚕素、莱科毒素(lycotoxin)、摩西鱼毒肽(paradaxin)、蟾蜍肽抗生素(buforin)、CPF、铃蟾抗菌肽样肽(BLP)、蛇毒抗菌肽(cathelicidin)、角毒素(ceratotoxin)、柄海鞘(S.clava)肽、盲鳗肠道抗菌肽(HFIAP)、爪蟾抗菌肽、brevinins-2、蛙皮抗菌肽(dermaseptin)、蜂毒肽、pleurocidin、H

肽和肽模拟物配体包括具有天然存在的或修饰的肽的那些，例如D或L肽；α，β或γ肽；N-甲基肽；氮杂肽；具有一个或多个酰胺的肽，即，键联被一种或多种脲、硫脲、氨基甲酸酯或磺酰基脲键联置换的肽；或环肽。

该靶向配体可以是能够靶向一种特定受体的任何配体。实例是：叶酸盐、GalNAc、半乳糖、甘露糖、甘露糖-6P、糖簇(如GalNAc簇、甘露糖簇、半乳糖簇)或一种适体。一个簇是两个或更多个糖单元的组合。这些靶向配体还包括整合素受体配体、趋化因子受体配体、转铁蛋白、生物素、血清素受体配体、PSMA、内皮素、GCPII、生长抑素、LDL以及HDL配体。这些配体还可以基于核酸，例如一种适体。该适体可以是未被修饰的或具有在此披露的修饰的任何组合。

内体释放剂包括咪唑、聚咪唑或寡咪唑、PEI、肽、融合肽、聚羧酸酯、聚阳离子、掩蔽的寡或聚阳离子或阴离子、缩醛、聚缩醛、缩酮/聚缩酮、原酸酯、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的聚合物、具有掩蔽或非掩蔽的阳离子或阴离子电荷的树状聚合物。

PK调节剂代表药代动力学调节剂。PK调节剂包括亲脂体、胆酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性PK调节剂包括但不局限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。包含许多硫代磷酸酯键联的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此骨架中包含多个硫代磷酸酯键联的短寡核苷酸，例如具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，作为配体(例如作为PK调节配体)也属于本发明。

另外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体作为PK调节配体也属于本发明。

属于本发明的其他配体缀合物描述在以下美国专利申请中：2004年8月10日提交的USSN:10/916,185；2004年9月21日提交的USSN:10/946,873；2007年8月3日提交的USSN:10/833,934；2005年4月27日提交的USSN:11/115,989以及2007年11月21日提交的USSN:11/944,227；这些专利申请的全部内容出于所有目的通过引用结合。

当存在两个或更多个配体时，这些配体可以都具有相同特性，都具有不同特性，或一些配体具有相同特性而其他配体具有不同特性。例如，一种配体可以具有靶向特性、具有内体溶解活性或具有PK调节特性。在一个优选实施例中，全部这些配体都具有不同特性。

可以将配体偶联到寡核苷酸的不同位置，例如3’末端、5’末端和/或在一个内部位置。在优选实施例中，将该配体经由一个介入系栓物(例如一个在此描述的载体)附接到这些寡核苷酸。当将一个单体并入正在生长的链中时，该配体或系栓的配体可以存在于该单体上。在一些实施例中，可以在已经将一个“前体”单体并入正在生长的链中后，将配体经由偶联到该“前体”单体来并入。例如，可以将具有例如一个氨基封端的系拴物(即不具有缔合的配体)的一个单体(例如TAP-(CH

在另一个实例中，可以并入具有一个适用于参与点击化学反应的化学基团的一个单体，例如一个叠氮化物或炔烃封端的系栓物/连接子。在一个随后的操作中，即在将该前体单体并入该链中后，可以将一种具有一个互补化学基团(例如一个炔烃或叠氮化物)的配体通过将该炔烃与该叠氮化物偶联在一起来附接至该前体单体。

对于双链寡核苷酸而言，可以将配体附接到一条或两条链上。在一些实施例中，双链iRNA试剂包含一种与有义链缀合的配体。在其他实施例中，双链iRNA试剂包含一种与反义链缀合的配体。

在一些实施例中，可以将配体与核酸分子的核碱基、糖部分或核苷间键联进行缀合。与嘌呤核碱基或其衍生物的缀合可以在任何位置处(包括内环和外环原子)出现。在一些实施例中，将一种嘌呤核碱基的2-、6-、7-或8-位附接至一个缀合物部分。与嘧啶核碱基或其衍生物的缀合物也可以在任何位置处出现。在一些实施例中，可以将一种嘧啶核碱基的2-、5-以及6-位用一个缀合物部分取代。与核苷的糖部分的缀合可以在任何碳原子处出现。可以被附接至一个缀合物部分的一个糖部分的示例性碳原子包括2'、3'以及5'碳原子。还可以将1'位附接至一个缀合物部分，如在一个脱碱基残基中。核苷间键联还可以具有缀合物部分。对于含磷键联(例如磷酸二酯、硫代硫酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酰酯等)而言，可以直接将该缀合物部分附接至该磷原子或与该磷原子结合的一个O、N或S原子。对于含胺或酰胺的核苷间键联(例如PNA)而言，可以将该缀合物部分附接至该胺或酰胺的氮原子或一个相邻碳原子。

可以使用RNA干扰领域中的任何适合配体，但该配体典型地是一种碳水化合物，例如单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、多糖。

使该配体与该核酸结合的连接物包括以上论述的那些。例如，该配体可以是通过一种二价或三价支链连接物附接的一种或多种GalNAc(N-乙酰葡糖胺)衍生物。

在一个实施例中，本发明的dsRNA与一种二价和三价支链连接物缀合，包括式(IV)-(VII)中的任一者中所示的结构：

其中：

q

P

Q

R

L

R

三价缀合的GalNAc衍生物特别可用于与RNAi试剂一起用于抑制一种靶基因的表达，如具有式(VII)的那些：

其中L

教授制备RNA缀合物的代表性美国专利包括但不限于：美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，前述专利的每个的全部内容特此通过引用结合在此。

给定化合物中的全部位置不必要经统一修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在iRNA内部的单个核苷处掺入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。

在本发明的上下文中，“嵌合体的”iRNA化合物或“嵌合体”是以下这样的iRNA化合物，优选是dsRNA，它们包含两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单元构成，即，在dsRNA化合物的情况下的一种核苷酸。这些iRNA典型地含有至少一个区域，其中该RNA被修饰以便赋予iRNA增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。iRNA的额外区域可以充当能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交分子的酶的底物。举例而言，RNase H是一种裂解RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNase H的激活导致RNA靶标的裂解，从而大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，可以在使用嵌合dsRNA时，经常用较短的iRNA获得可比较的结果。可以常规地通过凝胶电泳并且如果必要的话联合本领域中已知的核酸杂交技术来检测该RNA靶标的裂解。

在某些实例中，iRNA的RNA可以通过非配体基团来进行修饰。许多非配体分子已经被缀合到iRNA上以增强该iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类缀合的程序在科学文献中是可获得的。这类非配体部分包括脂质部分，诸如胆固醇(久保(Kubo),T.等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)2007,365(1):54-61；莱特辛格(Letsinger)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1989,86:6553)、胆酸(马诺哈兰(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.),1994,4:1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(马诺哈兰等人，纽约科学院纪事(Ann.N.Y.Acad.Sci),1992,660:306；马诺哈兰等人，生物有机化学与医药化学通讯,1993,3:2765)、巯基胆固醇(奥本豪森(Oberhauser)等人，核酸研究(Nucl.Acids Res.),1992,20:533)、脂肪链例如十二烷二醇或十一烷基残余物(塞森-贝毛拉斯(Saison-Behmoaras)等人,EMBO杂志,1991,10:111；卡巴诺夫(Kabanov)等人，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.),1990,259:327；斯维纳楚克(Svinarchuk)等人，生物化学(Biochimie),1993,75:49)、磷脂例如二十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(马诺哈兰等人，四面体通讯(Tetrahedron Lett.),1995,36:3651；谢(Shea)等人，核酸研究,1990,18:3777)、多胺或聚乙二醇链(马诺哈兰等人，核苷&核苷酸(Nucleosides&Nucleotides),1995,14:969)、或金刚烷乙酸(马诺哈兰等人，四面体通讯,1995,36:3651)、棕榈基部分(米什拉(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报,1995,1264:229)、或十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(克鲁克(Crooke)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.),1996,277:923)。教导此类RNA缀合物的制备的代表性美国专利已经在上文列出。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置处合成具有氨基接头的RNA。然后使用适当的偶联剂或活化剂使该氨基基团与被缀合的分子进行反应。可以用仍与固相载体结合或在裂解RNA之后处于溶液相中的RNA来进行缀合反应。通过HPLC纯化RNA缀合物典型地提供纯的缀合物。

在一些实施例中，本发明的方法双链RNAi试剂选自下组，该组由以下各项组成：AD-58681、AD-59054、AD-61719以及AD-61444。

III.本发明的iRNA的递送

可以通过许多不同方式实现本发明的iRNA试剂向一种细胞，例如受试者像人受试者(例如，有需要的受试者，如患有Serpina1缺乏相关病症例如Serpina1缺乏肝脏病症的受试者)内的细胞的递送。例如，可以通过在体外或体内使细胞与本发明的iRNA接触来进行递送。还可以通过向受试者给予包含iRNA(例如dsRNA)的组合物来直接进行体内递送。可替代地，可以通过施用编码和指导iRNA表达的一种或多种载体间接地进行体内递送。这些替代方案在后文进一步论述。

通常，递送(体外或体内)核酸分子的任何方法可以适应于随本发明的iRNA使用(参见例如阿赫塔尔(Akhtar)S.和朱利安(Julian)RL.(1992)细胞生物学趋势(TrendsCell.Biol.)2(5):139-144和WO94/02595，通过引用以其全文结合在此)。对于体内递送，为了递送iRNA分子所考虑的因素包括例如，所递送的分子的生物稳定性、非特异性效应的预防以及所递送的分子在靶组织中的累积。可以通过局部给予，例如通过直接注射或植入到组织中或局部给予制剂来使iRNA的非特异性效应最小化。向治疗部位局部给予使试剂的局部浓度最大化，限制该试剂向全身组织的暴露，该全身组织否则可以受该试剂损害或可以降解该试剂，并且容许给予较低总剂量的iRNA分子。若干研究已经显示在局部给予iRNA时成功敲低基因产物。例如，通过在食蟹猴中玻璃体内注射(托伦蒂诺(Tolentino)MJ.等人(2004)视网膜(Retina)24:132-138)和在小鼠中视网膜下注射(赖希(Reich)SJ.等人(2003)分子视觉(Mol.Vis.)9:210-216)进行的VEGF dsRNA眼内递送均显示出在年龄相关的黄斑变性的实验模型中预防新血管形成。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射dsRNA缩减肿瘤体积(皮尔(Pille),J.等人，(2005)分子治疗(Mol.Ther.)11:267-274)并且可以延长荷瘤小鼠的存活期(金姆(Kim),WJ.等人，(2006)分子治疗14:343-350；李(Li),S.等人，(2007)分子治疗15:515-523)。也已经示出通过直接注射将RNA干扰成功局部递送递至CNS(多恩(Dorn),G.等人，(2004)核酸(Nucleic Acids)32:e49；谭(Tan),PH.等人，(2005)基因治疗(Gene Ther.)12:59-66；牧村(Makimura),H.等人，(2002)BMC神经科学(BMC Neurosci.)3:18；希什金娜(Shishkina),GT.等人，(2004)神经科学(Neuroscience)129:521-528；塔克尔(Thakker),ER.等人，(2004)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)101:17270-17275；阿卡尼亚(Akaneya),Y.等人，(2005)神经生理学期刊(J.Neurophysiol.)93:594-602)并且通过鼻内给予成功递送至肺(霍华德(Howard)，KA.等人，(2006)分子治疗14:476-484；张(Zhang),X.等人，(2004)生物化学杂志(JJ.Biol.Chem.)279:10677-10684；比特科(Bitko),V.等人，(2005)自然医学(Nat.Med.)11:50-55)。对于全身性给予iRNA用于治疗疾病，可以将RNA修饰或可替代地使用药物递送系统进行递送；两种方法均起到防止dsRNA被体内核酸内切酶和核酸外切酶快速降解的作用。RNA或药用载体的修饰也可以允许iRNA组合物靶向至靶组织并避免不想要的脱靶效应。iRNA分子可以通过化学缀合至亲脂性基团如胆固醇以增强细胞摄取和防止降解进行修饰。例如将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身注射到小鼠中并且导致肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲减(苏兹赫克(Soutschek)J.等人(2004)自然432:173-178)。已经显示iRNA与适配体的缀合在前列腺癌的小鼠模型中抑制肿瘤生长并且介导肿瘤消退(麦克纳马拉(McNamara)JO.等人(2006)自然生物技术(Nat.Biotechnol.)24:1005-1015)。在替代实施例中，可以使用药物递送系统如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送iRNA。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)iRNA分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以容许iRNA由细胞高效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与iRNA结合或被诱导以形成包装siRNA的囊泡或胶束(参见例如金姆(Kim)SH.等人(2008)控制释放期刊(Journal ofControlled Release)129(2):107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身给予时iRNA的降解。用于制备和给予阳离子-iRNA复合物的方法很好地在本领域普通技术人员的能力范围内(参见例如，索伦森(Sorensen),DR.等人，(2003)分子生物学杂志327:761-766；维尔马(Verma),UN.等人，(2003)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)9:1291-1300；阿诺德(ArnoId),AS等人，(2007)高血压杂志(J.Hypertens.)25:197-205，这些文献的全部内容通过引用结合在此)。可用于全身性递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(索伦森,DR.等人，(2003)，上文；维尔马,UN.等人，(2003)，上文)、Oligofectamine、“固体核酸脂质粒子”(齐默尔曼(Zimmermann),TS.等人，(2006)自然441:111-114)、心磷脂(钱(Chien),PY.等人，(2005)癌症基因治疗12:321-328；帕尔(Pal),A.等人，(2005)国际肿瘤学杂志(Int J.Oncol.)26:1087-1091)、聚乙亚胺(博奈特(Bonnet)ME.等人(2008)药学研究(Pharm.Res.)8月16日电子出版先于印刷版；艾格纳(Aigner),A.(2006)生物医学与生物技术杂志(J.Biomed.Biotechnol.)71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(刘(Liu),S.(2006)分子制药学(Mol.Pharm.)3:472-487)以及聚酰胺型胺类(托马里亚(Tomalia),DA.等人(2007)生物化学会汇刊(Biochem.Soc.Trans.)35:61-67；柳(Yoo),H.等人，(1999)药学研究(Pharm.Res.)16:1799-1804)。在一些实施例中，iRNA与环糊精形成用于全身给予的复合物。用于给予iRNA和环糊精的药物组合物的方法可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用以其全文结合在此。

A.本发明的载体编码的iRNA

靶向Serpina1基因的iRNA可以从插入DNA或RNA载体中的转录单位表达(参见，例如，蒂尔(Couture),A等人,TIG.(1996),12:5-10；斯基尔伦(Skillern),A.等人，国际PCT公开号WO 00/22113；康拉德(Conrad)，国际PCT公开号WO 00/22114；以及康拉德，美国专利号6,054,299)。取决于使用的具体构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。转基因也可以如此构建以允许它作为染色体外质粒遗传(加斯曼(Gassmann)等人,美国国家科学院院刊(1995)92:1292)。

iRNA的单条链或多条链可以从表达载体上的启动子转录。当两条单独的链有待被表达以产生例如dsRNA时，可以将两个单独的表达载体共引入(例如通过转染或感染)到靶细胞中。可替代地，dsRNA的每条单独链可以通过均位于相同表达质粒上的启动子来转录。在一个实施例中，dsRNA被表达为通过一种接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，这样使得该dsRNA具有茎环结构。

iRNA表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞相容的那些，可以用来产生用于表达如在此所描述的iRNA的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域中熟知的并且从许多商业来源可获得。典型地，提供含有用于插入希望的核酸区段的合宜限制性位点的这类载体。表达iRNA的载体的递送可以是全身性的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向所需靶细胞引入的任何其他手段。

iRNA表达质粒可以被转染到靶细胞中作为具有阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKO

可以随在此所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不局限于：(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不局限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺伴随病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)微小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘病毒，例如痘苗病毒载体，或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；以及(j)辅助病毒依赖性腺病毒或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包含病毒序列以用于转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加体型复制的载体(例如EPV和EBV载体)中。用于重组表达iRNA的构建体通常将需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。以下进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。

有用于递送iRNA的载体将包括足以在希望的靶细胞或组织中表达iRNA的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型或调节/诱导型表达。

可以精确地调节iRNA的表达，例如通过使用对某些生理调节物(例如循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(多赫替(Docherty)等人,1994,FASEB杂志8:20-24)。适合于在细胞中或哺乳动物中控制dsRNA表达的此类诱导型表达系统包括例如由以下各项进行的调节：蜕皮激素、雌激素、黄体酮、四环素、二聚作用的化学诱导物以及异丙基-β-D1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。本领域技术人员将能够基于iRNA转基因的预期用途选择适宜的调节/启动子序列。

可以使用含有编码iRNA的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(参见米列尔(Miller)等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)217:581-599(1993))。这些逆转录病毒载体含有对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞DNA必需的组分。将编码iRNA的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如博森(Boesen)等人,生物疗法(Biotherapy)6:291-302(1994)找到，该文献描述使用逆转录病毒载体递送mdr1基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：克劳斯(Clowes)等人，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)93:644-651(1994)；金(Kiem)等人，血液83:1467-1473(1994)；萨尔蒙斯(Salmons)和贡兹堡(Gunzberg)，人类基因治疗(Human Gene Therapy)4:129-141(1993)；以及格罗斯曼(Grossman)和威尔逊(Wilson),遗传学与发育学新观点(Curr.Opin.in Genetics and Devel.)3:110-114(1993)。想到使用的慢病毒载体包括例如描述于美国专利号6,143,520；5,665,557和5,981,276中的基于HIV的载体，这些美国专利通过引用结合在此。

还想到腺病毒用于本发明的iRNA的递送中。腺病毒是特别有吸引力的媒介物，例如用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感不分裂细胞的优点。科扎斯凯(Kozarsky)和威尔森,遗传学与发育学新观点3:499-503(1993)提出基于腺病毒的基因疗法的综述。布特(Bout)等人，人类基因疗法5:3-10(1994)展示了腺病毒载体将基因转移至恒河猴呼吸道上皮的用途。基因治疗中使用腺病毒的其他实例可以在罗森菲尔德(Rosenfeld)等人，科学252:431-434(1991)；罗森菲尔德等人，细胞68:143-155(1992)；马斯特兰杰利(Mastrangeli)等人，临床研究杂志91:225-234(1993)；PCT公开WO94/12649；以及王(Wang)等人，基因治疗2:775-783(1995)中找到。用于表达本发明中表征的iRNA的合适AV载体、用于构建重组AV载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在夏(Xia)H等人,(2002),自然生物技术(Nat.Biotech.)20:1006-1010中描述。

也可以使用腺伴随病毒(AAV)载体来递送本发明的iRNA(沃尔什(Walsh)等人，实验生物学与实验医学会会报(Proc.Soc.Exp.Biol.Med.)204:289-300(1993)；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，iRNA可以从具有例如U6或H1 RNA启动子或细胞巨化病毒(CMV)启动子的重组AAV载体作为两个单独的互补性单链RNA分子表达。用于表达本发明中表征的dsRNA的合适AAV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于递送该载体至靶细胞中的方法在萨穆尔斯基(Samulski)R等人(1987)，病毒学杂志(J.Virol.)61:3096-3101；费希尔(Fisher)K J等人(1996),病毒学杂志，70:520-532；萨穆尔斯基R等人(1989),病毒学杂志63:3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号WO 94/13788；以及国际专利申请号WO 93/24641中描述，这些文献的完整披露内容通过引用结合在此。

另一种适合于递送本发明的iRNA的病毒载体是痘病毒如痘苗病毒，例如减毒痘苗病毒如修饰的安卡拉病毒(MVA)或NYVAC、禽痘病毒如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。

病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原来对这些载体假型化而进行修饰，或者适当时通过取代不同的病毒衣壳蛋白而进行修饰。例如慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、Mokola等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同衣壳蛋白血清型，使得AAV载体靶向不同的细胞；参见例如，拉宾诺维茨(Rabinowitz)J E等人，(2002)，病毒学杂志76:791-801，这些文献的完整披露内容通过引用结合在此。

载体的药物制剂可以包括在一种可接受的稀释剂中的该载体，或可以包括一种缓释基质，在该缓释基质中该基因递送媒介物被嵌入。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产出的情况下，该药物制剂可以包括产出该基因递送系统的一个或多个细胞。

III.本发明的药物组合物

本发明还包括药物组合物和配制品，它们包括本发明的iRNA。在一个实施例中，在此提供了含有如在此所描述的iRNA和药学上可接受的载体的药物组合物。含有iRNA的药物组合物可用于治疗与Serpina1基因的表达或活性相关联的疾病或病症，例如Serpina1缺乏相关病症如Serpina1缺乏肝脏病症。基于递送模型配制这类药物组合物。一个实例是经配制以便通过肠胃外递送，例如通过静脉内(IV)递送来全身性施用的组合物。另一个实例是被配制用于例如通过输注到脑，如通过连续泵输注来直接递送到脑实质中的组合物。

包含本发明的RNAi试剂的药物组合物可以是例如具有或不具有一种缓冲液的溶液或含有药学上可接受的载体的组合物。这样的组合物包括例如水性或结晶组合物、脂质体配制品、胶束配制品、乳剂以及基因治疗载体。

在本发明的方法中，该RNAi试剂可以在一种溶液中给予。一种游离RNAi试剂可以在一种非缓冲溶液中、例如在生理盐水中或在水中给予。可替代地，该游离siRNA还可以在一种适合缓冲溶液中给予。该缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个优选实施例中，该缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以将包含该iRNA试剂的缓冲液的pH与体积摩尔渗透压浓度进行调节，使得它适合于给予受试者。

在一些实施例中，该缓冲溶液进一步包含一种用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的试剂，以使得克分子渗透压浓度被保持在一个所希望的值，例如在人血浆的生理值。可以加入到该缓冲溶液以控制克分子渗透压浓度的溶质包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、非代谢聚合物、维生素、离子、糖、代谢物、有机酸、脂质或盐。在一些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是一种盐。在某些实施例中，用于控制该溶液的克分子渗透压浓度的该试剂是氯化钠或氯化钾。

本发明的这些药物组合物可以足以抑制Serpina1基因的表达的剂量给予。通常，本发明的iRNA的适合剂量将处于每天约0.001至约200.0毫克/受体的千克体重范围内，通常处于每天约1mg至50mg/千克体重范围内。例如，dsRNA可以按每个单剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、或约50mg/kg给予。

例如，可以按以下剂量给予RNAi试剂(例如dsRNA)：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或约10mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在另一个实施例中，可以按以下剂量给予RNAi试剂(例如dsRNA)：约0.1至约50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如，可以按以下剂量给予RNAi试剂(例如dsRNA)：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或约10mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在另一个实施例中，按以下剂量给予RNAi试剂(例如dsRNA)：约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kg、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kg、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kg、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kg、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kg、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。在一个实施例中，以约10mg/kg至约30mg/kg的剂量给予该dsRNA。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如，可以给予受试者治疗量的iRNA，如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或约50mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在某些实施例中，例如，当本发明的组合物包含如在此所描述的dsRNA和脂质时，可以给予受试者治疗量的iRNA，如约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.2mg/kg至约5mg/kg、约0.2mg/kg至约10mg/kg、约0.3mg kg至约5mg/kg、约0.3mg/kg至约10mg/kg、约0.4mg/kg至约5mg/kg、约0.4mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约2.5mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约4.5mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约5.5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约6.5mg/kg至约10mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约7.5mg/kg至约10mg/kg、约8mg/kg至约10mg/kg、约8.5mg/kg至约10mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg或约9.5mg/kg至约10mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

例如，可以按以下剂量给予dsRNA：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或约10mg/kg。这些列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

在本发明的某些实施例中，例如，当双链RNAi试剂包括修饰(例如，在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序，在该试剂的裂解位点处或附近包括这样一个基序)、六个硫代磷酸酯键联以及脂质时，按以下剂量给予这样一种制剂：约0.01至约0.5mg/kg、约0.01至约0.4mg/kg、约0.01至约0.3mg/kg、约0.01至约0.2mg/kg、约0.01至约0.1mg/kg、约0.01mg/kg至约0.09mg/kg、约0.01mg/kg至约0.08mg/kg、约0.01mg/kg至约0.07mg/kg、约0.01mg/kg至约0.06mg/kg、约0.01mg/kg至约0.05mg/kg、约0.02至约0.5mg/kg、约0.02至约0.4mg/kg、约0.02至约0.3mg/kg、约0.02至约0.2mg/kg、约0.02至约0.1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.09mg/kg、约0.02mg/kg至约0.08mg/kg、约0.02mg/kg至约0.07mg/kg、约0.02mg/kg至约0.06mg/kg、约0.02mg/kg至约0.05mg/kg、约0.03至约0.5mg/kg、约0.03至约0.4mg/kg、约0.03至约0.3mg/kg、约0.03至约0.2mg/kg、约0.03至约0.1mg/kg、约0.03mg/kg至约0.09mg/kg、约0.03mg/kg至约0.08mg/kg、约0.03mg/kg至约0.07mg/kg、约0.03mg/kg至约0.06mg/kg、约0.03mg/kg至约0.05mg/kg、约0.04至约0.5mg/kg、约0.04至约0.4mg/kg、约0.04至约0.3mg/kg、约0.04至约0.2mg/kg、约0.04至约0.1mg/kg、约0.04mg/kg至约0.09mg/kg、约0.04mg/kg至约0.08mg/kg、约0.04mg/kg至约0.07mg/kg、约0.04mg/kg至约0.06mg/kg、约0.05至约0.5mg/kg、约0.05至约0.4mg/kg、约0.05至约0.3mg/kg、约0.05至约0.2mg/kg、约0.05至约0.1mg/kg、约0.05mg/kg至约0.09mg/kg、约0.05mg/kg至约0.08mg/kg,or about 0.05mg/kg至约0.07mg/kg。前述列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分，例如该RNAi试剂可以约0.015mg/kg至约0.45mg/mg的剂量给予受试者。

在一些实施例中，RNAi试剂，例如药物组合物中的RNAi试剂可以按约0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg或约0.5mg/kg的剂量给予。前述列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该iRNA在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在所述情况下，包含在每次亚剂量中的iRNA必须是相对应更小的，以便实现总每日剂量。也可以将剂量单位复配用于在几天内递送，例如使用在几天时间范围内提供持续的iRNA释放的常规持续释放配制品。持续释放配制品是本领域中熟知的并且对于在特定位点递送试剂是特别有用的，由此可以与本发明的试剂使用。在这一实施例中，该剂量单位包含相对应的多个每日剂量。

在其他实施例中，单剂量的该药物组合物可以长久持续，从而后续剂量以不多于3、4或5天的间距或以不多于1、2、3、或4周的间距施用。在本发明的一些实施例中，每周给予一次单剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施例中，每两月给予单剂量的本发明的这些药物组合物。

本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所要求的剂量和时间安排，这些因素包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄以及其他存在的疾病。此外，用治疗有效剂量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或一系列治疗。如在此的其他地方所描述，使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试，可以评估本发明涵盖的各个iRNA的有效剂量和体内半衰期。

小鼠遗传学进展产生了用于研究不同人类疾病的许多小鼠模型，例如将从减少Serpina1表达受益的肝脏病症。此类模型可以用于iRNA的体内测试，以及用于确定治疗有效的剂量。适合的小鼠模型在本领域是已知的，并且包括例如含有表达人Serpina1的转基因的小鼠。

取决于希望局部或全身性治疗并且取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按许多方式给予。给予可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)；肺的，例如通过吸入或吹入粉剂或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的和透皮的；口服的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内的注射或输注；皮下的，例如通过植入性器械的给予；或颅内的，例如通过实质内、鞘内或心室内的给予。iRNA可以按这样的方式递送以靶向特定组织，如肝脏(例如肝脏的肝细胞)。

用于局部给予的药物组合物和配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉剂。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等可以是必要的或希望的。包衣的安全套、手套等也可以是有用的。适合的局部配制品包括其中在本发明中体现的iRNA与局部用递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子脂质和脂质体(例如二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本发明中表征的iRNA可以封装于脂质体内部或可以与其、尤其是与阳离子脂质体形成复合物。可替代地，iRNA可以与脂质、具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸与酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或C

A.包括膜性分子集合体的iRNA配制品

用于在本发明的组合物和方法中使用的iRNA可以被配制成用于在膜性分子集合体中递送例如脂质体或胶束。如在此所使用，术语“脂质体”是指由设置在至少一个双层(例如一个双层或多个双层)中的两亲性脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的或多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。水性部分包含该iRNA组合物。该亲脂性材料从典型地不包括iRNA组合物的水性外部(尽管在一些实例中，它可能包括)分离该水性内部。脂质体对于将活性成分转移以及递送至作用位点是有用的。因为脂质体膜与生物膜结构上类似，当脂质体被施用到一种组织时，该脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体与细胞的融合进行，包括iRNA的内部水性内容物被递送到细胞中，其中该iRNA可以特异性结合到一种靶RNA并且可以介导RNAi。在一些情况下，这些脂质体还被特异地靶向成例如将该iRNA引导到特定细胞类型上。

包含RNAi试剂的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中使得用脂质组分形成胶束。例如该脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。该洗涤剂可具有高的临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将RNAi试剂制剂添加到包括该脂质组分的胶束中。该脂质上的阳离子基团与RNAi试剂相互作用并在RNAi试剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析将该洗涤剂除去以得到RNAi试剂的脂质体制剂。

如果必要，可以在缩合反应过程中添加协助缩合的载体化合物，例如通过控制添加。例如，该载体化合物可以是除了核酸以外的一种聚合物(例如，精胺或亚精胺)。还可以调整pH以有利于缩合。

用于产生稳定的多核苷酸递送媒介物的方法(其结合了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为该递送媒介物的结构组分)进一步描述在例如WO 96/37194中，其全部内容通过引用结合在此。脂质体形成还可以包括描述于以下文献中的示例性方法的一个或多个方面：费尔格纳(Felgner),P.L等人，美国国家科学院院刊8:7413-7417,1987；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；班厄姆(Bangham)等人，膜分子生物学(M.Mol.Biol.)23:238,1965；奥尔森(Olson)等人，生物化学与生物物理学报(Biochim.Biophys.Acta)557:9,1979；苏卡(Szoka)等人，美国国家科学院院刊75:4194,1978；梅休(Mayhew)等人生物化学与生物物理学报775:169,1984；金等人生物化学与生物物理学报728:339,1983；以及福永(Fukunaga)等人，内分泌学(Endocrinol.)115:757,1984。常用的用于制备用作递送媒介物的具有适当尺寸的脂质聚集体的技术包括超声处理和冻融加挤出(参见例如梅耶(Mayer)等人生物化学与生物物理学报858:161,1986)。当希望一致小(50nm至200nm)和相对均匀的聚集体时，可以使用微流化法(梅休等人，生物化学与生物物理学报775:169,1984)。这些方法容易地适用于将RNAi试剂制剂封装到脂质体中。

脂质体分成两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，这些脂质体与带负电荷的核酸分子相互作用以形成一种稳定的复合物。该带正电荷的核酸/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在核内体中。由于核内体内的酸性pH，脂质体破裂，从而将它们的内含物释放到细胞质中(王等人，生物化学与生物物理研究通讯，1987,147,980-985)。

pH-敏感或带负电荷的脂质体包埋核酸而不与它复合。由于该核酸与该脂质是带类似的电荷，所以形成排斥而不是复合。然而，某种核酸包埋于这些脂质体的含水内部。pH-敏感脂质体已经用来递送编码胸苷激酶基因的核酸至培养的细胞单层。在靶细胞内检测到外源基因的表达(周(Zhou)等人，控制释放期刊，1992,19,269-274)。

脂质体组合物的一个主要类型包括除了天然来源的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如中性脂质体组合物可以从二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)中形成。阴离子脂质体组合物通常可以形成自二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，而阴离子融合脂质体主要形成自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。另一个类型的脂质体组合物从磷脂酰胆碱(PC)，例如像大豆PC和蛋PC中形成。另一个类型从磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物中形成。

用于将脂质体体内和体外引入细胞中的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；费尔格纳，生物化学杂志269:2550,1994；纳贝尔(Nabel)，美国国家科学院院刊90:11307,1993；纳贝尔，人类基因治疗3:649,1992；格申(Gershon)，生物化学32:7143,1993；以及施特劳斯(Strauss)EMBO杂志11:417,1992。

还已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的用途，具体地包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包括Novasome

脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此所使用的指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(A)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯G

包含一种或多种糖脂的不同脂质体是本领域中已知的。帕帕哈都久珀罗斯(Papahadjopoulos)等人(纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.),1987,507,64)报道了单唾液酸神经节苷酯G

在一个实施例中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合至细胞膜的优势。非阳离子脂质体尽管不能够一样有效地与质膜融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取，并且可以用来将RNAi试剂递送到巨噬细胞中。

脂质体的其他优点包括；从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的且生物可降解的；脂质体可以并入广泛类型的水溶性和脂溶性药物；脂质体可以在其内部区室中保护封装的RNAi试剂免受代谢和降解(洛索夫(Rosoff)，“药物剂型(Pharmaceutical DosageForms)”，利伯曼(Lieberman)、列赫尔(Rieger)与斑克(Banker)(编著),1988,卷1，第245页)。在制备脂质体配制品方面的重要的考虑是脂质表面电荷、囊泡尺寸以及这些脂质体的水性体积。

可使用一种带正电荷的合成阳离子脂质，N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)以形成小的脂质体，其自发地与核酸相互作用形成脂质-核酸复合物，这些复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致递送RNAi试剂(参见，例如费尔格纳P.L.等人，美国国家科学院院刊8:7413-7417，1987和美国专利号4,897,355，关于DOTMA以及其与DNA一起使用的说明)。

可以将一种DOTMA类似物、1,2-双(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)与磷脂组合使用形成DNA络合囊泡。Lipofectin

其他报道的阳离子脂质化合物包括已缀合至多个部分的那些，包括例如已缀合至两种类型的脂质中的一种的羧基精胺，并且包括化合物如5-羧基精胺基甘氨酸二辛油酰基酰胺(“DOGS”)(Transfectam

另一种阳离子脂质缀合物包括用胆固醇(“DC-Chol”)对该脂质进行的衍生，其已被配制成脂质体与DOPE的组合(参见高(Gao),X，和黄(Huang),L.，生物化学与生物物理学研究通讯179:280，1991)。脂质聚赖氨酸，通过将聚赖氨酸缀合至DOPE制成，已被报道在血清存在下是有效于转染的(周(Zhou),X等人，生物化学和生物物理学报1065:8，1991)。对于某些细胞系，这些含有缀合阳离子脂质的脂质体据说显示出较低的毒性，并且比含DOTMA组合物提供更有效的转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(维考(Vical)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州)和Lipofectamine(DOSPA)(生命科技公司(Life Technology,Inc.)，盖瑟斯堡，马里兰州)。适合用于寡核苷酸的递送的其他阳离子脂质被描述于WO 98/39359和WO 96/37194中。

脂质体配制品特别适用于局部给予，脂质体比其他配制品呈现若干优势。这些优势包括：减少的与所给予药物的高全身性吸收相关的副作用、在希望的靶标处所给予药物的增加的积累、以及将RNAi试剂给予进入皮肤的能力。在一些实施例中，脂质体用于将RNAi试剂递送到表皮细胞，并且也用以提高RNAi试剂向真皮组织(例如皮肤)的渗入。例如可局部施用这些脂质体。已经记录了配制为脂质体的药物至皮肤的局部递送(参见，例如温纳(Weiner)等人，药物靶向杂志(Journal of Drug Targeting),1992,卷2,405-410和杜普莱西斯(Plessis)等人，抗病毒研究(Antiviral Research),18,1992,259-265；曼尼诺(Mannino),R.J.和福尔德-福格利特(Fould-Fogerite),S.，生物技术(Biotechniques)6:682-690,1988；伊塔尼(Itani),T.等人，基因56:267-276.1987；尼古劳(Nicolau),C.等人，酶学方法(Meth.Enz.)149:157-176,1987；施特劳宾格(Straubinger),R.M.和帕帕哈都久珀罗斯D.，酶学方法101:512-527,1983；王C.Y.和黄L.，美国国家科学院院刊84:7851-7855,1987)。

还已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的用途，具体地包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包括Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将一种药物递送入小鼠皮肤的真皮。具有RNAi试剂的这样的配制品可用于治疗皮肤病学失调。

包括iRNA的脂质体可被制成高度可变形的。这样的变形可以使脂质体能够通过比该脂质体的平均半径小的孔渗透。例如传递体是一种可变形的脂质体的类型。传递体可以通过将表面边缘活化剂(通常为表面活性剂)添加到一种标准的脂质体组合物中制成。包括RNAi试剂的传递体可以例如通过皮下地感染被递送以将RNAi试剂递送到皮肤中的角质形成细胞中。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适合的透皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。此外，由于这些脂质特性，这些传递体可以是自优化的(适应例如皮肤中的孔的形状)、自我修复性的，并且可频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。

属于本发明的其他配制品描述在2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,611；2008年3月26日提交的美国临时申请序列号61/039,748；2008年4月22日提交的美国临时申请序列号61/047,087以及2008年5月8日提交的美国临时申请序列号61/051,528。2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331还描述了属于本发明的配制品。

传递体是又另一种类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集体，它们是用于药物递送媒介物的引人注目的候选物。传递体可以被描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶标而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了制备传递体，可能的是将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加至一种标准的脂质体组合物。传递体已经被用于将血清白蛋白递送至皮肤。传递体介导的血清白蛋白的递送已经显示与包含血清白蛋白的溶液的皮下注射同样有效。

表面活性剂在配制品如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中有广泛应用。对许多不同类型的表面活性剂(天然的和合成的两者)的特性进行分类并评级的最普通的方法是通过使用亲水/亲油平衡值(HLB)。亲水基团(又称为“头部”)的性质为对用于配制品中的不同表面活性剂进行归类提供了最有用的手段(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克公司(MarcelDekker,Inc.)，纽约州纽约(New York,N.Y.)，1988，第285页)。

如果该表面活性剂分子没有离子化，它被分类为一种非离子型表面活性剂。发现非离子型表面活性剂在药物与化妆品产品方面有广泛应用并且能够在广泛的pH范围使用。总体上，取决于它们的结构，它们的HLB值范围为从2至大约18。非离子型表面活性剂包括非离子型酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯以及乙氧基化酯。非离子型烷醇酰胺以及醚(例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物)也包括在这一类别中。聚氧乙烯表面活性剂是该非离子型表面活性剂类别中最常用的成员。

如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带负电荷，则该表面活性剂被分类为阴离子型。阴离子型表面活性剂包括羧化物(例如皂)、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯(例如烷基硫酸酯以及乙氧基化的烷基硫酸酯)、磺酸酯(例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯以及磺基琥珀酸酯)、以及磷酸酯。该阴离子型表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。

如果该表面活性剂分子在其溶解或分散在水中时携带正电荷，则该表面活性剂被分类为阳离子型。阳离子型表面活性剂包括季铵盐以及乙氧基化胺。这些季铵盐是这一类别的最常用的成员。

如果该表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，该表面活性剂被分类为两性型。两性型表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱以及磷脂。

已经综述了表面活性剂在药品、配制品和在乳剂中的用途(列赫尔，“药物剂型”，马塞尔德克公司，纽约州纽约，1988，第285页)。

用于在本发明的方法中使用的iRNA也可提供为胶束配制品。“胶束”在此处定义为一种特定类型的分子集合体，其中两亲性分子排列在一个球形结构中，使得这些分子的所有疏水部分向内定向，而使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。

适合用于通过透皮的膜递送的混合胶束配制品可以通过混合该siRNA组合物的水溶液、碱金属C

在一个方法中，制备一种第一胶束组合物，其包含该siRNA组合物以及至少该碱金属烷基硫酸盐。然后将该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合，以形成混合胶束组合物。在另一种方法中，该胶束组合物是通过将该siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成的化合物混合，然后添加剩余的胶束形成化合物(剧烈混合下)来制备。

可将苯酚和/或间甲酚添加到该混合胶束组合物中以稳定该配制品并防止细菌生长。可替代地，可随着胶束形成成分一起添加苯酚和/或间甲酚。也可以在该混合胶束组合物形成之后加入等渗剂，如甘油。

对于作为喷雾的胶束配制品的递送，该配制品可被装入气溶剂分配器中并将该分配器用推进剂填充。在该分配器中推进剂(其在压力下)处于液体形式。对各成分的比例进行调整，以便使该水相和推进剂相成为一体，即存在一个相。如果有两个相，有必要在分配这些内容物的部分(例如通过计量阀)之前摇动该分配器。药物试剂的分配量是从计量阀中以细雾推进。

推进剂可以包括含氢氯氟烃、含氢氟烃、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，也可以使用HFA 134a(1,1,1,2四氟乙烷)。

这些必需成分的特定浓度可以通过相对简单的实验来确定。对于经口腔的吸收，通常希望的是增加例如至少两倍或三倍的对于通过经胃肠道注射或给予的剂量。

B.脂质颗粒

iRNA，例如本发明的dsRNA可以被完全封装在脂质配制品(例如LNP或其他核酸-脂质颗粒)中。

如在此所使用，术语“LNP”是指一种稳定的核酸-脂质颗粒。LNP含有一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质以及一种阻止该颗粒聚集的脂质(例如一种PEG-脂质缀合物)。LNP对于合成应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端位点积累(例如在与给予位点物理分开的位点)。LNP包括“pSPLP”，该pSPLP包括如在PCT公开号WO 00/03683中列举的一种包囊的缩合剂-核酸复合物。本发明的颗粒典型地具有约50nm至约150nm，更典型地是约60nm至约130nm，更典型地是约70nm至约110nm，最典型地是约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。另外，当存在于本发明的核酸-脂质颗粒中时，这些核酸在水溶液中对核酸酶的降解是有抗性的。核酸-脂质颗粒及其制备方法在例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国公开号2010/0324120以及PCT公开号WO 96/40964中披露。

在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如脂质与dsRNA的比率)将处于从约1:1至约50:1，从约1:1至约25:1，从约3:1至约15:1，从约4:1至约10:1，从约5:1至约9:1，或约6:1至约9:1的范围内。以上列举的范围的范围中间值也被想到成为本发明的部分。

阳离子脂质可以例如N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(I-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、N-(I-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(DODMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二亚油烯基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(二甲基氨基)乙酸基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亚油烯基氧基-3-吗啉代丙烷(DLin-MA)、1,2-二亚油酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亚油烯基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、1-二亚油酰基-2-亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1-二亚油烯基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亚油酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亚油烯基氧基-3-(N-甲基哌嗪代)丙烷(DLin-MPZ)或3-(N,N-二亚油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基氨基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亚油烯基氧代-3-(2-N,N-二甲基氨基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)或其类似物、(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-胺(ALN 100)、(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(MC3)、1,1'-(2-(4-(2-((2-(二(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-l-基)乙基氮烷二基)双十二烷-2-醇(Tech G1)或其混合物。该阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从约20mol％至约50mol％或约40mol％。

在另一个实施例中，化合物2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环可以用来制备脂质-siRNA纳米颗粒。2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环的合成描述于2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中，将其通过引用结合于此。

在一个实施例中，该脂质-siRNA颗粒包括40％2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环:10％DSPC:40％胆固醇:10％PEG-C-DOMG(摩尔百分数)，颗粒尺寸在63.0±20nm，并且具有0.027siRNA/脂质比率。

该可电离的/非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不限于：二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从约5mol％至约90mol％，约10mol％，或约58mol％。

抑制颗粒聚集的缀合脂质可以是例如一种聚乙二醇(PEG)-脂质，其包括但不限于PEG-二酰甘油(DAG)、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)，或其混合物。PEG-DAA缀合物可以是，例如PEG-二月桂基氧丙基(Ci

在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该胆固醇例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约60mol％或约48mol％。

在一个实施例中，利匹哆异德(lipidoid)ND98.4HCl(MW 1487)(参见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，通过引用结合在此)、胆固醇(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))以及PEG-神经酰胺C16(阿文蒂极性脂质公司(Avanti Polar Lipids))可以用来制备脂质-dsRNA纳米颗粒(即，LNP01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：ND98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml；PEG-神经酰胺C16，100mg/ml。然后可以例如42:48:10摩尔比组合ND98、胆固醇和PEG-神经酰胺C16储备溶液。合并的脂质溶液可以与(例如pH5乙酸钠中的)水性dsRNA混合，这样使得最终乙醇浓度是约35％-45％并且最终乙酸钠浓度是约100-300mM。一旦混合，脂质-dsRNA纳米颗粒典型地自发形成。取决于所需的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北部脂质公司(Northern Lipids,Inc))，经聚碳酸酯膜(例如100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇去除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如在约pH 7，例如约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH 7.4下的磷酸盐缓冲的盐水(PBS)交换。

LNP01配制品例如在国际申请公开号WO 2008/042973中描述，将其通过引用结合在此。

另外的示例性脂质-dsRNA配制品描述于表A中。

表A.

DSPC:二硬脂酰磷脂酰胆碱

DPPC:二棕榈酰磷脂酰胆碱

PEG-DMG：PEG-双二肉豆蔻酰甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(平均分子量为2000的PEG)

PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(平均分子量为2000的PEG)

PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻基氧基丙胺(平均分子量为2000的PEG)

包含LNP(l,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的配制品描述于2009年4月15日提交的国际公开号WO 2009/127060中，通过引用将其结合于此。

含XTC的配制品描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686以及2010年1月29日提交的国际申请号PCT/US2010/022614，将其通过引用特此结合。

包含MC3的配制品描述于，例如2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120，其全部内容通过引用特此结合。

包含ALNY-100的配制品描述于例如以下中：例如，2009年11月10日提交的国际专利申请号PCT/US 09/63933，将其通过引用特此结合。

包含C12-200的配制品描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号PCT/US 10/33777，将其通过引用特此结合。

可电离的/阳离子脂质的合成

在本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物，例如阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。

“烷基”意指含有从1至24个碳原子的直链或支链、非环状或环状的饱和脂肪族烃。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戍基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等；而不饱和环状烷基包括环戊烯基和环己烯基等。

“烯基”意指在相邻碳原子之间含有至少一个双键的如上所定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基等。

“炔基”意指在相邻碳之间另外含有至少一个三键的如上所定义的任何烷基或烯基。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基等。

“酰基”是指任何烷基，烯基或炔基，其中，在附接点的碳被氧代基团取代，如下所定义。例如，-C(＝O)烷基、-C(＝O)烯基和-C(＝O)炔基是酰基。

“杂环”意味着一个5-至7-元单环、或7-至10-元二环的杂环，它是饱和的、不饱和的或芳香族的，并且它包含独立地选自氮、氧、和硫的从1或2个杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可以是任选地氧化的，并且该氮杂原子可以任选地是季铵化的，包括双环，其中上述杂环的任一个被稠合至一个苯环。杂环可以经由任何杂原子或碳原子附接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。

术语“任选取代的烷基”，“任选取代的烯基”，“任选取代的炔基”，“任选取代的酰基”和“任选被取代的杂环”是指，当取代时，至少一个氢原子被一个取代基置换。在氧代取代基(＝O)的情况下，两个氢原子被置换。在这方面，取代基包括氧代、卤素、杂环、-CN、-ORx、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、–SOnRx以及-SOnNRxRy，其中n是0、1或2，Rx和Ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一个可以进一步由以下取代基的一种或多种取代：氧代、卤素、-OH、-CN、烷基、-ORx、杂环、-NRxRy、-NRxC(＝O)Ry、-NRxSO2Ry、-C(＝O)Rx、-C(＝O)ORx、-C(＝O)NRxRy、-SOnRx以及-SOnNRxRy。

“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。

在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如有机合成中的保护基(Protective Groups in OrganicSynthesis)，格林(Green)T.W.等人，威利数字出版平台(Wiley-Interscience)，纽约市，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是降低或消除不希望的官能团反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团以掩蔽其在某些反应过程中的反应性并且随后将其移除以暴露原始官能团。在一些实施例中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除不希望的醇官能团反应性的任何基团。保护基团可以使用本领域中公知的技术添加和去除。

式A的合成

在一些实施例中，使用式A的阳离子脂质配制本发明的核酸-脂质颗粒：

其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以是一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是XTC(2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2产生以上式A的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。

方案1

根据方案1制备脂质A，其中R1和R2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且R3和R4独立地是低级烷基或R3和R4可以一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生式A的脂质。式A的脂质可以用式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中X是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根等的阴离子反离子。

方案2

可选地，可以根据方案2制备酮1原料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备格氏(Grignard)试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。如方案1中所述，酮1转化成式A的相应脂质。

MC3的合成

如下制备DLin-M-C3-DMA(即，(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-醇(0.53g)、4-N,N-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-N,N-二甲氨基吡啶(0.61g)以及1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5mL)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀碳酸氢钠水溶液洗涤。将有机部分在无水硫酸镁上干燥，过滤并且在旋转蒸发器上移除溶剂。使用1％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物穿过硅胶柱(20g)。合并含有纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。ALNY-100的合成

使用以下方案3进行缩酮519[ALNY-100]的合成：

515的合成

在0℃在氮气氛下向双颈RBF(1L)中LiAlH4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水THF中的搅拌悬浮液缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mLTHF中的溶液。在完全添加之后，将反应混合物加温至室温并且然后加热至回流，持续4h。通过TLC监测反应的进展。在完成反应(借助TLC监测)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和Na2SO4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用THF充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400mL二噁烷和26mL浓HCl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的盐酸盐515。产率：7.12g 1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝9.34(宽,2H),5.68(s,2H),3.74(m,1H),2.66-2.60(m,2H),2.50-2.45(m,5H)。

516的合成

向250mL双颈RBF中化合物515在100mL无水DCM中的搅拌溶液中添加NEt3(37.2mL，0.2669mol)并在氮气气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50mL无水DCM中的N-(苄氧羰氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应完成(通过TLC监测的2-3h)之后，用1N HCl溶液(1×100mL)和饱和NaHCO3溶液(1×50mL)连续洗涤混合物。随后在无水Na2SO4上干燥有机层并且蒸发溶剂以产生粗制材料，该粗制材料通过硅胶柱色谱法纯化以获得作为粘性物质的516。产率：11g(89％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝7.36-7.27(m,5H),5.69(s,2H),5.12(s,2H),4.96(br.,1H)2.74(s,3H),2.60(m,2H),2.30-2.25(m,2H)。LC-MS[M+H]-232.3(96.94％)。

517A和517B的合成

将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mL RBF中的220mL丙酮和水(10:1)的溶液内，并且在室温向其中添加N-甲基吗啉-N-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2mL 7.6％OsO4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时)后，将混合物通过添加固体Na2SO3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用DCM(300mL)稀释并且用水(2×100mL)洗涤，随后用饱和NaHCO3(1×50mL)溶液、水(1×30mL)并最终用盐水(1×50mL)洗涤。在无水Na2SO4上干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱色谱法纯化提供了非对映异构体的混合物，这些非对映异构体由制备级HPLC分离。产率：约6g粗制物

517A-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ＝7.39-7.31(m,5H),5.04(s,2H),4.78-4.73(m,1H),4.48-4.47(d,2H),3.94-3.93(m,2H),2.71(s,3H),1.72-1.67(m,4H)。LC-MS-[M+H]-266.3，[M+NH4+]-283.5存在，HPLC-97.86％。通过X射线证实立体化学。

518的合成

使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的方法，获得呈无色油状物的化合物518(1.2g，41％)。1H-NMR(CDCl3,400MHz):δ＝7.35-7.33(m,4H),7.30-7.27(m,1H),5.37-5.27(m,8H),5.12(s,2H),4.75(m,1H),4.58-4.57(m,2H),2.78-2.74(m,7H),2.06-2.00(m,8H),1.96-1.91(m,2H),1.62(m,4H),1.48(m,2H),1.37-1.25(br m,36H),0.87(m,6H)HPLC-98.65％。

用于合成化合物519的一般方法

将化合物518(1当量)在己烷(15mL)中的溶液以逐滴方式添加至LAH在THF(1M，2当量)中的冰冷溶液中。在完成添加之后，将混合物在40℃下加热0.5h，然后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和Na2SO4水溶液小心地水解，然后经硅藻土(celite)过滤并且缩减成油状物。柱色谱法提供呈无色油状物获得的纯519(1.3g，68％)。13C NMRδ＝130.2,130.1(x2),127.9(x3),112.3,79.3,64.4,44.7,38.3,35.4,31.5,29.9(x2),29.7,29.6(x2),29.5(x3),29.3(x2),27.2(x3),25.6,24.5,23.3,226,14.1；电喷雾MS(+ve):C44H80NO2(M+H)+的计算分子量为654.6，观察到分子量为654.6。

通过标准或非挤出方法制备的配制品可以按类似的方式来表征。例如配制品典型地通过视觉检查来进行表征。它们应该是发白的半透明溶液，无聚集物或沉淀。脂质纳米颗粒的粒径和粒径分布可以使用例如马尔文(Malvern)Zetasizer Nano ZS(马尔文公司(Malvern)，USA)通过光散射来进行测量。颗粒应该是约20-300nm，例如尺寸是40-100nm。该粒径分布应该是单峰的。配制品中的总dsRNA浓度以及捕获的片段是使用染料排除测定来评估。配制的dsRNA的样品可以与RNA结合染料如Ribogreen(分子探针公司(MolecularProbes))在配制品破坏性表面活性剂(例如0.5％Triton-X100)存在或不存在下孵育。配制品中的总dsRNA可以相对于标准曲线，通过来自含有表面活性剂的样品的信号来确定。该捕获的片段是通过将“游离”dsRNA内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)从该总dsRNA内含物中减去来确定。包埋的dsRNA的百分比典型地>85％。对于LNP配制品而言，颗粒尺寸是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm、以及至少120nm。适合的范围典型地是约至少50nm至约至少110nm、约至少60nm至约至少100nm、或约至少80nm至约至少90nm。

用于口服给予的组合物和配制品包括粉剂或颗粒剂、微粒剂、纳米颗粒剂、在水或非水性介质中的混悬液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或迷你片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或结合剂可以是希望的。在一些实施例中，口服配制品是以下那些：其中在本发明中体现的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂以及螯合剂结合地给予。适合的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。合适的胆酸/盐包括鹅脱氧胆酸(CDCA)以及乌索脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘油胆酸、甘油脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-梭链孢酸钠以及甘油二氢梭链孢酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、一种酰基肉毒碱、一种酰基胆碱、或一种甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠盐)。在一些实施例中，渗透增强剂的组合(例如脂肪酸/盐)是与胆汁酸/盐组合使用。一个示例性的组合是月桂酸、羊蜡酸以及UDCA的钠盐。其他渗透促强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本发明表征的dsRNA可以口服递送，以包括喷雾干燥颗粒的颗粒剂的形式递送，或者复合成微颗粒或纳米颗粒。DsRNA复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生化聚亚胺、短梗霉多糖、纤维素和淀粉。合适的复合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如p-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-异丁烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白与DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻朊酸盐、以及聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服配制品及其制备在美国专利6,887,906、美国公开号20030027780以及美国专利号6,747,014中详述，这些文献的每一个通过引用结合在此。

用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给药的组合物和配制品可以包括无菌水溶液，其也可以包含缓冲液、稀释剂及其他适当的添加剂，例如但不限于：渗透增强剂、载体化合物及其他药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳剂以及含脂质体配制品。这些组合物可以产生自多种组分，这些组分包括但不限于预成形的液体、自乳化固体以及自乳化半固体。特别优选的是当治疗肝脏病症(例如肝癌)时靶向肝脏的配制品。

本发明的药物配制品(可以方便地以单位剂型存在)可以根据医药工业内熟知的常规技术来制备。此类技术包括以下这样的步骤：将这些活性成分与该(这些)药物载体或赋形剂进行联合。总体而言，这些配制品是通过以下步骤来制备：使这些活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或它们两者均匀地且精细地联合，并且如果需要，进而将产品成形。

本发明的这些组合物可以被配制成任何许多可能的剂型，如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆剂、软凝胶、栓剂以及灌肠剂。本发明的这些组合物还可以被配制为在水性、非水性或混合性介质中的混悬液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该混悬液还可以含有稳定剂。

C.另外的配制品

乳剂

可以将本发明的组合物制备和配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散于另一种中的多相体系(参见，例如安赛尔(Ansel)的药物剂型与药物传递系统(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)，艾伦LV.、波波维奇(Popovich)NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(LippincottWilliams&Wilkins)(第8版)，纽约州纽约；艾迪升，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；布洛克，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第2卷，第335页；希古契(Higuchi)，雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，麦克出版公司(Mack Publishing Co.)，伊斯顿(Easton)，Pa.,1985,第301页)。乳剂经常是包含密切混合且彼此分散的两个不混溶的液相的双相体系。通常，乳剂可以为油包水(w/o)或水包油(o/w)两种。当水相作为微小液滴细碎并分散到本体油相中时，所产生的组合物被称为油包水(w/o)乳剂。可替代地，当油相作为微小液滴细碎并分散到本体水相中时，所产生的组合物被称为水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以含其他组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，或者其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，例如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。此类复合配制品通常提供某些简单的二元乳剂所不具有的优势。当多重乳剂中的o/w乳剂的各油滴还包有小水滴时，该多重乳剂形成w/o/w乳剂。同样地，在油连续相中稳定化的水滴中封装油滴的系统，构成o/w/o乳剂。

乳剂具有较小或没有热力学稳定性的特征。通常，乳剂的分散相或不连续相很好地分散在外相或连续相中并通过乳化剂或配制品的粘性保持这种形式。在乳剂型软膏基质或膏剂的情况下，乳剂的任一相可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的方式需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并到乳剂的任一相中。乳化剂可以被广泛地分成四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质以及精细分散的固体(参见例如，安塞尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安塞尔HC，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；艾迪升，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。

合成表面活性剂，也称作表面活性试剂，已经发现在乳剂的配制中广泛应用并且已经在文献中综述(参见，例如安赛尔的药物剂型与药物传递系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；列赫尔，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第285页；艾迪升，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，马塞尔德克公司，纽约州纽约，1988，第1卷，第199页)。表面活性剂典型地是两亲的，并且包含亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水和疏水性的比率被称为亲水/亲油平衡值(HLB)，并且它是配制品制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两亲分成不同类别(参见例如，安塞尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安塞尔HC，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；列赫尔，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第285页)。

乳剂配制品中使用的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收基质具有亲水特性，所以它们能够吸收水以形成w/o乳剂并仍然保持它们的半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水凡士林。精细分散的固体也已经被用做优良的乳化剂，尤其是与表面活性剂组合和在粘性制剂中使用。这些包括极性无机固体，如重金属氢氧化物、非溶胀粘土如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶状硅酸铝和胶状镁硅酸铝、颜料和非极性固体如碳或甘油基三硬脂酸酯。

在乳剂配制品中还包括多种非乳化材料，并且它们对乳剂的特性有帮助。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(布洛克，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第335页；艾迪升，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。

亲水胶体或水状胶体包括天然存在的树胶和合成的聚合物如多糖(如阿拉伯树胶、琼脂、藻酸、角叉菜聚糖、瓜耳胶、刺梧桐树胶和皇蓍胶)，纤维素衍生物(如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成的聚合物(如卡波姆胶、纤维素醚和羰基乙烯基聚合物)。这些物质在水中分散或溶胀形成胶状溶液，这些胶状溶液通过在分散相液滴的周围形成强的界面膜并通过增强外相的粘度来稳定乳剂。

由于乳剂通常包含一些可以容易地支持微生物生长的成份如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些配制品通常含有防腐剂。乳剂配制品中通常使用的防腐剂包括甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧剂加入到乳剂配制品中，以预防配制品的变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。

通过皮肤途径、口途径和肠胃外途径使用乳剂配制品和制造它们的方法已经在文献中综述(参见，例如安赛尔的药物剂型与药物传递系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；艾迪升，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。由于易于配制以及从吸收和生物利用度观点来看的有效性，用于口服递送的乳剂配制品已得到非常广泛地使用(参见，例如安赛尔的药物剂型与药物传递系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安赛尔HC.，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；艾迪升，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。基于矿物油的缓泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂属于经常作为o/w乳剂口服给予的物质。

ii.微乳剂

在本发明的一个实施例中，将iRNA和核酸的组合物配制为微乳剂。可以将微乳剂定义为水、油和两亲分子的体系，所述体系是光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(参见例如，安塞尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安塞尔HC，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第199页)。典型地，微乳剂是通过如下方法制备的系统：首先将油分散到表面活性剂水溶液中，然后加入足量的通常为中等链长度的醇的第四组分来形成透明系统。因此，微乳剂也被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散系(朗(Leung)与纱(Shah)，在：药物的受控释放:聚合物和聚集体系统(Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems)，洛索夫M.编著,1989,VCH出版公司，纽约，第185-215页)。通常微乳剂通过包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三至五种组分的组合来制备。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(斯科特(Schott)，雷明顿氏药物科学，麦克出版公司，伊斯顿，Pa.,1985,第271页)。

已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且该方法已经产生了为本领域普通技术人员所知的如何配制微乳剂的广泛知识(参见例如，安塞尔的药物剂型和药物递送系统，艾伦LV.、波波维奇NG.以及安塞尔HC，2004，利平科特威廉姆斯&威尔金斯(第8版)，纽约州纽约；洛索夫，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第245页；布洛克，药物剂型，利伯曼、列赫尔和班克(编著)，1988，马塞尔德克公司，纽约州纽约，第1卷，第335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供的优点是能将非水溶性药物溶解到自发形成的热力学稳定的液滴的配制品中。

在微乳剂的制备中使用的表面活性剂包括但不限于单独的或与助表面活性剂组合使用的离子表面活性剂、非离子表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油基醚、聚脂肪酸甘油酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、一又二分之一油酸十甘油酯(SO750)(decaglycerol sequioleate)、十油酸十甘油酯(DAO750)。该辅助表面活性剂通常是短链醇如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，作用是通过渗透到表面活性剂膜中并由此在表面活性剂分子间产生空余空间来产生无序膜从而提高界面流动性。然而，微乳剂可以不使用辅助表面活性剂来制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域中已知的。水相可以典型地是，但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于如多种材料，例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯，中等链(C8-C12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolized glyceride)，饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。

从药物溶解和增强的药物吸收方面看，微乳剂是特别令人感兴趣的。已提议基于脂质的微乳剂(o/w和w/o二者)增强药物(包括肽)的口服生物利用度(参见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯(Constantinides)等人,药学研究(Pharmaceutical Research),1994,11,1385-1390；瑞茨尔(Ritschel)，实验与临床药理学方法与成果(Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.)1993,13,205)。微乳剂提供以下优点：改善药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性剂引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服施用、临床效力改善和毒性减少(见例如美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；康斯坦丁尼德斯等人,药学研究,1994,11,1385；霍(Ho)等人,药学科学杂志(J.Pharm.Sci.),1996,85,138-143)。通常，当微乳剂的组分在环境温度下混合在一起时，它们可以自发形成微乳剂。当配制热不稳定的药物、肽或iRNA时，这可以是特别有利的。在化妆品和药物应用领域，微乳剂在活性组分的经皮递送中也是有效的。预期本发明的微乳剂组合物和配制品将促进iRNA和核酸从胃肠道的全身性吸收增加以及改善iRNA和核酸的局部细胞摄取。

本发明的微乳剂还可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill3)、Labrasol、以及改善配制品特性并增强本发明的iRNA和核酸吸收的渗透增强剂。本发明的微乳剂中使用的渗透增强剂可以分成归于五大类中的一种：表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(李(Lee)等人，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991,第92页)。这些类别中的每一个已经在以上进行了讨论。

iii.微颗粒

本发明的RNAi试剂可并入颗粒，例如微颗粒。微颗粒可以通过喷雾干燥来产生，但也可以通过其他方法包括冷冻干燥、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合来产生。

iv.渗透增强剂

在一个实施例中，本发明采用了不同渗透增强剂来实现向动物皮肤高效递送核酸，具体地iRNA。大多数药物以离子化形式和非离子化形式两者存在于溶液中。然而，通常只有脂溶的或亲脂的药物易于穿过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理有待穿过的膜，甚至连非亲脂药物也可以穿过细胞膜。除了帮助非亲脂药物扩散穿过细胞膜以外，渗透增强剂还增强亲脂药物的渗透性。

渗透增强剂可以被分成属于五个广泛分类中的一个，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(参见例如，马尔姆斯滕(Malmsten)M.药物递送中的表面活性剂和聚合物(Surfactants and polymers in drug delivery)，健康传播杂志(Informa Health Care)，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体系统锐评，1991，第92页)。以下更详细地描述了以上提及的渗透增强剂的类别中的每一个。

表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能减少该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是iRNA通过粘膜的吸收得到增强。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些渗透增强剂还包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚(参见例如马尔姆斯滕M.药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体系统锐评，1991，第92页；以及全氟化学乳剂如FC-43(高桥(Takahashi)等人，药物药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol.)，1988,40,252)。

充当渗透增强剂的各种脂肪酸及其衍生物包括例如油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油精(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其C

胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见例如，马尔姆斯滕M.药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；布鲁顿(Brunton)，第38章，引自：古德曼吉尔曼治疗学的药理学基础(Goodman&Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics)，第9版，哈德曼(Hardman)等人编辑，McGraw-Hill公司，纽约，1996，第934-935页)。不同天然的胆汁盐和它们的合成衍生物用作渗透增强剂。因此术语“胆汁盐”包括胆汁的任何天然存在的组分以及任何它们的合成衍生物。适合的胆盐包括，例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐、胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢褐霉酸钠(STDHF)、糖二氢褐霉酸钠以及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如，马尔姆斯滕M.药物递送中的表面活性剂和聚合物，健康传播杂志，纽约州纽约，2002；李等人，治疗性药物载体系统锐评，1991，第92页；斯温雅德(Swinyard)，第39章，雷明顿氏药物科学，第18版，真纳罗(Gennaro)编辑，麦克出版公司，伊斯顿，Pa.,1990,第782-783页；村西，治疗性药物载体系统锐评,1990,7,1-33；山本(Yamamoto)等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharm.Exp.Ther.),1992,263,25；山下(Yamashita)等人，药物科学杂志,1990,79,579-583)。

与本发明有关使用的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的iRNA的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为渗透增强剂的应用，因为多数特征化的DNA核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此可以被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当DNase抑制剂的附加优势(加热特(Jarrett)，层析学杂志(J.Chromatogr.)，1993,618,315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯(homovanilate))、胶原质的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如凯特戴尔(Katdare),A.等人，用于制药、生物技术和药物递送的赋形剂的发展(Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drugdelivery)，CRC出版社，丹弗斯(Danvers)，MA，2006；李(Lee)等人.，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems)，1991,第92页；村西(Muranishi)，治疗性药物载体系统锐评(Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems)，1990,7,1-33；李等人，治疗性药物载体系统锐评，1991，第92页；村西，治疗性药物载体系统锐评,1990,7,1-33；布尔(Buur)等人，控制释放杂志(J.ControlRel.)，1990,14,43-51)。

如在此所使用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强iRNA经消化道粘膜吸收的化合物(见例如村西，治疗性药物载体系统锐评，1990,7,1-33)。这类别的渗透增强剂包括例如不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(李等人，治疗性药物载体系统锐评，1991，第92页)；以及非类固醇类的抗炎剂，如双氯芬酸钠、引哚美辛和保泰松(山下等人，药物科学杂志,1987,39,621-626)。

还可以添加在细胞水平增强摄取iRNA的试剂至本发明的药物组合物和其他组合物。例如阳离子脂质，如脂质体(淳一(Junichi)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(洛洛(Lollo)等人,PCT申请WO 97/16529)也已知增强dsRNA的细胞摄取。可商购获得的转染试剂的实例包括例如Lipofectamine

可以用其他试剂来增强所施用核酸的渗透，包括二醇如乙二醇和丙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮和萜类如苧烯和薄荷酮。

v.载体

本发明的某些组合物还将载体化合物结合在配制品中。如在此所使用，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不具有生物活性)，但却在体内过程中被认为是核酸，例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而减少具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共给予(典型地后一种物质过量)可以引起肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度减少，假定归因于该载体化合物与该核酸之间对共同受体的竞争。例如与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰胺基-4'异硫氰酸茋-2,2'-二磺酸共施用时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsRNA的回收可以减少(宫尾(Miyao)等人，DsRNA研究与研发(DsRNA Res.Dev.)，1995,5,115-121；高仓(Takakura)等人，DsRNA&核酸药物研发(DsRNA&Nucl.Acid Drug Dev.)，1996,6,177-183)。

vi.赋形剂

与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种核酸递送至动物的任何其他药理学上惰性的媒介物。该赋形剂可以是液体或固体，并且当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考意欲的给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度等。典型的药物载体包括但不限于结合剂(例如，糯性玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉乙醇酸钠等)；以及润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)。

适合于非肠胃外给予的、不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适当的药学上可接受载体包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包括缓冲液、稀释液和其他合适的添加剂。可以使用适合于非肠胃外给予的、且不与核酸发生有毒反应的、药学上可接受的有机或无机赋形剂。

适当的药学上可接受赋形剂包括但不限于：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

vii.其他组分

本发明的这些组合物可以另外地含有其他本领域熟知用量的在药物组合物中常用的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包括另外的、可相容的药学上有活性的物质如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包括对本发明的组合物的各种剂型的物理配制有用的其他物质，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当加入此类物质时，它们不应当过度干扰本发明的组合物的成份的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、盐混合，用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。

水性悬浮液可以包括增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该混悬液还可以含有稳定剂。

在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包含(a)一种或多种iRNA化合物和(b)通过非RNAi机制发挥作用，并且对于治疗出血性疾病很有用的一种或多种试剂。这些试剂的实例包括但不限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒和/或抗纤维化剂。另外，其他常用于保护肝脏的物质，如水飞蓟素，也可以与在此描述的iRNA结合使用。其他有用于治疗肝脏疾病的试剂包括替比夫定，恩替卡韦和蛋白酶抑制剂，如特拉匹韦和例如在董(Tung)等人,美国专利申请公开号2005/0148548、2004/0167116、和2003/0144217；以及在黑尔(Hale)等人，美国专利申请公开号2004/0127488中披露的其他试剂。

此类化合物的毒性与治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如以确定LD50(50％群体的致死剂量)以及ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性与疗效之间的剂量比为治疗指数，并且它可以被表示为比率LD50/ED50。优选那些表现出高的治疗指数的化合物。

从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制人类中使用的剂量范围时使用。在此在本发明中体现的组合物的剂量总体上处在一个循环浓度范围内，该范围包括具有很小或没有毒性的ED50。该剂量可以取决于所采用的剂型以及使用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，该治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。在动物模型中可以将一个剂量配制为达到该化合物的循环血浆浓度范围，或者当适当时，一个靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到该多肽的一个降低的浓度)，该范围包括如在细胞培养中确定的IC

除了给予它们之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的iRNA与在治疗由Serpina1表达介导的病理学过程方面有效的其他已知试剂联合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或在此描述的标准功效量值所观察到的结果，给予医师可以调整给予iRNA的量和时间。

IV.用于抑制Serpina1表达的方法

本发明提供了抑制细胞中Serpina1的表达的方法。这些方法包括使一种细胞与一种RNAi试剂(例如一种双链RNAi试剂)以有效抑制该细胞中的Serpina1表达的一个量接触，从而抑制该细胞中的Serpina1表达。

使一种细胞与一种双链RNAi试剂接触可以在体外或体内进行。在体内使一种细胞与该RNAi试剂接触包括使受试者(例如，人类受试者)内的一种细胞或细胞群组与该RNAi试剂接触。体外和体内接触方法的组合也是可能的。如上所论述，接触可以是直接或间接的。此外，使一种细胞接触可以经由一种靶向配体(包括在此描述或本领域中已知的任何配体)实现。在优选实施例中，该靶向配体是一种碳水化合物部分(例如一种GalNAc

如在此所使用，术语“抑制”与“减少”、“沉默”、“下调”、以及其他类似术语可互换使用，并且包括任何水平的抑制。

短语“抑制Serpina1的表达”旨在指抑制任何Serpina1基因(如例如小鼠Serpina1基因、大鼠Serpina1基因、猴Serpina1基因或人Serpina1基因)以及Serpina1基因的变体或突变体的表达。因此，该Serpina1基因可以是野生型Serpina1基因、突变Serpina1基因、或在遗传操纵的细胞、细胞群组或生物体情形下的转基因Serpina1基因。

“抑制Serpina1基因的表达”包括Serpina1基因的任何水平的抑制，例如Serpina1基因的表达的至少部分抑制。基于与Serpina1基因表达相关的任何变量的水平或水平变化，例如Serpina1 mRNA水平、Serpina1蛋白水平、或脂质水平，可以评估Serpina1基因的表达。这一水平可以在个体细胞中或在一组细胞中(包括例如来源于一名受试者的一种样品)进行评估。

可以通过与对照水平相比的一个或多个与Serpina1表达相关的变量的绝对或相对水平的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从类似的未经处理或经对照(例如，仅缓冲液对照或惰性剂对照)处理的受试者、细胞、或样品确定的水平。

在本发明的方法的一些实施例中，Serpina1基因的表达被抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。

Serpina1基因表达的抑制可以通过由第一细胞或细胞群组(这样的细胞可以存在于例如来源于受试者的样品中)表达的mRNA的量的降低来显现，其中Serpina1基因被转录并且该细胞或这些细胞已经被处理(例如通过使该细胞或这些细胞与本发明的RNAi试剂接触，或通过向现在存在或以前存在这些细胞的受试者给予本发明的RNAi试剂)，这样使得与跟该第一细胞或细胞群组基本上相同但尚未被如此处理的第二细胞或细胞群组(一种或多种对照细胞)相比，Serpina1基因的表达被抑制。在优选实施例中，通过使用下式将被处理的细胞中的mRNA的水平表示为对照细胞中的mRNA的水平的百分比来评估该抑制：

可替代地，可以通过与Serpina1基因表达功能相关的参数(例如Serpina1蛋白表达，如ALT、碱性磷酸酶、胆红素、凝血素以及白蛋白)的降低来评估Serpina1基因表达的抑制。可以在组成性地或者通过基因组工程化而表达Serpina1的任何细胞中并且通过本领域中已知的任何测定来确定Serpina1基因沉默。肝脏是Serpina1表达的主要部位。其他重要表达部位包括肺和肠。

Serpina1蛋白的表达的抑制可以通过由一种细胞或细胞群组表达的Serpina1蛋白水平(例如来源于受试者的样品中表达的蛋白质水平)的降低来显现。如以上关于mRNA抑制的评估所解释，一种被处理的细胞或细胞群组中的蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为一种对照细胞或细胞群组中的蛋白质的水平的百分比。

可以用来评估Serpina1基因表达的抑制的对照细胞或细胞群组包括尚未与本发明的RNAi试剂接触的细胞或细胞群组。例如，该对照细胞或细胞群组可以来源于在用RNAi试剂处理受试者之前的个体受试者(例如人或动物受试者)。

可以使用本领域中已知用于评估mRNA表达的任何方法来测定由一种细胞或细胞群组表达的Serpina1 mRNA的水平。在一个实施例中，通过检测转录的多核苷酸或其部分(例如该Serpina1基因的mRNA)来测定样品中的Serpina1的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞提取RNA，包括例如使用酸苯酚/胍异硫氰酸酯提取(RNAzol B；生物起源公司(Biogenesis))、RNeasy RNA制备试剂盒(凯杰公司(Qiagen))或PAXgene(PreAnalytix公司，瑞士(Switzerland))。利用核糖核酸杂交的典型分析形式包括核连缀测定(nuclearrun-on assay)、RT-PCR、RNase保护测定(麦尔登(Melton)等人，核酸研究(Nuc.AcidsRes.)12:7035)、RNA印迹法、原位杂交以及微阵列分析。

在一个实施例中，使用核酸探针确定Serpina1表达的水平。如在此所使用，术语“探针”是指能够选择性地结合特异性Serpina1的任何分子。探针可以由本领域的技术人员合成或来源于适当生物制剂。探针可以具体地经设计成被标记的。可以用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体以及有机分子。

可以在包括但不限于以下各项的杂交或扩增分析中使用分离的mRNA：DNA印迹或RNA印迹分析、聚合酶链反应(PCR)分析以及探针阵列。用于确定mRNA水平的一种方法涉及使分离的mRNA与可以杂交Serpina1 mRNA的核酸分子(探针)接触。在一个实施例中，将该mRNA固定在一个固体表面上，并且例如通过使该分离的mRNA在一个琼脂糖凝胶上跑胶并且将该mRNA从该凝胶转移到一个膜(如硝化纤维素)而与一种探针接触。在一个替代性实施例中，将该探针或这些探针固定在一个固体表面上，并且使该mRNA例如在一个Affymetrix基因芯片阵列中与该探针或这些探针接触。熟练的技术人员可以容易地采取已知的用于确定Serpina1 mRNA水平的mRNA检测方法。

用于测定样品中Serpina1的表达水平的一种替代方法涉及核酸扩增过程和/或样品中的例如mRNA的逆转录酶(以制备cDNA)，例如通过RT-PCR(穆利斯(Mullis)，1987，美国专利号4,683,202中陈述的实验实施例)、连接酶链反应(巴拉尼(Barany)(1991)美国国家科学院院刊88:189-193)、自动维持序列扩增(瓜特利(Guatelli等人(1990)美国国家科学院院刊87:1874-1878))、转录扩增系统(科沃(Kwoh)等人(1989)美国国家科学院院刊86:1173-1177)、Q-β复制酶(李查蒂(Lizardi)等人(1988)生物/技术(Bio/Technology)6:1197)、滚环复制(李查蒂等人，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，随后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。如果这样的核酸分子以极低数目存在，那么这些检测方案尤其可用于检测这些分子。在本发明的具体方面，通过定量荧光RT-PCR(即TaqMan

可以使用膜印迹(如杂交分析中所用，如RNA印迹、DNA印迹、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠粒或纤维(或包含结合核酸的任何固体载体)监测Serpina1 mRNA的表达水平。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，这些美国专利通过引用结合在此。Serpina1表达水平的确定还可以包括使用溶液中的核酸探针。

在优选实施例中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达水平。这些方法的使用描述并且例证于在此呈现的实例中。

可以使用本领域中已知用于测量蛋白质水平的任何方法测定Serpina1蛋白表达水平。这样的方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单向或双向)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。

如在此所使用，术语“样品”是指从受试者中分离的一批类似的流体、细胞或组织以及存在于受试者内的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清以及浆膜液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液、唾液、眼内液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如样品可以源自特定器官、器官部分、或这些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可源自肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些段，或肝脏中的某些类型的细胞，例如肝细胞)。在优选实施例中，“源自受试者的样品”是指从该受试者中取出的血液或血浆。在其他实施例中，“源自受试者的样品”是指源自该受试者的肝脏组织。

在本发明的方法的一些实施例中，向一个受试者给予该RNAi试剂，这样使得该RNAi试剂被递送到该受试者内的一个具体部位上。可以使用来源于来自该受试者内的具体部位的流体或组织的样品中的Serpina1 mRNA或Serpina1蛋白的水平或水平变化的测量来评估Serpina1表达的抑制。在优选实施例中，该部位是肝脏。该部位还可以是来自前述部位的任一个的细胞的亚组或亚群。该部位还可以包括表达特定类型的受体的细胞。

V.用于治疗或预防Serpina1相关疾病的方法

本发明还提供了用于治疗或预防可通过下调Serpina1基因表达进行调节的疾病和病症的方法。例如，在此所描述的组合物可以用于治疗Serpina1相关疾病诸如肝脏病症，例如慢性肝病、肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌，以及可能与这些病症相关联的其他病理状况，如肺部炎症、肺气肿以及COPD。

本发明还提供了用于抑制受试者例如具有Serpina1缺乏变体的受试者中的肝细胞癌发展的方法。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的组合物，从而抑制该受试者中的肝细胞癌发展。

本发明还提供了用于减少受试者例如具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积的方法和本发明的组合物用于减少受试者例如具有Serpina1缺乏变体的受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积的用途。这些方法包括向该受试者给予治疗有效量的本发明的组合物，从而减少该受试者的肝脏中错误折叠的Serpina1的累积。

如在此所使用，“受试者”包括或者人或者非人类动物，优选脊椎动物，并且更优选哺乳动物。受试者可以包括转基因生物体。最优选地，受试者是人，如罹患或倾向于患上Serpina1相关疾病的人。在一个实施例中，罹患或倾向于患上Serpina1相关疾病的受试者具有一个或多个Serpina1缺乏等位基因，例如PIZ、PIS或PIM(Malton)等位基因。

在本发明的另一个实施例中，将本发明的iRNA试剂与另外的治疗剂联合给予。iRNA试剂以及另外的治疗剂可以在相同的组合物中联合给予，例如，肠胃外给予，或该另外的治疗剂可以作为一个单独的组合物的一部分或通过在此描述的另一种方法给予。

适合在本发明中使用的另外的治疗剂的实例包括已知用以治疗肝脏病症如肝硬化的那些试剂。例如，本发明中表征的iRNA试剂可以与例如熊脱氧胆酸(UDCA)、免疫抑制剂、甲氨蝶呤、皮质甾类、环孢霉素、秋水仙碱、止痒治疗如抗组胺药、考来烯胺、考来替泊、利福平、屈大麻酚(Marinol)、及去血浆法、预防性抗生素、紫外线、锌补充剂、以及甲型肝炎、流行性感冒和肺炎双球菌疫苗接种一起给予。

在本发明的方法的一些实施例中，Serpina1表达下降持续延长的持续时间，例如，至少一周、两周、三周、或四周或更长时间。例如，在某些情况下，通过给予在此所述的iRNA试剂，Serpina1基因表达被抑制至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或55％。在一些实施例中，通过给予iRNA试剂，Serpina1基因被抑制至少约60％、70％或80％。在一些实施例中，通过给予iRNA试剂，Serpina1基因被抑制至少约85％、90％或95％。

本发明的iRNA试剂可以使用本领域中已知的任何给药模式给予给一名受试者，包括但不限于皮下、静脉内、肌肉内、眼内、支气管内、胸膜内、腹膜内、动脉内、经淋巴、经脑脊髓及其任何组合。在优选实施例中，这些iRNA试剂是皮下给予的。

在一些实施例中，该给予是经由积存注射。积存注射可以在长时间内以一种连贯方式释放这些iRNA试剂。因此，积存注射可以减少获得希望的作用所需要的给药频率，该希望的作用例如对Serpina1的希望的抑制或治疗性或预防性作用。积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射包括皮下注射或肌内注射。在优选的实施例中，该积存注射是皮下注射。

在一些实施例中，该给予是经由一个泵。该泵可以是外部泵或手术植入的泵。在某些实施例中，该泵是一个皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，该泵是一个输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施例中，该输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，该泵是将该RNAi试剂递送到肝脏的一个手术植入的泵。

其他给药模式包括硬膜外、脑内、脑室内、鼻给药、动脉内、心内、骨内输注、鞘内和玻璃体内以及经肺。给药模式取决于是希望局部治疗还是全身性治疗并且基于有待治疗的区域来进行选择。给药的途径与位点可以被选择为增强靶向。

本发明的方法包括给予iRNA试剂，以足以抑制/降低Serpina1 mRNA的水平持续至少5天，更优选地持续7、10、14、21、25、30或40天的剂量；并且任选地，给予第二个单剂量的该iRNA试剂，其中该第二个单剂量是在给予第一个单剂量之后至少5天，更优选7、10、14、21、25、30或40天之后给予的，由此抑制Serpina1基因在受试者中的表达。

在一个实施例中，本发明的iRNA试剂的剂量是以每4周不多于1次、每3周不多于1次、每2周不多于1次或每周不多于1次给予的。在另一个实施例中，给药可以维持1个、2个、3个或6个月，或1年或更长时间。

通常，iRNA试剂不激活免疫系统，例如，其不增加细胞因子水平，如TNF-α或IFN-α水平。例如，当通过一种测定法如体外PBMC测定进行测量时，如在此所描述的，TNF-α或IFN-α水平的增加小于用对照iRNA试剂(如，不靶向Serpina1的iRNA试剂)处理的对照细胞的30％、20％、或10％。

例如，受试者可以被给予治疗量的iRNA试剂，如0.5mg/kg、1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、或2.5mg/kg dsRNA。可以经过一段时间，如经过5分钟、10分钟、15分钟、20分钟或25分钟时间静脉内输注而给予该iRNA试剂。例如，基于定期，如每两周(即，每2周)持续1个月、2个月、3个月、4个月或更长时间重复给药。

在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。例如，在双周给予持续三个月后，给予可以按每个月重复一次，持续六个月或一年或更长。iRNA试剂的给予可以降低例如患者的细胞、组织、血液、尿液、器官(例如，肝脏)或其他区室中的Serpina1水平至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％或更多。

在给予全剂量iRNA试剂之前，可以对患者给予一个较小剂量，并监测不良作用，例如，过敏反应、或升高的脂质水平或血压。在另一个实例中，针对不想要的免疫刺激作用(比如增加的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平)对该患者进行监测。示例性较小剂量是使得输注反应发生率小于或等于5％的一个剂量。

可以例如通过测量疾病进展、疾病缓和、症状严重性、疼痛减少、生活品质、维持治疗作用所要求的药剂的剂量、疾病标志物或适用于被治疗或目标用于预防的给定疾病的任何其他可测量参数的水平来评价疾病治疗或预防的功效。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。例如，可以通过例如定期监测a-2-巨球蛋白(a-MA)、转铁蛋白、载脂蛋白Al、透明质酸(HA)、层粘连蛋白、III型N-末端前胶原(PIIINP)、7S胶原IV(7S-IV)、总胆红素、间接胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、AST/ALT、g-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白、白蛋白/球蛋白、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐(Cr)、甘油三酸脂、胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白以及通过肝穿刺活检来评估肝纤维化治疗或肝纤维化改善的功效。在治疗方案期间，可以在治疗(初始数据)和随后(稍后数据)之前测量肝纤维化标志物和/或执行肝穿刺活检。

稍后数据与初始数据的比较为医师提供了该治疗是否有效的指示。通过测量任何一个此类参数或任何参数组合来监测治疗或预防的功效，这在本领域技术人员的能力范围之内。关于给予靶向Serpinal的iRNA试剂或其药物组合物，“有效抵抗”Serpina1相关疾病(如肝病，例如肝纤维化病状)表明以临床上适当的方式给予本发明的iRNA试剂会对至少统计学上显著分数的患者产生有益作用，如改善症状、治愈、减少疾病负荷、减小肿瘤质量或细胞数目、延长生命、提高生活品质、或被熟悉治疗肝病的医师公认为是积极的其他作用。

在本发明的方法中，在此所述的试剂可以用于治疗具有Serpina1相关疾病如肝病，例如肝炎症、肝硬化、肝纤维化和/或肝细胞癌的征象、症状和/或标志物的个体，或诊断患有该疾病的个体或有危险患有该疾病的个体。本领域技术人员可以容易地监测接受如在此所描述的iRNA试剂治疗的受试者中此类病症的征象、症状和/或标志物，并且测定到这些征象、症状和/或标志物减少至少10％以及优选地减少至表示低肝病风险的临床水平。

当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学上显著的改善的时候，或者通过使得以另外方式可以被预期的症状不再恶化或发展，治疗或预防效果是明显的。作为一个实例，在疾病的可测量参数(如上述肝功能)方面的至少10％，并且优选是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。

也可以使用如本领域已知的针对给定疾病的实验动物模型，判定本发明的给定iRNA试剂或这种iRNA试剂的配制品的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状的统计学上显著的减少时，治疗的功效是明显的。

当一种或多种症状被减少或减轻时，治疗或预防效果也是明显的。例如，当虚弱、疲劳、体重减轻、恶心、呕吐、腹部肿胀、末端肿胀、过度瘙痒、以及眼睛和/或皮肤黄疸中的一个或多个被减少或减轻时，治疗或预防是有效的。

对于某些指示，可以通过Serpinal蛋白的血清水平的增加来测量功效。作为一个实例，正确折叠的Serpinal的血清水平的至少10％、至少20％、至少50％、至少100％、至少200％更多可以指示有效的治疗。

可替代地，可以基于临床上接受的疾病严重性分级量表(仅举一例，肝功能评分(Child-Pugh score)，有时称作肝功能分级评分(Child-Turcotte-Pugh score))，通过诊断领域技术人员所确定的疾病严重性减小来测量该功效。在此实例中，慢性肝病(主要是肝硬化)的预后通过五种临床量度即胆红素、血清白蛋白、INR、腹水以及肝性脑病的总积分来测量。每种标志物被指定一个1-3的值，并且总值用于提供一个得分，该得分被分类为A(5-6分)、B(7-9分)、或C(10-15分)，这些可以与一年和两年的存活率相关联。用于测定和分析肝功能评分的方法在本领域中是众所周知的(法恩斯沃思(Farnsworth)等人，美国外科杂志(Am J Surgery)2004 188:580-583；蔡尔德(Child)和特科特(Turcotte)，手术和门静脉高压(Surgery and portal hypertension)，于：肝脏和门静脉高压(The liver and portalhypertension)，由CG蔡尔德编辑，费城：桑德斯1964:50-64；皮尤(Pugh)等人，英国外科杂志(Br J Surg)1973；60:648-52)。在此实例中可以通过患者从例如“B”至“A”的迁移测量功效。产生例如使用合适的量表而测量的疾病严重性的减轻的任何积极的改变代表使用如在此描述的iRNA或iRNA配制品的足够的治疗。

在一个实施例中，以约0.25mg/kg至约50mg/kg之间，例如在约0.25mg/kg至约0.5mg/kg之间、在约0.25mg/kg至约1mg/kg之间、在约0.25mg/kg至约5mg/kg之间、在约0.25mg/kg至约10mg/kg之间、在约1mg/kg至约10mg/kg之间、在约5mg/kg至约15mg/kg之间、在约10mg/kg至约20mg/kg之间、在约15mg/kg至约25mg/kg之间、在约20mg/kg至约30mg/kg之间、在约25mg/kg至约35mg/kg、或在约40mg/kg至约50mg/kg之间的剂量给予该RNAi试剂。

在一些实施例中，以约0.25mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg、约9mg/kg、约10mg/kg、约11mg/kg、约12mg/kg、约13mg/kg、约14mg/kg、约15mg/kg、约16mg/kg、约17mg/kg、约18mg/kg、约19mg/kg、约20mg/kg、约21mg/kg、约22mg/kg、约23mg/kg、约24mg/kg、约25mg/kg、约26mg/kg、约27mg/kg、约28mg/kg、约29mg/kg,30mg/kg、约31mg/kg、约32mg/kg、约33mg/kg、约34mg/kg、约35mg/kg、约36mg/kg、约37mg/kg、约38mg/kg、约39mg/kg、约40mg/kg、约41mg/kg、约42mg/kg、约43mg/kg、约44mg/kg、约45mg/kg、约46mg/kg、约47mg/kg、约48mg/kg、约49mg/kg或约50mg/kg的剂量给予该RNAi试剂。

在本发明的某些实施例中，例如，当双链RNAi试剂包括修饰(例如，在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序，在该试剂的裂解位点处或附近包括这样一个基序)、六个硫代磷酸酯键联以及脂质时，按以下剂量给予这样一种制剂：约0.01至约0.5mg/kg、约0.01至约0.4mg/kg、约0.01至约0.3mg/kg、约0.01至约0.2mg/kg、约0.01至约0.1mg/kg、约0.01mg/kg至约0.09mg/kg、约0.01mg/kg至约0.08mg/kg、约0.01mg/kg至约0.07mg/kg、约0.01mg/kg至约0.06mg/kg、约0.01mg/kg至约0.05mg/kg、约0.02至约0.5mg/kg、约0.02至约0.4mg/kg、约0.02至约0.3mg/kg、约0.02至约0.2mg/kg、约0.02至约0.1mg/kg、约0.02mg/kg至约0.09mg/kg、约0.02mg/kg至约0.08mg/kg、约0.02mg/kg至约0.07mg/kg、约0.02mg/kg至约0.06mg/kg、约0.02mg/kg至约0.05mg/kg、约0.03至约0.5mg/kg、约0.03至约0.4mg/kg、约0.03至约0.3mg/kg、约0.03至约0.2mg/kg、约0.03至约0.1mg/kg、约0.03mg/kg至约0.09mg/kg、约0.03mg/kg至约0.08mg/kg、约0.03mg/kg至约0.07mg/kg、约0.03mg/kg至约0.06mg/kg、约0.03mg/kg至约0.05mg/kg、约0.04至约0.5mg/kg、约0.04至约0.4mg/kg、约0.04至约0.3mg/kg、约0.04至约0.2mg/kg、约0.04至约0.1mg/kg、约0.04mg/kg至约0.09mg/kg、约0.04mg/kg至约0.08mg/kg、约0.04mg/kg至约0.07mg/kg、约0.04mg/kg至约0.06mg/kg、约0.05至约0.5mg/kg、约0.05至约0.4mg/kg、约0.05至约0.3mg/kg、约0.05至约0.2mg/kg、约0.05至约0.1mg/kg、约0.05mg/kg至约0.09mg/kg、约0.05mg/kg至约0.08mg/kg,or about 0.05mg/kg至约0.07mg/kg。前述列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分，例如该RNAi试剂可以约0.015mg/kg至约0.45mg/mg的剂量给予受试者。

在一些实施例中，RNAi试剂，例如药物组合物中的RNAi试剂可以按约0.01mg/kg、0.0125mg/kg、0.015mg/kg、0.0175mg/kg、0.02mg/kg、0.0225mg/kg、0.025mg/kg、0.0275mg/kg、0.03mg/kg、0.0325mg/kg、0.035mg/kg、0.0375mg/kg、0.04mg/kg、0.0425mg/kg、0.045mg/kg、0.0475mg/kg、0.05mg/kg、0.0525mg/kg、0.055mg/kg、0.0575mg/kg、0.06mg/kg、0.0625mg/kg、0.065mg/kg、0.0675mg/kg、0.07mg/kg、0.0725mg/kg、0.075mg/kg、0.0775mg/kg、0.08mg/kg、0.0825mg/kg、0.085mg/kg、0.0875mg/kg、0.09mg/kg、0.0925mg/kg、0.095mg/kg、0.0975mg/kg、0.1mg/kg、0.125mg/kg、0.15mg/kg、0.175mg/kg、0.2mg/kg、0.225mg/kg、0.25mg/kg、0.275mg/kg、0.3mg/kg、0.325mg/kg、0.35mg/kg、0.375mg/kg、0.4mg/kg、0.425mg/kg、0.45mg/kg、0.475mg/kg或约0.5mg/kg的剂量给予。前述列举值的中间值与范围也意在成为本发明的部分。

给予受试者的RNAi试剂的剂量可以被定制为平衡具体剂量的风险与效益，例如以实现所希望的水平的Serpina1基因抑制(如例如基于Serpina1 mRNA抑制、Serpina1蛋白表达而评估)或所希望的治疗或预防作用，同时避免不希望的副作用。

在一些实施例中，该RNAi试剂以两个或更多个剂量给予。如果希望促进重复或频繁输注，那么可能可取的是植入一个递送装置，例如一个泵、半永久性支架(例如静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储集器。在一些实施例中，后续剂量的数目或量取决于所希望的作用(例如Serpina1基因的抑制)的实现或治疗或预防作用(例如减轻肝病症状)的实现。在一些实施例中，该RNAi试剂根据一种方案给予。例如，可以每周一次、每周两次、每周三次、每周四次、或每周五次给予该RNAi试剂。在一些实施例中，该方案涉及定期间隔的给药，例如，每小时、每四小时、每六小时、每八小时、每十二小时、每天、每2天、每3天、每4天、每5天、每周、每两周、或每月一次。在其他实施例中，该方案包括紧密间隔的给药，接着是较长时间期，在该时间期间不给予该试剂。例如，该方案可以包括在相对短的时间期(例如约每6小时、约每12小时、约每24小时、约每48小时或约每72小时)中给予的一组初始剂量，接着是更长时间期(例如约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周或约8周)，在该时间期间不给予该RNAi试剂。在一个实施例中，最初每小时给予该RNAi试剂，并且后来以更长时间间隔(例如每天、每周、每两周或每月)给予。在另一个实施例中，最初每天给予该RNAi试剂，并且后来以更长时间间隔(例如每周、每两周或每月)给予。在某些实施例中，更长的时间间隔随时间增加或基于所希望的作用的实现来确定。在一个具体实施例中，该RNAi试剂在第一周期间每天给予一次，接着从给药的第八天开始每周给予一次。在另一个具体实施例中，该RNAi试剂在第一周期间每隔一天给予一次，接着从给药的第八天开始每周给予一次。

在一些实施例中，该RNAi试剂是以一个给药方案给予的，该给药方案包括一个紧密间隔给药的“负荷阶段”，继之以一个“维持阶段”，在该维持阶段中该RNAi试剂以更长的间隔给予。在一个实施例中，该负荷阶段包括在第一周的期间每日给予该RNAi试剂五次。在另一个实施例中，该维持阶段包括每周给予该RNAi试剂一次或两次。在另一个另外的实施例中，该维持阶段持续5周。在一个实施例中，该负荷阶段包括以2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量每周给予五次。在另一个实施例中，该维护阶段包括以2mg/kg、1mg/kg或0.5mg/kg的剂量每周给予一次或两次。

这些方案中的任一者可以任选地被重复用于一个或多个迭代。迭代数可以取决于所希望的作用(例如Serpina1基因的抑制)的实现、和/或治疗或预防作用(例如减少Serpina1相关疾病例如肝病的症状)的实现。

在另一方面，本发明的特征为一种指导终端使用者例如看护者或受试者关于如何给予在此描述的iRNA试剂的方法。该方法包括，任选地，向终端使用者提供一个或多个剂量的iRNA试剂，并且指导该终端使用者将该iRNA试剂按照在此描述的方案进行给予，由此指导该终端使用者。

遗传易感性在与靶基因相关疾病例如肝病的发展中起作用。因此，通过采集家族史，或者例如筛选一个或多个遗传标志物或变体，可以鉴定出需要siRNA的患者。因此，在一方面，本发明提供了一种通过基于患者具有Serpina1缺乏或Serpina1缺乏基因变体，例如PIZ、PIS或PIM(Malton)等位基因中的一个或多个来选择该患者从而治疗该患者的方法。该方法包括向该患者给予治疗有效量的iRNA试剂。

医疗保健提供者，如医生、护士或家族成员，可以在开处方或给予本发明的iRNA剂之前取得家族史。另外，可以进行试验来确定基因型或表型。例如，可以对来自患者的样品(例如，血样)进行DNA试验，以便在向患者给予Serpina1dsRNA之前鉴定出Serpina1基因型和/或表型。

VI.试剂盒

本发明还提供了用于使用任何iRNA试剂和/或执行本发明的任何方法的试剂盒。这样的试剂盒包括一种或多种RNAi试剂和使用说明书，例如用于通过使一种细胞与该RNAi试剂或这些RNAi试剂以有效抑制Serpina1表达的一个量接触来抑制该细胞中的该Serpina1表达的说明书。这些试剂盒可以任选地进一步包括用于使该细胞与该RNAi试剂接触的工具(例如，注射装置)或用于测量Serpina1的抑制的工具(例如，用于测量Serpina1mRNA的抑制的工具)。这样的用于测量Serpina1的抑制的工具可以包括用于从受试者获得样品(例如像，血浆样品)的工具。本发明的试剂盒可以任选地进一步包括用于将该RNAi试剂或这些RNAi试剂给予给一名受试者的工具或用于测定治疗有效量或预防有效量的工具。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实施或测试本发明中表征的iRNA和方法，然而现在描述合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式以其全文结合。在矛盾的情况下，本发明说明书，包括定义，将占据主导。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是限制性的。

实例

材料和方法

在这些实例中使用如下材料和方法。

siRNA设计

Serpinal基因具有多种替换转录物。进行siRNA设计以鉴定在NCBI基因数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中被注释的靶向所有人和食蟹猴(猕猴；此后称为“食蟹猴(cyno)”)Serpinal转录物的siRNA。使用了以下来自NCBI RefSeq集的人转录物：人-NM 000295.4、NM_001002235.2、NM_001002236.2、NM_001127700.1、NM_001127701.1、NM_001127702.1、NM_001127703.1、NM_001127704.1、NM_001127705.1、NM_001127706.1、NM_001127707.1。为了鉴定食蟹猴转录物，使用Spidey比对工具(

设计与所有列出的人和食蟹猴转录物具有100％一致性的所有siRNA双链体。

585个候选siRNA用于针对人转录组(定义为在人NCBI Refseq组内的NM_和XM_记录的组)的综合搜索中。合成总共48个有义(21聚体)和48个反义(23聚体)衍生的siRNA寡聚物，并且形成为双链体。Sepina1有义链序列和反义链序列的详细列表示于表1和表2中。

siRNA合成

I.

根据标准固相寡核苷酸合成方案，使用可商购的5'-O-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基-3'-O-(2-氰基乙基-N,N-二异丙基)尿苷亚磷酰胺单体、4-N-乙酰胞苷、6-N-苯甲酰基腺苷和2-N-异丁酰基鸟苷以及相应的2'-O-甲基和2'-氟代亚磷酰胺，在0.2-500μmol之间的规模合成RNA寡核苷酸。以0.1-0.15M浓度制备该亚酰胺(amidite)溶液并将5-乙硫基-1H-四唑(乙腈中0.25-0.6M)用作活化剂。在合成过程中用在二甲基吡啶:乙腈(1:1)(v:v)中的0.2M苯乙酰二硫化物(PADS)或在吡啶中的0.1M 3-(二甲氨基亚甲基)氨基-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(DDTT)引入硫代磷酸酯骨架修饰以用于氧化步骤。在合成完成后，从固体载体裂解这些序列，并用甲胺接着用三乙胺.3HF去保护以除去存在的任何2'-O-叔丁基二甲基甲硅烷基保护基。

对于5-500μmol之间的合成规模和完全2’修饰的序列(2’-氟代和/或2’-O-甲基或其组合)，在35℃下持续16h抑或在55℃下持续5.5h使用3:1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水去保护寡核苷酸。在氨水去保护之前，将寡核苷酸在固体载体上用在乙腈中的0.5M哌啶处理20min。通过LC-MS和阴离子交换HPLC(IEX-HPLC)来分析粗制寡核苷酸。使用：20mM磷酸盐，10％-15％ACN，pH＝8.5(缓冲液A)以及20mM磷酸盐，10％-15％ACN，1M NaBr，pH＝8.5(缓冲液B)通过IEX HPLC，进行对这些寡核苷酸进行纯化。通过分析型HPLC分析级分纯度。将具有适合纯度的含产物的级分汇集，并且在脱盐之前在旋转蒸发仪上浓缩。将样品通过尺寸排阻色谱法脱盐并且冻干至干燥。将等摩尔量的有义链和反义链在l×PBS缓冲液中退火，以制备相应的siRNA双链体。

对于小规模(0.2-1μmol)，在96孔形式下在MerMade 192合成仪上进行合成。在充分地2'-修饰的序列(2'-氟代和/或2'-O-甲基或其组合)的情况下，将这些寡核苷酸使用甲胺在室温下30-60min，然后在60℃孵化30min，或用3:1(v/v)乙醇和浓(28％-32％)氨水在室温下30-60分钟，然后在40℃下孵化1.5小时进行去保护。然后在乙腈:丙酮(9:1)的溶液中沉淀粗制的寡核苷酸，并通过离心分离并且倾析上清液。将粗制的寡核苷酸沉淀物重新悬浮于20mM NaOAc缓冲液中，并且通过LC-MS和阴离子交换HPLC来分析。在5mL HiTrapSephadex G25柱(GE卫生保健公司(GE Healthcare))上在96深孔板中将粗制的寡核苷酸序列进行脱盐。在每个孔中收集对应于一个单独的序列的约1.5mL的样品。通过LC-MS和阴离子交换色谱法分析这些纯化脱盐的寡核苷酸。通过在Tecan机器人上退火等摩尔量的有义序列和反义序列来制备双链体。将双链体的浓度调节至10μM的1×PBS缓冲液的溶液。

II.

使用一种固体载体在0.2-500μmol之间的规模下合成在其3'-末端处与GalNAc配体缀合的寡核苷酸，该固体载体用具有用于寡核苷酸合成的4,4'-二甲氧基三苯甲基(DMT)保护的伯羟基基团的Y形接头和通过系链附接的GalNAc配体预先负载。

为了在5-500μmol之间的规模下合成GalNAc缀合物，遵循以上用于RNA的合成方案，且具有以下修改：对于基于聚苯乙烯的合成载体，在合成过程中使用于甲苯中的5％二氯乙酸用于DMT-裂解。如上所述进行从该载体的裂解和去保护。不去除最后的5'-DMT基团(“带有DMT”)合成富含硫代磷酸酯的序列(通常>5硫代磷酸酯)，并且在如上所述的裂解和去保护之后，使用于水中的50mM乙酸铵(缓冲液A)和于80％乙腈中的50mM乙酸铵(缓冲液B)通过反相HPLC进行纯化。通过分析型HPLC和/或LC-MS分析级分纯度。将具有适合纯度的含产物的级分汇集，并且在旋转蒸发仪上浓缩。使用在水中的20％-25％乙酸去除DMT基团直到完成。将样品通过尺寸排阻色谱法脱盐并且冻干至干燥。将等摩尔量的有义链和反义链在l×PBS缓冲液中退火，以制备相应的siRNA双链体。

对于GalNAc缀合物的小规模合成(0.2-1μmol)，包括具有多个硫代磷酸酯键联的序列，适用以上描述的用于在MerMade平台上合成RNA或含完全2'-F/2'-OMe的序列的方案。在含GalNAc功能化的可控孔度玻璃载体的预填充柱上进行合成。

使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(应用生物系统(Applied Biosystems)，福斯特市(Foster City)，加利福尼亚州，目录号4368813)的cDNA合成

按每个反应将具有2μl 10X缓冲液、0.8μl 25X dNTP、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μl RNase抑制剂以及3.2μl H

细胞培养和转染

将Hep3B、HepG2或HeLa细胞(ATCC公司，弗吉尼亚州马纳萨斯)在37℃在5％CO

自由摄取转染

将5μ1的在PBS中的每种GalNac缀合的siRNA与重悬浮于95μ1的In Vitro Gro CP培养基(赛西斯离体技术公司(In Vitro Technologies-Celsis)，巴尔的摩，马里兰州)(在96孔板的每个孔中)或包括1.2×10

使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(英杰公司，部件号：610-12)的总RNA分离

收获细胞并且在150μl裂解/结合缓冲液中进行裂解，然后使用Eppendorf热混合器在850rpm混合5分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠与80μl裂解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液移除而不扰动这些珠粒。在移除上清液后，将裂解的细胞添加至剩余的磁珠并且混合5分钟。在移除上清液后，将磁珠用150μl洗涤缓冲液A洗涤2次并且混合1分钟。再次捕获珠粒，并且移除上清液。然后将珠粒用150μl洗涤缓冲液B洗涤，捕获，并且移除上清液。然后将珠粒用150μl洗脱缓冲液洗涤、捕获并且移除上清液。允许珠粒干燥持续2分钟。在干燥之后，添加50μl的洗脱缓冲液，并且在70℃下混合5分钟。将珠粒在磁体上捕获持续5分钟。移除50μl的上清液并且添加至另一96孔板中。

对于384孔制式，通过添加50μl裂解/结合缓冲液将细胞裂解一分钟。每孔使用2μl的磁珠。将所需体积的珠粒等分、捕获在磁性表座上，并且将移除珠粒保存溶液。然后将珠粒重新悬浮在所需体积的裂解/结合缓冲液(每孔25μl)中并且将25μl的珠粒悬浮液添加到裂解的细胞。将裂解物-珠粒混合物在设置#7的振动转译器(VibraTransaltor)上孵育10分钟(荷兰联合利华有限公司(UnionScientific Corp.)，兰德尔斯敦(Randallstown)，马里兰州)。随后使用磁性表座捕获珠粒，移除上清液并且将珠粒用90μl缓冲液A洗涤一次，随后为用90μl缓冲液B和100μl洗脱缓冲液的单次洗涤步骤。将这些珠粒浸泡在每种洗涤缓冲液中持续约1分钟(不涉及混合)。在最终洗涤之后，将珠粒重新悬浮在15μl 70℃的洗脱缓冲液中持续5分钟，继之捕获珠粒并移除上清液(多达8μl)，用于cDNA合成和/或纯化RNA的储存(-20℃)。

实时PCR

将2μl的cDNA添加至主体混合物中，该主体混合物在一个384孔50板(罗氏公司，目录号04887301001)的每一孔中包括0.5μl GAPDH TaqMan探针(应用生物系统公司，目录号4326317E)、0.5μl SERPINA1 TaqMan探针(应用生物系统公司，目录号Hs00165475_m1)(用于Hep3B实验或用按用户需要设计的GAPDH和SERPINA1 taqman测定用于PCH实验)以及5μlLightcycler 480探针主体混合物(罗氏公司，目录号04887301001)。在罗氏LC480实时PCR系统(罗氏公司)中完成实时PCR。在至少两次独立的转染(各自具有两个生物学重复)中测试每个双链体并且一式两份测定每次转染。

为了计算相对倍数变化，将实时数据使用ΔΔCt方法分析，并且归一化到以用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞执行的测定。针对自由摄取分析，针对PBS或GalNAc-1955(针对实验化合物使用最高浓度)处理的细胞将数据归一化。使用XLFit，使用4参数拟合模型计算IC

AD-1955的有义链和反义链是：有义：5’-cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT-3’(SEQ IDNO:33)；和反义：5’-UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT-3’(SEQ ID NO:40)。

如下使用Taqman引物和探针：

食蟹猴Serpina1和Gapdh TaqMan引物和探针：

Serpina1：正向引物：ACTAAGGTCTTCAGCAATGGG(SEQ ID NO:34)；反向引物：GCTTCAGTCCCTTTCTCATCG(SEQ ID NO:35)；Taqman探针：TGGTCAGCACAGCCTTATGCACG(SEQ IDNO:36)

Gapdh：正向引物：GCATCCTGGGCTACACTGA(SEQ ID NO:37)；反向引物：TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC(SEQ ID NO:38)；Taqman探针：CCAGGTGGTCTCCTCC(SEQ ID NO:39)

表B：核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。

使用上述技术设计并合成了跨越Serpina1 mRNA序列的一系列siRNA双链体，并且将其与三价GalNAc在有义链的3'端缀合。这些双链体的序列示于表1中。这些相同的序列也被合成为具有不同的核苷酸修饰并且与三价GalNAc缀合。修饰的双链体的序列示于表2中。

评价了这些双链体的子集在上述单剂量测定中的功效。表3示出在用指示的GalNAC缀合的修饰的iRNA转染的原代小鼠肝细胞(Hep3b)中的单剂量筛选的结果，以及在用指示的GalNAC缀合的修饰的iRNA转染的原代食蟹猴肝细胞(PCH)中的单剂量自由摄取筛选的结果。数据表示为相对于用AD-1955(用于Hep3B实验的非靶向对照)处理的细胞，或相对于用于PCH实验的稚细胞，余留信息的分数。

表3.通过在原代Hep3b细胞中以及在原代食蟹猴肝细胞(PCH)中的自由摄取的Serpina1功效筛选.

通过在原代Hep3Bare中的转染选定的双链体的IC

表4.通过在Hep3B人细胞系中的转染选定的双链体的Serpina1 IC

在表达Z-AAT形式的人Serpina1的转基因小鼠中评价这些双链体的子集的体内功效(参见，例如，戴卡科(Dycaico)等人，(1988)科学242:1409–12；卡尔森(Carlson)等人，(1989)临床研究杂志83:1183–90；颇福摩(Perfumo)等人，(1994)人类基因学年评(Ann HumGenet.)58:305-20。这是一种确立的AAT-缺乏相关肝病的模型。简言之，在第0天向转基因小鼠皮下注射20mg/kg单剂量的表5中列出的iRNA。在第-10、-5、0、3、5、7、10、和17天收集血清，并且使用人-特异性ELISA测定来确定循环Serpina1蛋白的量。这些分析的结果示于图1中。如图1中所指示，在降低这些小鼠中的血清Serpina1蛋白水平方面，AD-58681-6PS是最有效的。

表5.

实例3.转基因小鼠中的si-AAT的功效.

体内测试如之前实例中所描述的具有低IC50的五种siRNA双链体的功效。将这些siRNA双链体以10mg/kg注入表达人Z-AAT等位基因的转基因小鼠中，这种小鼠是一种确立的AAT-缺乏相关肝病的模型。在第0天向小鼠给药，并且在剂量后接着给予血清人AAT持续21天(图2A)。每个点表示三只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。在第21天处死小鼠，并且对它们的肝脏进行处理以便测量mRNA水平。该图示出每个组的归一化为GAPDH的hAAT mRNA(图2B)。这些条反映平均值并且误差条反映标准偏差。如图2A和2B中所指示，在降低这些小鼠中的hAAT mRNA水平方面，AD59054是最有效的。

实例4.剂量响应方式的持久AAT抑制.

通过皮下给予不同剂量的siRNA双链体AD-59054测量AAT-缺乏相关肝病的转基因动物模型中的siRNA双链体AD-59054的功效。以不同时间间隔抽取血清以使用人AAT特异性ELISA测量血清hAAT蛋白水平。示出在小鼠中测试的以不同剂量实现的最大敲低的功效曲线示于图3A中。每个点是三只小鼠的平均值，并且误差条表示标准偏差。在0.3、1、3或10mg/kg单剂量的AAT siRNA之后的敲低的持续时间示于图3B中。每个数据点是三只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。对于每只动物，将hAAT水平归一化为三个前血值的平均值。siRNA在PBS中给予，因此该PBS组充当对照以反映血清hAAT水平的可变性。皮下给予AATsiRNA引起血清hATT的剂量依赖性抑制，其中在3mg/kg剂量下观察到>95％的最大抑制。1mg/kg的单剂量维持40％的hAAT水平持续至少15天。另外还每周两次向动物给予0.5mg/kg剂量的AD-59054(图3C)。重复给药引起累积应答以及超过90％的蛋白抑制。每个数据点是四只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。

实例5.随Z-AAT减少而降低的肿瘤发生率.

表达转基因人Z-AAT的小鼠随着年龄增长而患肿瘤。设计此实验是为了确定向这些老龄小鼠长期给予本发明的siRNA是否可以降低小鼠中的肿瘤发生率。确切地说，向具有纤维化肝的老龄小鼠(25-46周龄)长期给予siRNA双链体AD-58681以便降低肝肿瘤发生率。向动物每隔一周一次(Q2W)皮下给予PBS或10mg/kg AAT siRNA，持续11个剂量，并且在最后一次剂量之后7天处死(图4A)。测量对照组和治疗组中的肝脏hAAT mRNA、Col1a2 mRNA和PtPrc mRNA的水平。AAT siRNA治疗的动物显示出高于90％的hAAT mRNA水平降低(图4B)。测量Col1a2 mRNA作为纤维化的标志物，并且在AAT siRNA治疗的动物中此标志物的水平降低(图4C)。测量PtPrc(CD45)mRNA作为用于免疫细胞的存在的标志物(图4D)。在患病肝脏中存在更多的免疫细胞浸润，并且如图4D中所示，当用AAT siRNA治疗动物时，PtPrc mRNA水平显著降低。

在首次剂量之后收集血清样品，以监测AAT抑制的程度。所有AAT siRNA治疗的动物显示出小于5％的残留AAT蛋白，并且在给予下一个剂量之前，单个剂量维持AAT水平低于80％持续14天(图5A)。表6提供了在处死时(第132天)来自这些动物的观察结果。给予siRNA双链体的转基因动物展示出相比未治疗的对照动物降低的肿瘤发生率。确切地说，用PBS治疗的六只动物中有四只显示出肝脏中的肿瘤，而用AAT siRNA治疗的六只动物中仅一只显示出肝脏肿瘤。肿瘤发生率中的差异的p值经t检验计算为0.045。图5B和图5C示出来自用PBS抑或AAT siRNA治疗的两只同窝仔畜的肝脏部分的PAS染色。深颜色的点表示球体或Z-AAT聚集体。这些数据指示siRNA双链体在降低转基因小鼠中的Z-AAT水平方面有效，并且降低的Z-AAT水平显示出更健康的肝脏形式的生理学益处。

表6.

实例6.AD-59054的先导物优化

如上文所描述，经证实AD-59054持久地以剂量响应方式体内抑制AAT。然而，AD-59054的核苷酸序列跨越AAT mRNA的一个区，该区包括一个普通的单核苷酸多态性(SNP)(参考SNP登录号：rs1303(

如上文所描述，评价这些修饰的双链体在原代小鼠肝细胞(Hep3B)中在单剂量自由摄取中的功效。Hep3B细胞mRNA携带在对应于AD-59054的反义链的位置6(5’至3’)的位置的C。这些双链体的IC

还评价这些双链体的子集的体内功效。在第0天向表达人Z-AAT等位基因(并且在mRNA中具有对应于AD-59054的反义链的位置6(5’至3’)的A)的转基因小鼠注射1.0mg/kg的AD-59054、AD-61719、AD-61700、AD-61726或AD-61704，并且在剂量后接着给予血清人AAT，如上文所测量，持续14天(图6)。每个点表示三只小鼠的平均值，并且误差条反映标准偏差。如图6中所示，AD-61719和AD-61704与亲本AD-59054同样很好地发挥作用。

表7.

实例7.AD-59054的先导物优化

基于AD-59054的序列制备另外的双链体，包括AD-61444。AD-61444的修饰的和未修饰的有义序列和反义序列提供于表9中。

表9.

实例8.非人类灵长动物的AD-59054、AD-61719和AD-61444的给药

通过向非人类灵长动物给予1mg/kg或3mg/kg单剂量的AD-59054、AD-61719和AD-61444，测试AD-59054、AD-61719和AD-61444在这些灵长动物中的功效。在给予前5天、第0天以及给予后第3、7、10、15、20和30天收集血清样品，以便通过使用人AAT特异性ELISA测量血清hAAT蛋白水平监测AAT抑制的程度。在给予任何这些化合物的动物的血清中未出现细胞因子或细胞因子水平的变化，并且无注射位点反应或药物相关健康问题与这些化合物的给予有关。图7示出1mg/kg单剂量的AD-59054、AD-61719或AD-61444(7A)或3mg/kg单剂量的AD-59054、AD-61719或AD-61444(7B)引起AAT蛋白的剂量依赖性的且持久的降低。