基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法

摘要

本发明公开了基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt‑MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；A2：将活细胞抗体和opt‑MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；A5：将混合液4培养4‑6小时，用PBS溶液清洗2‑3次，完成染色。本发明不需要进行细胞膜打孔，利用抗体，使得活细胞的荧光染色范围和固定细胞免疫荧光染色范围一样；同时，该方法只需要4‑6个小时即可，时间明显缩短。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析和生物技术应用领域，具体涉及基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法。

背景技术

目前国内的活细胞染色方法包括：1、中国专利“活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法”，专利号“201410061287.9”，该方法利用脂质体作为载体进行细胞内染色，方法需要22-26个小时且只针对直接带有荧光标记的抗体；2、中国专利“一种活细胞内蛋白质的免疫荧光标记方法”，专利号“201910633999.6”，该方法对细胞活性有一定的影响，且染色效率不高。

目前常规的活细胞的染色一般通过化学荧光染料实现，化学荧光染料进行染色的范围非常有限，且不是蛋白质特异性而是化学结构特异性的。目前常规的荧光染色一般通过细胞膜打孔实现，细胞膜打孔会影响细胞活性，容易造成细胞死亡，增加细胞碎片的产生，影响流式细胞学检测结果。目前常规的荧光染色时间也比较长，影响实验的效率。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供一种基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，不需要进行细胞膜打孔，利用抗体，使得活细胞的荧光染色范围和固定细胞免疫荧光染色范围一样；同时，该方法只需要4-6个小时即可，时间明显缩短。

本发明通过下述技术方案实现：基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:12-13充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:45-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比50-55:50-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为50-55:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

进一步，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

进一步，所述步骤A2中，活细胞抗体为细胞核内蛋白一抗和二抗混合物，一抗和二抗的重量份数比为1:1。

进一步，所述步骤A2中，活细胞抗体为荧光标记的细胞内蛋白抗体。

进一步，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至70-90℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:0.5-1.5；

B2：将冷却溶液PH调至6-8，然后用0.22μm的针头过滤器过滤，过滤后保持在3-6℃，得到活细胞免疫荧光辅助剂。

进一步，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至80℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:1；

B2：将冷却溶液PH调至7，然后用0.22μm的针头过滤器过滤，过滤后保持在4℃，得到活细胞免疫荧光辅助剂。

上述至少包括以下优点：

1、本发明基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，不需要进行细胞膜打孔，利用抗体，使得活细胞的荧光染色范围和固定细胞免疫荧光染色范围一样；

2、本发明基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，只需要4-6个小时即可弯沉染色，时间明显缩短；

3、本发明基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，可扩大荧光染色的范围，比现有化学荧光染料更具特异性。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明间接标记抗体用于活细胞染色在荧光显微镜下的效果图；

图2为本发明间接标记抗体用于活细胞的染色效果与现有技术活细胞胞内染色效果的对比图；

图3为本发明直接标记抗体用于活细胞染色在荧光显微镜下的效果图；

图4为本发明直接标记抗体用于活细胞的染色效果与现有技术活细胞胞内染色效果的对比图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:12-13充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比0.5-1.5:45-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比50-55:50-55充分混合，室温孵育10-15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为50-55:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

更优选地，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比0.5:12充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比0.5:45充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比1:1.1充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为50:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

更优选地，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1.5:13充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1.5:55充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比1:1充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为55:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

更优选地，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

更优选地，所述步骤A2中，活细胞抗体为细胞核内蛋白一抗和二抗混合物，一抗和二抗的重量份数比为1:1。

更优选地，所述步骤A2中，活细胞抗体为荧光标记的细胞内蛋白抗体。

更优选地，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至70-90℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:0.5-1.5；

B2：将冷却溶液PH调至6-8，然后用0.22μm的针头过滤器过滤，过滤后保持在3-6℃，得到活细胞免疫荧光辅助剂。

更优选地，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至80℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:1；

B2：将冷却溶液PH调至7，然后用0.22μm的针头过滤器过滤，过滤后保持在4℃，得到活细胞免疫荧光辅助剂。

采用本发明上述的工艺方法的优选方案，有如下具体实施方式。

实施例1

基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

更具体地，所述步骤A2中，活细胞抗体为细胞核内蛋白一抗和二抗混合物，一抗和二抗的重量份数比为1:1。

更具体地，细胞核内蛋白一抗为兔淋巴细胞核内的蛋白抗体，细胞核内蛋白二抗为带有AF488的山羊抗兔抗体。

更具体地，所述步骤A4中，目的细胞为小鼠淋巴细胞。

更具体地，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至80℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:1；

B2：将冷却溶液PH调至7，然后用0.22μm的针头过滤器过滤，过滤后保持在4℃，得到活细胞免疫荧光辅助剂。

实施例2

基于标记抗体的活细胞免疫荧光染色方法，包括如下步骤：

A1：将活细胞免疫荧光辅助剂和opt-MEM培养液按体积份数比1:12.5充分混合，室温孵育15min，得到混合液1；

A2：将活细胞抗体和opt-MEM培养液按体积份数比1:50充分混合，室温孵育15min，得到混合液2；

A3：将混合液1和混合液2按体积份数比54:52充分混合，室温孵育15min，得到混合液3；

A4：将混合液3加入到目的细胞培养基中，得到混合液4，所述混合液3和目的细胞培养基体积份数比为53:100；

A5：将混合液4培养4-6小时，用PBS溶液清洗2-3次，完成染色。

更具体地，所述步骤A2中，活细胞抗体为荧光标记的细胞内蛋白抗体。

更具体地，细胞内蛋白抗体为淋巴细胞分泌的蛋白抗体，具体为带APC荧光标记的IFNγ抗体。

更具体地，所述步骤A4中，目的细胞为小鼠淋巴细胞。

更具体地，所述步骤A1中，所述活细胞免疫荧光辅助剂的制备方法，包括如下步骤：

B1：将去离子水加热至80℃，加入线性聚乙烯亚胺，充分溶解后，冷却到室温，得到冷却溶液，所述去离子水和线性聚乙烯亚胺的重量份数比为：500:1；

B2：将冷却溶液PH调至7，然后用0.22μm的针头过滤器过滤，过滤后保持在4℃，得到活细胞免疫荧光辅助剂。

实验例1

将实施例1中完成染色的小鼠淋巴细胞，进行观察。如图1所示，图1（a）为普通显微镜在400倍下观察的小鼠淋巴细胞图，可清楚的观察到小鼠淋巴细胞；图1（b）为免疫荧光显微镜在400倍下观察的被标记小鼠淋巴细胞图，可观察到小鼠淋巴细胞核内被染色标记；图1（c）为图1（a）和图1（b）复合到一张图上，可观察到被标记小鼠淋巴细胞核内被染色标记细胞占到总细胞数量的比例。由图1可知，采用本发明的活细胞免疫荧光染色方法，不用打孔，即可实现免疫荧光染色。

如图2所示，图2（a）为现有技术中染色方法对细胞核内进行染色，然后用流式细胞检测仪检测后的效果图；图2（b）为本发明间接标记抗体对活细胞胞内进行染色，然后用流式细胞检测仪检测后的效果图。由图可知，本发明检测效果与现有技术检测效果相当，不存在明显的差别。但是采用本发明的染色方法与现有技术相比，现有技术染色需要22-26小时，本发明只需4-6小时；现有技术在染色时需要对细胞膜打孔，细胞膜打孔会影响细胞活性，容易造成细胞死亡，增加细胞碎片的产生，影响流式细胞学检测结果，存在较大的失败率，需要进行多组实验才能得到精确结果，而本发明不需要打孔，不会影响检测结果；由图2可知，本发明染色方法可扩大荧光染色的范围，比现有化学荧光染料更具特异性。

实验例2

将实施例2中完成染色的小鼠淋巴细胞，进行观察。如图3所示，图3（a）为普通显微镜在400倍下观察的小鼠淋巴细胞图，可清楚的观察到小鼠淋巴细胞；图3（b）为免疫荧光显微镜在400倍下观察的被标记小鼠淋巴细胞图，可观察到小鼠淋巴细胞胞内被染色标记；图3（c）为图3（a）和图3（b）复合到一张图上，可观察到被标记小鼠淋巴细胞胞内被染色标记细胞占到总细胞数量的比例。由图3可知，采用本发明的活细胞免疫荧光染色方法，不用打孔，即可实现免疫荧光染色。

如图4所示，图4（a）为现有技术中染色方法对细胞胞内进行染色，然后用流式细胞检测仪检测后的效果图；图4（b）为本发明间接标记抗体对活细胞胞内进行染色，然后用流式细胞检测仪检测后的效果图。由图可知，本发明检测效果与现有技术检测效果相当，不存在明显的差别。但是采用本发明的染色方法与现有技术相比，现有技术染色需要22-26小时，本发明只需4-6小时；现有技术在染色时需要对细胞膜打孔，细胞膜打孔会影响细胞活性，容易造成细胞死亡，增加细胞碎片的产生，影响流式细胞学检测结果，存在较大的失败率，需要进行多组实验才能得到精确结果，而本发明不需要打孔，不会影响检测结果；由图4可知，本发明染色方法可扩大荧光染色的范围，比现有化学荧光染料更具特异性。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。