包含Aptamin C作为有效成分的滴眼液组合物

摘要

本发明涉及包含维生素C及与上述维生素C结合的核酸适配体作为有效成分的滴眼液组合物，通过本发明可知，本发明的包含Aptamin C的滴眼液组合物保持较低的活性氧水平(ROS level)且改善上皮细胞损伤、炎症反应，具有利用长期保持这种抗氧化效果的核酸适配体与抗氧化剂复合物来改善及治疗干眼症的效果。

说明书

技术领域

本发明涉及包含Aptamin C作为有效成分的滴眼液组合物。

背景技术

在现代社会中，由于隐形眼镜的佩戴、技术带来的压力、与过敏原的接触、大气污染等原因，角膜或结膜所受的压力逐渐增大，因此，患干眼症(dry eye)的人也呈增多的趋势。若患上干眼症，则降低角膜或结膜的正常功能，容易引起角膜上皮障碍、角膜上皮糜烂、角膜溃疡、结膜炎、角膜炎、眼感染症等。

在以往，预防或治疗干眼症或者伴随角膜或结膜的功能低下的眼疾病的周知方法如下：通过向眼球滴入包含硫酸软骨素、透明质酸等粘弹性物质的滴眼剂来保护角膜或结膜并赋予保水性。但是，包含粘弹性物质的滴眼剂对角膜或结膜的保护作用不充分，无法获得充分的治疗效果，因此，需要开发新型的滴眼剂。

有关干眼症的病况虽不完全明了，但已知引起角结膜上皮障碍，最终会产生视觉异常。因此，早期适当治疗由干眼症引起的角结膜上皮障碍非常重要。

目前，干眼症的常规治疗方法为滴眼治疗，包含透明质酸钠的滴眼液广泛用于干眼症的治疗中。

关于包含透明质酸钠的滴眼液(以下，简称为“透明质酸钠滴眼液”)，具有以多次使用为目的的能够自由地进行盖子等的开封及再密封的多剂量型(Hyalein(注册商标)滴眼液0.1％、Hyalein(注册商标)滴眼液0.3％等)及以单次使用为目的的单位剂量型(Hyalein(注册商标)微型滴眼液0.1％、Hyalein(注册商标)微型滴眼液0.3％等)。

关于多剂量型的透明质酸钠滴眼液，需要进行盖子的开封和再密封，因此，添加苯扎氯铵作为防腐剂，另一方面，单位剂量型仅使用一次(一次性)，因此，不添加防腐剂。

苯扎氯铵等防腐剂被指出具有诱发角膜障碍的危险性，例如，关于苯扎氯铵，正如在Clinical and Experimental Ophthalmology，32，180-184(2004)中公开的，具有浓度依赖性地引起角膜上皮障碍的可能性。如前所述，干眼症本来是伴随角膜上皮障碍的疾病，因此，对重症干眼症患者使用单位剂量型透明质酸钠滴眼液。另一方面，由于生产成本问题等，很难对所有干眼症患者处方单位剂量型透明质酸滴眼液，因此，考虑通过减少多剂量型滴眼液中防腐剂的浓度来减少角膜上皮障碍的风险。但实际上，若减少滴眼液中防腐剂的浓度，则无法获得足够用作多剂量型的保存效力，并且，因减少防腐剂而产生的配合成分的变化，也会带来上述滴眼液的物理化学性质与以往的透明质酸钠滴眼液不同的隐患。

现有专利文献

国际专利公开号WO 2002/22131

发明内容

技术问题

本发明为了解决上述问题且鉴于上述需要提出，本发明的目的在于，提供一种用于治疗干眼症的滴眼液组合物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供一种滴眼液组合物，包含维生素C及与上述维生素C结合的核酸适配体作为有效成分。

在本发明的一实例中，优选地，与上述维生素C结合的核酸适配体由序列1的碱基序列(AGAGCTCGCGCCGGAGTTCTCAATGCAAGAGC)形成，但能够实现本发明目的的所有核酸适配体均包含在本发明的保护范围内。

在本发明的一实例中，优选地，上述维生素C及与上述维生素C结合的核酸适配体的组合摩尔比在10000∶1至10∶1的范围内，但不限定于此。

以下，详细说明本发明。

通过活性氧(ROS)的氧化性应激信号(signaling)引起眼球表面的上皮细胞及杯状细胞(goblet cell)的损伤和炎症反应，在促进干眼症周期中起到核心作用，为了减少过度的氧化性应激信号，需要维持较低的活性氧水平(ROS level)。

在本发明中，抗氧化剂(例如，维生素C(ex.Vitamin C))的使用维持较低的活性氧水平且改善上皮细胞损伤、炎症反应，确认了利用长期保持这种抗氧化效果的核酸适配体与抗氧化剂复合物来改善及治疗干眼症的效果。

在配制本发明的滴眼液时，除如上所述的本发明的Aptamin C复合物以外，可以根据需要配合氯化钠、氯化钾、氯化钙、甘油、丙二醇等等渗剂，硼酸、硼砂、柠檬酸、磷酸氢二钠、ε-氨基己酸等缓冲剂，苯扎氯铵、葡萄糖酸氯己定、苄索氯铵、山梨酸、山梨酸钾、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等防腐剂等药剂学上可接受的多种添加物。

本滴眼液的pH值为3～8，尤其，优选为4～7。

本发明滴眼液的配制方法无需特殊的技法或操作，可以通过常规方法来配制。

发明的效果

通过本发明可知，本发明的包含Aptamin C的滴眼液组合物保持较低的活性氧水平且改善上皮细胞损伤、炎症反应，具有利用长期保持这种抗氧化效果的核酸适配体与抗氧化剂复合物来改善及治疗干眼症的效果。

附图说明

图1为示出通过Aptamin C保持维生素C的还原力的曲线图，示出12-氧-植物二烯酸还原酶(OPDA，12-oxo-phytodienoic acid)测定(assay)(5mM的维生素C，1μM的AptaminC)的结果的曲线图。

图2和图3示出在人角质形成细胞(human keratinocyte，HaCaT cell line))上进行伤口愈合实验(wound healing assay)的结果，当使用维生素C及Aptamin C(与维生素C结合的核酸适配体)处理时，按照时间确认伤口恢复程度的代表图。

在本实验中，使用1μM(0.001％)的Aptamin C、0.5mM(0.008％)的唯生素C进行处理来确认效力。根据本实验的结果可确认，当使用混合Aptamin C和维生素C的组合物进行处理时，伤口恢复得非常好。

在本图中，将与维生素C(ascorbic acid)结合的核酸适配体命名为Aptamin C。

具体实施方式

以下，通过非限定的实施例更详细地说明本发明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围局限于下述实施例。

在常温下，在蒸馏水中以所记载的重量比混合在上述实施例1中具有效果的所合成的核酸适配体与维生素C(DSM公司，英国)在，由此，制备本发明的组合物。

例如，在蒸馏水中混合0.008％(w/v)的维生素C和0.001％(w/v)的与上述维生素C结合的Aptamin C来制备本发明的滴眼液组合物。

将溶于退火缓冲液(Annealing buffer)的Aptamin C加热至95℃后，慢慢将温度降至常温来制备核酸适配体的二级结构后，混合左旋维生素C(L-ascorbic acid)并反应约30分钟来使核酸适配体能够与左旋维生素C结合。之后，添加过氧化氢来造成氧化条件后，添加作为荧光染料的12-氧-植物二烯酸还原酶来测定左旋维生素C的氧化。可以通过从作为左旋维生素C的氧化物的二十二碳六烯酸(DHA)与12-氧-植物二烯酸还原酶进行反应而生成的二十二碳六烯酸-12-氧-植物二烯酸还原酶(DHA-OPDA)测定荧光量来定量分析二十二碳六烯酸的生成程度。在上述条件下，每两分钟测定二十二碳六烯酸-12-氧-植物二烯酸还原酶的荧光量，持续测定12小时。

通过图1中可知，12-氧-植物二烯酸还原酶测定的结果，得出一同使用维生素C与Aptamin C进行处理时防止维生素C的氧化的结果，因此，可预测，包含维生素C和与上述维生素C特异性结合的核酸适配体作为有效成分的滴眼液组合物通过降低维生素C的氧化速度来保持对干眼症的治疗功效。

在6孔培养板中以500μL/孔的量接种人角质形成细胞(从韩国淑明女子大学生命系统研究所中购买)(1×10

使用200μL移液器划破培养物的表面来在细胞上制造伤口。

为了去除未附着的细胞，使用新鲜的培养基洗涤上述被划破的人角质形成细胞。

在培养基分别处理1μM(0.001％)的Aptamin C、0.5mM(0.008％)的维生素C、混合Aptamin C和维生素C的组合物并培养24小时。

使用倒置(inverted)相差光源显微镜测定上述细胞的移动。

拍摄各孔的损伤部位并使用Image J测定其面积。

使用Image J确定移动的细胞边缘(edges)之间的平均面积。

对单独使用Aptamin C处理的、单独使用维生素C处理的以及使用混合Aptamin C和维生素C的组合物处理的人角质形成细胞的损伤缝合的百分比进行比较。