一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法

摘要

本发明提供了一种用于光热‑免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法。该方法具有制备简单、药物分布均一、生物相容性好、以及近红外光响应性特点，在808 nm激光的照射下具有光热效应，既可杀死局部肿瘤细胞，又可促进水凝胶自愈合，增强与周围组织的贴合。同时，该水凝胶可植入于肿瘤术后切除部位，用于局部光热治疗及抗肿瘤免疫佐剂缓释。本发明以聚乙烯醇(PVA）作为主体，装载二硫化钼（MoS2）纳米片和免疫佐剂咪喹莫特（R837），通过油浴法制备可植入体内的自愈合水凝胶药物支架，并结合免疫检查点阻断有望用于抑制术后肿瘤复发和转移。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，属于纳米复合材料制备和生物医学工程技术领域，特别涉及生物可降解聚合物材料与无机纳米材料形成的复合材料的制备方法。

背景技术

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，也是女性中癌症死亡的主要原因。据估计2018年全球有超过860万女性被诊断患有癌症，其中乳腺癌患者占比例高达24.2%。在将近一半的癌症死亡病例中，因乳腺癌而死亡的女性占15.0%，同时发病率及死亡率每年都在不断增加。虽然中国不是乳腺癌高发的国家，但研究显示，自1990年至今，中国乳腺癌发病増长速度比全球平均水平高2倍多。尤其是近年来，我国乳腺癌发病率的增长速度甚至比高发国家高出1%-2%，同时乳腺癌的发病率高峰期比西方国家女性一般要早10-15年。具有高复发、高转移、高致死率等特性的三阴性乳腺癌（TNBC）是最常见的乳腺癌之一，TNBC 是危害女性生命健康的首要重大疾病。如何实现TNBC的有效治疗是癌症治疗领域面临的重大挑战。

当前TNBC的临床治疗效果并不理想，手术虽然能够清除绝大部分宏观可见的肿瘤组织，但术后残留的微肿瘤导致复发率高；化疗及放疗虽然对癌细胞的杀伤力较强，可以降低术后复发与转移，但是这两种治疗方式具有较高的毒副作用，对患者自身的伤害极大；靶向治疗虽然毒副作用小，能够起到针对性治疗效果，但是靶向药物的价格较贵且容易产生耐药性，同时靶向药物的药物肿瘤内输送效率依然很低；局部给药的方式虽能大大提高局部药物浓度，但其治疗周期较短、生物安全性仍需改进，同时高剂量的光热和光动力治疗会对机体造成不可逆的损伤等。因此亟需一种有效的、安全的治疗方式，不仅能够抑制TNBC的术后局部复发，而且具有长期防止TNBC肿瘤转移的效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提出一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，以解决上述背景技术提出的问题。

本发明的技术方案如下：一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，包括如下步骤：

步骤（1）、首先配制不同浓度的R837溶液，利用紫外分光光度计，测得不同浓度的R837溶液在波峰处的吸收强度，由此作出R837在波峰处吸收强度随浓度的变化曲线；

步骤（2）、制备MoS

在Schlenk 管中装入MoS

步骤（3）、对MoS

步骤（4）、首先称量PVA固体颗粒，加入到10mL的小烧瓶内，再加入MoS

步骤（5）、将R837+MoS

步骤（6）、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液，不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度；随后原孔中补充磷酸缓冲溶液，继续孵育；统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线；

步骤（7）、体外培养癌细胞，将其种在R837+MoS

步骤（8）从小鼠中提取树突状细胞（DC），利用24孔板Transwell进行DC成熟实验，流式检测DC细胞的成熟度；

步骤（9）构建小鼠肿瘤术后切除模型，局部植入该自愈合水凝胶，随后通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

进一步的，所述步骤（1）中，R837溶液浓度范围为0.001~100μg/mL；R837的波峰处于320nm。

进一步的，所述步骤（2）中，MoS

进一步的，所述步骤（3）中，溶解于MoS

进一步的，所述步骤（4）中，加入的PVA固体颗粒质量为1g，加入3.8 mL浓度为0.658mg/mL的MoS

进一步的，所述步骤（5）中，R837+MoS

进一步的，所述步骤（6）中，孔板规格为6、12、24、96孔板中的一种。

进一步的，所述步骤（7）中癌细胞为胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

进一步的，所述步骤（8）中通过检测共刺激分子CD80和CD86从而检测DC细胞成熟度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种用于光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备方法，以聚乙烯醇(PVA）作为主体，装载二硫化钼（MoS

附图说明

图1为本发明的光热-免疫联合治疗的抗肿瘤自愈合水凝胶的制备过程示意图。

图2为本发明中R837标准曲线的测定，A图为不同浓度R837溶液的紫外吸收峰；B图为R837在320nm处的吸收强度随浓度的变化曲线。

图3为本发明中不同成分的水凝胶的明场图，A图为纯PVA的水凝胶照片；B图为R837+MoS

图4为本发明中自愈合水凝胶的表征及自愈合性能测试，A图为MoS

图5为本发明中自愈合水凝胶在近红外光照后与心、肝、脾、肺、肾的贴合效果。

图6为本发明中R837+MoS

图7为本发明中不同组（R837@PVA（-L）、R837+MoS

图8为本发明中MTT所测得的各组（Control、PVA、PM、PMR(L)、PMR(H)）光照后的细胞活性。

图9为本发明中自愈合水凝胶刺激DC成熟实验。

图10为本发明的动物实验过程示意图。

图11为本发明中自愈合水凝胶植入小鼠肿瘤术后切除部位治疗后，抑制术后肿瘤复发的效果图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明的内容，下面结合实施例和附图对本发明进行阐述。本发明实施例以本发明的技术为基础实施，给出了详细的实施方式和操作步骤。

实施例1

步骤1、首先配制不同浓度的R837溶液，溶液浓度为0.001~100μg/mL，利用紫外分光光度计，R837的激发波长为320nm，测得各溶液在320nm处的吸收强度，由此作出R837在320nm处吸收强度随浓度的变化曲线。

步骤2、制备MoS

步骤3、对MoS

步骤4、首先称量1g的PVA固体颗粒，加入到10mL的小烧瓶内，再加入3.8 mL浓度为0.658mg/mL的MoS

步骤5、用透射电子显微镜对MoS

步骤6、将R837+MoS

步骤7、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液。不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度。随后原孔中补充缓冲溶液，继续孵育。统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线。

步骤8、体外培养癌细胞，将其种在自愈合水凝胶上。MTT法测量癌细胞的存活率随时间的变化（每两天换一次新鲜的培养液），癌细胞可以是胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

步骤9、从小鼠中提取树突状细胞（DC），利用24孔板Transwell进行DC成熟实验。将提取出的DC培养在24孔板Transwell的下部，将之前处理后的癌细胞及相应的培养液置于Transwell的上部，共孵育24 h，之后离心获得DC细胞。流式检测DC细胞的成熟度。

步骤10、构建小鼠肿瘤术后切除模型，然后局部植入该自愈合水凝胶，随后用808nm激光照射10 min并注射aPDL1抗体。最后，通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

实施例2

步骤1、首先配制不同浓度的R837溶液，溶液浓度为0.001~100μg/mL，利用紫外分光光度计，R837的激发波长为320nm，测得各溶液在320nm处的吸收强度，由此作出R837在320nm处吸收强度随浓度的变化曲线。

步骤2、制备MoS

步骤3、对MoS

步骤4、首先称量0.5g的PVA固体颗粒，加入到10mL的小烧瓶内，再加入3.8 mL浓度为0.658mg/mL的MoS

步骤5、用透射电子显微镜对MoS

步骤6、将R837+MoS

步骤7、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液。不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度。随后原孔中补充缓冲溶液，继续孵育。统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线。

步骤8、体外培养癌细胞，将其种在自愈合水凝胶上。MTT法测量癌细胞的存活率随时间的变化（每两天换一次新鲜的培养液），癌细胞可以是胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

步骤9、从小鼠中提取树突状细胞（DC），利用24孔板Transwell进行DC成熟实验。将提取出的DC培养在24孔板Transwell的下部，将之前处理后的癌细胞及相应的培养液置于Transwell的上部，共孵育24 h，之后离心获得DC细胞。流式检测DC细胞的成熟度。

步骤10、构建小鼠肿瘤术后切除模型，然后局部植入该自愈合水凝胶，随后用808nm激光照射10 min并注射aPDL1抗体。最后，通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

实施例3

步骤1、首先配制不同浓度的R837溶液，溶液浓度为0.001~100μg/mL，利用紫外分光光度计，R837的激发波长为320nm，测得各溶液在320nm处的吸收强度，由此作出R837在320nm处吸收强度随浓度的变化曲线。

步骤2、制备MoS

步骤3、对MoS

步骤4、首先称量1g的PVA固体颗粒，加入到10mL的小烧瓶内，再加入3.8 mL浓度为0.658mg/mL的MoS

步骤5、用透射电子显微镜对MoS

步骤6、将R837+MoS

步骤7、将不同药物含量的自愈合水凝胶置于孔板中，加入磷酸缓冲溶液。不同时间点取出溶液，测量溶液的吸收强度，定量溶液中的药物浓度。随后原孔中补充缓冲溶液，继续孵育。统计不同时间的药物释放量，绘制累积药物释放曲线。

步骤8、体外培养癌细胞，将其种在自愈合水凝胶上。MTT法测量癌细胞的存活率随时间的变化（每两天换一次新鲜的培养液），癌细胞可以是胃癌、肠癌、肝癌、胰腺癌、食道癌、乳腺癌中的一种。

步骤9、从小鼠中提取树突状细胞（DC），利用24孔板Transwell进行DC成熟实验。将提取出的DC培养在24孔板Transwell的下部，将之前处理后的癌细胞及相应的培养液置于Transwell的上部，共孵育24 h，之后离心获得DC细胞。流式检测DC细胞的成熟度。

步骤10、构建小鼠肿瘤术后切除模型，然后局部植入该自愈合水凝胶，随后用808nm激光照射10 min并注射aPDL1抗体。最后，通过小动物生物发光成像监测肿瘤复发情况。

采用本发明的方法，由图2可知，R837的吸收强度在一定范围内与R837的浓度呈线性关系。

采用本发明的方法，由图3中的明场图可见，纯PVA水凝胶呈透明状胶体，而R837+MoS

采用本发明的方法，由图4可见，通过TEM对MoS

采用本发明的方法，由图5可见，自愈合水凝胶在近红外光照后与心、肝、脾、肺、肾紧密粘合。

采用本发明的方法，由图6可见，当光的功率为1 W/cm

采用本发明的方法，由图7可见，前期R837药物大量释放，但随着时间的推移，药物的释放速率逐渐放缓，在第六天基本达到平台。

由图8可见，在没有光照的条件下，各组均没有明显的细胞毒性，且即使在光照条件下，纯PVA同样没有明显的细胞毒性，结果说明PVA、MoS

采用本发明的方法，由图9可见，PMR+L组能够显著引起DC的成熟（CD80：57.68%、CD86：55.96%），这说明癌细胞在被光热杀死后，大量凋亡的癌细胞确实分泌出了各种肿瘤相关抗原，正是由于这些肿瘤相关抗原的存在，从而促进了 DC 的大量成熟。

采用本发明的方法，由图11可见，在治疗22天后，PMR+aPDL1+Light组肿瘤术后切除部位生物发光信号十分微弱，而仅手术组和PMR组肿瘤术后切除部位生物发光信号很强，说明PMR+aPDL1+Light组能有效抑制肿瘤术后切除之后的复发。