口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用

摘要

本发明属于医用材料技术领域，公开了一种口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用。制备方法主要包括以下步骤：将口腔鳞癌组织清洗后切成块；在摇床上，用1％的Triton‑X100处理12h得到初步脱细胞组织；在摇床上，用1％的SDS处理12h；在摇床上，用100U/ml的DNAseⅠ震荡24h；在摇床上，用PBS洗12h得到脱细胞基质；将脱细胞基质置于0.1U/L的青链霉素溶液中封闭保存。该制备方法所需设备要求不高，脱细胞试剂常见便宜，所以构建成本低，实用性强，适合推广。

说明书

技术领域

本发明属于医用材料技术领域，具体涉及一种口腔鳞癌组织脱细胞基质及其制备方法和应用。

背景技术

在世界范围内，口腔癌的发病率居全身恶性肿瘤的第六位，其中至少80％是鳞状细胞癌，近几十年来，尽管治疗手段进步，口腔鳞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)患者5年生存率仍未得到明显提高，OSCC发生发展机制仍未被阐明，因此迫切需要深入研究肿瘤生物学行为。目前常见的肿瘤研究方法包括：二维(2D)培养、肿瘤异种移植动物模型、人工合成生物支架。其中2D培养缺乏适当的细胞-细胞和细胞-细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)相互作用的三维(3D)结构；动物模型可以模拟人类肿瘤微环境，但动物引入了许多不可控制的变量，包括内源性生长因子的产生和免疫系统的缺乏；人工支架材料虽能建立起细胞生长的3D结构，然而缺乏细胞需要的各种生物成分。

细胞外基质(ECM)是由三维网构成，除了蛋白聚糖和葡糖胺聚糖，胶原蛋白，弹力蛋白和基础纤维之外，还有毛细血管，淋巴管和神经末梢，防御细胞和基底膜。ECM功能非常重要，不仅负责输送营养物质，排除代谢终产物，同时也承担免疫防御功能等作用。运用脱细胞方法制得的支架材料既去除了组织内细胞成分，又在最大程度上完整保留了细胞外基质(ECM)成分及三维立体结构，基于上述特点，可以通过口腔鳞癌组织脱细胞支架(decellularized ECM，dECM)来模拟肿瘤生长三维微环境，从而为肿瘤生物学研究提供新的思路。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题。为此，本发明第一目的在于提供一种口腔鳞癌组织脱细胞基质的制备方法。

为实现第一目的本发明所采用的技术方案为：

一种口腔鳞癌组织脱细胞基质的制备方法，包括以下步骤：

(1)将新鲜或者冻融后的口腔鳞癌组织清洗后切成块；

(2)在摇床上，用1％的Triton-X100处理12h得到初步脱细胞组织；

(3)在摇床上，用1％的SDS处理12h；

(4)在摇床上，用100U/ml的DNAseⅠ震荡24h；

(5)在摇床上，用PBS洗12h得到脱细胞基质；

(6)将脱细胞基质置于0.1U/L的青链霉素溶液中封闭保存。

优选地，所述步骤(1)中，口腔鳞癌组织用PBS冲洗3遍，在4℃将口腔鳞癌组织切成块。

优选地，所述步骤(2)至步骤(5)均在室温条件下进行。

优选地，所述步骤(2)、步骤(3)和步骤(4)结束后均用PBS冲洗脱细胞组织。

优选地，所述步骤(6)中的保存温度为3-5℃或-90℃～-70℃。

优选地，所述步骤(2)至步骤(5)中摇床的转速均为225rpm。

本发明的第二目的在于提供一种采用上述方法制备得到的口腔鳞癌组织脱细胞基质。

本发明的第三目的在于提供一种上述口腔鳞癌组织脱细胞基质作为培养支架的应用。

本发明的第四目的在于提供一种上述口腔鳞癌组织脱细胞基质用于口腔鳞癌类器官构建的应用。

本发明的第五目的在于提供一种上述口腔鳞癌组织脱细胞基质用于肿瘤药物筛选及相关检测的应用。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的

1、本发明的口腔鳞癌组织脱细胞基质的制备方法所需设备要求不高，脱细胞试剂常见便宜，所以构建成本低，实用性强，适合推广。制得的口腔鳞癌组织脱细胞基质经过物理、化学及酶处理后，脱除细胞完全，核酸残留少，基本能保存原有基质的生物成分(Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白)，因此能模拟体内肿瘤细胞生长的细胞外基质微环境，使培养的口腔肿瘤细胞及相关细胞的生物学特性更接近在体内生长状态，因此能改善实验的可靠性及可重复性。

2、本发明的口腔鳞癌组织脱细胞基质适用肿瘤细胞及相关细胞与ECM相互作用及肿瘤细胞之间互相作用机制研究。用于研究肿瘤生长微环境，有助于进一步探究肿瘤生物学行为，从而为实现靶向细胞外基质治疗提供可能性。

3、本发明的口腔鳞癌组织脱细胞基质可以用于研究肿瘤微环境对肿瘤细胞、巨噬细胞及肿瘤相关细胞生物学行为的影响，从而研究肿瘤微环境对肿瘤促进、免疫抑制方面的影响，有利于深入了解口腔鳞癌的发展，从而为实现口腔鳞癌精准治疗提供可能性。

附图说明

图1是本发明脱细胞组织标本前后对比示意图。

图2是本发明脱细胞基质DNA含量示意图。

图3是本发明脱细胞基质组织学染色示意图。

图4是本发明脱细胞组织前后组织微观结构示意图。

图5是本发明脱细胞基质ECM结构图。

图6是本发明脱细胞基质实例一的实验结果图。

图7是本发明脱细胞基质实例二的实验结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将更为清楚。但实施例仅用于说明本发明，并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本实施例的一种口腔鳞癌组织脱细胞基质的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)口腔鳞癌组织标本可取自口腔颌面外科手术，标本离体后放入4℃冰盒中，转移至实验室，用PBS(磷酸盐缓冲液)将标本冲洗3～4次，去除血迹后进行后续处理或放入-80℃冰箱中保存。

取出标本并置于常温，用PBS冲洗标本3次，在冰块上将组织切成小块，小块的大小约1cm

(2)在摇床上，以225rpm的转速，室温条件下用1％的Triton-X100(聚乙二醇辛基苯基醚)处理12h得到初步脱细胞组织；

室温条件下将初步脱细胞组织用PBS反复冲洗数次，直至基本清洁。

(3)在摇床上，以225rpm的转速，室温条件下用1％的SDS(十二烷基硫酸钠)处理12h得到脱细胞组织；

室温条件下将脱细胞组织用PBS冲洗数次，直至基本清洁。

为保证彻底脱细胞效果，本发明继续对脱细胞加以下述处理。

(4)在摇床上，以225rpm的转速，室温条件下用100U/ml的DNAseⅠ(脱氧核糖核酸酶Ⅰ)震荡24h得到脱细胞基质；

室温条件下将脱细胞基质用PBS冲洗3-4次。

(5)在摇床上，以225rpm的转速，室温条件下用PBS洗12h得到最终的脱细胞基质；

(6)将脱细胞基质置于0.1U/L的青链霉素溶液中，封口胶封闭EP管(离心管)的开口后置于4℃冰箱环境中保存以待使用，如需长期保存，可置于-80℃冰箱中。

采用上述的方法制备得到的口腔鳞癌组织脱细胞基质可作为一种优选的实验载体，该脱细胞基质材料在使用前需要进行无菌处理，将脱细胞基质置于75％医用酒精过夜后用高温高压灭菌的PBS冲洗3-4次，可用于细胞及动物实验。

为保证脱细胞结果，本实施例对脱细胞基质进行一系列质量控制。

1.脱细胞组织标本大体观察：标本变得透明白色(图1)；

2.DNA含量检测：1mg的ECM含DNA含量不超过50ng(图2)；

3.组织学染色：H&E和Masson染色(图3)；

4.扫描电镜(SEM)：比较脱细胞前后组织微观结构，进一步验证脱细胞后组织无细胞存在(图4)；

5.免疫组化(IHC-P)：主要观察Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原(Collagen1,4)，纤维连接蛋白(fibronectin)，层粘连蛋白(laminin)等ECM主要结构(图5)。

该口腔鳞癌组织脱细胞基质可作为培养支架使用，例如：切成小块后灭菌接种细胞进行三维细胞共培养；脱细胞材料用胃蛋白酶消化获取多肽混合物后，制成水凝胶溶液用于三维培养；用胃蛋白酶等酶消化成多肽混合物或者浸泡形成浸出液，加入培养基中进行二维培养。

该口腔鳞癌组织脱细胞基质还可用于构建口腔鳞癌类器官。

该口腔鳞癌组织脱细胞基质还可用于肿瘤药物筛选等相关实验。

实例一

3D共培养：将脱细胞基质消毒后，口腔鳞癌细胞cal-27接种于支架上，5d后收样，SEM观察cal-27在dECM中分布状态。

实验结果：cal-27细胞分布于dECM内，且通过纤维丝等结构与dECM形成三维网状结构，证明脱细胞基质具有良好的生物相容性，能作为细胞培养三维的平台。(图6)

实例二

耐药性实验：将正常口腔组织，早期dECM(E-dECM)及晚期dECM(L-dECM)通过胃蛋白酶消化成多肽混合物后，用DMEM高糖无血清培养基将上述3种基质溶液稀释成浓度为：0.5mg/ml，并用上述溶液稀释顺铂药物，浓度梯度设置为0、4、8、12μM。将cal-27以5×10

实验结果：晚期dECM对耐受性最好，依次是早期dECM，正常组，2D组对顺铂耐受性最差。说明晚期肿瘤ECM耐药性最强，在一定程度上解释了晚期肿瘤治疗难度增加(P<0.05)(图7)。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。