一种快速获得高滴度慢病毒的包装方法

摘要

本发明公开了一种快速获得高滴度慢病毒的包装方法，包括步骤为：将慢病毒包装质粒、目的基因表达质粒、转染试剂、鱼精蛋白混合形成脂质体，其中所述慢病毒包装质粒为pRsv‑REV、pMDLG‑pRRE、pVSV‑G；将形成的脂质体加入工具细胞中转染并培养；收集培养的病毒上清，处理得到病毒液。通过上述方式，本发明采用此慢病毒包装系统的四质粒系统和转染试剂的优化改良配方，可以大大缩减病毒包装周期，节省时间成本，此方法无需对细胞反复换液，包装步骤简单，易操作，此方法所用试剂种类减少，易操作，此方法包装的慢病毒滴度高，纯度高，此方法包装的慢病毒可用于动物层面研究。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种快速获得高滴度慢病毒的包装方法。

背景技术

慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒的一种，基因组为双链RNA。但区别于一般的逆转录病毒，慢病毒具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒基因组进入细胞后在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白，或产生小RNA；重组慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础，使用PAX和P2G外壳蛋白发展起来的工具载体，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。慢病毒载体技术与瞬转表达载体相比，感染能力强，特别对于原代细胞有很好的感染效果，可以替代瞬转表达载体使用，又可以整合到目的细胞的基因组内，确保目的基因在受体细胞中稳定复制、遗传、表达，使其发挥作用。

慢病毒载体通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，产生可用慢病毒，为在哺乳动物细胞中研究特定基因提供了研究基础。

总之，慢病毒与其他病毒工具比较，具有以下优势：

(1)表达时间长：慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上，可实现目的基因长时间稳定的表达，不随着细胞分裂传代而丢失，是细胞及动物实验的首选；

(2)安全性高：未发现致病性，已被用于CAR-T治疗作用于人体；

(3)免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。

但慢病毒在应用上仍存在着以下难题：

(1)目前慢病毒包装系统繁琐，难度大。一般等级的实验室无法自行获取病毒工具，只能借助于专业机构获得慢病毒颗粒。但是时间周期很长，通常从获得慢病毒质粒开始，到完成慢病毒包装，往往需要一个月的时间，时间长，效率低，严重影响科研人员实验进度。

(2)目前慢病毒包装步骤繁多：a、需要在慢病毒包装前，对工具细胞的完全培养基换液为无血清培养基,无血清培养基势必会影响工具细胞生长及状态，转染后状态不佳直接导致产量底下，病毒滴度满足不了后续实验；b、脂质体转染之后8h，需要将无血清培养基更换液为完全培养基。频繁的换液会造成贴壁不牢固的工具细胞脱落，从而影响包装效果；c、随后24小时、48小时、72小时甚至96小时都要小心翼翼吸取上清并换新鲜培养基，一不小心细胞就全部飘起来，导致前功尽弃；d、后续上清需要离心、过滤、纯化、浓缩等更为繁琐，最后收集慢病毒颗粒并测滴度后才可使用。整个过程对细胞生长、技术操作和人为判断要求苛刻，步骤繁琐复杂，一步错可能就要从头做，而且对科研人员时间要求比较苛刻，科研人员通常为等实验时间点而加班加点，起早贪黑，并且一旦做起来中间无法停滞，实验周期较长，严重影响实验效率。

(3)目前慢病毒包装脂质体配置体系繁杂，试剂繁多，比如用lipo3000转染法，脂质体的配制过程非常繁琐，需要加无血清无双抗特定培养基，然后计算病毒各包装质粒质量、慢病毒载体的目的质粒、lipo3000和P3000的量，转染试剂和质粒还要分开在不同的EP管孵育后然后再逐一加入混合，像四质粒包装系统前后需要吸取、加入和混合的操作10次以上，并且还有一定的先后顺序，过程十分繁琐，一不小心就会加错，很容易漏加或者错加试剂。

(4)目前市面上慢病毒载体种类虽多，但所携带的荧光基因表达强度较弱，不能直观判断感染效率。现有的慢病毒载体种类繁多，需要花费很多时间精力去选择载体，一旦选错又会影响实验结果。而且现有的慢病毒载体所携带的荧光基因表达强度较弱，慢病毒感染细胞后，在48小时内荧光显微镜下观察荧光很弱，无法准确判断感染效率，只能通过费时费力又昂贵的流式细胞仪检测感染效率，给科研人员带来诸多不便。

(5)目前市面上慢病毒滴度普遍较低，大致滴度为1E+8TU/mL层面，该滴度只适合感染普通易感肿瘤细胞，对于比较难感染的原代细胞、神经细胞、干细胞、内皮细胞、心肌细胞等，则需要反复感染才可获得微弱效果，更甚者通过反复感染之后，依然感染失败。

(6)目前市面上慢病毒因其滴度低，纯度不佳等因素，只能用作细胞层面感染，而对于动物层面的实验，则要求病毒滴度高，纯度高。很多科研人员既要做体外细胞层面研究，也要做体内动物层面研究，因此不得不同时包装慢病毒和腺相关病毒，由此大大增加了科研成本。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种快速获得高滴度慢病毒的包装方法，能缩短包装时间，普通等级实验室可实现，包装步骤简单，尤其脂质体配置体系简单，获得的慢病毒载体会有很强的荧光显现，滴度高，纯度高，大大减轻了科研经费负担，同时也便捷的提高了实验效率，适用于基础医学科研领域。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种快速获得高滴度慢病毒的包装方法，包括步骤为：

(1)将慢病毒包装质粒、目的基因表达质粒、转染试剂、鱼精蛋白混合形成脂质体，其中所述慢病毒包装质粒为pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G；

(2)将步骤(1)形成的脂质体加入工具细胞中转染并培养；

(3)收集培养的病毒上清，处理得到病毒液。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中目的基因表达质粒：pRsv-REV：pMDLG-pRRE：pVSV-G的质量比为10：5：3：2。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中转染试剂的浓度为1mg/mL，转染试剂的体积为pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G、目的基因表达质粒四质粒质量总和的3倍。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中慢病毒包装质粒、目的基因表达质粒、转染试剂、鱼精蛋白混合静置30分钟后形成脂质体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述工具细胞为293T细胞。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中收集培养的病毒上清，将病毒上清离心过滤，再超速离心，加入病毒保存液重悬收集得到病毒浓缩液。

在本发明一个较佳实施例中，所述快速获得高滴度慢病毒的包装方法中全步骤使用完全培养基。

在本发明一个较佳实施例中，所述快速获得高滴度慢病毒的包装方法中全步骤完成时间为3天。

本发明的有益效果是：本发明的快速获得高滴度慢病毒的包装方法，采用此慢病毒包装系统的四质粒系统和转染试剂的优化改良配方，更适用于高密度过量生长的工具细胞，无需担心工具细胞过密影响转染效率及出毒量，节省了准备合适密度细胞花费的时间和精力；此方法无需在转染前和转染后对细胞进行反复换液，包装步骤简单；此方法所用试剂种类少，部分试剂可提前预混好备用，操作简便，不易出错；此方法不仅高效还能大幅增加病毒产量，更易浓缩出大于1E+9TU/mL的高滴度甚至大于1E+10TU/mL的超高滴度慢病毒，并且慢病毒纯度高活性强，可用于动物层面实验研究。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：

图1是本发明方法的流程示意图；

图2是本发明一实施例中包装过程的示意图；

图3是本发明一实施例在慢病毒包装时目标细胞的荧光显现示意图；

图4是本发明一实施例在包装的慢病毒感染目的细胞后的荧光显现示意图；

图5是本发明一实施例中的实验参数图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易地从商业公司获取的实验材料。

本实施例中使用的包装质粒pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G，购自addgene公司，其具体基因结构可以参考addgene官方网站。

请参考图1和图2所示，本发明实施例提供一种快速获得高滴度慢病毒的包装方法，包括步骤为：

一、载体制备

此载体制备能够获得目的基因表达质粒。

(1)设计引物

通过NCBI获得目的基因序列，使用引物设计网站https://www.takarabio.com/设计一对特异性引物用于构建到载体中。序列需包含正向引物和反向引物，格式如下：

随后交由上海生工合成公司进行合成。

(2)载体酶切

根据如下列表，配制40μL酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

(3)目的基因片段的获得

收到模板后，按照如下PCR反应体系进行扩增目的基因CDS区域的片段：

PCR仪扩增，程序为：

30个循环。

(4)连接

配制完连接体系后，于37℃隔水式恒温培养箱内放置30min。

(5)转化

a、先在冰上溶解感受态细胞，待其溶化后开始实验；

b、把5μL连接产物加入到50μL感受态细胞中，冰上孵育30分钟；

c、42℃热激细胞90秒；

d、立即转移到冰上孵育2分钟；

e、加入600μL LB液体培养基，在37℃、225RPM.的摇床里孵育1小时；

f、10000RPM离心1分钟，保留100μL转化物涂到含有氨苄的LB平板上，37℃孵育过夜；

(6)筛选阳性克隆

按照如下体系操作：

PCR鉴定，程序为：

30个循环。

(7)质粒小抽

挑两个克隆，加入到含相应抗生素3.2mL LB液体培养基中，37℃培养15h。按照质粒小提试剂盒说明书进行质粒抽提。

(8)酶切鉴定

重组质粒酶切鉴定(20μL)

(9)测序

将酶切正确的基因质粒吸取10μL送去上海生工公司测序。

二、慢病毒包装

1、细胞处理

a、293T细胞复苏

293T细胞购自美国ATCC生物资源中心，为慢病毒包装的工具细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含浓度为10％的FBS)。细胞经培养生长增殖，形成单层细胞。

(1)从液氮罐中取出293T细胞冻存管(应带有防护眼睛和手套)，迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。

(2)用浓度为70％的酒精对293T冻存管擦拭消毒后，移至生物安全柜台内，吸出细胞悬液至离心管中，1000rpm 5min后，弃掉上层培养基，留下管底部细胞，用1mL完全培养基将离心管中的细胞重悬，补加4mL含浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基至6cm培养皿内，置37度恒温培养箱内培养。次日更换一次培养液后再继续培养。

b、293T细胞传代

(1)弃去旧的完全培养基，加入2mL灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然后弃去PBS溶液。

(2)加入1mL胰酶消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。

(3)加入含浓度为10％的胎牛血清DMEM培养基1mL终止消化，离心重悬混匀细胞后分至两个新的培养皿中，继续培养。

c、细胞接种

包装前一天：取状态良好的对数生长期293T细胞，胰蛋白酶消化计数后接种于10cm细胞培养皿(每个平皿接种细胞约为8×10

第一天：

(1)细胞选取

在显微镜下观察，选取生长密度80％以上的培养皿进行后续慢病毒包装，无需换液；密度过高的培养皿不会影响包装效果，但是需要根据细胞情况进行换液，轻轻吸去旧的完全培养基，逐滴加入新鲜DMEM完全培养基8-10mL，放置培养箱。

(2)脂质体配制

取1mL不含血清不含双抗的opti-MEM至离心管内，将慢病毒包装质粒和目的基因表达质粒分别加入该培养基后，再加入转染试剂，另需要加入鱼精蛋白，震荡混匀，室温静置约30min形成脂质体；所述慢病毒包装质粒为pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G。

本发明所述包装方法采用的病毒包装系统为四质粒系统，组成为pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G、目的基因表达质粒，其中，表达质粒能表达绿色荧光蛋白(GFP)，pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G含有病毒包装所必须的元件。目的基因表达质粒：pRsv-REV：pMDLG-pRRE：pVSV-G＝10：5：3：2，转染试剂(PEI，sigma公司的产品，1mg/mL)体积为各质粒质量和的三倍，即pRsv-REV、pMDLG-pRRE、pVSV-G、目的基因表达质粒四质粒质量和的三倍，鱼精蛋白的使用浓度为1mg/mL，鱼精蛋白具有很高的营养性和功能性，添加到细胞中可以促进细胞增殖，改善细胞状态。

(3)脂质体转染

将配置好的脂质体逐滴加入已经换好新鲜培养基的293T细胞中，培养箱中继续培养。

第二天收集病毒上清：分别在转染后24h、48h收集培养上清，并在24h收完上清后小心加入新鲜培养基继续培养。

第三天病毒上清离心、过滤：将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，收集离心后的上清液；将上清液以0.45μm滤器过滤。于50mL超速离心管中，4℃，25000rpm/min离心2h，弃上清，加入50-100μL病毒保存液重悬收集浓缩病毒，将病毒浓缩液立即存放-80℃。

效果实验：

慢病毒滴度测定

(1)取状态良好的对数生长期293T细胞，胰蛋白酶消化计数后接种于24孔板中(每个孔接种细胞1×10

(2)取2μL病毒浓缩液，加入198μL培养基，稀释100倍，得到病毒稀释液；

(3)在24孔板3个孔中分别加入10μL、2μL、1μL病毒稀释液(相当于0.1μL体系、0.02μL体系、0.01μL体系病毒原液)培养箱继续培养48小时；

(4)48小时后，观察各孔细胞荧光，并用显微镜拍照计数和流式细胞仪检测荧光比例，从而计算感染效率，最后计算出病毒滴度。

本发明的有益效果是：

一、所述快速获得高滴度慢病毒的包装方法提供了一种优化便捷的慢病毒包装系统，普通等级实验室即可通过此包装方法，便捷的包装出高质量慢病毒。此优化后的慢病毒包装方法有效缩短整个慢病毒包装时间，从获得慢病毒质粒开始，到完成慢病毒包装，时间周期缩短为3天；

二、所述快速获得高滴度慢病毒的包装方法步骤简单，无需在慢病毒包装前将工具细胞换液为无血清培养基，无需在脂质体质粒转染后8h，再将工具细胞换为完全培养基，全程使用完全培养基，简单便捷，大大提高了实验人员工作便捷度；

三、所述快速获得高滴度慢病毒的包装方法中脂质体配置体系简单，能显著降低重组产生具有复制能力病毒的序列同源性，生物安全性更为可靠，脂质体配置步骤简单，只需要将目的基因质粒、包装质粒及转染试剂一次性加入opti-mem培养基中，等待30min即可，无需等待更长时间，也无需将几种试剂分别混匀后再混合到一起，大大提高了操作便捷度；

四、本发明获得的慢病毒载体荧光强度是目前市面上常见的EGFP的10倍以上，病毒包装时，目的细胞可以直观的看到荧光，肉眼明显可见绿色荧光和红色荧光，由此方法包装的慢病毒感染目的细胞后，会有很强的荧光显现，具体见图3-4，因此不再需要借助昂贵的流式细胞仪即可获得实验结果，方便科研人员直观的判断细胞感染效率及实验成功率；

五、本发明获得的慢病毒产量高，可轻松浓缩出高滴度慢病毒，滴度可达

具体的，图5流式细胞仪检测实验数据如下表1：

表1

六、本发明获得的慢病毒因其滴度高，纯度高，不但可以用于体外细胞感染实验，同时可以直接用于体内动物层面的感染实验，科研人员不需要再去单独包装腺相关病毒，这大大减轻了科研学者的经费负担，同时也便捷的提高了实验效率；

七、所述快速获得高滴度慢病毒的包装方法适用于基础医学科研领域，能用于感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞中，形成稳定表达目的基因的细胞系，为神经领域、心血管领域、肝脏、肌肉、眼、肺、肿瘤及其他领域的科研工作者们提供更强有力的基因研究工具，还可用于构建转基因动物模型、生物医药研发、临床医学转化、基因编辑、基因治疗、CAR-T治疗、以及药物研究等方面。

本发明研发的高效高产的慢病毒包装方法，打破了优质慢病毒包装的技术壁垒。本发明公开了从慢病毒包装工具细胞到包装质粒，从慢病毒纯化到感染细胞、筛选稳转株的全套工具、试剂及操作步骤，使用者只需要根据本方法进行傻瓜式操作即可完成慢病毒包装。并且对实验室的基础设施条件要求较低，普通级别实验室就可以高效便捷地包装出高质量慢病毒。

本发明经过改造优化，操作步骤经过简化改进，高效便捷，大幅缩短实验周期。本发明中的工具细胞经过改造，更易转染，产毒效率更高，并且其生长特性变得更喜高密度细胞环境，无需担心细胞过密影响转染效率及出毒量；本发明所配的试剂盒将病毒包装质粒按照最优的配比提前预混并加入稳定剂，将本来需要转染前依次计算质量并混合的三个病毒质粒变为一个慢病毒包装试剂，让操作变得更加简单快捷；试剂盒的操作说明优化了后续的操作流程和实验步骤，如原来需要收集4个时间点的病毒上清优化为只需要收集2个时间点，实验周期可缩短两天，并且原来需要离心的步骤直接可以省去，原来测滴度至少需要四天，改进只需要2天。经过改进后的包装流程和实验步骤，在慢病毒载体构建好的情况下最快3天即可获得优质慢病毒，再加2天即可得到病毒滴度，最快4天即可获得慢病毒感染成功的稳定细胞株，大大缩短了实验周期。

本试剂盒包装出的病毒产量高，更易浓缩出高滴度甚至超高滴度的慢病毒。针对目前慢病毒包装存在的一些问题，本发明把工具细胞改造成为慢病毒包装专用细胞，改造后的细胞更易转染，产毒效率更高，并且其生长特性变得更喜高密度细胞环境，相同数量大小的培养皿包装出的慢病毒产量更高，比传统方法获得的总量要高出2-4倍。例如传统方法及包装试剂盒要包装出总量1E+8TU的活性慢病毒需要约4个10cm培养皿的细胞，而本发明仅仅需要1-2个相应培养皿的细胞量，不仅节省培养基、血清、培养皿等试剂耗材，而且节省了细胞培养扩增的时间，更重要的是病毒产量大大的提高了，更易浓缩出高滴度甚至超高滴度的慢病毒。使用该试剂盒包装出的慢病毒进行浓缩后，滴度区间为1E+9TU/mL-1E+10TU/mL，甚至能够超过1E+10TU/mL，比市面上的滴度要高出一个数量级。对于一些较难感染的原代细胞、神经细胞、心肌细胞等效果非常好，并且对于一些动物组织的感染效果可以媲美腺相关病毒。

本试剂盒内使用的慢病毒对照载体，包含强荧光和药物筛选抗性，更便于稳转株构建和筛选。针对慢病毒、稳转株特性构建改良了慢病毒载体，该载体在慢病毒包装24小时显微镜下即可看到强荧光，48小时可肉眼看到明显的荧光，如绿色荧光和红色荧光，可用来经验性判断病毒滴度及产量。使用该载体包装的慢病毒感染细胞后，显微镜下24小时即可开始判断病毒感染效率，甚至在没有荧光显微镜的条件下也可根据肉眼观察荧光强度判断感染效率，给科研人员带来更多的操作便利、节省更多宝贵的时间。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。