辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法

摘要

本发明属于色谱检测技术领域，公开了一种辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法，包括标准品的配制、样品的前处理、高效液相检测以及后续的计算分析过程，其中标准品配制过程中不同组分采用不一样的标准品配制浓度，样品前处理过程根据不同时期的辣椒果实采取不同的处理方法，能够很好的分离不同发育阶段辣椒果实中的7种类胡萝卜素组分，分离后各组分的含量均较高，为辣椒果实类胡萝卜素各组分的测定提供了较准确高效的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及色谱检测技术领域，更具体的说是涉及一种辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法。

背景技术

辣椒亦称番椒、茄椒或海椒，原产中南美洲、墨西哥、秘鲁等地，是茄科辣椒属一年生蔬菜，其果实颜色因种类而异，大部分品种果实成熟过程中颜色从绿色、乳白色转变为棕色、黄色、橙色、红色等，果实主要以类胡萝卜素为主。类胡萝卜素具有重要的保健及经济价值：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、γ-胡萝卜素和β-隐黄质作为膳食可直接为人提供维生素A，番茄红素可预防心血管疾病和前列腺癌，玉米黄质和叶黄素可以降低黄斑病变风险，此外，成熟辣椒果实所含的辣椒红素和辣椒玉红素作为自然源的食品添加剂和增色剂，被广泛应用于食品和化妆品行业。

新疆凭借其独特的自然气候条件和红色产业政策的扶植，已成为全国最大的制干辣椒生产基地。色价和辣度是新疆制干辣椒最重要的商品性状，其中辣度的测定方法已十分成熟，但类胡萝卜素有700多种同分异构体，因此类胡萝卜素各组分的测定难度较大，且类胡萝卜素的组分及含量对辣椒果实颜色形成起着决定作用。

目前辣椒中已分离出50多种类胡萝卜素，已鉴别出30多种，类胡萝卜素组分的测定主要以液相色谱为主，原材料的处理和液相条件不同，分离出的组分差别较大。现有技术中类胡萝卜素的测定主要有以下几种方法：一是以二氯甲烷-乙醇(体积比为1:1)为提取溶剂，流动相A为甲醇-乙腈(V甲醇:V乙腈＝55:45)，B为100％甲基叔丁基醚，以VA:VB＝90:10匀速洗脱，此方法能较好地鉴定辣椒果实中的叶黄素、辣椒红素、β-胡萝卜素等组分，但是分离出的类胡萝卜素组分较少；二是以石油醚为提取溶剂，KOH皂化，甲醇-乙腈为流动相，该方法能分离辣椒叶片中的叶黄素、玉米黄素、β-胡萝卜素；第三种是以丙酮和乙酸乙酯为提取液，KOH皂化，流动相A为乙腈，B为水，C为甲基叔丁基醚(MTBE)和甲醇，D为乙酸乙酯，此法能够分离辣椒叶片中的新黄质、紫黄质、玉米黄素、叶黄素、番茄红素、八氢番茄红素、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素等。由上可知，辣椒叶片的类胡萝卜素组分测定较成熟，但果实中类胡萝卜素组分的分离及测定方法尚不完善，效率较低。

因此，如何提供一种辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法，本发明提供的方法能够同时提取7种类胡萝卜素，并能通过高效液相色谱法将7种组分准确定量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法，包括以下步骤：

(1)标准品的配制：β-胡萝卜素、叶黄素标准品采用甲醇和MTBE的混合溶液稀释成50、100、150、200、250ug/ml浓度梯度的混合标液，α-胡萝卜素、新黄质、紫黄质、玉米黄素、辣椒红素采用甲醇和MTBE的混合溶液稀释成0.625、1.25、2.5、5、10ug/ml浓度梯度的单标，备用；

(2)样品的前处理：将新鲜辣椒果实样品在液氮中研磨成匀浆，依次用氯仿-二氯甲烷混合提取溶剂、氯化钠溶液离心提取，收集有机相，用氮气吹干，得到辣椒果实干粉样品，备用；

(3)将步骤(1)配制的标准品溶液进行HPLC检测，得到各标准品溶液对应的高效液相色谱图，分别对各个标准品按照其浓度和峰面积，绘制标准曲线，得到各个标准品的线性回归方程；

(4)将步骤(2)得到的辣椒果实干粉样品溶解于甲醇和MTBE的混合溶液中，进行HPLC检测，得到辣椒果实待测样品的色谱图，根据待测样品的色谱图，对应标准品的线性回归方程，计算待测样品溶液中不同类胡萝卜素的含量；

其中，HPLC检测过程的液相条件如下：

色谱柱：C30高效液相色谱柱；

流动相：A相是体积比为98：2的甲醇和水混合液，B相是体积比为95：5的甲醇和水混合液，C相是甲基叔丁基醚；此流动相可以清楚的分辨出叶黄素和叶绿素b的峰，并且不需要繁琐的皂化过程，就可以分离出这些组分；

流动相的流速为1.0ml/min，柱温为20℃，检测波长为450nm；

流动相洗脱方式为线性梯度洗脱，流动相组分为色谱级。

在试验过程中，对α-胡萝卜素、新黄质、紫黄质、玉米黄素、辣椒红素尝试采用甲醇和MTBE的混合溶液稀释成50、100、150、200、250ug/ml的混标，但由于所测辣椒果实样品中的类胡萝卜素组分含量过低，无法计算其含量，也不符合标品配制原则，一般所测辣椒样品的含量在标准品的最小值和最大值之间。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，步骤(2)中所述离心提取具体为：

A.将研磨成匀浆的辣椒果实转移至离心管中，加入氯仿-二氯甲烷混合提取溶剂，在4-25℃，1000-4000rpm条件下离心20-25min，取出后加入氯化钠溶液摇匀，在4-25℃，4000-5000rpm条件下离心5-10min，收集上层有机相；

B.在下层溶液中加入氯仿-二氯甲烷混合提取溶剂，在4-25℃，1000-4000rpm条件下离心10-25min，再次收集有机相，两次有机相合并。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，所述混合提取溶剂中氯仿和二氯甲烷的体积比为2:1。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，步骤A中所述辣椒果实样品与所述混合提取溶剂的比值为1g：(3-8)mL，进一步优选为1g：7.5mL。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，步骤A中所述混合提取溶剂、所述氯化钠溶液的体积比为3:1，且所述氯化钠溶液的浓度为1M/L。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，步骤B中所述混合提取溶剂的添加量与辣椒果实样品的比值为(1-4)mL:1g，进一步优选为3.75mL：1g。

上述技术方案的有益效果是：在以上物质配比的情况下，每个类胡萝卜素的组分都可以很好的被分离。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，当辣椒果实样品为绿果期时，步骤(4)中将辣椒果实干粉样品溶解于体积比为60:40的甲醇和MTBE的混合溶液中；当辣椒果实样品为转色期和红熟期时，步骤(4)中将辣椒果实干粉样品溶解于体积比为25:75的甲醇和MTBE的混合溶液中。

上述技术方案的有益效果是：由于转色期和红果期的辣椒果实富含更多的辣椒红素，因此需要更多的MTBE完全溶解辣椒红素。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，辣椒果实样品的测定如需隔日测定，则必须保存于低温冰箱，且测定前应恢复至室温。

上述技术方案的有益效果是：由于类胡萝卜素对光、温、氧都较为敏感，因此样品的测定应在当日完成，如需隔日测定辣椒果实样品必须在低温冰箱遮光保存；从低温环境中取出的待测样品应恢复至室温再测定，防止因温度过低而造成色素浓度的改变。

优选的，在上述辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法中，所述色谱柱为YSL-301205-2546ECOSIL C30，规格为250×4.6mm，填料直径为5um。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种辣椒果实中类胡萝卜素组分的提取及含量测定方法，具有以下优势：

(1)本发明的提取方法能够同时分离辣椒果实中的7种类胡萝卜素组分，而现有的主流方法主要针对辣椒叶片或只能提取2-4种果实类胡萝卜素，本发明提供的方法更科学高效；

(2)本发明提供的方法中标准品采用了混标和单标两种方法，混标和单标的色谱图均反应出一致的出峰时间，说明本发明中类胡萝卜素各组分测定方法的准确性较高；

(3)本发明提供的方法中标样液相峰图杂峰少且面积小，对结果的影响极小，说明本发明提供的标样配制方法及液相条件科学准确；液相峰图表明7种组分峰图无重叠交叉，各组分峰值较高且出峰时间界限清晰分明，既能定性区分各组分又能准确的定量计算组分含量；而且本发明中7种类胡萝卜素标准品的相关系数均在0.99以上，进一步说明本发明液相参数设置的合理性和科学性；

(4)本发明中辣椒绿果期、转色期、红熟期的液相峰图各组分出峰时间与标准品出峰时间一致性高，杂峰小，类胡萝卜素各组分峰值显著高于杂峰，说明本发明中对辣椒果实处理及色素浸提试剂的种类和浓度确定科学准确。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明类胡萝卜素7种混合标准样品高效液相色谱图；

图2为本发明辣椒果实中新黄质高效液相色谱单标图；

图3为本发明辣椒果实中紫黄质高效液相色谱单标图；

图4为本发明辣椒果实中辣椒红素高效液相色谱单标图；

图5为本发明辣椒果实中叶黄素高效液相色谱单标图；

图6为本发明辣椒果实中玉米黄素高效液相色谱单标图；

图7为本发明辣椒果实中α-类胡萝卜素高效液相色谱单标图；

图8为本发明辣椒果实中β-类胡萝卜素高效液相色谱单标图；

图9为本发明辣椒中7种类胡萝卜素标准品的混标拟合曲线。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

(1)标准品的配制：根据7种类胡萝卜素标准品的目标物质含量，β-胡萝卜素、叶黄素标准品用甲醇：MTBE(体积比60:40)的混合液稀释成50、100、150、200、250ug/ml浓度梯度的混合标液，α-胡萝卜素、新黄质、紫黄质、玉米黄素、辣椒红素标准品用甲醇：MTBE(体积比60:40)的混合液稀释成0.625、1.25、2.5、5、10ug/ml浓度梯度的单标溶液，标准品溶液按照下述色谱条件检测。

以标准溶液中7种类胡萝卜素组分的含量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线(图9)，建立液相峰图和组分含量的关系式，得到7种类胡萝卜素混标的标准曲线拟合方程，参见表1。

表1 7种类胡萝卜素混标的标准曲线拟合方程

需要说明的是：对α-胡萝卜素、新黄质、紫黄质、玉米黄素也尝试采用甲醇和MTBE的混合溶液稀释成50、100、150、200、250ug/ml的混标，但由于所测辣椒果实样品中的类胡萝卜素组分含量过低，无法计算其含量，也不符合标品配制原则，一般所测辣椒样品的含量在标准品的最小值和最大值之间。因此α-胡萝卜素、新黄质、紫黄质、玉米黄素采用0.625、1.25、2.5、5、10ug/ml的混标，辣椒红素与叶黄素出峰时间接近，而辣椒红素是辣椒果实中比较重要的组分，因此采用0.625、1.25、2.5、5、10ug/ml的单标。

(2)样品的处理及类胡萝卜素提取：取辣椒果实鲜样0.2g，加入少量液氮研磨成匀浆，转移至2mL离心管中，加入1.5mL氯仿：二氯甲烷(体积比2:1)的混合液，在4℃，1000rpm条件下离心20min，取出后加入0.5mL的1M/L的氯化钠溶液摇匀，在4℃，5000rpm条件下离心10min，收集上层有机相。在下层溶液中再加入0.75mL氯仿：二氯甲烷(体积比2:1)的混合液，在4℃，1000rpm条件下离心10min，再次收集有机相。两次有机相合并，用氮气吹至近干。绿果样品溶解于1mL甲醇：甲基叔丁基醚(MTBE)(体积比60:40)的混合液中，转色期和红熟期果实溶解于1mL甲醇：甲基叔丁基醚(MTBE)(体积比25:75)的混合液中，过0.22μm有机滤膜，滤液盛装在棕色进样瓶中进行HPLC检测，得到辣椒果实待测样品的色谱图。

(3)根据待测样品的色谱图，对应标准品的线性回归方程，计算待测样品溶液中不同类胡萝卜素的含量，下表为本发明针对色素椒不同果实期测得的类胡萝卜素含量，但需要说明的是，本发明限定的方法还可以应用于其他辣椒品种中类胡萝卜素的测定。

表2 不同果实期类胡萝卜素含量(ug/ml)

其中，HPLC检测过程的液相条件如下：

色谱柱为类胡萝卜专用柱YSL-301205-2546 ECOSIL C30，规格为250×4.6mm，填料直径为5um；

流动相：A相是体积比为98：2的甲醇和水混合液，B相是体积比为95：5的甲醇和水混合液，C相是甲基叔丁基醚；

流动相的流速为1.0ml/min，柱温为20℃，检测波长为450nm；

流动相洗脱方式为线性梯度洗脱，流动相组分为色谱级。

其中，流动相线性洗脱程序如下表3所示：

表3 辣椒果实类胡萝卜素组分梯度洗脱条件

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的方案而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。