缺乏免疫球蛋白FC结构域结合亲和力的新三螺旋多肽及其用途

摘要

本发明涉及蛋白质工程和纯化领域，并且具体而言涉及具有三螺旋结构并对免疫球蛋白Fc结构域缺乏结合亲和力的新多肽。本发明还涉及新非Fc结合多肽在技术应用如亲和层析中以及在治疗和诊断中的用途。另外，本发明涉及降低具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质工程和纯化领域，并且具体而言涉及具有三螺旋结构并对免疫球蛋白的Fc结构域缺乏结合亲和力的新多肽。本发明进一步涉及新的非Fc结合多肽在技术应用如亲和层析中以及在治疗和诊断中的用途。另外，本发明涉及降低具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法。

背景技术

重组产生的多肽的下游加工通常涉及在宿主细胞中表达的多肽的纯化。该纯化过程通常包括一个或多个层析步骤，而亲和层析法通常用作捕获步骤。虽然亲和层析法是一种简单而稳健的方法，可以一步获得纯净而浓缩的产品，但仍需要先进的工具，以容许进行有效的靶向性蛋白纯化以及开发适用于技术应用如亲和层析法或用于治疗和诊断的新分子。

本发明通过提供具有三螺旋结构并对免疫球蛋白Fc结构域缺乏结合亲和力的新多肽而满足该需求。这些新多肽是特别有利的，因为它们借助Fc非依赖性(Fc独立性，Fc-independent)的蛋白纯化，容许在亲和层析中进行精确捕获。此外，对免疫球蛋白的Fc结构域缺乏结合亲和力的新三螺旋多肽使得能够产生文库，所述文库允许识别出高度选择性的靶特异性分子，其不仅适用于技术应用，而且适用于治疗和诊断。该综述仅是示例性的，而因此不一定描述本发明解决的所有问题。

发明内容

本公开提供以下项1-15，但并非具体限于此：

1.一种具有三螺旋结构的多肽，其中螺旋1、2和3就其位置而言分别对应于SEQ IDNO:1的7-19、23-37和40-56，并且其中该多肽包含：

a)在与SEQ ID NO:1的位置13对应的位置上选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的酸性氨基酸；和

b)在与SEQ ID NO:1的位置31对应的位置上选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)中任一种的碱性氨基酸。

2.根据第1项的具有三螺旋结构的多肽，其中该多肽对免疫球蛋白Fc结构域具有不可检出的结合亲和力，这通过表面等离子体共振(SPR)进行测定。

3.根据第1或2项的具有三螺旋结构的多肽，其中该多肽包含

a)在与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的天冬氨酸(D)；和/或

b)在与SEQ ID NO:1的位置31相对应的位置上的精氨酸(R)。

4.根据第1-3项中任一项的具有三螺旋结构的多肽，其在与SEQ ID NO:1的位置10、14和35相对应的一个或多个位置上进一步包含丝氨酸(S)。

5.一种融合蛋白，其包含第1-4项中任一项的多肽。

6.一种生成根据第1-4项中任一项的具有对靶蛋白的结合亲和力的、具有三螺旋结构的多肽的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供根据第1-4项中任一项的一种或多种多肽；

b)使a)的一种或多种多肽与靶蛋白接触；

c)识别包含与靶蛋白结合的根据第1-4项中任一项的多肽的复合物；

d)获得能够与靶蛋白结合的第1-4项中任一项的多肽。

7.一种组合物，其包含根据第1-4项任一项的多肽，或根据第5项的融合蛋白，或通过第6项的方法获得的对靶蛋白具有结合亲和力的多肽。

8.根据第1-4项中任一项的多肽，或根据第5项的融合蛋白，或通过第6项的方法获得的对靶蛋白具有结合亲和力的多肽，用于在技术应用中使用。

9.根据第1-4项中任一项的多肽，或根据第5项的融合蛋白，或通过第6项的方法获得的与靶蛋白具有结合亲和力的多肽，用于在亲和层析中使用。

10.根据第1-4项任一项的多肽，或根据第5项的融合蛋白，或通过第6项的方法获得的靶蛋白具有结合亲和力的多肽，或根据第7项的组合物，用于在药物、诊断剂和/或预后剂中使用。

11.一种降低具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法，该方法包括：

a)选择螺旋1和螺旋2内的至少两个氨基酸位置进行突变，其中螺旋1和2分别对应于SEQ ID NO:1的位置7-19和23-37，并且其中至少两个用于突变的氨基酸位置对应于SEQID NO:1的氨基酸序列中的位置13和31；和

b)使选择用于突变的至少两个氨基酸位置进行突变，其中突变包括与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的氨基酸被选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的酸性氨基酸取代，和与SEQ ID NO:1的位置31相对应的位置上的氨基酸被选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)中任一种的碱性氨基酸取代。

12.第11项的方法，其中突变包括与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸(D)取代，和与SEQ ID NO:1的位置31相对应的位置上的氨基酸被精氨酸(R)取代。

13.第11项或第12项的方法，其中突变还包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中与位置10、14和35相对应的位置上的氨基酸中的一个或多个被丝氨酸(S)取代。

14.一种具有三螺旋结构的多肽，其通过第6项和11-13项中任一项的方法可获得或获得，或根据其制备。

15.一种多核苷酸，其编码根据第1-4项和第14项中任一项的多肽或根据第5项的融合蛋白。

本发明的内容并非限制性的，并且根据以下描述、实施例和附图，本发明的其他方面和实施方式将变得显而易见。

附图说明

图1：显示了对免疫球蛋白Fc区、特别是IgG

图2：显示了与SEQ ID NO:16(实线)的Fc结合蛋白相比，SEQ ID NO:1、2、3、5、7(点虚线)的多肽对免疫球蛋白Fc区、特别是IgG

图3：显示了与Ig结合蛋白SEQ ID NO:16或野生型蛋白A结构域C或结构域A或结构域Z相比，SEQ ID NO:1、2、3、5、7(点虚线)的多肽对免疫球蛋白Fc区、特别是IgG

图4：显示了亲和层析后，与具有特异性靶标结合特性(BP)的蛋白A衍生物融合的SEQ ID NO:1(非Fc结合蛋白)的融合蛋白的改善定量。结合蛋白或融合蛋白的回收率根据制造商的说明书通过夹心免疫分析法(sandwich immunoassay)进行定量。BP1，具有Cys和His10的结合蛋白1；BP2，具有Cys和His10的结合蛋白2；BP3，具有Cys和His10的结合蛋白2；融合蛋白1，融合蛋白SEQ ID NO:1-BP2-SEQ ID NO:1；融合蛋白2，融合蛋白SEQ ID NO:1-BP1；融合蛋白3，融合蛋白BP1-SEQ ID NO:1，融合蛋白4，融合蛋白SEQ ID NO:1-BP3；融合蛋白5，融合蛋白BP3-SEQ ID NO:1。回收率显示了所测得的信号与内标的关系。

具体实施方式

本发明提供了具有三螺旋结构的新多肽，其具有通过例如表面等离振子共振(SPR)确定的对免疫球蛋白Fc结构域的不可检出的结合亲和力。本发明的多肽代表了先进而强效的工具，填补了蛋白工程和纯化领域的空白。具体而言，由于对免疫球蛋白Fc区的结合亲和力改变，新多肽在蛋白纯化中提供了有利的作用。具体而言，与已知的Ig结合蛋白相比，本发明提供的新多肽容许Fc融合蛋白或抗体本身能够用作靶蛋白而不受Fc结构域的干扰。因此，本发明的型多肽是特别有利的，因为由于靶蛋白的Fc非依赖性的纯化，它们允许在亲和层析法中精确捕获。当具有三螺旋结构的多肽在螺旋1中在对应于SEQ ID NO:1的位置13的位置上包含选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的酸性氨基酸，并且在螺旋2中在对应于SEQ ID NO:1的位置31的位置上包含选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)中任一种的碱性氨基酸时，能够实现对免疫球蛋白的Fc结构域缺乏可检出的结合亲和力(由SPR确定)，其中螺旋1、2和3就其位置而言分别对应于SEQ ID NO:1的位置7-19、23-37和40-56。

本发明的新多肽不仅提供了特别有效的靶向性蛋白质纯化，而且还允许基于用于文库设计的新概念识别出新的有价值的分子。具体而言，具有三螺旋结构的新非Fc结合多肽使得能够产生文库，所述文库允许识别出高度选择性的靶标特异性分子，其不仅可以用于技术应用，而且可用于治疗和诊断。本发明的非Fc结合多肽允许新的文库设计，其基于本发明人识别出的特定氨基酸取代，并且显然提供了广泛的实验选择，并且能够提高设计用于识别出结合蛋白的选择策略的成功率。例如，通过合适的方法如SPR确定的具有不可检出的Fc结合亲和力的文库架能够在选择和筛选方法中应用针对与Fc结构域融合的靶蛋白的此类文库，而针对该Fc部分的假阳性命中率更低。实际上，这允许产生更广泛的新靶标特异性结合分子集，其中每个都进一步以改变的靶标特异性为特征，但仍然特别的是具有通过合适的方法如SPR测定的不可检出的Fc结合亲和力。

在下面更详细地描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限于本文描述的具体方法、方案和试剂，因为这些都可以变化。还应理解的是，本文所使用的术语仅出于描述特定方面和实施方式的目的，而并非旨在限制本发明的范围，这由所附权利要求反映。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。这包括蛋白工程和纯化领域内工作的技术人员，还包括开发适用于技术应用如亲和层析以及治疗和诊断的新靶标特异性结合分子领域内工作的技术人员。

优选的是，本文所用的术语如在“A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.and

在整个本申请和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”及其变体如“包含”和“含有”将被理解为暗示包括所述的整数或步骤，或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤，或整数或步骤的组。要是某种限制由于任何原因和在任何程度上是必需的，术语“包括”或“包含”可以涵盖对“由...组成”或“由...构成”的这种限制。

在整个本申请书中，可能会引述一些文献(例如：专利、专利申请、科学出版物、制造商规格、说明书、GenBank登记号序列提交文件等)。本文中的任何内容均不应该解释为承认本发明无权凭借先前的发明而早于这种公开。本文引用的某些文献的特征可能是“通过引用而引入”。在这种引入的参考文献的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间发生冲突的情况下，以本申请的文本为准。

本文所指的所有序列在所附序列表中公开，该序列表以其全部内容和公开内容一起都构成本申请的公开内容的部分。

本申请中使用的重要术语的一般定义

术语“蛋白”和“多肽”是指通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的任何链，并非是指产物的特定长度。因此，“肽”、“蛋白”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的链的任何其他术语，包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替任何这些术语使用，也可以与其互换使用。术语“多肽”还旨在指代多肽的翻译后修饰的产物如，例如，糖基化的产物，其在本领域中是公知的。

术语“三螺旋形结构”或“三螺旋结构”是指具有三螺旋束的多肽，其中该多肽包含至少48个氨基酸，优选至少50个氨基酸，更优选至少58个氨基酸，而更加优选58个氨基酸，其中螺旋1包含氨基酸残基7-19，螺旋2包含氨基酸残基23-37，而螺旋3包含氨基酸残基40-56。具体而言，螺旋1、2和3就其位置而言，基本上分别对应于SEQ ID NO:1的位置7-19、23-37和40-56。在各个实施方式中，具有三螺旋结构的多肽由56、57或58个氨基酸组成，优选由58个氨基酸组成。

因此，本发明提供的多肽包含三个螺旋，其中螺旋1、螺旋2和螺旋3相对于SEQ IDNO:1的序列中的氨基酸位置包含以下氨基酸位置：螺旋1：基本上对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的7-19位置的氨基酸位置；螺旋2：基本上对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的23-37位置的氨基酸位置；螺旋3：基本上对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的40-56位置的氨基酸位置。本文进一步公开了本发明提供的具有三螺旋结构的多肽的实施方式，其中螺旋1相对于其位置而言基本上对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的6-19位置；螺旋2就其位置而言基本上对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的位置23-37；螺旋3就其位置而言基本上对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的40-56位。

正如本文所公开，根据本发明的具有三螺旋结构的多肽可以描述为具有三螺旋结构的折叠多肽。正如本文进一步公开，可以将根据本发明的具有三螺旋结构的多肽描述为折叠成三螺旋束结构的多肽。

术语“群”和“文库”在本文可以互换使用。文库可以是多肽或多核苷酸的群。换句话说，文库可以采取群或混合物或多种多肽或核酸分子(多核苷酸)的形式。文库可以是变体的集合。

术语“修饰”或“氨基酸修饰”是指氨基酸在多肽序列中特定位置的取代、缺失或插入，其中取代意指被另一种氨基酸取代。给定已知的遗传密码，以及重组和合成DNA技术，本领域普通技术人员可以很容易构建编码这种氨基酸变体的DNA。

正如本文所用，术语“变体”或“衍生物”包括通过至少一个氨基酸取代、缺失或插入而与另一氨基酸序列不同的氨基酸序列。根据本发明的术语“变体”可以是，例如与SEQID NO:1相比，基于SEQ ID NO:1具有最多20个氨基酸被取代的多肽。根据本发明的变体的特征在于本文其它地方所定义的三螺旋基序。在一些实施方式中，SEQ ID NO:1的多肽的变体可以涵盖相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，在N端至多6个氨基酸残基的缺失，和/或在C端至多4个氨基酸残基的缺失。

术语“Fc区”和“Fc结构域”在本文可以互换使用。Fc区是免疫球蛋白、特别是例如与称为Fc受体的细胞表面受体相互作用的抗体的尾区。因此，Fc区或Fc结构域是指免疫球蛋白、特别是抗体的Fc区或Fc结构域。在各个实施方式中，Fc区来自哺乳动物IgG(抗体)，包括人IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、山羊IgG、牛IgG、豚鼠IgG和兔IgG。Fc区也可以来自人IgM或人IgA。在各个实施方式中，Fc区来自人IgG(抗体)，例如，来自人IgG

正如本文所用，术语“靶”或“靶蛋白”是指具有被特异性结合蛋白识别的抗原或表位的蛋白或肽或其片段等。正如本文所述，“Fc结合”可以被认为是指与大多数IgG具有高选择性和亲和力的Fc区的相互作用。结合位点位于称为位于Fc区的CH2和CH3结构域之间的铰链区上共有结合位点的保守区域中。

正如本文所述，“非Fc结合多肽”是指不具有Fc结合的多肽，即，与IgG的Fc区具有通过下文所述的合适方法如通过SPR分析而确定的不可检出的相互作用的多肽。

术语“结合亲和力”和“结合活性”在本文中可以互换使用，并且它们是指本发明的多肽结合另一种蛋白、肽或其片段或结构域的能力。结合亲和力通常通过平衡解离常数(K

术语“融合蛋白”涉及包含至少一种与至少第二蛋白遗传连接的第一蛋白的蛋白。融合蛋白是通过将两个或更多个最初编码为单独蛋白的基因连接起来而产生的。因此，融合蛋白可以包含表达为单个线性多肽的相同或不同蛋白的多聚体。

正如本文所用，术语“连接子”以其最广泛的含义是指共价连接至少两个其他分子的分子。

术语“氨基酸序列同一性”是指两种或更多种蛋白质的氨基酸序列的同一性(或差异性)的定量比较。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列并引入空位(gap)(如果必要)以实现最大序列同一性百分比之后，该序列中的氨基酸残基与参考多肽序列中氨基酸残基相同的百分数。为了确定序列同一性，要将查询蛋白的序列与参考蛋白或多肽的序列，例如与SEQ ID NO:1的多肽进行比对。用于序列比对的方法在本领域内是公知的。例如，为了确定相对于如SEQ ID NO:1的氨基酸序列的任意多肽的氨基酸序列同一性的程度，优选使用SIM局部相似性程序(SIM Local similarity program)(Huang and Webb Miller(1991),Advances in Applied Mathematics,12:337-357)，可免费获得。对于多重比对分析，能够使用ClustalW(Thompson et al.(1994)Nucleic AcidsRes.,22:4673-4680)。

本发明实施方式的详细描述

本发明的新多肽对免疫球蛋白的Fc结构域表现出如通过SPR确定的不可检出的结合亲和力。当具有三螺旋结构的多肽在螺旋1中在与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上包含选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的酸性氨基酸，并且在螺旋2中在与SEQ ID NO:1的位置31相对应的位置上包含选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)中任一种的碱性氨基酸时，能够实现对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的这种缺乏，其中螺旋1、2和3相对于它们的位置则分别基本上对应于SEQ ID NO:1的7-19、23-37和40-56的位置。下表1显示了缺乏可检出的免疫球蛋白Fc结合的三螺旋多肽实例。

表1.非Fc结合蛋白(PAdelFc)的氨基酸序列SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、23、24、25、26、27、28、29、30。位置13和31以粗体显示。

下表2总结了导致无Fc结合的三螺旋多肽中的特定氨基酸。位置10、13、14、31和35对应于SEQ ID NO:1中的位置。D＝天冬氨酸，R＝精氨酸，S＝丝氨酸。

因此，本发明提供了一种非Fc结合多肽，其中该多肽在与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上包含选自天冬氨酸和谷氨酸的酸性氨基酸，而在与SEQ ID NO:1的31位相对应的位置上包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸中任一种的碱性氨基酸。

位置10、14、35上的特定氨基酸的结构表征。在本发明的各个实施方式中，正如本文所公开的非Fc结合多肽在结构上进一步的特征在于：在各个实施方式SEQ ID NO:1中，它在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10、14和/或35相对应的一个或多个位置上包含一个具有极性侧链的氨基酸残基，优先选自丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、组氨酸(H)。在各个实施方式中，该多肽在结构上进一步的特征在于：在各个实施方式SEQ ID NO:1中，它在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10或14或35，或位置10和14，或位置10和35，或位置14和35，或位置10、14和35相对应的位置上包含一个具有极性侧链的氨基酸残基。优选地，本文所公开的非Fc结合多肽在结构上进一步的特征在于，在各个实施方式SEQ ID NO:1中，它在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10、14和35相对应的一个或多个位置上包含丝氨酸。在一些实施方式中，本文公开的非Fc结合多肽在结构上进一步的特征在于，除了在各种实施方式SEQ ID NO:1中在SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的酸性氨基酸以及在各个实施方式SEQ ID NO:1中在SEQ IDNO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的碱性氨基酸之外，在各个实施方式SEQID NO:1中，它在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10、14和35相对应的所有位置上都包含丝氨酸。

变体。本文还公开了一种多肽，其在各种实施方式SEQ ID NO:1中具有与SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、23、24、25、26、27、28、29、30中任一个的氨基序列具有至少70％序列同一性，其中该多肽包含：在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在SEQID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的选自天冬氨酸和谷氨酸的酸性氨基酸；和在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸中任一种的碱性氨基酸，并且条件是该多肽对IgG Fc具有通过例如SPR测定的不可检出的结合活性。

在各个优选的实施方式中，本发明通过在各个实施方式SEQ ID NO:1中定义为具有与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、23、24、25、26、27、28、29、30中任一个的氨基序列至少70％的序列同一性的任何非Fc结合多肽，在各个实施方式SEQ ID NO:1中可以具有与SEQ ID NO:1-15和23-30中任一个的氨基酸序列至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％的序列同一性。在进一步的实施方式中，在各种实施方式SEQ ID NO:1中该非Fc结合多肽具有与SEQ ID NO:1-15和23-30中任一个的氨基序列至少80％的序列同一性。在一些实施方式中，在各个实施方式SEQ ID NO:1中该非Fc结合多肽具有与SEQ ID NO:1-15和23-30中任一个的氨基序列至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％或88％的序列同一性。在优选的实施方式中，在各个实施方式SEQ ID NO:1中该非Fc结合多肽具有与SEQ ID NO:1-15和23-30中任一个的氨基序列至少89％的序列同一性。在其他实施方式中，在各个实施方式SEQ ID NO:1中该非Fc结合多肽具有与SEQ ID NO:1-15和23-30中任一个的氨基序列至少90％或95％的序列同一性。

SEQ ID NO:1-15和23-30的非Fc结合多肽的所有变体具有如本文其他地方所定义的三螺旋结构，具有位置13上的酸性氨基酸和位置31上的碱性氨基酸，并且对免疫球蛋白Fc结构域具有不可检出的结合亲和力，优选对免疫球蛋白Fc结构域具有通过如表面等离子体共振测定的不可检出的结合亲和力。

多聚体。在本发明的一个实施方式中，该非Fc结合蛋白包含彼此连接的1、2、3、4，优选1或2个非Fc结合蛋白，即，例如，该非Fc结合蛋白可以是单体、二聚体、三聚体或四聚体。本发明的多聚体是通常通过技术人员公知的重组DNA技术人工产生的融合蛋白。本文公开的非Fc结合蛋白可以通过许多常规的公知技术如纯有机合成策略、固相辅助合成技术或可商购的自动化合成仪中的任一个进行制备。在一些实施方式中，该多聚体是均多聚体，例如，非Fc结合蛋白的氨基酸序列是相同的。在其他实施方式中，该多聚体是杂多聚体，例如，非Fc结合蛋白的氨基酸序列是不同的。

融合蛋白。根据一个实施方式，本文提供了一种融合蛋白，其包含整个本申请内公开的非Fc结合多肽。根据一个实施方式，本文提供一种融合蛋白，其包含整个本申请内公开的一种或多种、例如两种非Fc结合多肽。更具体而言，该融合蛋白包含整个本申请中公开的一种或多种非Fc结合多肽，以及与本公开的多肽不同的另外的多肽。在各个实施方式中，与本文所公开的非Fc结合多肽不同的另外的多肽是靶结合蛋白，优选是对预定靶标具有结合亲和力的免疫球蛋白结合多肽或泛素突变蛋白(ubiquitin mutein)。靶标结合蛋白是具有结合预定靶标、优选蛋白质靶标的能力的多肽。因此，一些实施方式涵盖包含一种或两种如本文公开的非Fc结合多肽和免疫球蛋白结合多肽的融合蛋白。因此，其他实施方式涵盖包含一种或两种本文公开的非Fc结合多肽和对预定靶标具有亲和力的结合多肽的融合蛋白。因此，其他实施方式涵盖包含一种或两种本文公开的非Fc结合多肽和人血清蛋白泛素的衍生物，例如，泛素-基结合蛋白(泛素突变蛋白)，包括公知的

在一些实施方式中，例如，该融合蛋白可以包含以下组合(从N端到C端)：

(a)非Fc结合蛋白-靶结合蛋白；

(b)靶结合蛋白-非Fc结合蛋白；

(c)非Fc结合蛋白-靶结合蛋白-非Fc结合蛋白；

(d)非Fc结合蛋白-非Fc结合蛋白-靶结合蛋白；

(e)靶结合蛋白-非Fc结合蛋白-非Fc结合蛋白，和/或

(f)靶结合蛋白-非Fc结合蛋白-非Fc结合蛋白-靶结合蛋白。

在一些实施方式中，融合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:1-15、23-30的组中的非Fc结合蛋白，或与其具有至少90％同一性的非Fc结合蛋白。在一些优选的实施方式中，融合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的非Fc结合蛋白。在一些优选的实施方式中，融合蛋白可以包含选自SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的非Fc结合蛋白，或与其具有至少90％同一性的非Fc结合蛋白。

这种融合蛋白特别适用于蛋白A浸出分析测试法，以检测在亲和层析期间或之后浸出的蛋白A或蛋白A衍生物或其他免疫球蛋白结合蛋白。蛋白A或蛋白A衍生物或其他免疫球蛋白结合蛋白通过如实施例中所述的夹心免疫分析测试法进行定量。优选地，用于浸出分析测试法的融合蛋白包含一种或两种本文所述的非Fc结合多肽和Ig结合蛋白(优选蛋白A或衍生自蛋白A或人工Ig结合蛋白)。包含非Fc结合多肽的此类融合蛋白的部分不干扰Ig结合蛋白的功能。参见图4，其显示了蛋白A衍生物如果与至少一种非Fc结合蛋白融合而改善可检测性的实例。

融合蛋白可以适用于稳定基于蛋白A的Ig结合蛋白。例如，如果表达为在N端或C端包含非Fc结合多肽的融合蛋白，则蛋白质的表达得到改善。

此外，包含本文公开的至少一种非Fc结合多肽和Ig结合多肽的融合蛋白特别适合用于亲和层析法，因为与基质的距离受到有利的影响。

融合蛋白的各部分可以直接首尾互连，或可以通过连接子连接，其中所述连接子优选是肽连接子。在各种实施方式中，肽连接子可以被认为是在空间上分隔融合蛋白的两个部分的氨基酸序列。通常而言，此类连接子由1-10个氨基酸组成。

融合蛋白可以表征为通过将编码非Fc结合多肽的基因与编码不同于本文所述多肽的多肽的基因而基因融合或组合而形成的蛋白。因此，融合蛋白可以被认为是两个或更多个一起翻译的基因的产物(在它们之间没有终止密码子)。

文库。一些实施方式提供了新多肽群，其衍生自或基于SEQ ID NO:1-15、23-30中公开的单体非Fc结合蛋白中的任一个的支架序列，或由其定义，其构成了特定的优选文库的基础。基于本发明中公开的如此小的单体支架序列的文库的优点是高结构稳定性，而使得从此类文库中识别出的蛋白可以经受恶劣的条件。此外，这种蛋白的非Fc结合性质对于许多应用将是有利的。

一些实施方式提供了对免疫球蛋白的Fc结构域缺乏可检出的结合亲和力的多肽群，其特征在于具有三螺旋结构。优选的是，对免疫球蛋白的Fc结构域缺乏可检出的结合亲和力的多肽群与SEQ ID NO:1-15、23-30的氨基序列，例如，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:27的氨基序列具有70％-90％，优选70％-85％的序列同一性。例如，一些实施方式提供了包含基于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:27的支架的多个变体的文库。例如，本文提供的文库可以包含多肽的序列多样性，每个多肽可选地包含不同的氨基酸序列。文库成员之间的序列差异是造成文库中存在多样性的原因。随机修饰的核苷酸或氨基酸序列是在许多位置已被核苷酸或氨基酸取代、插入或缺失的核苷酸或氨基酸序列。

例如，这种文库包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:27的变体多肽，其具有在各个实施方式SEQ ID NO:1中与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的至少一个酸性氨基酸，和在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的碱性氨基酸，并且在各种实施方式SEQ ID NO:1中，进一步的特征可以在于，如本文别处所述，在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10、14和35的位置上的特定氨基酸残基。此外，在一些实施方式中，在各种实施方式SEQ ID NO:1中该文库包含SEQ ID NO:1-15、23-30中的任一个在三螺旋中每两个具有至少五个氨基酸取代，即，例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:27的至少10个氨基酸随机化而产生用于预选非Fc靶标的新相互作用位点的变体非Fc结合多肽。在各个实施方式SEQ ID NO:1中，本文公开的文库包含SEQ ID NO:1-15、23-30中的任一个，优选在螺旋3和螺旋1中或在螺旋3和螺旋2中具有氨基酸位置随机化的变体多肽。

因此，本发明的一些实施方式涉及基于非Fc结合蛋白的文库，非Fc结合蛋白如在各个实施方式SEQ ID NO:1中，SEQ ID NO:1-15、23-30中的任一个，或相应的三螺旋蛋白，其中该文库的化合物包含在三个螺旋的两个中具有10-16个随机化位置的以下三个非Fc结合蛋白之一：a)在选自螺旋2中位置25、26、28、29、30、32、33、35、36、37的位置上包含至少5个或更多个突变，以及在螺旋3中位置42、43、44、46、47、50、54的位置上包含至少5个或更多个突变；如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示，b)在选自螺旋1中的位置7、8、10、11、14、15、18、20的位置上包含至少5个或更多个突变，并且在选自螺旋3中的位置42、43、46、47、49、50、53、54的位置上包含5个或更多个突变；如SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34所示。螺旋1、螺旋2和螺旋3中所述位置的识别应该理解为在各个实施方式SEQ ID NO:1中，相对于SEQ IDNO:1-15、23-30中的任一个中的相应位置。在一些实施方式中，各取代可以是除C、G、N或P之外的任何氨基酸取代。这是因为半胱氨酸是反应性氨基酸，并且能够与其他含半胱氨酸多肽形成二硫醚键；已知甘氨酸和脯氨酸会破坏螺旋结构的稳定性；最后，天冬酰胺对苛性碱处理特别敏感，会导致降解。

在一些实施方式中，具有三螺旋结构的非Fc结合多肽包含SEQ ID NO:31、32、33或34中任一个的氨基酸序列，或由其组成。

产生文库的方法。除了本文其他地方描述的文库之外，本发明提供了产生此类文库的方法。作为文库合成的现有方法，有利的三重态技术(triplet Technology)(Morphosys Slonomics)能够合成具有例如20种天然氨基酸或氨基酸选择的分布的随机文库。假设20个天然氨基酸在例如7-16个位置上的随机分布，会产生SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2-15、23-30的多肽的20的7次幂(20

文库展示。该文库可以在核糖体、噬菌体、病毒、细菌或酵母细胞的表面上展示为与RNA的缀合物，优选展示于核糖体和噬菌体上，并针对各靶标进行反复的淘选(rounds ofpanning)。根据本发明的接触优选通过合适的呈递和选择方法进行，如噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示或细胞表面展示、酵母表面展示或细菌表面展示方法，优选借助于噬菌体展示方法或核糖体展示方法。本文提及的方法是本领域技术人员已知的。

在本文所述的噬菌体展示方案中，SEQ ID NO:1的重组变体或相应的非Fc结合支架氨基酸序列表达于丝状噬菌体上，而所表达的变体的编码DNA同时被包裹于噬菌体包膜中的单链形式内。因此，在亲和力富集的框架中，能够从文库中选择出具有某些特性的变异，并且通过感染合适的细菌能够扩增它们的遗传信息，或将其遗传信息分别添加到另一个富集循环中。SEQ ID NO:1的变体或相应的非Fc结合支架氨基酸序列在噬菌体表面上的呈现是通过与所述噬菌体的信号序列和衣壳或表面蛋白遗传融合而实现的。此外，所编码的蛋白能够包含其他功能元件，如亲和标签或抗体表位，用于通过亲和层析法检测和/或纯化，或用于在亲和力富集过程中特异性切割蛋白的蛋白酶识别序列。

从文库中选择的方法。在另一方面中，本发明涉及一种用于从包括SEQ ID NO:1的支架的变体或相应的非Fc结合支架氨基酸序列的变体的文库中进行选择的方法，一个或多个所述变体具有对靶蛋白或靶肽的特异性结合亲和力，所述方法包括以下步骤：a)提供包含SEQ ID NO:1的支架或相应的非Fc结合支架氨基酸序列的变体的文库；(b)在足以允许一种或多种SEQ ID NO:1的变体多肽或相应的非Fc结合支架氨基酸序列与靶蛋白或肽相互作用的条件和时间内使文库与靶蛋白或靶肽接触；和(c)从文库中选择(识别)出对靶蛋白具有范围为10

变体的选择程序。在分离SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列的情况下适合于选择程序并且所述融合蛋白的基因盒插入其中的细菌载体被称为噬菌粒。其中，它包含丝状噬菌体的基因间区域(例如，M13或f1)或其一部分，在通过辅助噬菌体对带有噬菌粒的细菌细胞进行超感染的情况下，这会导致噬菌粒DNA的共价封闭链包裹于噬菌体衣壳内。

针对通过本领域技术人员已知的方法将展示于其上的本文所公开的SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列的变体向任何靶标的结合，能够选择出所获得的噬菌体粒子。为此目的，可以将所呈现的SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列瞬时固定于靶标物质上，并且能够在分离非结合变体之后特异性地洗脱。以这种方式获得的噬菌体粒子能够通过具有与选定靶标的结合特性的SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列的连续选择和扩增循环而被重新扩增和富集。

将来自富集的噬菌体库的SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列的变体克隆到用于各个蛋白表达的表达载体中。优选本文公开的SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列的表达使得能够通过已确立的技术，例如，自动化高通量筛选平台上的ELISA，而筛选出特异性结合蛋白。然后可以对所识别出的具有所需结合特性的克隆体进行测序，以揭示所述氨基酸序列。所识别出的蛋白可以进行进一步的成熟步骤，例如，通过基于所识别出的序列的改变和如本文所述的重复噬菌体展示、核糖体展示、淘选和筛选步骤产生另外的文库。所表达的蛋白质能够与靶蛋白质接触而使伴侣彼此结合。该过程使得能够识别出对给定靶蛋白具有结合活性的那些蛋白。

本发明允许本领域技术人员富集SEQ ID NO:1的变体或相应非Fc结合支架氨基酸序列的选择集(库，repertoire)，所述集是功能性的，并能够结合给定靶标，但对于免疫球蛋白的Fc结构域却没有通过合适的方法如SPR测定的可检出的结合亲和力。

产生多肽的方法。本发明还提供了产生具有对预定靶蛋白的结合亲和力的本文公开的新非Fc结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供本文公开的多肽群；(ii)使(i)的多肽群与靶蛋白接触；(iii)识别出包含与靶蛋白结合的本文所公开的非Fc结合多肽的复合物；和(iv)获得能够与靶蛋白结合的本文公开的非Fc结合多肽。通过几个洗涤步骤，可以消除非特异性结合多肽。对靶蛋白具有特异性结合亲和力的蛋白与靶蛋白一起保留。从靶蛋白洗脱后，能够扩增多肽并使其与靶蛋白进行一轮或多轮接触。本公开涵盖了对通过上述方法获得或可获得的，或通过上述方法产生或制备的靶分子具有结合亲和力的此类非Fc结合多肽。

产生对靶分子具有结合亲和力的新非Fc结合多肽的方法可以包括在步骤(iii)之后和步骤(iv)之前，测定多肽与靶标蛋白的结合亲和力的另一步骤。结合亲和力可以如本文其他地方所述进行测定。

在各个实施方式SEQ ID NO:1中，一些实施方式涉及用于产生衍生自SEQ ID NO:1-15、23-30的非Fc结合蛋白的任一种的多肽的变体蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(i)使编码在每个螺旋3和螺旋2的至少5个选定位置上或在每个螺旋3和螺旋1中至少5个选定的位置上具有修饰的SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的多肽的氨基酸序列的核酸分子的核苷酸三联体进行诱变，(ii)获得一种或多种变体核酸分子，(iii)在合适的表达系统中表达在(ii)中获得的一种或多种变体核酸分子，和(iv)通过选择和/或分离而富集一种或多种变体蛋白。

该诱变考虑了根据本文其他地方描述的各方面和各实施方式的任何结构技术特征。

新多肽在技术应用中的用途。本文还提供了本发明的任何新多肽、包括对通过本文所述方法获得的靶蛋白具有结合亲和力的新多肽在技术应用中的用途，优选用于亲和层析法的用途。

正如本文所述，亲和层析法(也称为亲和纯化)利用分子之间的特异性结合相互作用。例如，包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、23、24、25、26、27、28、29、30的非Fc结合蛋白中的任一个和与其具有至少90％同一性的蛋白的融合蛋白能够如本文所述用于浸出分析测试法中。此外，如本文所述，SEQ ID NO:1-15、23-30的非Fc结合蛋白中的任一个和具有至少90％同一性的蛋白可以被固定为用于将蛋白结合至固体载体的间隔子。固定蛋白质的方法和用于亲和层析法的方法在蛋白质工程和纯化领域中是公知的，并且能够由本领域技术人员使用标准技术和设备容易进行。

在各个实施方式中，亲和纯化的方法可以还包括在足以从亲和分离基质中去除非特异性结合于其上的一些或全部分子的条件下进行的一个或多个洗涤步骤。适用于所公开的用途和方法的亲和分离基质是根据本文所述方面和实施方式并为本领域技术人员已知的那些基质。

与固体载体的缀合(结合，conjugation)。在本发明的各个方面和/或实施方式中，本文公开的新多肽、包括通过本文所述的任何方法产生或获得的新多肽缀合至固体载体上。在本发明的一些实施方式中，该多肽包含用于多肽与固相载体的位点特异性共价偶联的附连位点。特异性的附连位点包括但不限于天然氨基酸如半胱氨酸或赖氨酸，其使得能够与固相的反应性基团发生特异性化学反应；或固相与蛋白质之间的连接子。

在一些实施方式中，该非Fc结合蛋白还可以在N-和/或C-端包含另外的氨基酸残基，如例如，在N-和/或C-端上具有或没有标签的另外的序列。

亲和分离基质。在另一个实施方式中，提供了包含非Fc结合多肽的亲和分离基质，该非Fc结合多肽包括通过本文所述的任何方法识别出的多肽。在各种实施方式中，该亲和分离基质可以是亲和纯化基质。

在优选的实施方式中，该亲和分离基质是固体载体。亲和分离基质包含至少一种本发明提供的非Fc结合多肽。因此，本文公开的多肽的任何新非Fc结合蛋白均涵盖用于通过亲和(分离/纯化)基质的蛋白分离和/或纯化。

用于亲和层析的固体载体基质是本领域已知的，并且包括但不限于琼脂糖和琼脂糖的稳定化衍生物、纤维素或纤维素衍生物、受控孔玻璃、整料(monolith)、二氧化硅、氧化锆、氧化钛或合成聚合物以及各种组成的水凝胶。

固体载体基质的形式能够是任何合适的公知类型。例如，此类用于偶联本发明的新蛋白或多肽的固体载体基质可以包括以下之一，但不限于：柱、毛细管、颗粒、膜、滤料、整料、纤维、垫、凝胶、载玻片、层析板、暗盒或层析中常用的任何其他形式，以及本领域技术人员已知的任何形式。

在一个实施方式中，基质由基本上球形的颗粒组成，也称为珠粒，例如，交联琼脂糖或琼脂糖珠粒。颗粒形式的基质能够用作填充床或呈悬浮形式，包括膨胀床。在本发明的其他实施方式中，固体载体基质是膜，例如，水凝胶膜。在一些实施方式中，亲和纯化可以涉及将膜作为本发明的蛋白与之共价结合的基质。固体载体也可以是以筒中的膜的形式。

在一些实施方式中，亲和纯化涉及包含本发明的新蛋白与之共价结合的固相载体基质的层析柱。通过常规偶联技术，能够将本发明的新蛋白或多肽连接至合适的固体载体基质。蛋白配体固定于固体载体上的方法在蛋白质工程和纯化领域中是公知的，并且可以由本领域技术人员使用标准技术和设备很容易进行。

组合物。此外，本文提供了包含如本申请全文中所公开的非Fc结合多肽的组合物，该非Fc结合多肽包括通过本文所述的相应方法获得的对靶蛋白具有结合亲和力的新非Fc结合多肽。在各种实施方式中，此类组合物包含诊断或治疗有效剂量或含量的新非Fc结合多肽。待给药的蛋白的量尤其取决于待治疗的生物、疾病类型、患者年龄和体重以及其他因素。

在各种实施方式中，该组合物是包含非Fc结合多肽和诊断用载体的诊断组合物。在各个其他实施方式中，该组合物是包含非Fc结合多肽和药用载体的药物组合物。所述组合物可选地包含本领域普通技术人员已知的其他辅助剂和赋形剂。这些包括但不限于稳定剂、表面活性剂、盐、缓冲剂、着色剂等。

通过本领域已知的方法能够制备包含至少一种非Fc结合多肽的组合物。例如，药物制剂的类型可以取决于要治疗的疾病的具体类型、给药途径、疾病严重程度、要治疗的患者以及医学领域技术人员已知的其他因素。

本文还进一步提供了任何新非Fc结合多肽，包括对通过本文所述的相应方法获得的靶蛋白具有结合亲和力的新多肽，或本文所述的组合物作为药物、诊断剂和/或预后剂的用途。

降低具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法。本发明还提供了降低或减弱具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法，该方法包括：(a)选择螺旋1和螺旋2内的至少两个氨基酸位置用于突变，其中螺旋1和2就起位置而言分别对应于SEQ ID NO:1的7-19和23-37的位置，并且其中用于突变的所述至少两个氨基酸位置对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置13和31；(b)使选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置发生突变，其中突变包括将与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的氨基酸被选自天冬氨酸和谷氨酸的酸性氨基酸取代，和与SEQ ID NO:1的位置31相对应的位置上的氨基酸被选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸中任一种的碱性氨基酸取代。优选该突变包括在与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸取代，和在与SEQID NO:1的位置31相对应的位置上的氨基酸被精氨酸取代。

在本文描述的方法还有的其他优选实施方式中，所述突变可以还包括，在各个实施方式中SEQ ID NO:1中，在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10、14和35相对应的位置上的一个或多个氨基酸被任何氨基酸残基，优选具有极性侧链，更优选选自丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸，甚至更优选丝氨酸取代。本发明包括具有三螺旋结构的多肽，该多肽根据本文所述的降低或减弱具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白的Fc结构域的结合亲和力的方法进行制备。

在各个实施方式SEQ ID NO:1中，突变可以包括在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10和14，或位置10和35，或位置14和35，或位置10、14和35相对应的位置上的氨基酸被氨基酸残基，优选被具有极性侧链的氨基酸残基取代。

在各个实施方式SEQ ID NO:1中，优选该突变包括在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10、14和35相对应的位置上的一个或多个氨基酸被丝氨酸取代，更优选在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10、14和35相对应的位置，包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中，分别对应于SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10和14、10和35以及14和35的位置上的两个氨基酸取代。在特别优选的实施方式中，在各种实施方式SEQ ID NO:1中，该突变包括在与SEQ IDNO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10、14和35相对应的位置上的所有所述氨基酸被丝氨酸取代。

在其他优选的实施方式中，该突变包括在各种实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10、14和35相对应的位置上，更优选在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10、14和35相对应的两个位置上，包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中分别对应于SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10和14、10和35、14和35的位置上的一个或多个氨基酸被苏氨酸取代。

在特别优选的实施方式中，在各个实施方式SEQ ID NO:1中，该突变包括在与SEQID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中的位置10、14和35相对应的所有氨基酸被苏氨酸取代。正如本文所述，在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置10、14和35相对应的任何位置上，相对于苏氨酸残基，优选丝氨酸残基。

在本文描述的方法的各个实施方式中，该突变可以包括在各种实施方式SEQ IDNO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13的位置上的氨基酸被天冬氨酸取代，和在各种实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上被在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的选自精氨酸、赖氨酸和组氨酸中任一个的碱性氨基酸取代。该突变也可以包含在与SEQ ID NO:1的位置13相对应的位置上的氨基酸被谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被选自在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的精氨酸、赖氨酸和组氨酸中任一个的碱性氨基酸取代。

在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ IDNO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸或谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被精氨酸取代。在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸或谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ IDNO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被赖氨酸取代。在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ IDNO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸或谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被组氨酸取代。

在本文所述方法的进一步优选的实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被赖氨酸取代。在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被天冬氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被组氨酸取代。在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ IDNO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被精氨酸取代。在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被赖氨酸取代。在本文所述方法的其他优选实施方式中，该突变可以包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被谷氨酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被组氨酸取代。

本文描述的降低或减弱具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法包括降低或减弱具有三螺旋结构的多肽的结合亲和力，该具有三螺旋结构的多肽的特征还在于具有如本文其他地方的所述，在各个实施方式SEQ ID NO:1中与SEQ IDNO:1-15、23-30中任一个的氨基序列至少70％的序列同一性。这包括本文公开的SEQ IDNO:1-15、23-30的任何变体非Fc结合多肽，特别是在各个实施方式SEQ ID NO:1中具体特征在于与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的氨基序列具有一定序列同一性百分比的那些。因此，本发明包括一种降低或减弱具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法，该方法包括：在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的氨基酸序列中选择位置13和31；b)使选择用于突变的所述至少两个氨基酸位置进行突变，其中该突变包括，在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的氨基酸被选自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的酸性氨基酸取代，和在各个实施方式SEQ ID NO:1中，在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的氨基酸被选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)和组氨酸(H)中任一种的碱性氨基酸取代。

在各个实施方式中，通过本文公开的降低具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白Fc结构域的结合亲和力的方法产生、制备、获得或可获得的具有三螺旋结构的多肽对免疫球蛋白的Fc结构域具有通过合适方法如表面等离振子共振法测定的不可检出的结合亲和力。

优选的实施方式包括在各个实施方式SEQ ID NO:1中任何SEQ ID NO:1-15、23-30的变体多肽。一些实施方式包括具有三螺旋结构且在各个实施方式SEQ ID NO:1中与SEQID NO:1-15、23-30中任一个的氨基序列具有至少70％序列同一性的非Fc结合多肽，其中该多肽a)包含在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置13相对应的位置上的酸性氨基酸残基，优选天冬氨酸(D)残基；并且b)包含在各个实施方式SEQ ID NO:1中在与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置31相对应的位置上的碱性氨基酸残基，优选精氨酸(R)残基。优选的是，这种多肽在螺旋3中包含至少任何5、6、7或8个氨基酸取代，其中螺旋3包含在各种实施方式SEQ ID NO:1中对应于SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置40-56的氨基酸残基，优选选自对应于SEQ ID NO:1的位置42、43、44、46、47、49、50、51、53和54的位置的氨基酸残基。而且，这种蛋白包含在包含螺旋1的氨基酸残基的位置上的至少6、7或8个氨基酸取代并且第一残基直接毗邻于螺旋1，其中螺旋1包含在各种实施方式SEQ ID NO:1中对应于SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置7-19的氨基酸残基，优选选自对应于位置7、8、10、11、14、15、18和20的位置的氨基酸残基。在一些实施方式中，此类蛋白在螺旋3中包含至少5、6、7或8个氨基酸取代，其中螺旋3包含在各个实施方式SEQ IDNO:1中对应于SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置40-56的氨基酸残基，优选选自对应于SEQ ID NO:1的位置42、43、44、46、47、49、50、51、53和54的位置的氨基酸残基，和在包含螺旋2的氨基酸残基的位置上的至少任何5、6、7或8个氨基酸取代，其中螺旋2包含对应于在各种实施方式SEQ ID NO:1中与SEQ ID NO:1-15、23-30中任一个的位置23-37相对应的氨基酸残基，优选选自对应于位置24、25、26、27、28、29、30、32、33、35、36和37的位置的氨基酸残基。

多核苷酸、载体、宿主细胞。本文提供的一个实施方式涵盖编码本文公开的多肽的分离多核苷酸或核酸分子。另一个实施方式还涵盖由本文公开的多核苷酸编码的多肽。还提供了包含本发明的分离多核苷酸或核酸分子的载体，特别是表达载体，以及包含该分离多核苷酸或表达载体的宿主细胞。例如，在合适的宿主中可以表达编码本文公开的多肽的一种或多种多核苷酸，以及如此产生的蛋白，能够进行分离。载体是指能够用于将编码蛋白的信息转移到宿主细胞中的任何分子或实体(例如，核酸、质粒、噬菌体或病毒)。本发明能够使用的合适载体在本领域内是已知的。

此外，提供了包含多核苷酸或核酸或载体的经分离的细胞。合适的宿主细胞包括原核生物或真核生物，例如，宿主细胞或携带载体的非人宿主(细胞)。宿主细胞是已经被核酸序列转化或能够被核酸序列转化从而表达所关注的基因的细胞。合适的细菌表达宿主细胞或体系在本领域内是已知的。正如本领域已知的各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也能够用于表达重组蛋白。

产生本发明蛋白的方法。在一个进一步的实施方式中，提供了一种产生如上所述的非Fc结合多肽的方法，该方法包括以下步骤：(a)在适于表达非Fc结合多肽的条件下培养(合适的)宿主细胞，从而获得所述非Fc结合多肽；和(b)可选地分离所述非Fc结合多肽。培养原核或真核宿主的合适条件对于本领域技术人员是公知的。

非Fc结合多肽可以通过任何常规的和公知的技术，例如，普通有机合成策略、固相辅助合成技术或通过商业上可获得的自动化合成仪进行制备。它们也可以通过常规重组技术单独或与常规合成技术组合进行制备。

在一个实施方式中，提供了一种制备非Fc结合多肽的方法，如本文中详述，该方法包括以下步骤：(a)提供编码非Fc结合多肽的核酸分子；(b)将所述核酸分子引入表达载体中；(c)将所述表达载体引入宿主细胞中；(d)在培养基中培养所述宿主细胞；(e)使所述宿主细胞经受适于表达非Fc结合多肽的培养条件，从而产生非Fc结合多肽；可选地，(f)分离步骤(e)中产生的蛋白或多肽；和(g)可选地将蛋白或多肽缀合至本文所述的固体基质。在本发明的各种实施方式中，非Fc结合多肽的生产通过无细胞体外转录和翻译而完成。

优先权申请EP 18 205 679.6的公开内容通过引用以其整体结合于本文中，这意味着EP 18 205 679.6的全部公开内容被认为构成本申请的公开内容的部分。

实施例

以下实施例提供用于进一步举例说明本发明。然而，本发明并不限于此，并且以下实施例仅基于以上描述而显示了本发明的实用性。为了完全公开本发明，还要参考本申请中引用的文献，这些文献通过引用完全结合于本申请中。

实施例1.蛋白的表达和纯化

在T7启动子的调控下，使用低拷贝质粒系统在大肠杆菌BL21(DE3)中表达所有构建体。在由培养基(自诱导培养基)中包括的乳糖诱导后，蛋白以可溶形式细胞质型产生。用表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，铺展到选择性琼脂平板(卡那霉素)上，并在37℃下培养过夜。将预培养物从单个菌落中接种到3ml补充有50μg/ml卡那霉素的2xYT培养基中，并在培养管中于常规定轨振荡器中37℃和200rpm下培养6小时。主培养物在1L锥形烧瓶中接种3mL在300ml补充了50μg/ml卡那霉素的ZYM-5052(0.5％甘油、0.2％乳糖、0.05％葡萄糖、0.5％酵母提取物、1.0％酪蛋白氨基酸、25mM Na

具有亲和标记的蛋白通过亲和层析法和尺寸排阻法进行纯化。亲和层析纯化后，使用

实施例2.通过表面等离子体共振(SPR)分析蛋白

将500-1500RU IgG

参照SEQ ID NO:17(参见图1)或SEQ ID NO:16(参见图2和图3)或野生型蛋白结构域(参见图3)或结构域Z(参见图3)测量对IgG-Fc结构域的结合亲和力。在将数据用1:1Langmuir模型拟合之后，对于c27计算出3nM的K

实施例3.使用具有本发明的非Fc结合蛋白的融合蛋白的浸出分析测试

在亲和层析中确定低水平浸出的蛋白A衍生物或免疫球蛋白结合蛋白对于获得可靠的结果是很重要的。根据制造商的说明书，将用于检测天然和重组蛋白A(Repligen，目录号9000-1)的蛋白A ELISA试剂盒用于进行浸出分析测试。所测试的融合蛋白：SEQ ID NO:1的N端与对靶标具有结合亲和力的蛋白BP1或BP3融合，SEQ ID NO:1的C端与对靶标具有结合亲和力的蛋白BP1或BP3融合，以及SEQ ID NO:1的N端和C端与对靶标具有结合亲和力的蛋白BP2融合。BP1、BP2和BP3是具有三螺旋结构的58个氨基酸的蛋白，具有与靶标的特异性亲和力。例如，BP3与SEQ ID NO:1具有75.8％的同一性，而BP3是与SEQ ID NO:1相比在螺旋2和螺旋3中有修饰的非Fc结合蛋白。图4显示了SEQ ID NO:1与具有特异性靶标结合特性的衍生物的融合蛋白的回收率的改进。

实施例4.文库构建、文库克隆、变体选择

文库构建和文库克隆。

支架SEQ ID NO:1(PAdelFc)：

IAAKFD

带下划线的是氨基酸残基7-19(螺旋1)、氨基酸残基23-37(螺旋2)和氨基酸残基40-56(螺旋3)。

通过三重态技术(ThermoFisher Scientific-GeneArt，Germany)，或在室内通过凭借合成三核苷酸亚磷酰胺(ELLA deisBiotech)生成的随机化寡核苷酸，合成了包含随机化氨基酸位置的文库，以实现充分平衡的氨基酸分布，而同时排除半胱氨酸和其他随机位置的氨基酸残基。PAdelFc(SEQ ID NO:1)在螺旋3和螺旋2或螺旋3和螺旋1中的至少5个氨基酸位置被随机化。基于SEQ ID NO:1产生了以下文库：

·文库PA02(SEQ ID NO:31)：在螺旋2中(25、26、28、29、30、32、33、35、36)和螺旋3(42、43、44、46、47、50、54)随机化的位置。

·文库PA12(SEQ ID NO:32)：在螺旋2(25、29、30、32、33、36、37)和螺旋3(43、46、47、50、51)中随机化的位置。

·文库PA03(SEQ ID NO:33)：在螺旋1(7、8、10、11、14、15、18、20)和螺旋3(42、43、46、47、49、50、53、54))中随机化的位置。

·文库PA13(SEQ ID NO:34)：在螺旋1(7、8、11、14、15、18)和螺旋3(42、46、49、50、53)中随机化的位置。

ThermoFisher Scientific以GeneArt Strings DNA片段的形式提供了PA02和PA03的相应cDNA文库。通过PCR扩增了包含螺旋1-3的编码区。全长文库分子通过重叠延伸PCR(oePCR)产生，其中使用PAdelFc作为模板序列扩增了非随机化区域。

使用随机化寡核苷酸(ELLA Biotech)进行PA12和PA13的克隆。PAdelFc序列用作模板。通过一个包含螺旋1和随机化的螺旋2的片段和另一个包含随机化螺旋3的片段的oePCR产生全长PA12。使用随机化寡核苷酸和PAdelFc序列作为模板，在一个PCR步骤中获得PA13的编码区。

使用本领域技术人员已知的标准方法，将所有产生的文库PCR产物与修饰的pCD87SA噬菌粒(本文称为pCD33-OmpA)进行连接。pCD33-OmpA噬菌粒包含OmpA前导序列和与CT-pIII的直接融合。该连接混合物的等分试样用于大肠杆菌SS320(Lucigen)的电穿孔。正如本领域技术人员已知建立的重组遗传方法。

通过TAT噬菌体展示的初步选择。使用噬菌体展示作为选择系统，针对靶标富集了原始文库。用携带文库的噬菌粒pCD33-OmpA转化感受态细菌SS320细胞(Lucigene)后，使用技术人员已知的标准方法进行噬菌体扩增和纯化。为了进行选择，将靶蛋白固定为该靶在

靶结合噬菌体库至表达载体的克隆。根据本领域已知的方法，通过PCR扩增在噬菌体库ELISA中显示出与靶标特异性结合的选择库，用合适的限制性核酸酶进行切割，并连接到包含Strep-Tag II(IBA GmbH)的表达载体pET-28a(Merck，Germany)的衍生物中。

单集落命中分析。BL21(DE3)细胞(Merck，Germany)转化后，生长出卡那霉素抗性单集落。通过使用自动诱导培养基(Studier,2005,Protein Expr.Purif.41(1):207-234)在384孔板(Greiner Bio-One)中的培养而实现靶结合修饰的支架变体的表达。收获细胞，并随后分别通过BugBuster试剂(Novagen)化学或酶促裂解并通过冷冻/融化循环进行机械裂解。离心后，通过ELISA将所得到的上清液用固定于High Bind 384ELISA微量滴定板(Greiner Bio-One)上的靶标进行筛选。结合蛋白的检测通过

成熟度选择和分析。对亲和力成熟度进行了两轮淘选。第一轮和第二轮分别以50nM和5nM的浓度进行靶标Fc融合。对于两轮，均进行了具有IgG

序列表

<110> 纳维格蛋白质有限公司（Navigo Proteins GmbH）

<120> 缺乏免疫球蛋白FC结构域结合亲和力的新三螺旋多肽及其用途

<130> NP36 PAdelFc

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 1

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有13D 31R)

<400> 2

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 3

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有13D 31R 35S)

<400> 3

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 4

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有10S 13D 31R)

<400> 4

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 5

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> #PAdelFc (27+ 具有10S 13D 31R 35S)

<400> 5

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 6

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有13D 14S 31R)

<400> 6

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 7

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有10S 13D 14S 31R)

<400> 7

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 8

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27+ 具有13D 14S 31R 35S)

<400> 8

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 9

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (27 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 9

Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ser Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 10

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (14+ 具有13D, 31R)

<400> 10

Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 11

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (14+ 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 11

Ile Ala Ala Lys His Asp Lys Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 12

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (50+ 具有13D 31R)

<400> 12

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 13

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (50+ 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 13

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ser Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 14

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (54+ 具有13D 31R)

<400> 14

Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 15

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (54+ 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 15

Ile Asp Ala Gln His Asp Glu Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Gln Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 16

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27+

<400> 16

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 17

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 27

<400> 17

Asn Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Val Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Gln Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 18

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 Fc区

<400> 18

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

115 120 125

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

180 185 190

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 19

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IgG1 Fc

<400> 19

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

1 5 10 15

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

20 25 30

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

35 40 45

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

50 55 60

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

65 70 75 80

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

85 90 95

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

100 105 110

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

115 120 125

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

130 135 140

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

145 150 155 160

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

180 185 190

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

195 200 205

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

210 215

<210> 20

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结构域C

<400> 20

Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 21

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结构域A

<400> 21

Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 22

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 结构域Z

<400> 22

Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 23

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (24+ 13D 31R)

<400> 23

Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 24

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (24+ 10S 13D 14S 31R 35S)

<400> 24

Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Glu Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Gly Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 25

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (26+ 13D 31R)

<400> 25

Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 26

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (26+ 10S 13D 14S 31R 35S)

<400> 26

Ile Ala Ala Gln His Asp Lys Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Glu Ile Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 27

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (60+ 13D 31R)

<400> 27

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 28

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (60+ 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 28

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Ala Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 29

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (59+ 13D 31R)

<400> 29

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Gln Ala Ala Asp Tyr Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Arg Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 30

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PAdelFc (59+ 具有10S, 13D, 14S, 31R, 35S)

<400> 30

Ile Asp Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Asp Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Leu Ala Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Pro

50 55

<210> 31

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA02

<220>

<221> Xaa

<222> (25)..(25)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (26)..(26)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (28)..(28)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (29)..(29)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (30)..(30)

<223> F, H, 或Y

<220>

<221> Xaa

<222> (32)..(32)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (33)..(33)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (35)..(35)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (36)..(36)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (42)..(42)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (43)..(43)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (44)..(44)

<223> I, L, T, 或V

<220>

<221> Xaa

<222> (46)..(46)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (47)..(47)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (50)..(50)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<220>

<221> Xaa

<222> (54)..(54)

<223> 可以是除了C, G, N, P之外的任何氨基酸

<400> 31

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Arg Xaa

20 25 30

Xaa Leu Xaa Xaa Asp Pro Ser Val Ser Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Ala

35 40 45

Gln Xaa Leu Asn Asp Xaa Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 32

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA12

<220>

<221> Xaa

<222> (25)..(25)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (29)..(29)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (33)..(33)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (36)..(36)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (37)..(37)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (43)..(43)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (46)..(46)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (47)..(47)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (50)..(50)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (51)..(51)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (54)..(54)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<400> 32

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Glu Ala Gln Ser Ala Ala Asp Ser Glu Ile

1 5 10 15

Leu His Leu Pro Asn Leu Thr Glu Xaa Gln Arg Asn Xaa Phe Arg Gln

20 25 30

Xaa Leu Ser Xaa Xaa Pro Ser Val Ser Leu Xaa Val Leu Xaa Xaa Ala

35 40 45

Gln Xaa Xaa Asn Asp Xaa Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 33

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA03

<220>

<221> Xaa

<222> (7)..(7)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (10)..(10)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (11)..(11)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (14)..(14)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (15)..(15)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (18)..(18)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (20)..(20)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (42)..(42)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (43)..(43)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (46)..(46)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (47)..(47)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (49)..(49)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (50)..(50)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (53)..(53)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<220>

<221> Xaa

<222> (54)..(54)

<223> A, L, M, F, W, K, Q, E, S, V, I, Y, H, R, D, 或T

<400> 33

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Ala Asp Xaa Xaa Ile

1 5 10 15

Leu Xaa Leu Xaa Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Xaa Xaa Val Leu Xaa Xaa Ala

35 40 45

Xaa Xaa Leu Asn Xaa Xaa Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 34

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PA13

<220>

<221> Xaa

<222> (7)..(7)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (8)..(8)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (11)..(11)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (14)..(14)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (15)..(15)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (18)..(18)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (42)..(42)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (46)..(46)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (49)..(49)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (50)..(50)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<220>

<221> Xaa

<222> (53)..(53)

<223> H, E, V, A, L, Y, W, K, I, Q, T, 或R

<400> 34

Ile Ala Ala Lys Phe Asp Xaa Xaa Gln Ser Xaa Ala Asp Xaa Xaa Ile

1 5 10 15

Leu Xaa Leu Pro Asn Leu Thr Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Arg Gln

20 25 30

Ser Leu Ser Asp Asp Pro Ser Val Ser Xaa Glu Val Leu Xaa Glu Ala

35 40 45

Xaa Xaa Leu Asn Xaa Ser Gln Ala Pro Lys

50 55