一种含调节时间节律组合物的精华液及其制备方法

摘要

本发明提供一种含调节时间节律组合物的精华液及其制备方法。所述含调节时间节律组合物的精华液的制备原料包括：调节时间节律组合物、皮肤调理剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂和水；所述调节时间节律组合物包括：水解酵母蛋白、迷迭香叶提取物和白杨素；所述皮肤调理剂包括：乳酸杆菌发酵溶胞产物、小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物、棕榈酰四肽‑7、水解胶原。本发明所述调节时间节律组合物与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，进一步修复皮肤真皮层中受损的胶原纤维和弹性纤维，修护皮肤弹性，实现抗皱抗老化的功效；并且能有效抑制炎症因子产生，具有良好的抗炎舒缓效果，并能够很好地修复皮炎导致的受损皮肤。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品生产与应用技术领域，具体涉及一种含调节时间节律组合物的精华液及其制备方法。

背景技术

“时间节律(Crcadan Rhythms)”是指每日体内多项生物过程的周期性变化，受体内生物钟影响，主要由光来调节。而人体的时间节律被打乱，会加快老化、导致免疫力下降、癌症几率的上升，还会导致代谢紊乱，从而影响肌肤状态。同时，皮肤作为人体最大的器官，也具有时间节律的特点。科学家已证明皮肤细胞中时钟基因的活跃作用，体现在皮肤细胞的生长分化、皮肤水分流失、体表温度、和油脂分泌等等方面随24小时循环改变。

其中，皱纹是皮肤老化的标志之一，其是由于人体受到内源性及外源性因素的影响后，导致皮肤支撑组织及皮肤结构的变化，造成皮肤保水能力的丧失，弹力纤维和胶原排列顺序的变化，由此导致皮肤的机械力和弹性下降，形成凹陷，从而形成皱纹。而皱纹产生的机制十分复杂，其中之一就是包括细胞损伤以及由该损伤增加的细胞凋亡、蛋白酶如基质金属蛋白酶表达的增加导致的纤维成分如胶原蛋白的水解，和细胞因子的增加导致的纤维束瓦解。而这些降解作用导致细胞外基质的减少和变性，是皮肤形成皱纹、松弛等的重要因素。另外，由于炎症引起细胞产生的TNF-α、IL-1和IL-6等炎性细胞因子可通过诱导MMPs的产生，导致皮肤皱纹和松弛的形成。

CN110960474A公开了一种抗炎抗氧化抗皱稻糟精华液，包括以下质量百分比的组分：稻糟提取物50-80％；去离子水30％-50％；甘油2％-5％；丁二醇2％-5％；辛甘醇1％-2％；Γ-聚谷氨酸1％-2％；大分子量透明质酸钠0.1％-0.2％；小分子量透明质酸钠0.1％-0.2％。该发明应用超声波提取法提取稻糟，能够有效提取稻糟中的阿魏酸、多糖以及各种氨基酸类物质，使其具有抗炎抗氧化以及抗皱的复合功能。

CN110123661A公开了一种包含神经酰胺的保湿抗炎抗皱组合物及其制备方法和应用，该组合物由异构糖、磷脂酰胆碱、神经酰胺、植物甾醇、硬脂酰谷氨酸钠、丁二醇和水组成。该发明的组合物具有优异的保湿、抗炎症、抗皱功效，且容易透膜吸收，添加在透明水基化妆品中外观透明、长期稳定。

因此，开发一种具有抗皱、舒缓消炎的护肤品是本领域研究的重点。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种含调节时间节律组合物的精华液及其制备方法。本发明所述调节时间节律组合物，通过调校细胞生物钟，从而帮助肌肤维持正常的生息与代谢，其可与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，从而提高精华液的抗炎和舒缓的功效，降低皮肤的敏感性，修护皮肤弹性，实现抗皱抗老化的功效。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种含调节时间节律组合物的精华液，所述含调节时间节律组合物的精华液的制备原料包括：调节时间节律组合物、皮肤调理剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂和水；

所述调节时间节律组合物包括：水解酵母蛋白、迷迭香叶提取物和白杨素；

所述皮肤调理剂包括：乳酸杆菌发酵溶胞产物、小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物、棕榈酰四肽-7、水解胶原。

本发明所述调节时间节律组合物，通过调校细胞生物钟，从而帮助肌肤维持正常的生息与代谢，其可与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，进一步促进皮肤胶原蛋白生成，修复皮肤真皮层中受损的胶原纤维和弹性纤维，修护皮肤弹性，实现抗皱抗老化的功效；能够杀灭入侵的细菌，并消除因为炎症而产生的炎症因子，从而缓解、消除炎症，预见性地减少金属蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶的降解。

其中，乳酸菌发酵溶胞产物中包含氨基酸、小肽、多糖、B族维生素、乳酸菌素等有益护肤的成分，可加强角质层代谢，激活机体修复性能，同时粘附于表皮细胞，对皮肤形成保护屏障；乳酸菌发酵溶胞产物使各种介质的比例恢复平衡，利于免疫系统的调控，缓解皮肤炎症。小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物为小球藻(CHLORELLAVULGARS)和白羽扇豆蛋白(LUPINUS ALBUS)的发酵产物，能够缓解肌肤压力，抚平细纹和皱纹，减少肌肤瑕疵，可以淡化暗沉和不均匀的肤泽。棕榈酰四肽-7可以延缓和抑制过量细胞白介素的生成，从而抑制一些不必要不恰当的炎症反应和糖基化损伤。水解胶原含有丰富的水解胶原蛋白层的真皮能够把皮肤细胞撑起，增加胶原蛋白生成，同时与水解胶原蛋白自身的保湿型结合能够达到淡化细纹、舒展粗纹的作用。

优选地，所述水解酵母蛋白、迷迭香叶提取物和白杨素的质量比为(3-12):(5-7):(0.5-5)；

其中，“3-12”例如可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12等；

其中，“5-7”例如可以是5、5.5、6、6.5、7等；

其中，“0.5-5”例如可以是0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等。

优选地，所述乳酸杆菌发酵溶胞产物、小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物、棕榈酰四肽-7和水解胶原的质量比为(1-5):(0.5-3):(0.5-2):(0.1-1)；

其中，“1-5”例如可以是1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5等；

其中，“0.5-3”例如可以是0.5、1、1.5、2、2.5、3等；

其中，“0.5-2”例如可以是0.5、0.8、1、1.2、1.5、2等；

其中，“0.1-1”例如可以是0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1等。

优选地，以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述精华液按质量百分含量计包括：调节时间节律组合物0.01-5％、皮肤调理剂0.5-10％、保湿剂5-20％、增稠剂0.1-2％、乳化剂0.5-5％，余量为水。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述调节时间节律组合物含量为0.01-5％，例如可以是0.01％、0.02％、0.04％、0.06％、0.08％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述皮肤调理剂含量为0.5-10％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述保湿剂含量为5-20％，例如可以是5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述增稠剂含量为0.1-2％，例如可以是0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.5％、2％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述乳化剂含量为0.5-5％，例如可以是0.5％、0.6％、0.8％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％等。

优选地，所述皮肤调理剂中还包括烟酰胺、羟基积雪草甙、α-葡聚糖寡糖、菊薯根汁、麦芽糊精、乳酸杆菌、水解珍珠或人参提取物中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述保湿剂包括透明质酸钠、水解透明质酸钠、羟乙基脲、糖类同分异构体、1,2-己二醇、丁二醇、1,3-丙二醇、1,2-戊二醇或甘油中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述增稠剂包括卡波姆、丙烯酸酯类共聚物钠、卵磷脂或丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述乳化剂包括鲸蜡醇磷酸酯钾、C20-22醇或C20-22醇磷酸酯中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述精华液的制备原料中还包括：抗氧化剂、润肤剂、pH调节剂、助溶剂、防腐剂或芳香剂中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述抗氧化剂为对羟基苯乙酮。

优选地，所述润肤剂包括聚二甲基硅氧烷、聚二甲基硅氧烷醇、环五聚二甲基硅氧烷或环己硅氧烷中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述pH调节剂为精氨酸。

优选地，所述助溶剂为双-二乙氧基二甘醇环己烷1,4-二羧酸酯。

优选地，所述防腐剂包括苯甲酸钠和/或山梨酸钾。

优选地，所述芳香剂为香精。

优选地，以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述精华液的制备原料按质量百分含量计包括：调节时间节律组合物0.01-5％、皮肤调理剂0.5-10％、保湿剂5-20％、增稠剂0.1-2％、乳化剂0.5-5％、抗氧化剂0.4-0.6％、润肤剂1-10％、pH调节剂0.1-0.25％、助溶剂0.1-1％、防腐剂0.01-1％、芳香剂0.01-0.5％，余量为水。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述抗氧化剂含量为0.4-0.6％，例如可以是0.4％、0.45％、0.5％、0.55％、0.6％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述润肤剂含量为1-10％，例如可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述pH调节剂含量为0.1-0.25％，例如可以是0.1％、0.12％、0.14％、0.16％、0.18％、0.2％、0.22％、0.25％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述助溶剂含量为0.1-1％，例如可以是0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述防腐剂的含量为0.01-1％，例如可以是0.01％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％等。

以所述精华液的制备原料的总质量为100％计，所述芳香剂的含量为0.01-0.5％，例如可以是0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％等。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的含调节时间节律组合物的精华液的制备方法，所述精华液的制备方法包括以下步骤：

(1)将保湿剂、增稠剂、乳化剂中的水相成分和水进行混合，得到水相混合液；将保湿剂、增稠剂、乳化剂中的油相成分进行混合，得到油相混合液；

(2)将步骤(1)得到的水相混合液和油相混合液混合均质，得到均质液；

(3)将步骤(2)得到的均质液和剩余组分混合，得到所述精华液。

优选地，步骤(1)中，所述水相成分和水进行混合的温度为80-85℃，例如可以是80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃等。

优选地，步骤(1)中，所述油相成分进行混合的温度为78-80℃，例如可以是78℃、78.5℃、79℃、79.5℃、80℃等。

优选地，步骤(2)中，所述均质的温度为80-82℃，例如可以是80℃、80.5℃、81℃、81.5℃、82℃等，均质的时间为5-10min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min等。

优选地，步骤(3)中，所述混合的温度为45℃以下，例如可以是45℃、44℃、43℃、42℃、41℃、40℃、39℃、38℃等。

优选地，所述精华液的制备方法包括以下步骤：

(1)将皮肤调理剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂中的水相成分和水在80-85℃下进行混合，得到水相混合液；将皮肤调理剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂中的油相成分在78-80℃进行混合，得到油相混合液；

(2)将步骤(1)得到的水相混合液和油相混合液混合，在80-82℃下搅拌5-10min进行均质，得到均质液；

(3)将步骤(2)得到的混合液、调节时间节律组合物、皮肤调理剂、抗氧化剂、润肤剂、pH调节剂、助溶剂、防腐剂和芳香剂在45℃以下混合搅拌，得到所述含调节时间节律组合物的精华液。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所述调节时间节律组合物，通过调校细胞生物钟，从而帮助肌肤维持正常的生息与代谢，其可与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，进一步促进皮肤胶原蛋白生成，修复皮肤真皮层中受损的胶原纤维和弹性纤维，修护皮肤弹性，实现抗皱抗老化的功效；

(2)本发明所述调节时间节律组合物可与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，能够杀灭入侵的细菌，并消除因为炎症而产生的炎症因子，从而缓解、消除炎症，预见性地减少金属蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶的降解，进一步实现抗皱抗老化的功效。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

以下制备例中各组分均可由市售购得。

制备例1

本制备例提供一种水解酵母蛋白，所述水解酵母蛋白由以下方法制备得到：

(1)将啤酒酵母菌株接种到活化培养基中，在28℃、pH为5的条件下进行发酵培养40h，得到酵母乳；

所述活化培养基按质量浓度计包括：糖蜜10g/L、酵母抽提物12g/L、蛋白胨5g/L、硫酸铵4g/L和磷酸二氢钾4g/L；

(2)将步骤(1)得到的酵母乳浓缩至酵母乳的浓度为12wt％，在35℃下以500W的功率超声处理25min，升温至100℃煮沸20min，得到酵母自溶液；

(3)将步骤(2)得到的酵母自溶液和复合蛋白酶混合，所述复合蛋白酶的质量为所述酵母自溶液质量的0.1％，在55℃进行18h的酶解反应后，灭活后，在35℃、100bar下喷雾干燥，得到所述水解酵母蛋白；

所述复合蛋白酶按重量份数计包括：破壁酶50份、木瓜蛋白酶30份、中性蛋白酶15份、碱性蛋白酶15份和风味蛋白酶10份。

制备例2

本制备例提供一种迷迭香叶提取物，所述迷迭香叶提取物由以下制备方法制备得到：

(a)将迷迭香叶粉碎后过筛，得到60目的迷迭香叶粉末；

(b)将迷迭香叶粉末，与等体积玻璃珠混合均匀，置于萃取釜中。设定萃取釜的温度为45℃，压力为5.5MPa；其中，二氧化碳则由柱塞泵加压(流速为0.6L/min)，乙醇通过双活塞往复泵泵入(流速为3L/min)，对迷迭香叶粉末进行提取，所述提取时间为80min，由分离釜底部收集萃取液，浓缩，得到所述迷迭香叶提取物。

制备例3

本制备例提供一种白杨素，所述白杨素由以下制备方法制备得到：

(A)将10份的蜂胶和45份的硅胶固载离子液体混合，研磨均匀，得到混合物后将其装入玻璃柱中；其中，所述硅胶固载离子液体的制备方法为：将硅胶置于100℃烘箱中干燥3h，然后将其浸入到200mM的1-十二烷基-3-甲基咪唑的甲醇溶液中，将此混合物在室温下搅拌12h后，于150℃左右的烘箱中干燥至恒重，所得的白色粉末即为硅胶固载离子液体；

(B)采用1200份的正己烷进行淋洗后，再采用1200份的甲醇进行洗脱，将洗脱液浓缩后上聚酰胺反相柱进行纯化，得到纯的白杨素(HPLC检测纯度为95.6％)。

除水解酵母蛋白、迷迭香叶提取物和白杨素由上述制备方法制备得到，下述实施例和对比例中其余组分均由市售购得。

实施例1

本实施例提供一种调节时间节律组合物，所述调节时间节律组合物按重量份数计包括：8份的水解酵母蛋白、6份的迷迭香叶提取物和2份的白杨素。

实施例2

本实施例提供一种调节时间节律组合物，所述调节时间节律组合物按重量份数计包括：6份的水解酵母蛋白、7份的迷迭香叶提取物和3份的白杨素。

实施例3

本实施例提供一种调节时间节律组合物，所述调节时间节律组合物按重量份数计包括：7份的水解酵母蛋白、5份的迷迭香叶提取物和4份的白杨素。

实施例4

本实施例提供一种调节时间节律组合物，所述调节时间节律组合物按重量份数计包括：2份的水解酵母蛋白、8份的迷迭香叶提取物和6份的白杨素。

实施例5

本实施例提供一种调节时间节律组合物，所述调节时间节律组合物按重量份数计包括：6份的水解酵母蛋白、4份的迷迭香叶提取物和6份的白杨素。

对比例1

本对比例提供一种组合物，所述组合物按重量份数计包括：8份的水解酵母蛋白、8份的迷迭香叶提取物。

对比例2

本对比例提供一种组合物，所述组合物按重量份数计包括：8份的水解酵母蛋白、8份的白杨素。

对比例3

本对比例提供一种组合物，所述组合物按重量份数计包括：8份的迷迭香叶提取物、8份的白杨素。

应用例1

本应用例提供一种精华液，所述精华液的制备原料按质量百分含量计包括如下组分：

本实施例所述精华液的制备方法包括以下步骤：

(1)将皮肤调理剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂中的水相成分和水在82℃下进行混合，得到水相混合液；将皮肤调理剂、保湿剂、增稠剂、乳化剂中的油相成分在78℃进行混合，得到油相混合液；

(2)将步骤(1)得到的水相混合液和油相混合液混合，在80℃下搅拌7min进行均质，得到均质液；

(3)将步骤(2)得到的混合液、调节时间节律组合物、皮肤调理剂、抗氧化剂、润肤剂、pH调节剂、助溶剂、防腐剂和芳香剂在45℃混合搅拌，得到所述含调节时间节律组合物的精华液。

应用例2

本应用例提供一种精华液，所述精华液的制备原料按质量百分含量计包括如下组分：

本应用例提供精华液制备方法同应用例1。

应用例3

本应用例提供一种精华液，所述精华液的制备原料按质量百分含量计包括如下组分：

本应用例提供精华液制备方法同应用例1。

应用例4

本应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，将实施例1提供的调节时间节律组合物替换为等质量的实施例4提供的调节时间节律组合物，其他组分含量及制备方法同应用例1。

应用例5

本应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，将实施例1提供的调节时间节律组合物替换为等质量的实施例5提供的调节时间节律组合物，其他组分含量及制备方法同应用例1。

应用例6

本应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加α-葡聚糖寡糖、菊薯根汁、麦芽糊精和乳酸杆菌，不足部分以水补至100％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

应用例7

本应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加水解珍珠，水解胶原含量增至0.4％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

应用例8

本应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加人参提取物，不足部分以水补至100％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例1

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加实施例1提供的调节时间节律组合物，不足部分以水补至100％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例2

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，将实施例1提供的调节时间节律组合物替换为等质量的对比例1提供的调节时间节律组合物，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例3

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，将实施例1提供的调节时间节律组合物替换为等质量的对比例2提供的调节时间节律组合物，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例4

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，将实施例1提供的调节时间节律组合物替换为等质量的对比例3提供的调节时间节律组合物，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例5

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加乳酸杆菌发酵溶胞产物，小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物含量增至3％、棕榈酰四肽-7含量增至2％、水解胶原含量增至1.3％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例6

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物，乳酸杆菌发酵溶胞产物含量增至4％、棕榈酰四肽-7含量增至2％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例7

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加棕榈酰四肽-7，乳酸杆菌发酵溶胞产物含量增至3.5％、小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物含量增至2.5％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

对比应用例8

本对比应用例提供一种精华液，与应用例1的区别在于，不添加水解胶原，乳酸杆菌发酵溶胞产物含量增至3.1％、小球藻/白羽扇豆蛋白发酵产物含量增至2.1％、棕榈酰四肽-7含量增至1.1％，其他组分含量及制备方法同应用例1。

试验例1

安全性能测试

对应用例1-8提供的精华液和对比应用例1-8提供的精华液进行安全性能测试，方法如下：

(1)红细胞溶血实验

红细胞悬液的制备：选择健康家兔，心脏取血9mL，加入2％的草酸钾溶液1mL，离心，弃去上清液，用20mmol/L的PBS溶液将沉淀物稀释至20mL，4℃保存备用。选择样品用PBS溶液稀释至不同浓度，每个样品设置5个浓度梯度。取10mL待测样品的稀释液，加入200μL上述红细胞悬液(控制样品终浓度分别为5、10、20、50、100mg/mL)，以蒸馏水作为全溶血对照，PBS溶液作为阴性对照，轻轻混匀，37℃下孵育30min，在2000r/min的转速下离心10min，取上清液，用分光光度计测试其在560nm处的吸光度(A

绘制溶血率-样品浓度标准曲线，计算50％红细胞发生溶血时的样品浓度(HD

(2)蛋白变性实验：

将样品用PBS溶液稀释至10g/L，取10mL待测样品的稀释液，加入200μL上述红细胞悬液，以蒸馏水作为空白对照，1mg/mL十二烷基硫酸钠(SDS)溶液作为阳性对照，轻轻混匀，37℃下孵育30min，在2000r/min的转速下离心10min，取上清液，用分光光度计分别测试其在540nm和575nm处的吸光度A

其中，R

根据L/D值对待测样品的刺激性进行评价，其中L/D值为HD

表1

上述红细胞溶血实验和蛋白变性实验的测试结果如下表2所示：

表2

由安全性能测试可知，由上述试验结果可知，本发明应用例1-8所制备的精华液温和无刺激；本发明所制备的精华液的50％红细胞发生溶血时的样品浓度HD

试验例2

促进弹性蛋白生成实验

将人成纤维细胞按照每孔20000枚的密度接种在96孔板上，加入培养基，在37℃培养箱中培养24小时，待细胞贴壁后，更换新的培养基，并分别加入应用例1-8和对比例应用1-8提供的精华液(控制样品终浓度为50mg/mL)，以20mmol/L的PBS溶液作为空白对照，然后在37℃培养箱中培养2天。

培养结束后，利用细胞裂解液将细胞洗脱下来，并超声破碎。采用Biocolor弹性蛋白检测试剂盒对弹性蛋白的含量进行检测：用弹性蛋白沉淀剂处理样本，使弹性蛋白沉淀下来，离心分离，去除上清液，向沉淀中加入染料和反应液，反应形成弹性蛋白-染料复合物，离心分离并用PBS溶液洗涤三次，去除未结合的染料，添加染料释放剂，使弹性蛋白-染料复合物中的染料释放出来，采用分光光度计测定样品在513nm处的吸光度。根据吸光度-染料浓度标准曲线计算弹性蛋白的表达量(以空白组的表达量为1)；

具体测试结果下表3所示：

表3

由表3的结果可以看出，本发明所述精华液处理的成纤维细胞的弹性蛋白的表达量可达到8.0以上；与应用例1相比，经对比应用例1-8提供的精华液处理的成纤维细胞的弹性蛋白表达量均有下降，表明本发明本发明所述调节时间节律组合物，通过调校细胞生物钟，从而帮助肌肤维持正常的生息与代谢，其可与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，具有修复皮肤真皮层中受损的胶原纤维和弹性纤维，修护皮肤弹性，实现抗皱抗老化的功效。

试验例3

抗皱效果实验

选择160名年龄在40-55岁之间、眼周出现皱纹的女性志愿者作为受试对象，随机分为16组，每组10人。采用硅树脂获取受试者眼周测试部位的皱纹印记，然后分别在受试者眼周涂抹应用例1-8和对比应用例1-8提供的精华液，每天2次，连续60天。分别获取处理30天和60天后的受试者眼周测试部位的皱纹印记，用共聚焦显微镜测试皱纹深度。计算处理30天和60天后的皱纹深度减小的百分比；

具体测试结果如下表4所示：

表4

由4的测试结果数据可知，使用本发明所述精华液30天后，皱纹减少量达到20％以上，使用本发明所述精华液60天后，皱纹减少量达到30％以上，表明本发明本发明所述调节时间节律组合物，其可与精华液的皮肤调理剂中各成分相互配合，能够通过抑制、再生、抚平等作用机理，有效淡化皮肤的假性纹和真性纹。

试验例4

抗炎性能体外测试

主要材料：小鼠巨噬细胞系RAW264.7、应用例1-8提供的精华液和对比应用例1-8提供的精华液、小鼠前列腺素E2(PGE2)ELISA检测试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA检测试剂盒、脂多糖(LPS)。

(1)对脂多糖(LPS)刺激RAW264.7细胞释放PGE2的影响，对照组(无血清培养基)，于LPS刺激18h后收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书要求进行PGE2检测，计算抑制率。

(3)对LPS刺激RAW264.7细胞释放TNF-α的影响，对照组(无血清培养基)，LPS刺激18h后收集细胞上清，按ELISA试剂盒说明书操作要求进行TNF-α检测，计算抑制率。

具体测试结果如表5所示：

表5

由表5的测试数据可知，本发明制备得到的精华液对PGE2释放的抑制率在87％以上，对TNF-α释放的抑制率在85％以上，说明本发明所述调节时间节律组合物同精华液的配方中的皮肤调节剂中的各组分相互配合在一起，从根本上达到增强皮肤屏障功能，有效抑制炎症因子的释放、传递，能起到抗炎舒敏的作用，从而有效修复炎症肌肤。

试验例5

皮肤屏障修复试验

测试样品：应用例1-8和对比应用例1-8提供的精华液

测试原理：当皮肤屏障受到急性破坏时，颗粒层细胞迅速分泌和形成前体板层小体，导致短期内板层小体数量减少，抑制脂质转运，达到角质层脂质膜的初步修复。之后，新生成的板层小体出现在颗粒层，并快速发挥作用直至渗透性屏障功能恢复；

测试方法：实验招募20名无活动性皮肤病的志愿者，实验前，志愿者用清水清洗双前臂，在18～22℃、相对湿度40～60％的环境中静坐30min。选取志愿者前臂屈侧17个部位，其中，一个作为空白对照，每个部位为2cm×2cm大小，进行胶带粘贴(胶带粘贴不仅减少角质层的角质细胞和细胞间脂质，还使角质层变薄，使皮肤屏障出现机械性损伤)，每个部位粘贴15次，每次粘贴时间、压力和撕去胶带的速度及方向均保持一致，记录此时板层小体数量L

具体测试结果如表6所示：

表6

由表6测试数据可知，本发明的应用实施例1-8制备的精华液较于对比应用例1-8对皮肤角质层的屏障修复效果明显，促进了板层小体的增加，加快了屏障的修复过程，板层小体变化率在25％以上。这充分说明本发明所述调节时间节律组合物同精华液的配方中的皮肤调节剂中的各组分相互配合在一起，能够促进角质层脂质转运，从而加快皮肤角质层屏障的修复过程。所述精华液能够有效调节角质更新，强化肌肤角质屏障，提升肌肤抵御力。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明含调节时间节律组合物的精华液及其制备方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。