抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供一种抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明通过鉴定ECMP(BAJ41227.1)为仿刺参性别鉴定标记物并据此制备相应单克隆抗体V2F5C8，基于该单克隆抗体有效通过体腔液上清鉴定仿刺参性别，特异性强、准确度高，同时还具有高通量、快速检测等优势。

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种抗仿刺参(Apostichopusjaponicus)卵壳基质蛋白的单克隆抗体。

背景技术

仿刺参属于棘皮动物门、海参纲、楯手目、刺参科、仿刺参属，是我国海水养殖的支柱性品种之一，也是我国海水养殖产业中单一品种产值最高的品种。仿刺参为雌雄异体动物，在自然条件下，其雌性和雄性个体数量的比例接近1:1。肉眼可观察到的仿刺参雌性和雄性个体最显著的表型区别为：①雌性个体繁殖期排出的卵子在水中呈橘红色，雄性个体繁殖期排出的精子在水中呈乳白色；②雌性个体繁殖期解剖后体内的性腺呈橘红色，雄性个体繁殖期解剖后体内的性腺呈乳白色。然而，从外观性状上难以判断仿刺参的性别。在仿刺参的人工育苗生产中，主要通过产卵、排精时水中的卵子和精子颜色来判定仿刺参性别。仿刺参的人工育苗生产通常选择外海采捕的大规格仿刺参(>200g)作为种参，其价格高昂，是普通商品参价格的数倍。并且，仿刺参的人工育苗生产要求种参中雌性个体比例高于雄性，通常雌雄数量比在2:1～10:1，过高的雄性种参比例会影响受精效率。为了保证育苗生产中雌性种参的数量，育苗生产企业或单位只能过量购买种参，然后在种参产卵、排精的过程中鉴定种参性别并挑出多余的雄性种参，从而造成了资源的浪费和育苗成本的高企。另外，在仿刺参的人工育苗生产中，虽然有干露、升温等措施刺激种参同步产卵和排精，但种参个体之间的产卵和排精并不十分同步，这一过程往往从前一日23时左右持续至次日凌晨3时左右，生产和技术人员在此期间需要持续观察和鉴别种参性别、调整雌雄种参的比例在适当范围内，给生产和技术人员造成了繁重的劳动负担。目前已报道的仿刺参种参性别鉴定技术主要包括医用超声波扫描鉴定技术、体腔液PAGE鉴定技术、麻醉后负压采集种参部分性腺组织观察鉴定技术等，但这些技术都存在高通量检测的局限，不适用于对大量的仿刺参种参开展性别快速鉴定，无法解决仿刺参育苗生产中种参过量采购和工作人员种参性别鉴定工作任务繁重的问题。

酶联免疫吸附测定(ELISA)是实现大批量仿刺参种参样品性别快速鉴定的可行技术。能够实现仿刺参种参性别高通量、快速检测的ELISA技术高度依赖仿刺参性别差异标志物及其特异性抗体。

有鉴于此，提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其制备方法，为实现仿刺参种参性别的高通量、快速检测提供重要的工具，从而弥补现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种杂交瘤细胞株，命名为V2F5C8，所述杂交瘤细胞株V2F5C8保藏编号为：CCTCC NO：C2020258，于2021年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉。

本发明还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株分泌。

进一步的，所述抗体不做限制，可以是IgG型、IgM型、IgA型、IgE型或IgD型任一种。

本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码上述单克隆抗体。

本发明还提供了一种组合物或复合物，所述组合物或复合物包含上述抗体或其序列等。

本发明还提供了一种上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在仿刺参性别鉴定中的应用。

本发明还提供了一种上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体在制备仿刺参性别鉴定试剂或试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种仿刺参性别鉴定试剂盒，所述试剂盒包含上述杂交瘤细胞株或单克隆抗体。

进一步的，所述试剂盒可以为ELISA试剂盒，或WB试剂盒；

优选的，上述单克隆抗体经ELISA检测显示：抗体能与ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段结合，且能够通过体腔液上清鉴定仿刺参的性别；而经western-blot检测显示：抗体能与分子量约为54kDa的ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段以及雌性仿刺参体腔液上清中的分子量约为77kDa的ECMP(BAJ41227.1)结合。

本发明还提供了一种上述单克隆抗体制备方法，是利用上述杂交瘤细胞株分泌制备；或者利用ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段小鼠免疫制备。

优选的，比如包括以下具体步骤：(1)从Genbank获得仿刺参ECMP(BAJ41227.1)的cDNA序列和氨基酸序列，分析ECMP(BAJ41227.1)的抗原表位和序列特异性，确定25-492aa肽段抗原效果和序列特异性最佳；(2)根据大肠杆菌密码子偏好性优化密码子，基因合成经过密码子优化的ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段对应的cDNA序列，设计带有BamHI和XhoI酶切位点的引物并以合成的cDNA为模板进行通过PCR扩增，纯化PCR产物后将PCR产物连接pET-28a载体并转化至大肠杆菌BL21(DE3)，利用IPTG诱导大肠杆菌表达带6×His标签的25-492aa肽段，通过亲和层析纯化得到带6×His标签的25-492aa肽段；(3)以带6×His标签的25-492aa肽段为抗原免疫Balb/C小鼠；(4)通过PEG介导的细胞融合制备杂交瘤细胞，经免疫学检测筛选得到分泌抗ECMP(BAJ41227.1)单克隆抗体的杂交瘤细胞V2F5C8，利用常规培养方法培养上述得到的杂交瘤细胞V2F5C8，收集细胞培养上清液，得到鼠抗仿刺参卵壳基质蛋白单克隆抗体。

本发明还提供了一种仿刺参性别鉴定方法，其特征在于，利用上述单克隆抗体进行仿刺参性别鉴定，或利用上述试剂盒进行仿刺参性别鉴定。

本发明还提供了一种制备上述单克隆抗体的分离的抗原片段，所述分离的抗原片段为Genbank号BAJ41227.1的ECMP氨基酸的第25-492AA肽段；

优选的，所述分离的抗原片段编码序列如SEQ ID NO.1所示，其实经密码子优化后序列。

本发明还提供了一种ECMP蛋白在仿刺参性别鉴定中的应用，该ECMP蛋白可作为仿刺参性别鉴定标记物，进一步的，所述ECMP蛋白为ECMP(genbank号为BAJ41227.1)；更近一步的，通过ECMP蛋白的抗体进行仿刺参性别鉴定，比如ELISA或WB试验。

本发明的有益技术效果：

1)本发明首次提出ECMP(BAJ41227.1)可作为仿刺参性别鉴定的标记物；

2)本发明制备的单克隆抗体V2F5C8能够通过体腔液上清鉴定仿刺参的性别，具有良好的特异性；

3)基于本发明单克隆抗体V2F5C8建立的ELISA检测试剂盒能够准确检测出测仿刺参性别，准确度大于93％，且具有高通量、快速检测等显著优势，弥补现有技术不足，适于产业推广；

4)本发明抗体制备方法，通过选择ECMP(BAJ41227.1)的25-492aa肽段作为免疫原，具有抗原效果和序列特异性最佳优势，能够制备出高特异性抗体，避免与其他ECMP蛋白交叉，有效应用于仿刺参性别鉴定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1雌性和雄性仿刺参体腔液上清的蛋白质组分析中不同ECMP同源物检测结果，其中A为第1次蛋白质组检测的结果；B为第2次蛋白质组检测的结果；C为第3次蛋白质组检测的结果。

图2仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段的重组表达和纯化结果。

图3本发明的抗仿刺参卵壳基质蛋白单克隆抗体的western-blot结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明中关于细胞、核酸所使用的术语“分离的”，例如“分离的抗体或其片段”是指分别与存在于天然来源中的其它抗体或其片段所分离的分子；还可指当通过重组技术产生时基本上不含细胞材料、病毒材料或细胞培养基的核酸或肽，或化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。此外，“分离的”意在包括不以天然状态存在的，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本发明中也用于指从其他细胞蛋白质或组织分离的细胞、多肽或核酸等。分离的抗体意在包括纯化的和重组的多肽。

术语“编码”应用于多核苷酸时，是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果在其天然状态或当通过本领域技术人员公知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译以产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这种核酸的互补序列，其编码序列可以从中推导出来。

在本发明中“抗体”是指特异性识别和结合抗原的多肽或多肽复合物。因此术语“抗体”包括分子中含有具有与抗原结合的生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的含蛋白质或肽。

本发明中的“杂交瘤细胞(hybridoma)”是一种在制备单克隆抗体过程中，用骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合而成的细胞，一般通过瘤细胞培养来制备，他可使两个不同来源的细胞核在同一细胞中表达功能。

本发明中的卵壳基质蛋白ECMP蛋白，优选的为仿刺参ECMP(BAJ41227.1)，本领域已知，在仿刺参中,ECMP的同源蛋白存在多种，本发明通过仿刺参体腔液的蛋白质组学鉴定发现大部分ECMP无法作为雌性的生物标志物，唯有ECMP，GenBank登录号：BAJ41227.1蛋白在雌雄个体之间差异极为显著，可作为仿刺参性别鉴定的标记物。

本发明中的“单克隆抗体”是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，通常采用免疫后经杂交瘤技术来制备。

作为示例，本发明所述的单克隆抗体制备方法可包括以下具体步骤：以ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段作为抗原免疫Balb/C小鼠；细胞融合制备杂交瘤细胞，经免疫学检测筛选得到分泌抗ECMP单克隆抗体的杂交瘤细胞，收集细胞培养上清液，得到鼠抗仿刺参卵壳基质蛋白单克隆抗体。

下面为具体的实施例实验。

实施例1：仿刺参雌雄鉴定生物标志物筛选

本领域知晓的是，仿刺参中ECMP的同源蛋白存在多种(目前已鉴定出4种，GenBank登录号分别为BAJ41227.1、BAJ41225.1、BAJ41226.1、PIK61820.1)。本发明通过开展仿刺参雌雄个体产卵期的体腔液上清蛋白质组分析发现：在3次蛋白质组检测中，唯有卵壳基质蛋白(egg coat matrix protein，ECMP，GenBank登录号：BAJ41227.1)始终在雌性个体中表达量较高，在雄性个体中则未检测到表达；ECMP(GenBank登录号：BAJ41225.1)在第2次蛋白质组检测中未检测到在雌性仿刺参中表达，且在第1次和第3次蛋白质组检测中在雌性仿刺参中的表达量较低，而在雄性仿刺参中未检测到表达；ECMP(GenBank登录号：BAJ41226.1)在第1次和第3次蛋白质组检测中均未检测到在雌性仿刺参中表达，仅在第2次蛋白质组检测中检测到在雌性仿刺参中表达，另外在雄性仿刺参中也未检测到表达；ECMP(GenBank登录号：PIK61820.1)在3次蛋白质组检测中均未检测到在雌性和雄性仿刺参中表达。

蛋白质组分析结果表明，在所有仿刺参ECMP同源物中，仅ECMP(GenBank登录号：BAJ41227.1)稳定且特异性在雌性仿刺参体腔液上清中高水平表达，而其他ECMP同源物在雌性和雄性个体之间未出现类似差异表达。

因此判定ECMP(BAJ41227.1)为可区分仿刺参雌雄的生物标志物。接下来通过研制ECMP(BAJ41227.1)的单克隆抗体，一方面验证该标记物的有效性，同时也通过ELISA技术实现对大批量仿刺参种参样品性别的快速检测，进而弥补现有技术的不足。

实施例2：鼠源抗仿刺参卵壳基质蛋白单克隆抗体的制备与特性分析

(1)仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段的重组表达和纯化

通过Genbank获得仿刺参ECMP(BAJ41227.1)的cDNA序列和氨基酸序列，鉴于ECMP(BAJ41227.1)蛋白分子量相对较大，大肠杆菌作全蛋白表达比较困难，本发明分别使用DNAstar软件和Protein BLAST program分析仿刺参ECMP(BAJ41227.1)的抗原表位和序列特异性，反复测试后最终确定25-492aa肽段的抗原性和序列特异性较佳。

同时根据大肠杆菌密码子偏好性，优化仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段对应的密码子，委托生工基因合成经过密码子优化的仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段对应的cDNA序列，如seq id no.1所示：

TTCGGCGATGACATCAGCCAAGATAACGAAGACAACCGCTTTGCCGAAATGGGCCAAGTTACCAAGAACACCTTTGACATCACGGACGGCCAAGTTGAACTGATTTTCGACGTGCAAGATACCAAGAACATCGATGAACTCTGGATTCTGGACTTCGAACCGTACCGCTTCGATGAATTCGCGCTGCCAGTGAACGAACTGACCGGCGAGCTGATTCTGAATAACACGGGCGATTGCAGCAGCGTGTATGAGACGGTGCAGTGGACCTTCTTCAACGACAGCTACTTCCGCGACCGCAACGAAGCGCAGCTGAGCACCAAGAATCTGTTCACCAGCTTCGTGAGCGGCGAGAATTATGACGGCGACGGTATCCGTACGGATCAGATCATCTACCGCGGCACGATCGCCAGCTTCTTCGAGTGCAAGAAAAGCGACGAGGAGAGTGATGTGTGGGTGCAGACCAACACGAGTAGCGACGACGAAATCGAGTACCGCACCAAAGTGTACGCGACCAATGTTCGCCCAAAAGATCCGGCGGATAACGAGGCGGGCGTGAGCTTCGTGCAAAGCCACATCGAGCTGATTTGGCGTCTGAGCCGTCAAGCCATTAGTAATTTCATTATTAGCAGCACGGCCGTTCTGAAGCCGGTGATTGATTTTGCGCGCGTTAGCGCCATCTTTGATGGTCAAGGCGAGCCGATCCCAGAAGAAACGCGCCTCCACCTCCGTTTTACGACGATTCTGGATAGCGACGAGCAAATCGTGAGCTACAACAGCAGTGGTACCCAGTTCACCCCAGATAACCCGCTGCATGGCCTCAAAGAGATCGTGTACGAACCAACCCCGACCCTCGATGCGGCGCCAGTTTGTGACCGTCAACTGGATGTGGGCACCGGCACCCAATTCCAGTGCCACCAGACGTGGAATTTCATTTTTGTGCTCGACATCGACACGGCCAGCCAGACCAAGAACTTCGTTCCGATCGACGCGAGCGGTACGTTCGACTTTTTCTTCGATGTGTACAGTTGCGACCTCACCCAGAATGTGCTCGACAAAGCGACGTGCAACAAGATCGACCCAGCGCCGGCCAAGGTTAGCACGCTGATCACGATCCAGACGACGGTGTTCATCACGGATAAGGAGGACGATCAAGTTAGCATTCTCCTCGTTAGCCTCAAAGGTGCCAACAACGATGAGCTCAGCGGTGTTGCGGCCCGTGGTGTTGCCCACAAGGAGGACGTGACCCTCCAAGTTAAATTCAGCCCGGCGCTGCTCCGCAAGGACTACGATCTGGATCTGATGCTGTTCATGGTGTGCAAGGGCGAGCAGTACGCCGGTGAAAATTTTCTGCAAGGCTGCCTCCAAGCCCCGATTAGTGAACGCTACGTGGCCCACAAAGCCAGCTAA。

设计带有BamhI、XhoI酶切位点的引物(sense:5′–TTTTGGATCCTTCGGCGATGACATCAGCCAAG–3′；antisense:5′–TTTTCTCGAGTTAGCTGGCTTTGTGGGCCAC–3′)，按表1准备PCR反应体系，然后向反应体系添加上述基因合成的cDNA作为模板和带有BamhI、XhoI酶切位点的引物，按表2反应程序进行PCR扩增。使用1％琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物片段大小后，使用Gel Extraction Kit D2500(Omega)按照说明书操作对PCR产物进行切胶回收。取40μL纯化回收的PCR产物，与10μL buffer，1μL BamhI酶、1μL XhoI酶混合后，在37℃孵育8h，然后使用Gel Extraction Kit D2500(Omega)按照说明书操作对双酶切后的DNA产物进行回收。按表3准备反应体系，将反应体系混匀后，22℃孵育4h，65℃灭活10min，从而将双酶切后的DNA片段连接至pET28a载体。取10μL上述连接产物加入100μL BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴30S，再冰浴5min，加入800μL SOB,16μL 1M Glu,4μL 2M MgCl

表1

表2

表3

将阳性克隆菌落接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的LB肉汤培养基在37℃条件下220rpm震荡培养过夜，向细菌培养液中加入IPTG至终浓度为0.5mM，在37℃条件下220rpm震荡培养3.5h，然后4℃、4000rpm离心10min。弃掉上清，收集细菌沉淀，加入细菌裂解液重悬细菌沉淀，然后加入PMSF至终浓度为1mM，使用超声波破碎仪对细菌进行破碎，最后4℃12000rpm离心15min，收集上清。取部分上清进行SDS-PAGE检测以确定重组表达效果，另取未经诱导表达的BL21(DE3)破碎液上清作为SDS-PAGE对照。SDS-PAGE参数如下：浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为10％；每个上样孔上样20μL(待测样品与SDS-PAGE上样缓冲液等体积混匀后，沸水浴5min)；使用Tris-甘氨酸缓冲液(3.03g Tris，14.41g甘氨酸，1.00g SDS，1L蒸馏水)进行电泳；恒电流30mA使样品在浓缩胶中迁移；恒电流60mA使样品在分离胶中迁移。待溴酚蓝指示剂到达分离胶底部边缘时停止电泳，取出凝胶使用考马斯亮蓝R250染色，脱色后使用凝胶成像仪拍照。

参照使用说明，使用His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天)分离、纯化上述细菌破碎液上清中的带His标签的重组表达蛋白。取部分纯化的重组表蛋白进行SDS-PAGE，SDS-PAGE参数同上，凝胶使用考马斯亮蓝R250染色，脱色后使用凝胶成像仪拍照。

SDS-PAGE结果显示(图2)：图2中有：1表示SDS-PAGE标准分子量蛋白考马斯亮蓝染色结果；2表示未使用IPTG诱导的大肠杆菌BL21破碎液上清SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色结果；3表示经IPTG诱导的大肠杆菌BL21破碎液上清SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色结果；4表示纯化的重组表达仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色结果。

相比未经IPTG诱导的BL21(DE3)，经IPTG诱导的BL21(DE3)细胞破碎液上清中多出一条分子量约54kDa的蛋白条带，该蛋白条带的分子量基本符合仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段的估算分子量；通过His标签亲和纯化获得的目的蛋白分子量同样为54kDa左右，与IPTG诱导后BL21(DE3)新表达的蛋白一致。表明经IPTG诱导的BL21(DE3)成功表达了仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段，并且通过本发明的方法成功获得了纯化的重组表达仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段。

(2)免疫小鼠

用分离、纯化的重组表达的仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段作为抗原，免疫6周龄的Balb/C鼠，免疫参数如表4所示：

表4

(3)细胞融合

在无菌操作间中断颈法分别处死免疫的小鼠和3周龄的小鼠，在无菌操作台中分别取免疫小鼠的脾脏和3周龄小鼠的胸腺，用100目灭菌不锈钢网分别研磨脾脏和胸腺，使用预热至37℃的RPMI1640吹打重悬，获得脾细胞和胸腺细胞的单细胞悬液。将脾细胞和胸腺细胞的单细胞悬液在室温下1000rpm离心5min，在无菌操作台中弃掉上清，使用预热至37℃的含有1％HAT和15％胎牛血清的RPMI 1640重悬胸腺细胞并转移至37℃CO

(4)检测筛选和克隆

上述培养板培养1-2周左右，取变黄的杂交瘤细胞培养上清进行ELISA检测。ELISA操作流程如表5所示：

表5

按上述小鼠胸腺单细胞悬液制备方法制备Balb/C小鼠的胸腺细胞RPMI1640悬液(含15％胎牛血清)，采用有限稀释法克隆上述ELISA检测呈阳性的杂交瘤细胞株，并使用RPMI1640(含15％胎牛血清和Balb/C小鼠胸腺细胞)培养基在37℃CO

ELISA筛选结果如表6所示：32株单克隆杂交瘤细胞株所分泌的抗体中，仅V2F5C8和V2C3C1细胞分泌的抗体可特异性与雌性仿刺参体腔液上清反应，而不与雄性仿刺参体腔液上清反应，并且，抗体V2F5C8的阳性强于V2C3C1。

因此，根据ELISA检测结果，最终筛选、保留单克隆杂交瘤细胞株V2F5C8。

注：“+”表示结果为阳性，“+”数量表示阳性强弱；“－”表示结果为阴性。

(5)交瘤细胞株V2F5C8的扩大培养、免疫学检测和冻存

将交瘤细胞株V2F5C8从96孔板转移至24孔板扩大培养，培养基为RPMI1640(含15％胎牛血清)，培养条件为37℃、CO

通过解剖分别获取10只雌性仿刺参和10只雄性仿刺参的体腔液，4℃、3000rpm离心10min，获得体腔液上清。从每只雌性仿刺参的体腔液上清中取1mL体腔上清进行混合，得到来自于10只雌性仿刺参的混合体腔液上清。同样从每只雄性仿刺参的体腔液上清中取1mL体腔上清进行混合，得到来自于10只雄性仿刺参的混合体腔液上清。分别以纯化的重组表达仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段、仿刺参雌性和雄性个体的混合体腔液上清为样品进行SDS-PAGE，SDS-PAGE操作流程同上。SDS-PAGE结束后，通过湿转法将凝胶中的蛋白条带转印至0.45μm孔径的PVDF膜上。转印操作流程如下：将SDS-PAGE后的凝胶取出于电转移缓冲液(25mM Tris-Base，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.35)中浸泡15min；PVDF膜依次在甲醇中浸泡5S、超纯水中浸泡2min、电转移缓冲液中浸泡5min；按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵的顺序放置并固定；将上述海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜组合放置于盛有电转移缓冲液的电泳槽内，凝胶一侧朝向负极；恒电压30V电泳1.5h；电泳完成后，将PVDF膜中预染的标准分子量蛋白条带剪下并保存，剩余PVDF膜浸于立春红染色液(0.5g立春红溶于1mL冰乙酸，加蒸馏水定容至100mL)染色，根据染色结果剪开各样品对应的电泳条带，使用0.1MNaOH洗脱立春红染色。使用裁剪好的PVDF膜进行免疫印迹反应，操作流程如表7所示，表7

Western-blot结果显示(图3)：图3中有：1表示预染的SDS-PAGE标准分子量蛋白；2表示本发明的单克隆抗体特异性的与重组表达的仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段反应；3表示本发明的单克隆抗体特异性的与雌性仿刺参体腔液上清中的ECMP(BAJ41227.1)反应；4表示本发明的单克隆抗体不与雄性仿刺参体腔液上清发生反应；5表示以重组表达的仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段为样品的western-blot阴性对照；6表示以雌性仿刺参体腔液上清为样品的western-blot阴性对照；7表示以雄性仿刺参体腔液上清为样品的western-blot阴性对照。

单克隆抗体V2F5C8能够识别重组表达的仿刺参ECMP(BAJ41227.1)25-492aa肽段，并且能够与雌性仿刺参体腔液上清中的分子量约为77kDa的蛋白条带反应，该蛋白条带分子量与仿刺参ECMP(BAJ41227.1)估算分子量基本一致，并且单克隆抗体V2F5C8与雄性仿刺参体腔液上清不发生反应。表明本发明的单克隆抗体能够识别仿刺参ECMP(BAJ41227.1)，且与仿刺参体腔液上清的其他蛋白无明显交叉反应，具有较好的特异性。

分别以仿刺参雌性和雄性个体的混合体腔液上清为抗原样品进行包被(50μL/孔)，并使用单克隆抗体V2F5C8进行ELISA检测，ELISA操作步骤同上。ELISA检测结果显示，雌性仿刺参混合体腔液上清样品的P/N值为2.22±0.04，雄性仿刺参混合体腔液上清样品的P/N值为1.17±0.05，表明雌性仿刺参混合体腔液上清样品的ELISA检测结果为阳性，而雄性仿刺参混合体腔液上清样品的ELISA检测结果为阴性。

将生长旺盛、贴壁紧密、形态良好的杂交瘤细胞用胎牛血清吹打呈细胞悬液，将细胞悬液按体积比9:1的比例与DMSO混合，取上述混合细胞悬液1mL装入2mL灭菌冻存管，用厚毛巾紧密包裹后在-80℃条件下放置12h以上，然后转移至液氮中保存。本发明获得的生长旺盛、形态良好的杂交瘤细胞，其名称为：小鼠杂交瘤细胞V2F5C8，该细胞株已于2021年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为保藏号为：CCTCCNO：C2020258。

实施例3基于单克隆抗体的ELISA法检测仿刺参性别

(1)制备体腔液上清

随机选取60只性腺已发育的仿刺参，用灭菌注射器刺入仿刺参的体腔抽取体腔液150μL，离心(4℃，3500rpm，10min)，取上清作为体腔液上清。

(2)ELISA检测仿刺参性别

以上述制备的仿刺参体腔液上清为抗原样品进行酶标板包被(50μL/孔)，使用本发明的单克隆抗体进行ELISA检测，ELISA操作流程同上。ELISA检测结果为阳性时，判定该体腔液上清来源的仿刺参为雌性，反之为雄性。

(3)解剖鉴定仿刺参性别

将随机选取的60只性腺已发育的仿刺参进行解剖，观察性腺颜色并结合镜检判定仿刺参性别，作为ELISA检测仿刺参性别准确度的依据。

结果如表8所示：随机选取的60只性腺已发育的仿刺参中，经解剖性腺鉴定有34只为雌性，26只为雄性；经ELISA检测有30只为雌性，30只为雄性，ELISA检测准确率高达93.3％，效果显著，适于推广应用。

表8

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 辽宁省海洋水产科学研究院

<120> 抗仿刺参卵壳基质蛋白的单克隆抗体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1407

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcggcgatg acatcagcca agataacgaa gacaaccgct ttgccgaaat gggccaagtt 60

accaagaaca cctttgacat cacggacggc caagttgaac tgattttcga cgtgcaagat 120

accaagaaca tcgatgaact ctggattctg gacttcgaac cgtaccgctt cgatgaattc 180

gcgctgccag tgaacgaact gaccggcgag ctgattctga ataacacggg cgattgcagc 240

agcgtgtatg agacggtgca gtggaccttc ttcaacgaca gctacttccg cgaccgcaac 300

gaagcgcagc tgagcaccaa gaatctgttc accagcttcg tgagcggcga gaattatgac 360

ggcgacggta tccgtacgga tcagatcatc taccgcggca cgatcgccag cttcttcgag 420

tgcaagaaaa gcgacgagga gagtgatgtg tgggtgcaga ccaacacgag tagcgacgac 480

gaaatcgagt accgcaccaa agtgtacgcg accaatgttc gcccaaaaga tccggcggat 540

aacgaggcgg gcgtgagctt cgtgcaaagc cacatcgagc tgatttggcg tctgagccgt 600

caagccatta gtaatttcat tattagcagc acggccgttc tgaagccggt gattgatttt 660

gcgcgcgtta gcgccatctt tgatggtcaa ggcgagccga tcccagaaga aacgcgcctc 720

cacctccgtt ttacgacgat tctggatagc gacgagcaaa tcgtgagcta caacagcagt 780

ggtacccagt tcaccccaga taacccgctg catggcctca aagagatcgt gtacgaacca 840

accccgaccc tcgatgcggc gccagtttgt gaccgtcaac tggatgtggg caccggcacc 900

caattccagt gccaccagac gtggaatttc atttttgtgc tcgacatcga cacggccagc 960

cagaccaaga acttcgttcc gatcgacgcg agcggtacgt tcgacttttt cttcgatgtg 1020

tacagttgcg acctcaccca gaatgtgctc gacaaagcga cgtgcaacaa gatcgaccca 1080

gcgccggcca aggttagcac gctgatcacg atccagacga cggtgttcat cacggataag 1140

gaggacgatc aagttagcat tctcctcgtt agcctcaaag gtgccaacaa cgatgagctc 1200

agcggtgttg cggcccgtgg tgttgcccac aaggaggacg tgaccctcca agttaaattc 1260

agcccggcgc tgctccgcaa ggactacgat ctggatctga tgctgttcat ggtgtgcaag 1320

ggcgagcagt acgccggtga aaattttctg caaggctgcc tccaagcccc gattagtgaa 1380

cgctacgtgg cccacaaagc cagctaa 1407