一种基于核酸质谱的风湿免疫疾病用药的基因检测方法及其应用

摘要

本发明提供一种基于核酸质谱的风湿免疫疾病(尤其类风湿疾病)用药的基因检测方法及应用。本发明基于MassArray核酸质谱平台设计优化检测风湿免疫用药相关SNP位点的引物组及其检测体系，可对风湿用药相关的点突变进行准确分型，具有准确性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测周期短、结果直观等诸多优势。

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于核酸质谱的风湿药物用药(尤其类风湿)基因检测方法及其应用。

背景技术

风湿免疫病临床上最常见的主要包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、痛风等。其中，类风湿关节炎(RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。风湿免疫类疾病是迁延反复的疾病，多数患者需要在相当长时间内带病生存，且绝大部分病种目前尚无根治方法，治疗以通过药物控制病情、维持临床缓解、提高生存质量为目的。但可惜的是，即使在指南标准药物治疗方案下规律治疗，其疾病的控制率和缓解率依然很低。

在临床上，风湿免疫疾病治疗过程中，风湿免疫疾病患者的基因多态性会导致药物疗效和不良反应发生个体差异，可以通过对患者基因的筛查制订个体化给药方案，提高疗效和降低不良反应发生。

尽管现有技术中已有针对风湿免疫疾病个体化用药相关的检测，但不同检测方法侧重不同，难以满足临床实际需求。目前市场上与风湿免疫疾病(尤其类风湿免疫疾病)个体化用药相关的检测无法准确全面评估治疗中的有效性和安全性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题是寻求适于风湿免疫疾病用药(尤其类风湿)相关基因检测的方法，因此本发明的目的如下：

本发明的第一目的是提供一种用于风湿免疫疾用药相关基因检测相关SNP位点的引物组。

本发明的第二目的是提供一种上述风湿免疫疾用药相关基因检测相关SNP位点的引物组在风湿用药相关基因检测中的应用。

本发明的第三目的是提供一种风湿免疫疾用药相关基因检测方法。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种用于检测风湿免疫疾病用药相关SNP位点的引物组，所述引物针对如下SNP位点：rs10306114、rs1042597、rs1045642、rs1050828、rs1050829、rs10509681、rs1051266、rs1057910、rs1061631、rs1065852、rs10919563、rs11188072、rs1128503、rs1142345、rs11572080、rs11678615、rs116855232、rs11706052、rs12041331、rs12208357、rs12248560、rs1229984、rs1495741、rs1544105、rs16947、rs1695、rs17602729、rs1799724、rs1799971、rs1800462、rs1800629、rs1801131、rs1801133、rs1801279、rs1801280、rs2032582、rs2187668、rs2231142、rs2234693、rs2740574、rs289714、rs3131003、rs3213422、rs3397、rs34650714、rs35167514、rs361525、rs3731722、rs3758149、rs3794271、rs41303343、rs4244285、rs4646437、rs4673993、rs4802101、rs4846051、rs4986893、rs5030865、rs5918、rs6028945、rs6138150、rs662、rs671、rs7046653、rs719235、rs7254579、rs730012、rs7301582、rs7439366、rs7574865、rs75995567、rs762551、rs776746、rs854555、rs9340799、rs983332、rs9923231。

在一些实施方式中，将所述引物组分为如下4组：

第一组包括检测rs41303343、rs10306114、rs5918、rs2231142、rs671、rs1799724、rs854555、rs1051266、rs1061631、rs11572080、rs17602729、rs4846051、rs662、rs3213422、rs1042597、rs4986893、rs1495741、rs1801133、rs1050829、rs7301582、rs983332、rs1695、rs2740574、rs1229984、rs10509681、rs1544105、rs730012的引物组；

第二组包括检测rs361525、rs289714、rs7254579、rs762551、rs9340799、rs1800629、rs12041331、rs7046653、rs1057910、rs1045642、rs11188072、rs1050828、rs4673993、rs6138150、rs776746、rs12248560、rs34650714、rs1801279、rs11678615、rs3794271、rs6028945、rs11706052、rs116855232、rs4646437、rs1801280、rs719235的引物组；

第三组包括检测rs10919563、rs2187668、rs3131003、rs75995567、rs3758149、rs3731722、rs35167514、rs1799971、rs4244285、rs7439366、rs12208357、rs1142345、rs2234693、rs2032582、rs1800462引物组；

第四组包括检测rs16947、rs1065852、rs1801131、rs5030865、rs9923231、rs1128503、rs3397、rs4802101、rs7574865引物组。

在一些实施方式中，所述引物序列分别如SEQ ID NO.1-154所示，或者所述引物序列分别与SEQ ID NO.1-154具有至少85％同一性。

在一些实施方式中，所述引物组进一步包括延伸引物，所述延伸引物序列如SEQID NO.155-231所示，或者所述延伸引物序列与SEQ ID NO.155-231具有至少85％同一性。

在一些优选的实施方式中，所述引物组序列的分组如下：

第一组：引物序列如SEQ ID NO.1-54和SEQ ID NO.155-206所示；

第二组：引物序列如SEQ ID NO.55-106和SEQ ID NO.182-207所示；

第三组：引物序列如SEQ ID NO.107-136和SEQ ID NO.208-222所示；

第四组：引物序列如SEQ ID NO.137-154和SEQ ID NO.223-231所示。

本发明提供了一种上述引物组在制备检测风湿免疫疾病用药相关产品中的应用。

本发明还提供了一种上述的引物组在核酸质谱检测中的应用。

本发明还提供了一种用于风湿免疫疾病用药相关基因检测的组合物/产品/试剂盒，其特征在于，所述组合物/产品/试剂盒包括上述引物组。

在一些实施方式中，所述组合物/产品/试剂盒还包括用于检测SNP位点的常规试剂和/或软件。

在一些实施方式中，所述软件为MassARRAY软件。

本发明还提供了一种风湿免疫疾病用药的基因检测方法，所述方法包括应用上述的引物组对待测样品基因组中SNP位点的核苷酸序列进行检测。

在一些实施方式中，所述检测基于MassARRAY平台。

本发明的有益技术效果：

1)本发明筛选针对中国人群与风湿免疫疾病(尤其类风湿免疫疾病)用药的相关SNP位点，可以实现全面有效的类风湿用药相关基因检测。

2)本发明经大样本测试筛选，通过对引物序列、引物靶向区段以及延伸引物方向等的调整及优化，得到的引物序列能对样本进行准确分型、特异性高；另外通过分组优化，保证每组内引物间互相无干扰。上述优化满足质谱检测技术的要求，实现MassARRAY系统对待测样本的风湿免疫疾病(尤其类风湿免疫疾病)用药进行快速有效的检测。

3)本发明检测体系成本低、周期短、操作简单，已在市场广泛推广，商业回报高。

附图说明

图1为本发明实施例2提供的rs4802101位点优化前位点的聚类图；

图2为本发明实施例2提供的rs4802101位点优化后位点的聚类图；

图3为本发明实施例2提供的rs10509681位点优化前位点的聚类图；

图4为本发明实施例2提供的rs10509681位点优化后位点的聚类图；

图5为本发明实施例2提供的rs1229984位点优化前位点的聚类图；

图6为本发明实施例2提供的rs1229984位点优化后位点的聚类图；

图7为本发明实施例2提供的rs116855232位点优化前位点的聚类图；

图8为本发明实施例2提供的rs116855232位点优化后位点的聚类图；

图9为本发明实施例2提供的rs10919563位点优化前位点的峰图；

图10为本发明实施例2提供的rs10919563位点优化后位点的峰图；

图11为本发明实施例2提供的rs1128503位点优化前位点的峰图；

图12为本发明实施例2提供的rs1128503位点优化后位点的峰图；

图13为本发明实施例2提供的并孔后rs1801131位点的聚类图；

图14为本发明实施例2提供的并孔后rs1801131位点的聚类图；

图15为本发明实施例2提供的并孔后rs7574865位点的聚类图；

图16为本发明实施例2提供的并孔后rs7574865位点的聚类图；

图17为本发明实施例2提供的并孔后rs9923231位点的聚类图；

图18为本发明实施例2提供的并孔后rs9923231位点的聚类图；

图19为本发明实施例3提供rs7574865位点的峰图和测序结果图；

图20为本发明实施例3提供rs9923231位点的峰图和测序结果图；

图21为本发明实施例3提供rs11706052位点的峰图和测序结果图；

图22为本发明实施例3提供rs1128503位点的峰图和测序结果图；

图23为本发明实施例3提供rs10306114位点的峰图和测序结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明通过附图和如下实施例进一步描述，所述的附图和实施例只是为了例证本发明的特定实施方案，不应理解为以任何方式限制本发明范围之意。

本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：

表1主要试剂信息

本发明实施例中用到的主要仪器信息如下：

表2主要仪器信息

实施例1检测位点的论证与筛选

综合考虑中国人群基因型特性，针对风湿免疫疾病(尤其类风湿)用药的相应多态性位点进行选择，确立可行的对应SNP位点如下：rs10306114、rs1042597、rs1045642、rs1050828、rs1050829、rs10509681、rs1051266、rs1057910、rs1061631、rs1065852、rs10919563、rs11188072、rs1128503、rs1142345、rs11572080、rs11678615、rs116855232、rs11706052、rs12041331、rs12208357、rs12248560、rs1229984、rs1495741、rs1544105、rs16947、rs1695、rs17602729、rs1799724、rs1799971、rs1800462、rs1800629、rs1801131、rs1801133、rs1801279、rs1801280、rs2032582、rs2187668、rs2231142、rs2234693、rs2740574、rs289714、rs3131003、rs3213422、rs3397、rs34650714、rs35167514、rs361525、rs3731722、rs3758149、rs3794271、rs41303343、rs4244285、rs4646437、rs4673993、rs4802101、rs4846051、rs4986893、rs5030865、rs5918、rs6028945、rs6138150、rs662、rs671、rs7046653、rs719235、rs7254579、rs730012、rs7301582、rs7439366、rs7574865、rs75995567、rs762551、rs776746、rs854555、rs9340799、rs983332、rs9923231。

实施例2引物的设计以及反应体系的建立

鉴于MassARRAY检测是一种基于多重PCR扩增的反应，引物组合必须避免交叉扩增、偏好性扩增和非特异性等问题(D.van den Boom et al./International Journal ofMass Spectrometry，238(2004)，173–188)，因此该反应体系引物设计需经大量优化过程。

首先，本发明通过MassARRAY网址的引物设计软件(Assay Design Suite)，调整相关参数，完成77个位点的PCR和UEP的引物的初步设计，导出设计好的引物及各参数文件，并合成引物。按照引物配置表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX，并微调延伸引物MIX直至符合要求。然后进行引物测试和优化。具体步骤如下：

(1)将基因组DNA样本稀释至10ng/μL，按下表配制PCR反应MIX(以下为单个样本量)

表3 PCR反应体系

封膜，2272g离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：

表4 PCR扩增反应条件

(2)虾碱性磷酸酶消化(SAP)

取出PCR板，2272g离心1分钟，按下表配制SAP反应体系(以下为单个样本量)：

表5 SAP反应体系

每个反应孔加2μL SAP混液，封膜，2272g离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：

表6酶解纯化条件

(3)单碱基延伸(EXT)

取出PCR板，2272g离心1分钟，按下表配制EXT反应体系，其中Extend Primer Mix为两组位点不同的延伸引物混液(以下为单个样本量)：

表7 EXT反应体系

每个反应孔加入2μL延伸混液，封膜，2272g离心1分钟，将板放上PCR仪进行以下热循环：

表8 EXT反应条件

(4)树脂脱盐

A.把洁净树脂(Resin)铺平在dimple plate应孔上，风干最少10分钟；

B.样本板取出，板式离心机2272g离心1分钟；

C.样本板每一个有样本的孔里加入16μL水，封板；

D.轻轻将样本板凌空翻转，放在已放树脂的dimple plate上，然后将dimpleplate连样本板一起翻转(过程中两快板不可水平移动)，让树脂掉到孔里；

E.2272g离心5分钟。

(5)Dispensing点样

使用MassARRAY CPM将样本点到对应的SpectroCHIP(芯片)上。

(6)MALDI-TOF

使用MALDI-TOF(基质辅助激光解吸电离-飞行时间)质谱仪获得数据。

应当指出的是，MassARRAY检测的特殊性在于，需要先通过PCR反应扩增出含有目标SNP位点的片段，再通过延伸引物延伸出SNP位点的碱基，通过其产物的分子量判断其SNP位点信息。本发明可在一个反应体系中检测出多种SNP位点信息，这需要各SNP位点的PCR反应、延伸反应间不能有明显的干扰。

靶向区域调整、UEP引物调整：以rs4802101、rs10509681、rs1229984、rs116855232、rs10919563和rs1128503位点引物优化为例：

rs4802101位点出现no call，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGTCGAGACCATCCTGGCCCAC，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGAGCTGGGATTAAAAGTACCC)和更改UEP引物(更改前UEP序列为：CCATCTGTACTAAAAACACAAAAATTA)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测试效果更好，no call现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现no call，更改引物前的具体的聚类峰图如图1所示，更改引物后的具体的聚类峰图如图2所示。从图中可以看出更改引物前的聚类均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。

rs10509681位点出现no call，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGTGGCATTACTGACTTCCGTG，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGCAGGGCACAACCATAATGGC)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物测试效果更好，no call现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现no call，更改引物前的具体的聚类峰图如图3所示，更改引物后的具体的聚类峰图如图4所示。从图中可以看出更改引物前的聚类均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。

rs1229984位点出现no call，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGAGGTTGCCACTAACCACGTG，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGTGAATCTGAACAGCTTCTCT)和更改UEP引物(更改前UEP序列为：GACAGATTCCTACAGC)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测试效果更好，no call现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现no call，更改引物前的具体的聚类峰图如图5所示，更改引物后的具体的聚类峰图如图6所示。从图中可以看出更改引物前的聚类均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。

rs116855232位点出现no call，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGCCTTTGTATCCCACCAGATG，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGGAACTACCTCCCCTGGACCA)和更改UEP引物(更改前UEP序列为：GCCTTGTTCTTTTAAACAAC)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物和UEP引物测试效果更好，no call现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现no call，更改引物前的具体的聚类峰图如图7所示，更改引物后的具体的聚类峰图如图8所示。从图中可以看出更改引物前的聚类均为no call，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。

rs10919563位点出现出峰较低现象，经过重新设计PCR引物(更改前上游引物序列为：ACGTTGGATGGAGAAGGGATCCCAGACCAA，更改前下游引物序列为：ACGTTGGATGTCATTTGCATGTTTACAGTAT)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后的PCR引物测试效果更好，出峰较低现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现出峰较低现象，优化之前引物前位点峰图如图9所示，更改引物优化后的位点峰图如图10所示。从图中可以看出更改引物前该位点出峰较低，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。

rs1128503位点出现偏峰现象，经过重新设计UEP引物(更改前引物序列为：ACTCTGCACCTTCAGGTTCAG)后，按照上述步骤进行测试，发现更改后UEP引物测试效果更好，偏峰现象改善。通过对40例样本进行测试均未出现明显偏峰现象，优化之前引物前位点峰图如图11所示，更改引物优化后的位点峰图如图12所示。从图中可以看出更改引物前的位点有偏峰现象，而更改后的聚类正常且都成功报出位点基因型，这说明更改后的引物优于更改前的引物，符合本项目的检出要求。

引物间并孔调整：以rs1801131、rs7574865、rs9923231位点优化引物为例。

rs1801131、rs7574865、rs9923231位点在并孔之前，rs9923231在well1中，rs1801131和rs7574865在well2中；优化调整之后全部在well4中。通过对40例样本进行聚类，rs1801131位点聚类图13、rs7574865位点聚类图14和rs9923231位点聚类图15，可以看出并孔后符合本项目要求。

综上，获得了最优PCR扩增引物及单碱基延伸(UEP)引物，具体引物序列参见表9和10的引物序列。

表9 PCR扩增引物序列信息

表10 UEP引物序列

实施例3临床结果实验(与一代测序比较)

本发明在确认最优反应体系后又进行了一系列的验证实验，包括准确性、重复性及一次实验成功率进行的实验验证。具体的验证方案如下：

(1)准确性实验验证方案：77个位点各选取至少5例样本进行Sanger测序，并比对sanger测序与MassARRAY的结果。

要求一致性大于95％则验证通过。

(2)重复性实验验证方案：挑取5例临床样本，每个样本重复2次进行检测。

要求2次检测结果一致性为100％。

具体的验证过程如下：首先按照本发明实施例1提供的体系加量表配制扩增引物MIX和延伸引物MIX。然后按照实施例1中的操作步骤，分别进行PCR扩增、虾碱性磷酸酶消耗、单碱基延伸、树脂脱盐和MassARRAY CPM点样分析等步骤后进行结果分析。准确性和重复性结果见下表。

表11准确性的验证结果(部分位点为例)

经至少5例临床样本MassARRAY结果和Sanger结果的比对可知，本发明的体系验证实验的准确性为100％。选取部分位点rs7574865、rs9923231、rs11706052、rs1128503和rs10306114进行结果展示(图19、图20、图21、图22和图23)，附图结果中同样可以得出，本发明的准确性为100％。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

序列表

<110> 南京先声医学检验有限公司

江苏先声诊断技术有限公司

南京先声诊断技术有限公司

<120> 一种基于核酸质谱的风湿免疫疾病用药的基因检测方法及其应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgttggatg agagggtggt tgtaagattc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgttggatg cttccgataa ctgagcacct 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgttggatg gccaaatatt tctccctccc 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acgttggatg cactgtgcac cttcttcaag 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acgttggatg tggccagtac gatgatgcag 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acgttggatg caggtagaag aggcggttg 29

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acgttggatg tggcattact gacttccgtg 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgttggatg cttatctaga aagtggccag 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgttggatg tgaagccgta gaagcaaagg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

acgttggatg agaagcaggt gcccgtggaa 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acgttggatg aggcaggcca ttcaacttac 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acgttggatg ttgtgtctgc gtctgtgttg 30