H3流感病毒的广泛反应免疫原、组合物及其使用方法

摘要

本文提供衍生自H3流感病毒的的非自然发生、广泛反应、泛表位抗原，其具有免疫原性并且能够在引入受试者后引发针对H3病毒的广泛反应免疫反应，例如广泛反应中和抗体反应。本文亦提供非自然发生、广泛反应的免疫原、疫苗、类病毒颗粒(VLP)以及包含免疫原及疫苗的组合物。本文提供了通过施用免疫原、疫苗、VLP或其组合物在受试者中产生免疫反应的方法。特别地，免疫原包含H3流感病毒株的血凝素(HA)蛋白。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张2018年7月13日提交的美国临时申请62/697,846的优先权及益处，其全部内容通过引用方式将其全部整体并入本文。

背景技术

2017年，美国疾病控制与预防中心预估季节性流感疫苗的有效率仅为42％。此有限的效力是由于在A型流感(H3N2)疫苗株中发生的突变所导致感染个体中的流感。此外，由B型流感病毒引发的流感病例在2017年至2018年期间有所上升。鉴于一恶劣的流感季节仅在美国即可杀死约50,000人，因此迫切需要改进的免疫原及疫苗，以提供广泛的对抗病毒防护，尤其是针对目前和将来循环的A型H3或H3N2流感病毒。

发明内容

如下所述，提供了非自然发生、广泛反应抗原及源自H3流感病毒(本文中亦称作“H3流感”、“H3流感病毒”，或“H3病毒”)，例如H3N2亚型，的抗原序列。此等H3病毒抗原通常是结构蛋白或肽以及包含，例如：血凝素(HA)蛋白，或HA蛋白的HA1(头)或HA2(尾或茎)部分，并且是有效的免疫原，可引发针对H3 HA蛋白的广泛反应免疫反应，最终，针对受试者目前和将来的H3病毒株。如本文所指，在受试者中引发免疫反应的H3病毒抗原或抗原序列是免疫原性抗原或免疫原。此等H3免疫原被称作广泛反应及泛表位抗原，这是因为它们可以直接针对具有序列相似性及变异性的不同亚型或H3病毒株引发广泛反应抗体，以及其抗原及序列中的表位的多样性，特别是HA抗原。

一方面，非自然发生H3病毒抗原氨基酸序列及包含本文所述序列的抗原(例如结构抗原)包含广泛反应表位，其反映了过去、现在及将来的H3抗原的序列相似性及变异性。这种抗原序列及包含所述序列的抗原因此被称作“非自然发生、广泛反应、泛表位”抗原。抗原是免疫原性的，并且当被引入或施用于受试者时，在受试者中引发针对H3病毒的广泛反应抗体，例如中和抗体，特别是H3抗原，例如HA或其抗体结合部分。在一实施例中，这样的H3抗原序列是氨基酸序列。在一实施例中，H3抗原序列是多核苷酸序列，例如：编码本文描述的抗原的氨基酸序列的多核苷酸序列。为了便于参考，本文所述的H3病毒的“非自然发生、广泛反应、泛表位”抗原被称作“广泛反应抗原”。

本文所述的广泛反应性H3抗原是免疫原，因为它们在受试者中引发广泛反应性免疫反应。免疫反应特别是中和抗体反应的形式，例如：特异性针对H3病毒的HA抗原并且中和HA蛋白活性的中和抗体。因此，还提供了包含本文所述的广泛反应性H3抗原的免疫原和免疫原性组合物，包含在受试者中诱导针对H3病毒(例如针对H3病毒的HA蛋白)的免疫反应的免疫原性组合物，例如疫苗(例如多肽或多核苷酸产物)。为了便于参考，本文所述的“非自然发生、广泛反应、泛表位”H3病毒免疫原将被称作“广泛反应免疫原”。

亦提供了方法，使用本文所述的免疫原，在受试者中诱导针对H3流感感染、疾病及/或其症状的免疫反应。在一特定实施例中，H3病毒抗原是H3流感病毒的HA、HA1，或HA2蛋白，或流感病毒的H3N2亚型，或与其相关的病毒类型，或其抗体结合部分。亦提供了使用免疫原在受试者中诱导免疫反应的方法。

在一方面，H3HA免疫原性抗原具有与图1A及1B中列出的一种或多种HA蛋白(在本文中称作“TJ1至9HA”)的H3 HA多肽(或HA1或HA2多肽)序列至少或等于85％、至少或等于90％、至少或等于91％、至少或等于92％、至少或等于93％、至少或等于94％、至少或等于95％、至少或等于96％、至少或等于97％、至少或等于98％，或至少或等于99％相同的氨基酸序列。

在一方面，广泛反应H3抗原序列能够针对目前和未来的H3流感病毒株产生免疫反应，可以通过例如在2018年7月13日提交的共同申请待决的临时专利申请号62/697,803所描述的方法产生，其内容在此通过引用的方式并入，以及其中涉及H3抗原序列的参数的考虑，例如HA抗原序列，从一个时间跨度或范围(例如：线性时间范围)，如一种或多种流感季节，以及地理位置(或多个)在其中所述H3病毒分离，诸如，例如：南半球或北半球。

在一方面，提供了H3流感病毒(H3病毒)的非自然发生、广泛反应、泛表位的抗原，能够针对目前和未来H3病毒株产生免疫反应。其中H3病毒抗原包含与图1A至1C中列出的HA抗原(TJ-1至TJ-9)的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

在另一方面，提供了H3流感病毒(H3病毒)的非自然发生、广泛反应、泛表位的抗原，能够针对目前和未来H3病毒株产生免疫反应。在一实施例中，抗原是血凝素(HA)、HA1，或HA2，或其抗体结合蛋白部分。在一实施例中，H3病毒抗原包含与图1A至1C中列出的HA抗原的氨基酸序列至少95％相同或至少98％相同的氨基酸序列。在一特定实施例中，H3病毒抗原包含图1A至1C中列出的HA抗原的氨基酸序列。

将理解的是，提供了非自然发生、广泛反应、泛表位的免疫原，为简单起见，其在本文中可互换地称作“非自然发生免疫原”、“广泛反应免疫原”，或“泛表位免疫原”。

在另一方面，提供一种类病毒颗粒(VLP)，其包含根据前述方面的H3病毒免疫原性抗原。在一实施例中，VLP包含编码H3病毒抗原的多核苷酸。

在另一方面，提供一种非自然发生、泛表位的免疫原，能够针对目前和未来H3流感(H3)病毒株产生免疫反应；其中免疫原包含与图1A至1C所示的HA抗原(TJ-1至TJ-9)的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。

在另一方面，提供一种非自然发生、广泛反应、泛表位的免疫原，能够针对目前和未来H3流感病毒株产生免疫反应。在一实施例中，H3病毒抗原、免疫原，或VLP引发中和抗体的产生。在一实施例中，所述抗体具有血凝素抑制活性。在一实施例中，H3病毒抗原、免疫原，或VLP引发T淋巴细胞的产生。

在另一方面，提供一种药学上可接受的组合物，其包含前述方面及所述实施例中任一项的H3病毒抗原、免疫原，或VLP，以及药学上可接受的载体、稀释剂，或赋形剂。在一实施例中，所述组合物亦包含佐剂。

在另一方面，提供一种疫苗或免疫原性组合物，其包含前述方面及所述实施例中任一项的H3病毒抗原、免疫原，或VLP。

在另一方面，提供一种在受试者中产生免疫反应的方法，其中所述方法包含向受试者施用有效量的前述方面及所述实施例中任一项的所述免疫原、医药组合物、疫苗，或VLP。在一实施例中，引发的免疫反应包含中和抗体及/或T淋巴细胞的产生。

在一方面，广泛反应的H3免疫原是分离及/或纯化的。在另一方面，配制了广泛反应H3免疫原，以施用于需要其的受试者。在另一方面，将广泛反应H3免疫原或包含所述免疫原的组合物，以有效量施予需要其的受试者，以引发受试者的免疫反应。在一实施例中，所述免疫反应引发中和抗体。在一实施例中，所述免疫反应是预防性或治疗性的。

在另一方面，提供一种包含广泛反应H3免疫原的疫苗或免疫原性组合物。

在另一方面，提供一种包含广泛反应H3免疫原或其序列的类病毒颗粒(VPLs)。在一实施例中，所述序列是氨基酸序列。在一实施例中，所述序列是编码氨基酸序列的多核苷酸序列。

在另一方面，提供一种在受试者中产生免疫反应的方法，其中所述方法包含给所述受试者施用有效量的前述方面及所述实施例中任一项的所述H3广泛反应免疫原、疫苗、VLP，或组合物。在所述方法的一实施例中，佐剂同时被施予受试者。

定义

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属或涉及的本领域技术人员通常理解的含义。下列参考文献为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的一般定义：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(1994年第2版)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编辑，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等人(编辑)，Springer Verlag(1991)；Benjamin Lewin，Gene V，Oxford University Express出版，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人，(编辑)；Blackwell Science Ltd.出版的The Encyclopedia ofMolecular Biology，1994(ISBN 0-632-02182-9)；Molecular Biology andBiotechnology:a Comprehensive Desk Reference，Robert A.Meyers(编辑)，由VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；以及Hale&Marham，The HarperCollins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。

“佐剂”是指非特异性增强对抗原的免疫应答的物质或载体。佐剂可以包含其上吸附了抗原的矿物质(例如明矾，氢氧化铝或磷酸盐)悬浮液；或油包水型乳剂，其中抗原溶液在矿物油中乳化(例如：弗氏不完全佐剂)，有时包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)，以进一步增强抗原性。

免疫刺激性寡核苷酸(如彼等包含CpG基序)亦可用作佐剂(参见，例如：美国专利号6,194,388；6,207,646；6,214,806；6,218,371；6,239,116；6,339,068；6,406,705；以及6,429,199)。佐剂亦包含生物分子，例如共刺激分子。示例性的生物佐剂包含，但不限于，介白素-1(IL-2)、“记忆调控激活、正常T表达及分泌”(RANTES)的蛋白质记忆T细胞引诱剂、粒细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、淋巴细胞功能-相关抗原3(LFA-3，亦称作CD58)、分化抗原簇72(CD72)、(B细胞反应性的负调节剂)、膜周边蛋白B7-1(B7-1，亦称作CD80)、膜周边蛋白B7-2(B7-2，亦称作CD86)，所述TNF配体超家族成员4配体(OX40L)或属于TNF超家族(4-1BBL)的2型跨膜糖蛋白受体。

“施用”是指给予、供应、分配组合物、试剂、治疗剂等给受试者，或将组合物等施加或使其与受试者接触。施加或施用可以通过多种途径中的任一种来完成，例如：但不限于，局部、口服、皮下、肌内、腹膜内、静脉内(IV)、(注射)、鞘内、肌内、真皮、皮内、颅内、吸入、直肠、阴道内，或眼内。

“试剂”是指任何小分子化合物、抗体、核酸分子、肽、多肽或其片段。

“改变”是指通过标准领域已知的方法如本文所述的方法检测到的基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或降低)。如本文所用，改变包含表达水平的5％变化，表达水平的10％变化，优选25％的变化，更优选40％的变化，以及最优选50％或更大的表达水平的变化。

“改善”是指降低、减少、减轻、抑制、减弱、阻止或稳定疾病或病理状况的发展或进程。

“类似物”是指不同但具有相似的功能或结构特征的分子。例如：多肽类似物保留了相应的自然发生的多肽的生物活性，同时具有某些生物化学修饰，相对于自然发生的多肽，其可以增强类似物的功能。这种生化修饰可以增加类似物的蛋白酶抗性、膜通透性，或半衰期，而不会改变，例如：配体结合。类似物可包含非天然氨基酸。

“抗体”是指由B淋巴样细胞产生并具有特定氨基酸序列的免疫球蛋白(Ig)分子。暴露于特定抗原(免疫原)后，在受试者(人类或其他动物或哺乳动物)中诱发或引发抗体。能够产生针对特定抗原/免疫原的抗体/免疫球蛋白(即免疫反应)的受试者，被称作具有免疫能力。抗体的特征在于以某种可证实的方式与抗原或免疫原特异性反应(例如：结合)，抗体及抗原/免疫原各自定义为彼此。

“引发抗体反应”是指抗原、免疫原或其他分子诱导抗体产生的能力。抗体具有不同的类别，例如IgM、IgG、IgA、IgE、IgD及亚型或亚类，例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4。在受试者中引发的抗体/免疫球蛋白反应，可以通过与病原体上的表位(抗原决定簇)结合并阻断或抑制其活性来中和病原体(例如：传染性或致病性)，及/或通过与从受试者的系统(例如：通过肝脏)中清除的试剂以形成结合复合物。

如本文所用，“广泛反应”是指在受试者中针对病毒蛋白(例如：病毒抗原、抗原序列、蛋白或蛋白序列)引发的免疫反应，足以阻断、抑制、阻碍、中和、或防止感染各种相关的流感病毒(诸如特定亚型内的多数或所有流感病毒，例如：与H3流感病毒有关的病毒)。

“抗原”是指可以刺激动物中抗体的产生或T细胞反应的化合物、组合，物或物质，包含注射或吸收至动物中的组合物。抗原与特定的体液或细胞免疫产物反应，包含由异源免疫原诱导的产物。在所揭露的组合物及方法的一些实施例中，抗原是流感血凝素(HA)蛋白。在许多情况下，在受试者中引发或刺激免疫反应的抗原被称作“免疫原”。

术语“抗原漂移”是指诸如病毒的生物或微生物变异的机制，其涉及编码抗体结合位点的基因内的突变的积累(也称作抗原决定簇或表位)。该过程产生了新的病毒/病毒颗粒株，其不能被突变前最初针对病毒株抗原产生的抗体有效地抑制或阻断，从而使病毒更易于在部分免疫人群中传播。举例而言，在A型流感病毒和B型流感病毒中均发生了致病性漂移。

在活病毒的上下文中，术语“减毒”是指与野生型病毒产生疾病的能力相比，如果其感染细胞或受试者的能力及/或其产生疾病的能力降低(例如：减少、消除，或删除)，则所述病毒在受试者体内减毒。通常，减毒病毒在向具有免疫能力的受试者施用药物后保留至少一些引发免疫反应的能力。在某些情况下，减毒病毒能够引发保护性免疫反应，而不会引发任何感染迹象或症状。在一些实施例中，相对于野生型病毒在受试者中引起疾病或病理的能力，减毒病毒在受试者中引发疾病或病理的能力降低至少约或等于5％、或至少约或等于10％、或至少约或等于25％、至少约或等于50％、至少约或等于75％、或至少约或等于80％、或至少约或等于85％、或至少约或等于90％，或至少约或等于95％或，更高。

术语“进化支”是指已知流感病毒(例如：A型流感H3N2病毒)的不同分类(通常称作亚型)。H3N2进化支中的病毒具有遗传相关性，但不共享确切的病毒基因组。

如本领域技术人员所理解的，在本领域中指定了许多H3N2病毒亚型的进化支和亚型进化支。举例而言，一进化支是3C.2a；此进化支的亚型进化支包含3C.2a.1、3C.2a.2、3C.2a.3及3C.2a.4。另外，在此至少有10种不同的H5N1病毒亚型进化支被指定为：进化支0、进化支1、进化支2、进化支3、进化支4、进化支5、进化支6、进化支7、进化支8和进化支9(Abdel-Ghafar等人，新英格兰医学杂志358：261-273，2008)。进化支2进一步分为次进化支(包含进化支2.1、进化支2.2、进化支2.3、进化支2.4及进化支2.5)。

“密码子优化”核酸(多核苷酸)是指已经改变的核酸序列，使得密码子对于在特定系统(例如物种组中的特定物种)中表达是最优的。例如：可以优化核酸序列以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化不会改变编码蛋白质的氨基酸序列。

在本公开中，“包含(comprises、comprising、containing)”及“具有(having)”等可以具有美国专利法赋予它们的含义，并且可以表示“包含(includes、including等)”；“基本上由……组成("consisting essentially of"或"consists essentially"等)”同样具有美国专利法中赋予的含义，并且所述术语是开放式的，只要所列举的基本或新颖特征不因所列举的以上特征的存在而改变，则允许存在比所列举的更多的特征，而排除现有技术的实施例。

“检测”是指识别要检测的分析物、化合物、试剂或物质的存在、不存在或数量。“可检测标记”是指一种组合物，当与所关注的分子连接时，使其可通过例如光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段被检测。有用的可检测标记的非限制性实例包含放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体颗粒、萤光染料、电子密度试剂、酶(例如：如在ELISA中通常使用的)、生物素、洋地黄毒苷，或半抗原。

“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况、病症，或病理。疾病的实例包含由H3病毒感染引发的疾病以及由H3病毒感染人体引发的症状和不良反应。流感病毒在受感染的个体中引发流感及其症状。

“有效量”是指相对于未经治疗的患者，改善、减轻、加强、废除、减少或消除疾病的症状和效应所需的活性治疗剂、组合物、化合物、生物制剂(例如：疫苗或治疗性肽，多肽或多核苷酸)的量。

用于实施由H3病毒引发的疾病、病症或病理学的治疗方法的免疫原或包含免疫原的组合物的有效量取决于施用药物方式、年龄、体重及受试者的总体健康状况。最终，主治医师或兽医将决定适当的量和剂量方案。所数量被称作“有效”量。

“治疗有效量”是指足以在用所述药剂治疗的受试者中获得所需效果的指定药剂的量。例如：H3流感病毒免疫原或疫苗的量可以用于在受试者中引起免疫反应及/或用于预防H3流感病毒的感染。理想地，在本申请的上下文中，治疗有效量的流感疫苗或抗流感免疫原性组合物的量足以增加抵抗力，以预防、改善、减少及/或治疗受试者中由流感病毒引起的感染，而不会在受试者中产生实质性的细胞毒性作用。有效量的免疫原性组合物的流感疫苗可用于增加抵抗力，以预防、改善、减少及/或治疗受试者取决于例如治疗主体、治疗组合物的给药方式及其他因素的感染，如上所述。

“片段”是指多肽或核酸分子的一部分。所述部分包含，优选的，参考核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可包含10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷酸或氨基酸。多肽的部分或片段可以是肽。在抗体或免疫球蛋白片段的情况下，所述片段通常与靶抗原结合。

“融合蛋白”是指通过表达从编码两种不同(异源)蛋白质或肽的至少一部分的核酸序列改造而来的核酸(多核苷酸)序列而产生的蛋白质。为了产生融合蛋白，核酸序列必须在相同的读框中并且包含非内部终止密码子。例如：融合蛋白包含H3流感HA蛋白融合至异源蛋白。

“基因疫苗”是指包含编码抗原的多核苷酸的免疫原性组合物。

术语“地理位置或地理区域”是指地球的地理区域的预先选定的划分，例如按大陆或其他预先选定的领土或细分(例如：跨越一个以上大陆的中东)。不同地理区域的示例包含国家(例如：土耳其、埃及、伊拉克、阿塞拜疆、中国、美国)；大洲(例如：亚洲、欧洲、北美、南美、大洋洲、非洲)；公认的地缘政治细分(例如：中东)；或世界上的半球(例如：北半球、南半球、东半球、或西半球)。

“H3病毒多肽”是指与图1A至1C所示的HA抗原或其片段的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列，能够在免疫主体中诱导免疫反应。在一实施例中，H3病毒多肽包含TJ1至9HA序列或其片段或由其组成。

“H3病毒多核苷酸”是指编码H3病毒多肽(抗原或抗原蛋白)的核酸分子。

术语“血凝素(HA)”是指由流感病毒表达的表面糖蛋白。HA介导病毒颗粒与受试者细胞结合且病毒随后进入受试者细胞。许多流感HA蛋白的核苷酸及氨基酸序列在本领域中是已知的，并且是公众可获得的，例如彼等在基因银行中所保藏的(参见，例如：美国公开号US2015/0030628，表1)。HA(与神经氨酸酶(NA)一起)是具有抗原决定簇(表位)的两种主要流感病毒抗原蛋白之一，这些抗原决定簇被抗体/免疫球蛋白识别并结合。

举例而言，H3N2流感病毒的血凝素(HA)蛋白与A型流感病毒(A/中国香港/1-4/1968(H3N2))片段4的氨基酸序列具有至少约或等于85％，或至少约或等于90％、95％、98％、99％或更高的氨基酸序列同一性的多肽或其片段，完整序列，登记号CY033017，如下所述：

MKTIIALSYIFCLALGQDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNNPHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQNETWDLFVERSKAFSNCYPYDVPDYASLRSLVASSGTLEFITEGFTWTGVTQNGGSNACKRGPGSGFFSRLNWLTKSGSTYPVLNVTMPNNDNFDKLYIWGVHHPSTNQEQTSLYVQASGRVTVSTRRSQQTIIPNIGSRPWVRGLSSRISIYWTIVKPGDVLVINSNGNLIAPRGYFKMRTGKSSIMRSDAPITCISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAIDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI.

此外，H3N2流感病毒的血凝素(HA)蛋白由与所述多核苷酸序列具有至少约或等于85％，或至少约或等于90％、95％、98％、99％，或更高的序列同一性的多核苷酸或其片段编码，如下所示：

“混成”是指氢键键结，其可以是互补核碱基之间的瓦生克立克、胡斯坦，或反向胡斯坦氢键键结。例如：在DNA中，腺嘌呤及胸腺嘧啶及胞嘧啶及鸟嘌呤分别是通过形成氢键配对的互补核碱基。

“免疫原”是指化合物、组合物，或物质，其能够在适当条件下引发或刺激免疫反应，例如：产生抗体及/或T细胞反应，在动物中，包含注射或吸收至动物体内的组合物。如本文中所使用的，“免疫原性组合物”是包含免疫原(例如H3 HA多肽或包含H3 HA多肽的疫苗)。如本领域技术人员将理解的，若在受试者患上疾病或经历全面疾病前向有需要的受试者施用药物，则免疫原性组合物可预防并导致受试者引发免疫反应，例如：中和抗体及/或细胞免疫反应，以预防疾病或预防更严重的疾病状况及/或其症状。若在受试者患上疾病后向有需要的受试者施用药物，则免疫原性组合物可以起到治疗作用，并导致受试者引发免疫反应，例如：中和抗体及/或细胞免疫反应，以治疗疾病，例如：通过减少(reducing)、减轻(diminishing)、废除(abrogating)、改善(ameliorating)或消除(eliminating)疾病，及/或其症状。在一实施例中，免疫反应是B细胞反应，其导致抗体的产生，例如：中和抗体，直接针对包含抗原或抗原序列的免疫原或免疫原性组合物。以类似于前述的方式，在一些实施例中，免疫原性组合物或疫苗可以是预防性的。在一些实施例中，免疫原性组合物或疫苗可以是治疗性的。在一实施例中，所述疾病是流行性感冒(流感)。

术语“免疫反应”是指由免疫反应细胞介导的任何反应。在免疫反应的一实例中，募集白血球以响应暴露于抗原(例如：外来实体)而执行多种不同的特定功能。免疫反应是多因素过程，取决于涉及的细胞类型而有所不同。免疫反应包含细胞介导的反应(例如：T细胞反应)、体液反应(B细胞/抗体反应)、先天反应及其组合。

“免疫原性组合物”是指包含抗原、抗原序列，或免疫原的组合物，其中所述组合物在被免疫的受试者中引发免疫反应。

术语“免疫(immunize)”或“免疫作用(immunization)”是指使受试者免受由H3病毒(例如通过疫苗接种)引起的疾病、传染性疾病，或病理学，或其症状的侵害。

术语“流感病毒”是指属于正粘病毒科病毒家族的分段负链RNA病毒。流感病毒分为三种类型：A、B及C。A型流感病毒感染多种鸟类和哺乳动物，包含人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂，及鸡。在动物中，多数A型流感病毒会引发呼吸道及肠道的轻度局部感染。但是，高致病性的A型流感菌株，例如H3N2，会引发家禽全身性感染，其死亡率可能达到100％。

“抑制性核酸”是指双链RNA、siRNA、shRNA或反义RNA，或其一部分，或其模拟物，当施用于哺乳动物细胞时会导致靶基因表达降低(例如：5％、10％、25％、50％、75％，或甚至90至100％)。通常，核酸抑制剂包含靶核酸分子或其直系同源物的至少一部分，或包含靶核酸分子的互补链的至少一部分。例如：抑制性核酸分子包含本文所述的任何或所有核酸的至少一部分。

术语“分离的(isolated)”、“纯化的(purified)”，或“生物纯净的”是指从其天然状态下通常与的伴随的组分不同程度地释放的材料。“隔离(isolate)”表示与原始来源或环境的隔离度。“纯化(purify)”表示分隔的度高于分离度。“纯化的(purified)”或“生物纯净的”蛋白质充分不含其他物质，以使任何杂质均不会严重影响该蛋白质的生物学特性或引发其他不利后果。即，若通过重组DNA技术生产的核酸、蛋白质或肽基本上不含细胞物质、碎片、不相关的病毒物质或培养基，或通过化学合成方法生产的核酸、蛋白质或肽基本上不含化学前体或其他化学物质，则可以纯化核酸、蛋白质或肽。纯度和均质性通常使用标准纯化方法及分析化学技术确定，例如：聚丙烯酰胺凝胶电泳法或高效液相层析法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中实质上产生一个亮带。对于可以进行修饰的蛋白质，例如磷酸化或糖基化，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以将其分别纯化。术语“分离的”也包含重组核酸、蛋白质或病毒，以及化学合成的核酸或肽。

“分离的多核苷酸(”是指不含基因的核酸(例如DNA分子)，所述基因在衍生本发明核酸分子的生物的自然发生的基因组中位于所述基因的侧翼。因此，所述术语包含，例如：掺入载体中的重组DNA；进入自主复制的质粒或病毒；或进入原核生物或真核生物的基因组DNA；或作为独立于其他序列的独立分子存在(例如：通过PCR或限制性核酸内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)。另外，所述术语包含从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码附加多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。

“分离的多肽”是指已经与天然伴随的组分分离的本发明的多肽。当多肽按重量计至少40％、按重量计至少50％、按重量计至少60％，没有与的自然结合的蛋白质及天然有机分子时，多肽通常是分离的。优选地，分离的多肽制品按重量计至少75％，更优选至少90％，最优选至少99％，不含与的天然缔合的蛋白质及天然有机分子。分离的多肽可以获得，例如，从天然来源中提取；通过编码这种多肽重组核酸的表达；或通过化学合成蛋白质。纯度可以通过任何标准的合适方法来测量，例如柱层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法，或通过HPLC分析。分离的多肽可以是指通过本文描述的方法产生的广泛活性病毒免疫原多肽。

“连接子”是指充当融合蛋白的两个多肽或肽的间的间隔基的一个或多个氨基酸。

“标记”是指与疾病，病状，病理学或病症相关的表达水平或活性改变的任何蛋白质或多核苷酸。

“基质(M1)蛋白”是指在病毒套膜内发现的流感病毒结构蛋白。M1被认为在细胞感染后在病毒的组装和出芽中起作用。

术语“神经氨酸酶(NA)”是指流感病毒膜糖蛋白。NA通过从感染细胞表面上的碳水化合物部分裂解末端唾液酸残基而参与病毒HA的细胞受体的破坏。NA亦可从病毒蛋白上裂解唾液酸残基，从而防止病毒聚集。NA(以及HA)是两个主要的流感病毒抗原决定簇的一。

如本文所用，“获得”在“获得试剂”中包含合成、分离、购买或以其他方式获得试剂。

术语“可操作地连接”是指本文所用的核酸序列。举例而言，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列可操作地连接至第二核酸序列。例如：若启动子影响(允许)编码序列的转录或表达，则所述启动子可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，它们处于同一读框中。

经过“计算优化”的流感HA蛋白通常反映了HA蛋白序列，所述序列是通过比较两种或多种病毒的序列(氨基酸序列)，例如：H3流感病毒进化支的序列得出的，诸如例如在美国专利申请公开US2015/0030628中所述。编码的核苷酸序列的H3 HA蛋白是由所描述的方法产生的，其可使用本领域中实施的制程及技术，通过密码子优化及RNA优化(例如增加RNA稳定性)在哺乳动物细胞中表达。

广泛反应、泛表位免疫原，如H3流感血凝素(HA)蛋白，用于引发受试者中的免疫反应，具有一组强烈的免疫原性表位(亦称作抗原决定簇)本文所描述的H3病毒HA蛋白是“泛表位”H3免疫原，其适合于用作疫苗，其引发广泛活性免疫反应，例如：中和抗体反应，当被引入受试者主体，特别是，被H3病毒感染的人类主体时，可以抵抗多种在病毒表面表达HA蛋白的H3病毒。免疫原性抗原(或疫苗)有利于提供抗H3病毒免疫原(或疫苗)，所述抗H3病毒免疫原(或疫苗)引起具有抗原变异性和相似性的针对H3流感病毒HA抗原的广泛活性免疫反应，并治疗或预防由一种以上的H3流感病毒亚型引发的感染和疾病。

“开放读框(open reading frame，ORF)”是指一系列的核苷酸三联体(密码子)，其编码氨基酸没有任何终止密码子。此等序列通常可转译为肽或多肽。

如本文所用，流感病毒“爆发”是指在给定的时间段(例如：一年)中来自地理位置内(例如：在单一国家内)的病毒分离物的集合。

术语“药学上可接受的媒介物(pharmaceutically acceptable vehicle)”是指常规的载体(媒介物)及生理学上及药学上可接受供使用的赋形剂，特别是在哺乳动物，例如：人类，受试者。这样的药学上可接受的媒介物是本领域技术人员已知的，且可以容易地在Remington's Pharmaceutical Sciences，E.W.Martin，Mack出版公司，伊斯顿，宾夕凡尼亚，第15版(1975)及其更新版本中找到，其中描述了适于药物递送一种或多种治疗组合物(例如一种或多种流感疫苗)及其他医药组合物及制剂。通常，药学上可接受的载体的性质取决于所采用的特定给药方式。例如：肠胃外制剂通常包含可注射的流体/液体，其包含药学上及生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、右旋糖水溶液、甘油等作为媒介物。对于固体组合物，例如：粉末、丸剂、片剂或胶囊剂形式，常规的无毒固体载体可包含例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁，其通常会稳定及/或增加组合物或药物的半衰期。除生物中性载体外，待施用的医药组合物可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

“质粒”是指能够在受试者细胞中自主复制的环状核酸分子。

通过“多肽”(或蛋白质)是指聚合物，其中的单体包含通过酰胺键连接在一起的氨基酸残基。当氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。本文所用的术语“多肽(polypeptide)”或“蛋白质(protein)”旨在涵盖任何氨基酸序列及包含修饰的序列，例如糖蛋白。术语“多肽(polypeptide)”是特别用于涵盖自然发生的蛋白质以及彼等重组或合成产生的蛋白质。术语“残基(residue)”或“氨基酸残基(amino acid residue)”亦指掺入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸。

守氨基酸取代是指那些在进行时对原始蛋白质的特性影响最小的取代，也就是说，蛋白质的结构，特别是功能保守的，不会被这种取代显著改变。保守氨基酸取代的实例是本领域已知的，例如，例如在美国公开号2015/0030628中所述。保守取代通常保持(a)在取代区域中的多肽骨架的结构，例如呈片状或螺旋状构象；(b)所述分子在靶位上的电荷或疏水性；和/或(c)大部分侧链。

通常预期会产生最大蛋白质特性变化的取代是非保守的，例如，以下变化：(a)用亲水性残基例如丝氨酰基或苏酰基取代(或被)疏水性残基例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、戊酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸被其他残基取代(或被其取代)；(c)具有正电侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基或组胺基，被(或被)负电残基例如谷氨酰基或天冬氨酰取代(或被其取代)；(d)具有庞大的侧链的残基例如苯丙氨酸被(或被)没有侧链的残基例如甘氨酸取代(或被其取代)。

“引子组”是指可用于例如PCR的一组寡核苷酸。引子组应至少包含2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600，或更多引子。

“启动子”是指核酸控制序列的阵列，其直接转录核酸。启动子包含转录起始位点附近的必需核酸序列。启动子亦任选地包含远端增强子或阻遏物序列元件。“组成型启动子”是连续活性的并且不受外部信号或分子调节的启动子。相反，“诱导型启动子”的活性由外部信号或分子(例如：转录因子)调节。举例而言，启动子可以是CMV启动子。

如本领域技术人员将理解的，术语“纯化的”不需要绝对的纯度。相反，其旨在作为一个相对术语。因此，例如：纯化的肽、蛋白质、病毒或其他活性化合物是从天然结合的蛋白质及其他污染物中全部或部分分离的肽。在某些实施例中，术语“实质上纯化的”是指已经从细胞、细胞培养基或其他粗制品中分离并经过常规方法如化学分离法、层析法，或电泳法，以去除初始制剂的各种组分，例如蛋白质、细胞碎片及其他组分。

“重组”核酸、蛋白质或病毒，是广泛活性的序列或具有由两个原本分离的序列片段的人工组合制成的序列。通常通过化学合成或通过人工操作分离的核酸片段，例如通过基因工程技术，来实现这种人工组合。“非自然发生”核酸、蛋白质或病毒，是可以通过重组技术、人工操作，或遗传或分子生物学工程制程及技术制备，例如彼等本领域通常实施的。

“减少”是指至少5％、10％、25％、30％、40％、50％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100的负变化％。

“参考”是指标准或对照条件。

“参考序列”是用作序列比较基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部。例如：全长cDNA或基因序列的片段，或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度通常为至少约16个氨基酸，优选至少约20个氨基酸，更优选至少约25个氨基酸，甚至更优选约35个氨基酸，约50个氨基酸，或约100个氨基酸。对于核酸，参考核酸序列的长度通常为至少约50个核苷酸，优选至少约60个核苷酸，更优选至少约75个核苷酸，甚至更优选约100个核苷酸或约300个核苷酸或其任何整数或两者的间。

“特异性结合”是指识别并结合多肽，例如病毒多肽、肽或疫苗产品的化合物或抗体，但基本上不识别并结合样品，例如：生物样品，其自然包括多肽，如病毒多肽或肽。

可用于本文描述的方法的核酸分子包括编码所述多肽或其片段的任何核酸分子。这样的核酸分子不必与内源核酸序列100％相同，但是通常将显示出实质同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下配对以在互补多核苷酸序列(例如：基因)或其部分的间形成双链分子。(参见，例如：Wahl,G.M.及S.L.Berger，(1987)，Methods Enzymol.，152：399；Kimmel,A.R.(1987)，Methods Enzymol.，152：507)。

举例来说，严格的盐浓度通常小于约750mM NaCl及75mM柠檬酸三钠，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠，更优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下可以获得低严格度的杂交，而在至少约35％的甲酰胺，更优选至少约50％的甲酰胺的存在下可以获得高的严格度杂交。严格的温度条件通常将包括至少约30℃，更优选至少约37℃，最优选至少约42℃的温度。可变的其他参数，例如杂交时间，去污剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度以及载体DNA的包含或排除，是本领域技术人员众所周知的。各种严格程度通过如所需来结合此等各种条件来实现。在一优选的实施例中，杂交将在30℃下于750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠，及1％SDS中进行。在一更优选的实施例中，杂交将在37℃下于500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺，及100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中进行。在最优选的实施例中，杂交将在42℃下于250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺，及200μg/ml ssDNA中发生。在此等条件下有用的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。

对于大多数应用而言，杂交后的洗涤步骤的严格性亦有所不同。洗涤严格条件可通过盐浓度及温度来定义。如上所述，可通过降低盐浓度或通过提高温度来提高洗涤严格性。例如：洗涤步骤的严格盐浓度将优选小于约30mM NaCl及3mM柠檬酸三钠，最优选小于约15mM NaCl及1.5mM柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃，更优选至少约42℃，甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施例中，洗涤步骤将在25℃下于30mMNaCl、3mM柠檬酸三钠及0.1％SDS中进行。在更优选的实施例中，洗涤步骤将在42℃下于15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠及0.1％SDS中进行。在一个更优选的实施例中，洗涤步骤将在68℃下于15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠及0.1％SDS中进行。此等条件的其他变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如Benton及Davis(Science 196：180，1977)；Grunstein及Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72：3961，1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，纽约，2001)；Berger及Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，纽约学术出版社)；以及Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社，纽约。

“实质上相同(substantially identical)”是指与参考氨基酸序列(例如：本文所述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如：例如：本文所述的任一核酸序列)具有至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这种序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列至少60％，或至少80％或85％，或至少或等于90％、95％或甚至99％相同。

“序列同一性”是指氨基酸或核酸序列的间的相似性，其根据序列的间的相似性表达。序列同一性经常用百分比同一性(或相似性或同源性)来衡量。百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，给定基因或蛋白质的同源物或变体将具有相对较高的序列同一性。序列同一性通常使用序列分析软体进行测量(例如：威斯康星大学生物技术中心遗传计算机组的序列分析软体包，威斯康星州麦迪逊市，1710University Avenue，Madison，Wis.53705，BLAST，BESTFIT，GAP，或PILEUP/PRETTYBOX程式)。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失及/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包含以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程式，其中e

“受试者”是指动物，例如：哺乳动物，包含，但不限于，人、非人灵长类动物，或一非人类哺乳动物，如：牛、马、犬、羊或猫科动物的哺乳动物，或绵羊、山羊、美洲驼、骆驼，或囓齿类动物(大鼠、小鼠)、沙鼠，或仓鼠。在一非限制性的实例中，受试者是指感染了H3病毒或有被该病毒感染的危险或易受这种感染的人。在本文所述的特定方面，所述受试者是人类受试者，例如患者。

本文所提供的范围应理解为所述范围内所有值的简写形式，包含首尾的规范值。例如：范围1至50应理解为包含任何数字、数字的组合，或子范围选自包含以下数字的群组：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更大，连续如达到100或更大。

如本文所使用的，术语“治疗(‘treat’、‘treating’、‘treatment’等)”是指减少、减轻、降低、废除、改善或消除疾病、病症、失调或病理学，及/或随的而来的相关症状。虽然不旨于限制，“治疗(treating)”通常涉及在疾病、病症、失调或病理学，及/或与的相关的症状开始发展后发生的治疗性干预措施，以减轻疾病等的严重程度以及相关的体征和症状。应当理解，尽管并未排除，然而治疗疾病或病症并不需要完全消除疾病、病症、失调、病理学，或与的相关的症状。

如本文所用，术语“预防(‘prevent’、‘preventing’、‘prevention’)”、“预防性治疗(prophylactic treatment)”等，是指抑制或阻断受试者的疾病状态或疾病的全面发展，或减少在受试者中患上疾病、病症或病状的可能性，所述受试者是指未患上但有患上风险，或易于患上疾病、失调或病状的人。

如本文所指，“转化的(transformed)”细胞是已经通过分子生物学技术将核酸分子或多核苷酸序列引入其中的细胞。如本文所用，术语“转化(transformation)”涵盖可通过其将核酸分子或多核苷酸引入此类细胞的所有技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染，以及粒子枪加速引入裸核酸。

“疫苗”是指能够刺激(引发)免疫反应的免疫原性物质(例如：蛋白质或核酸；疫苗)的制剂，其被施用于受试者以治疗疾病、病症或病理学，或预防疾病、病症，或病理学，例如传染病(如由H3病毒感染引发)。免疫原性物质可包括例如减毒或杀死的微生物(例如减毒病毒)，或源自此类微生物的抗原蛋白、肽或DNA。疫苗可引起受试者的预防性的(预防性)免疫反应；它们亦可引起受试者的治疗反应免疫反应。如上所述，疫苗施用的方法根据疫苗而有所不同，并且可以包括途径或手段，例如接种(静脉内或皮下注射)、摄入、吸入，或其他形式的施用。可通过许多途径中的任一种来递送接种，包括肠胃外的，诸如静脉内、皮下，或肌内。疫苗亦可与佐剂一起给药以增强免疫反应。

如本文所用，“载体”是可以在不破坏载体在主体细胞中复制和/或整合入主体细胞的能力的情况下将外源核酸插入其中的核酸(多核苷酸)分子。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。插入载体能够将其自身插入宿主核酸。载体亦可包括一或多个可选择的标记基因及其他遗传元件。表达载体包含必需调控序列以允许在主体细胞中转录和转译插入的一或多个基因的载体。在本申请的一些实施例中，载体编码流感HA、NA，或M1蛋白。在一些实施例中，载体是pTR600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798；Ross等人，2000，Nat Immunol.1(2)：102-103；以及Green等人，2001，Vaccine 20：242-248)。

“类病毒颗粒(virus-like particle，VLP)”是指由一种或更多种病毒结构蛋白组成的病毒颗粒，但是缺少病毒基因组。由于VLP缺乏病毒基因组，因此它们无感染力，可产生更安全、可能更经济的疫苗及疫苗产品。另外，VLP通常可以通过异源表达产生并且可以容易地纯化。大多数VLP至少包含病毒核心蛋白，所述蛋白驱动主体细胞出芽及释放颗粒。这种核心蛋白的一实例是M1流感。在本文的一些实施例中，H3流感VLP包含HA、NA及M1蛋白。如本文所述，可以通过用编码H3 HA、NA及M1蛋白的质粒转染宿主细胞来产生H3流感VLP。将转染的细胞孵育适当的时间以允许蛋白质表达后(例如约72小时)，可以从细胞培养上清液中分离VLP。举例而言，用于从细胞上清液中纯化或分离流感VLP的临床实验包括低速离心(以除去细胞碎片)，真空过滤并通过20％甘油对VLP进行超速离心。类病毒颗粒亦可包括亚病毒颗粒(SVP)，其大小通常小于病毒，并且构成没有病毒衣壳或基因组的颗粒。

除非特别声明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“或(or)”应理解为包含性的。除非特别说明或根据上下文显而易见，否则如本文所用，术语“一(a)”，“一个(an)”和“所述(the)”应理解为单数或复数。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或(or)”旨在包含“和(and)”。因此，“包含A或B(comprising A or B)”是指包含A、或B，或A和B。亦应理解，针对核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值均为近似值，并提供用于描述。

除非特别说明或从上下文中显而易见，否则如本文所用，术语“约(about)”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差的内。大约可以理解为在以下范围的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％的内规范值。除非上下文另有明确说明，否则本文提供的所有数值均由术语“大约”修饰。

在本文对变量的任何定义中，列举化学基团的清单包含将所述变量定义为所列基团的任何单个基团或所列基团的组合。本文中对变量或方面的实施例的叙述，包含该实施例作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分组合。

本文提供的任何组合物或方法可以与本文提供的任何其他组合物及方法中的一种或多种结合。

附图说明

图1A至1C显示H3流感A病毒株的九种代表性HA多肽(蛋白)的氨基酸序列，在本文中称作TJ1-9 HA，其是引发针对H3病毒及H3病毒HA蛋白的免疫反应的广泛反应免疫原。编码此等多肽的核酸序列可用于产生包含H3蛋白抗原的类病毒颗粒(VLP)，其被用作免疫原/疫苗以在免疫主体中产生中和抗体。如图1A至1C所示，TJ1-9 HA多肽的长度总长为566个氨基酸。

图2A至2C显示血清(例如：小鼠血清)在血球凝集抑制实验(HAI)中与不同H3病毒株(历史菌株)温育后产生的针对不同H3病毒HA蛋白来源的VLP的血清抗体的血凝抑制效价，这些VLP用作免疫原(疫苗)。图2A显示了针对从本文所述(示出于图1A至1C中)的TJ-2、TJ-3、TJ-5、TJ-6、TJ-7、TJ-8及TJ-9HA序列(“TJ”VLP)产生及用作免疫原(疫苗)的VLP产生的血清抗体的血球凝集抑制实验(HAI)效价图。针对几种TJ VLP产生的抗体对H3病毒株的不同历史菌株(x轴)具有广泛的反应性。使用从第77天采血的免疫小鼠血清，0.75％的豚鼠红血球及20nM的奥司他韦(Oseltamivir)(克流感胶囊(Tamiflu))进行HAI分析。图2B显示使用含有其他H3 HA序列(例如：Bris/07、Perth/09、Vic/11、Tx/12、Switz/13、HK/14)的VLP进行HAI分析的结果。图2C显示使用PBS对照的HAI分析的结果。

具体实施方式

H3流感病毒通常在人类中传播，并引发季节性流感流行。H3病毒通常会引发严重的流感疾病，并通过不断改变其表面蛋白(例如HA蛋白)来适应被消除的疾病。在从2017年到2018年的流感季节，H3 A型流感病毒被发现是美国和全球范围内的(例如：澳大利亚及英国)的主要菌株。由于H3菌株异常高的突变率及无法生成有效对抗其HA表面蛋白中发生的相对快速变化的疫苗(例如在针对此菌株的疫苗生产过程中)，因此H3病毒株的治疗尤其困难。

本文的特征是合成的(非自然发生)免疫原性抗原，例如：蛋白质及糖蛋白抗原，其衍生自A型流感病毒H3菌株的流行性感冒(“流感”)血凝素(HA)蛋白，可在受试者(特别是人类受试者)中引发强力、广泛反应及持久性的免疫反应。这些免疫原性抗原在本文中亦称作“免疫原”。

提供了免疫原，所述免疫原可预防由H3流感病毒株或季节性H3流感病毒株引发的疾病，跨越数年，包含尚不存在的漂移菌株。在一实施例中，其中完全合成的蛋白质抗原，例如H3流感病毒HA蛋白质抗原。此类H3 HA抗原是自然界中未发现的合成蛋白，但它们保留了天然H3 HA病毒蛋白的所有功能并具有免疫原性，即它们可以引发免疫反应，特别是，在施用或递送至受试者或引入受试者后，以中和抗体和/或反应性T淋巴细胞的形式，产生广泛活性的免疫反应。亦提供免疫原性组合物，例如疫苗，其包含合成的H3病毒蛋白抗原或编码抗原的核酸。

H3 HA氨基酸序列以及具有所述序列的蛋白质抗原特别用作免疫原，或用于免疫原性组合物，例如疫苗，其在施予所述组合物或疫苗的受试者中，特别是人类受试者，引发广泛的反应性免疫反应。H3病毒免疫原包含代表不同“抗原空间”的抗原决定簇，所述抗原决定簇衍生自许多基于季节性时间段(重叠或不重叠的季节性时间段)分析的H3病毒株的序列。这种重叠或不重叠的季节性时间段可能包含不同的时间间隔，例如5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、10年或以上，包含它们的间的时间间隔。

本文所述的H3病毒抗原包含H3流感病毒及其亚型的季节性、泛表位、广泛反应抗原，尤其是含有基于H3漂移变体的序列的抗原，其中所述抗原被设计为产生广泛活性的免疫反应，特别是以受试者中和抗体的形式，特别是人类受试者。这样的抗原作为免疫原是有益的，其引发针对H3病毒的免疫反应(例如：中和抗体的产生)，其中多种H3菌株在一次同时循环。广泛活性H3免疫原性抗原可衍生自H3病毒，所述病毒经常突变其基因组的一部分以避开免疫压力，因此，在受感染后未免疫或未激发免疫系统产生针对H3抗原上抗原表位的抗体的受试者中避开免疫监视。因此，合成的H3抗原，例如H3 HA抗原，包含氨基酸(或多核苷酸)序列，与野生型抗原序列相比，其将在多个季节内和跨多个季节引发更多数量的针对潜在H3漂移变体的中和抗体。

如本文所述的H3HA免疫原性蛋白质，或免疫原，可用于免疫原性组合物中或用作疫苗，其可以在几年内提供针对许多H3病毒株的保护。本文所述的广泛活性H3流感免疫原及疫苗的优点在于，它们被设计为针对在不同地理位置流行的几种季节性H3流感菌株(或进化支)提供更广泛及更持久的保护。如本文所述，由免疫原及其序列提供的是通用且广泛的H3流感疫苗，其可以减轻对每年施用的针对流感病毒的H3菌株及亚型的季节性流感疫苗(免疫原性组合物)的需求。

本文所述的免疫原性H3病毒HA抗原可用于能够提供针对受试者中的H3流感感染及疾病的保护性免疫的免疫原性组合物(例如流感疫苗)。

流感病毒

流感病毒是属于正粘液病毒科家族的分段负链RNA病毒。共有三种类型的流感病毒：A、B及C。A型流感病毒感染多种鸟类及哺乳动物，包含人、马、海洋哺乳动物、猪、雪貂及鸡。在动物中，多数A型流感病毒会引发呼吸道及肠道的轻度局部感染。然而，高致病性的A型流感菌株，例如H3，会引发家禽的全身性感染，其死亡率可能达到100％。感染A型流感的动物通常作为流感病毒的受试者，并且已显示某些亚型跨越了人类的物种屏障，导致严重的疾病及毁灭性的流感爆发，从而导致受感染的人类受试者死亡。

A型流感病毒可根据编码表面糖蛋白的两个基因(即血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA))的抗原区域中的等位基因变异，将其分类为亚型，这是病毒附着及细胞释放所必需的。目前，已知A型流感病毒有16种亚型HA(H1至H16)以及9种NA(N1至N9)抗原性变体。以前，只有三种亚型在人类中传播(H1N1、H1N2及H3N2)。然而，近年来，例如：据报导，如1997年及2003年在中国香港的纪录，A型禽流感的致病性H5N1亚型可越过物种屏障并感染人类，导致多名患者死亡。

在人类中，禽流感病毒感染呼吸道以及肠道、肝脏、脾脏、肾脏及其他器官的细胞。禽流感感染的症状包含发烧、呼吸困难，包含呼吸急促及咳嗽、淋巴细胞减少、腹泻及调节血糖水平困难。与季节性流感相反，最危险的人群是健康成年人，成年人占总人口的大部分。由于某些禽流感A亚型(尤其是H3)的高致病性，以及它们表现出的交叉感染人类的能力，因此，与这些病毒株相关的经济及公共卫生风险非常大，包含真正的流行性及大流行威胁。

A型流感病毒基因组编码9种结构蛋白及1种具有调节功能的非结构蛋白(NS1)。流感病毒分段基因组包含八个负义RNA(nsRNA)基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS、HA及NA)，其编码至少十个多肽，包含RNA定向的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB 1及PA)、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)、血凝素，例如亚基HA1，通常称作“头部”亚基；以及HA2，通常被称作“尾”或“茎”亚基；基质蛋白(M1及M2)；以及非结构蛋白(NS1和NS2)(参见，例如：Krug等人，1989，In:TheInfluenza Viruses，R.M.Krug编辑，Plenum Press，纽约，第89152页)。

流感病毒(例如H3)引发广泛疾病的能力是由于其通过经历抗原的改变而避开免疫系统的能力，据信这是在受试者同时感染动物流感病毒及人类流感病毒时发生的病毒。在受试者的突变及重配过程中，病毒可能会将另一种病毒的HA及/或NA表面蛋白基因整合到其基因组中，从而产生新的流感亚型并避开了免疫系统。

由于H3流感病毒的循环株，特别是病毒的HA及NA蛋白中的抗原变异(漂移)，针对H3流感病毒的疫苗的功效经常无法达到最佳及次佳水平。本文所述的方法提供了H3流感病毒的广泛反应、泛表位HA或NA抗原，其产生了广泛的免疫反应，尤其是，以与H3病毒抗原结合并中和病毒活性的中和抗体形式(例如：其感染细胞的能力)，以更有效地治疗H3流感及其症状。

流感病毒血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)蛋白

HA是一种病毒表面糖蛋白，通常包含约560个氨基酸(例如566个氨基酸)，并占总病毒蛋白的25％。如本文所述，HA是蛋白抗原，其高度有效地用作针对H3病毒的免疫原，因为它包含多种针对抗体的表位，在感染期间遇到H3 HA抗原的受试者或受试者体内产生。

HA负责在感染的早期将病毒颗粒粘附在受试者细胞上，并渗透到受试者细胞中，特别是在呼吸道上皮中。为了将病毒感染细胞，将病毒HA0前体裂解成HA1及HA2亚片段是必需的步骤。因此，需要裂解以将受试者细胞中的新病毒颗粒转化为能够感染新细胞的病毒体。已知在将完整的HA0膜蛋白从被感染细胞的内质网运输到质膜的过程中发生裂解。在运输过程中，HA经历了一系列的共译及转译后修饰，包含前体HA的蛋白水解裂解为氨基末端片段HA1(“头部”)及羧基末端HA2(“尾”或“茎”)。在原代组织培养或已建立的细胞系中生长H3流感菌株的主要困难的一是由受试者细胞中的流感血凝素的蛋白水解裂解激活所引发的。

尽管已知未裂解的HA可以介导病毒与其在细胞表面上含神经氨酸的受体的结合，但它不能在感染循环的下一步即融合。据报导，需要通过裂解暴露HA2的疏水性氨基末端，以便可将其插入靶细胞中，从而在病毒及靶细胞膜之间形成桥梁。在此过程之后，两个膜融合，病毒进入靶细胞。

HA的蛋白水解激活涉及通过类胰蛋白酶内切蛋白酶于精氨酸残基裂解，所述蛋白酶通常是一种细胞内酶，依赖于钙且具有中性的最佳pH值。由于活化蛋白酶是细胞酶，因此感染的细胞类型决定了HA是否被裂解。哺乳动物流感病毒及非致病性禽流感病毒的HA仅在有限数量的细胞类型中易于蛋白水解裂解。由于血凝素可裂解性的差异，受试者范围也存在差异，这与病毒的致病特性有关。

神经氨酸酶(NA)是流感病毒的第二膜糖蛋白。已显示病毒NA的存在对于产生针对感染病毒的多方面保护性免疫反应是重要的。对于大多数A型流感病毒，NA的长度为413个氨基酸，并由1413个核苷酸的基因编码。在流感病毒中已鉴定出九种不同的NA亚型(N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8及N9)，所有的亚型均在野生鸟类中发现。NA通过从感染细胞表面上的碳水化合物部分裂解末端神经氨酸(也称作唾液酸)残基而参与病毒HA的细胞受体的破坏。NA亦可从病毒蛋白上裂解唾液酸残基，从而防止病毒聚集。假设使用此种机制，NA通过防止新形成的病毒颗粒沿细胞膜积聚，以及通过促进病毒通过粘膜表面上存在的粘液的运输来促进病毒后代的释放。NA是重要的抗原决定簇，会发生抗原变异。

除表面蛋白HA和NA外，H3流感病毒亦包含6个其他内部基因，其产生了8种不同的蛋白，包含聚合酶基因PB1、PB2及PA，基质蛋白M1及M2，核蛋白(NP)，以及非结构蛋白NS1和NS2(参见，例如：Horimoto等人，2001，Clin Microbiol Rev.14(1)：129-149)。

为了包装到子代病毒粒子中，H3病毒RNA从核中作为核糖核蛋白(RNP)复合体从核转运，所述复合体由三种流感病毒聚合酶蛋白，核蛋白(NP)及病毒RNA以及流感病毒组成基质1(M1)蛋白及核输出蛋白(Marsh等人，2008，J Virol，82：2295-2304)。位于包膜内的M1蛋白被认为在组装和出芽中起作用。有限数量的M2蛋白被整合到病毒体中(Zebedee，1988，JVirol 62：2762-2772)。此等M2蛋白形成具有H

NS1是一种非结构蛋白，具有多种功能，包含调节细胞mRNA的剪接及核输出以及刺激转译。NS1的主要功能似乎是抵消受试者的干扰素活性，因为NS1敲除病毒是可行的，尽管其在无干扰素的细胞中的生长效率低于亲代病毒(Garcia-Sastre，1998，Virology 252：324-330)。

NS2非结构蛋白已在病毒颗粒中被检测到(Richardson等人，1991，Arch.Virol.116：69-80；Yasuda等人，1993，Arch.Virology 196：249-255)。病毒颗粒中NS2蛋白的平均数量估计为130-200个分子。体外结合测定法已证明M1和NS2的间存在直接的蛋白质-蛋白质接触。亦通过免疫沉淀在病毒感染的细胞裂解物中检测到NS2-M1复合物。NS2蛋白被认为通过与M1蛋白的相互作用，在RNP从细胞核的输出中发挥作用(Ward等人，1995，病毒学档案期刊140：2067-2073)。

广泛反应流感蛋白及类病毒颗粒(VLP)

提供了非自然发生、广泛活性、泛表位H3流感HA免疫原性多肽(免疫原)及流感类病毒颗粒(VLP)，其包含含有多种表位(抗原决定簇)的H3 HA免疫原，可在施药用物并递送给易感主体后，赋予HA抗原针对流感及其症状产生广泛活性的免疫反应的能力，以进行预防或治疗。举例而言，通过实施本文所描述的方法，所产生的代表性的H3 HA免疫原性抗原序列，在本文的图1A至1C中给出。在特定实例中，广泛反应、泛表位H3 HA多肽作为VLP的一部分施用。

应当理解，无论是否明确说明这些特性和特征，本文所述及提供的H3流感病毒免疫原与序列都是非自然发生、具有广泛反应以及泛表位。亦应理解，如本文所述并用作免疫原的H3抗原蛋白，例如HA、HA1，或HA2，是在受试者中引发免疫反应的非自然发生或合成的抗原，例如中和抗体。

具有广泛反应及免疫原性的H3抗原序列，能够产生针对H3流感病毒株的免疫反应，包含目前及未来的H3病毒，可以通过例如在2018年7月13日提交的共同申请待决的临时专利申请号62/697,803所述的方法所产生，其内容被引入本文作为参考，且其涉及对H3抗原序列参数的考虑，例如HA抗原序列，从一个时间跨度或范围(例如：线性时间范围)，例如一或多个流感季节，以及分离出H3病毒的地理位置(或多个)，例如南半球或北半球。

在一实施例中，H3流感VLP包含病毒HA蛋白。在实施例中，VLP可以包含HA1及/或HA2蛋白。应当理解，在某些情况下，H3流感病毒VLP可以包含病毒NA及M1蛋白。流感VLP的产生已在本领域中描述，并且在本领域普通技术人员的技能及专长范围内。简要而言，并且如所描述的，流感VLP可以通过以一种或多种包含编码HA、NA及M1蛋白的多核苷酸序列的质粒转染受试者细胞来产生。在将转染的细胞孵育一段适当的时间以允许蛋白质表达后(例如约72小时)，可以从细胞培养上清液中分离出H3 VLP。可以使用本领域中实施的步骤从细胞上清液中纯化H3流感VLP，例如：可以通过低速离心(以去除细胞碎片)、真空过滤以及通过20％甘油超速离心分离VLP。

流感VLP可以用作免疫原性组合物或流感疫苗以引发针对H3流感病毒的免疫反应。特别地，免疫原性组合物或疫苗(或VLP)的组分，广泛反应、泛表位H3流感HA多肽含有抗原(泛表位)决定簇，具有广泛反应并在受试者中引发免疫反应(例如：产生中和抗体及/或活化的T细胞)，可以治疗被H3病毒感染的受试者(例如：中和感染的病毒)及/或保护受试者免受病毒的全面感染或其体征及症状。

在一实施例中，本文所述的具有广泛反应及免疫原性的H3流感抗原的抗原序列，例如H3 HA抗原，包含各种表位决定簇，其可以反映H3病毒抗原蛋白中的抗原漂移和序列变异性，例如：在不同季节(时间)及不同地理位置。特别地，本文所述的H3病毒HA抗原可以包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含衍生自序列多样的流感病毒株的抗原决定簇(表位)，包含漂移变体，可以针对其产生广泛反应中和抗体，尤其是当抗原用作免疫原性产物时，(免疫原)，例如：一种抗病毒疫苗，被引入受试者中。

在一方面，所述H3病毒抗原氨基酸序列提供一种复合物，免疫原性抗原序列，其中包含衍生自过去和最近几个季节的病毒感染或疾病的最终决定因素，及/或来自不同地理位置的病毒，及/或来自H3病毒的不同亚型或进化支，即，“泛表位”抗原，作为免疫原、疫苗，或VLP一起使用时，引发广泛反应免疫反应。在一实施例中，免疫原性H3病毒HA抗原序列包含表位，这些表位是由于病毒复制过程中点突变引发的H3 HA表面抗原序列的抗原变化所致。其结果是，向受试者施用如本文所述H3免疫原，可在受试者中，针对反映此类抗原变化的表位，引发广泛反应免疫反应。

如本文所述的广泛反应H3 HA抗原及其序列并用作免疫原或免疫原性组合物，例如疫苗，在具有免疫能力的受试者中引发广泛反应免疫反应，因此，他们提供了一种出色的疫苗，可以捕获许多不同的H3流感病毒分离株(亚型或菌株)的抗原表位，针对其产生广泛活性的免疫反应(例如：广泛活性的中和抗体)。须注意的是，术语“广泛活性”及“广泛反应”在本文同义使用。

在一实施例中，如本文所述的H3病毒抗原是多肽或H3病毒的肽抗原，目前引发疾病或感染及其症状，如季节性H3流感，并且对特定地理区域而言是天然的。在另一实施例中，H3病毒抗原是多肽或肽抗原，在未来将引发H3感染的疾病及症状。在一实施例中，H3病毒抗原是多核苷酸序列。在一实施例中，H3病毒抗原是编码如本文所述的多肽或肽抗原的多核苷酸序列。举例而言，代表性的广泛反应H3病毒HA免疫原在图1A至1C中示出。

在另一实施例中，本文所述的H3免疫原序列在细胞中表达为多肽、蛋白质，或肽。在一实施例中，H3免疫原是分离的及/或纯化的。在一实施例中，免疫原被配制用于施用给需要的受试者。在一实施例中，免疫原以有效量施用于需要其的受试者以引发受试者中的免疫反应。在一实施例中，免疫反应引发中和抗体。在一实施例中，免疫反应是预防性或治疗性的。

在一实施例中，提供了非自然发生H3病毒免疫原(免疫原序列)，例如：疫苗，在将免疫原引入、施用，或递送至受试者后，其引发受试者中的广泛反应免疫反应。引入、施用或递送的途径不受限制，并且可包含，例如：静脉内，皮下，肌内，口服等途径。疫苗可以是治疗性的(例如：在由H3病毒引发的疾病(流感)症状后施予受试者，或是预防性的(保护性的)(例如：在受试者患有或表现出疾病(流感)症状前施予受试者，或由H3病毒引发的全面的疾病)。

在一实施例中，抗原的最终氨基酸序列(例如：HA)被反向转译并优化用于在哺乳动物细胞中表达。如本领域技术人员将理解的，核酸序列的优化包含用于在哺乳动物细胞中表达序列的密码子的优化以及RNA的优化(例如RNA稳定性)。

在一实施例中，分离的核酸分子(多核苷酸)包含编码多肽或肽抗原的核苷酸序列，例如H3流感HA多肽(或HA1或HA2多肽)，被提供。在某些实施例中，编码H3 HA多肽的核苷酸序列，与编码图1A至1C中所示的HA多肽(或HA1或HA2多肽)序列多核苷酸至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在其他实施例中，编码H3流感HA多肽(或HA1或HA2多肽)的核苷酸序列，与编码图1A至1C中所示的H3 HA多肽(或HA1或HA2多肽)序列的多核苷酸至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％，或至少99％相同，但缺少编码N端甲硫氨酸的起始密码子。

提供了包含编码非自然发生、广泛活性多肽或肽抗原，例如H3流感HA多肽(或HA1或HA2多肽)的核苷酸序列的载体。在一些实施例中，载体包含编码多肽或肽抗原，例如流感H3 HA多肽抗原的核苷酸序列，其与编码图1A至1C中所示的H3 HA多肽(或HA1或HA2多肽)序列的多核苷酸至少94％、至少％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施例中，载体进一步包含与编码H3 HA多肽(或HA1或HA2多肽)的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一特定实施例中，启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施例中，载体的核苷酸序列与编码图1A至1C中所示的H3 HA多肽序列的多核苷酸至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％相同。在具体实施例中，载体的核苷酸序列包含编码图1A至1C中所示的H3 HA多肽(或HA1或HA2多肽)序列的多核苷酸。在实施例中，载体是原核或真核载体。在一实施例中，载体是表达载体，诸如真核(例如：哺乳动物)表达载体。在另一实施例中，载体是质粒(原核或细菌)载体。在另一实施例中，载体是病毒载体。

用于表达H3病毒抗原的载体，例如：H3病毒蛋白，如HA蛋白，如本文所述，可以是已知的并且在本领域中使用的任何合适的表达载体。载体可以是，例如：哺乳动物表达载体或病毒载体。在一些实施例中，载体是pTR600表达载体(美国专利申请公开号2002/0106798，通过引用并入本文；Ross等人，2000，Nat Immunol.1(2)：102-103；以及Green等人，2001，(例如：Vaccine 20：242-248)。

提供了H3流感病毒衍生的非自然发生多肽抗原，例如H3流感HA多肽抗原，或HA1或HA2多肽抗原，其通过在足以允许多肽在细胞中表达的条件下用本领域已知及使用的表达载体转染受试者细胞所产生，例如：H3 HA、HA1，或HA2多肽。亦提供了包含载体的分离的细胞。

亦提供了如本文中所描述的非自然发生、广泛反应，泛表位H3抗原多肽，如泛表位、广泛反应H3流感HA多肽。在某些实施例中，多肽的氨基酸序列与HA、HA1，或HA2多肽的氨基酸序列至少95％至99％(含)相同，如图1A至1C所示。在特定实施例中，H3流感HA、HA1，或HA2多肽的氨基酸序列与图1A至1C所示的HA、HA1，或HA2多肽的氨基酸序列至少95％至99％(含)相同，但缺少N端甲硫氨酸残基。在一具体实施例中，H3流感HA多肽的氨基酸序列与图1A至1C中所示的H3 HA多肽的1-566个氨基酸至少95％至99％(含)相同。

在一些实施例中，融合蛋白包含如本文所述的广泛反应、泛表位H3病毒抗原多肽，例如：但不限于，本文所揭露的H3流感HA多肽。在一些实施例中，H3流感HA多肽可以与任何异源氨基酸序列融合以形成融合蛋白。举例而言，HA1及HA2多肽可独立产生，然后融合在一起以产生H3 HA多肽抗原，例如：包含566个氨基酸。

亦提供了类病毒颗粒(VLP)，特别是H3流感VLP，其含有泛表位、广泛反应蛋白抗原，例如本文所述的H3流感HA、HA1或HA2蛋白。在某些实施例中，VLP的HA蛋白与图1A至1C所示的H3 HA蛋白质的至少或等于94％、至少或等于95％、至少或等于96％、至少或等于97％、至少或等于98％、至少或等于99％或100％相同。病毒或流感病毒VLP亦可包含形成病毒颗粒所需的任何其他病毒或流感蛋白。在某些实施例中，病毒或流感VLP进一步包含流感神经氨酸酶(NA)蛋白、流感基质(M1)蛋白，或两者。

亦提供了包含本文所述的H3流感HA、HA1，或HA2多肽的H3流感VLP，其通过用含有编码H3 HA、HA1，或HA2多肽的多核苷酸的载体转染受试者细胞而产生。在一实施例中，亦提供含有H3流感HA多肽，或HA1或HA2多肽的一种H3流感VLP，如本文所述，通过用编码H3 HA、HA1，或HA2多肽的载体转染受试者细胞所产生，在足以允许H3 HA、NA及M1蛋白表达的条件下，编码流感NA蛋白的载体及编码流感M1蛋白的载体。如图2A至2C中所观察到的，包含图1A至1C中所示序列并用作免疫原的此类VLP针对不同H3流感病毒株产生具有高血凝素抑制作用(HAI)效价的抗体。

亦考虑了质粒(载体)的收集。在某些实施例中，质粒的收集包含编码H3流感NA的质粒，编码H3流感MA的质粒，以及编码如本文所述的广泛反应H3 HA蛋白的质粒。在一些实施例中，编码HA质粒的编码H3流感HA蛋白的核苷酸序列，与图1A至1C中所示的编码H3 HA氨基酸序列的多核苷酸至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施例中，HA编码质粒中编码密码子优化的H3流感HA蛋白的核苷酸序列，与图1A至1C中所示的编码H3 HA氨基酸序列的多核苷酸至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。

在本申请的上下文中，“广泛反应”或“广泛活性”是指所述H3蛋白质(例如：H3 HA蛋白质序列)是免疫原性的，并且包含表位的多样性(抗原决定簇；泛表位)，其在受试者中引发足以治疗疾病或感染的免疫反应(例如：针对H3病毒HA表位多样性的中和抗体，经常伴随T细胞反应)，及/或抑制、中和，或预防由特定亚型内的大多数或所有H3流感病毒或相关病毒株引发的感染。在实施例中，非自然发生H3病毒抗原蛋白，例如：HA蛋白，能够引发针对大多数或所有已知的H3流感病毒分离株的保护性免疫反应，例如约80％、约85％、约90％、约95％、或约96％至99％的已知H3流感病毒分离株。

用于给药的组合物及医药组合物

提供了包含广泛反应、泛表位H3流感HA蛋白的组合物，或融合蛋白，或包含这种如本文所述的广泛反应H3流感HA蛋白的VLP。在一些实施例中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂，或媒介物。在一些实施例中，亦使用佐剂(一种药物或免疫试剂，可修饰或增强免疫反应，例如产生更多持久的抗体)。例如：但不限于，所述佐剂可以是无机化合物，例如明矾、氢氧化铝或磷酸铝；矿物或石蜡油；鲨烯；清洁剂，例如Quil A；植物皂苷；弗氏完全或不完全佐剂、生物佐剂(例如：细胞因子，如IL-1、IL-2，或IL-12)；细菌产品，例如杀死的百日咳博德特氏菌，或类毒素；或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。

用于肠胃外施用的，含有所述非自然发生、广泛活性，泛表位H3流感HA多肽以及H3流感类病毒颗粒(VLP)的组合物及制剂(例如：生理学上或药学上可接受的组合物)，包含，但不限于，无菌水或非水溶液、悬浮液及乳液。非水溶剂的非限制性实例包含丙二醇、聚乙二醇、植物油，例如橄榄油和低芥酸菜子油，以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。水性载体包含水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，包含盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包含，例如：氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液，或不挥发性油。静脉内媒介物包含，例如：液体及营养补充剂、电解质补充剂(例如彼等基于林格氏葡萄糖的)，以及类似物。此类组合物和制剂中亦可存在防腐剂及其他添加剂，例如抗，微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、着色剂、稳定剂、惰性气体等。

一些组合物可以潜在地施用药学上可接受的酸或碱加成盐，通过与无机酸反应而形成，例如盐酸、氢溴酸、高氯酸、硝酸、硫氰酸、硫酸、磷酸、及有机酸，例如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸和富马酸，或通过与无机碱反应而形成，例如氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化钾，以及有机碱例如单、二、三烷基及芳基胺及取代的乙醇胺。

本文提供的医药组合物包含了治疗有效量的非自然发生、广泛反应、泛表位，H3病毒蛋白抗原，或H3流感VLP，其可以单独使用，或与药学上可接受的载体组合使用。药学上可接受的载体包含，但不限于，盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合。所述载体及组合物可以是无菌的，并且制剂适合于施用药物方式。所述组合物亦可包含少量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体或水溶液、悬浮液、乳液、分散液、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂，或缓释制剂。可以将液体或水性组合物冻干，并在使用前用溶液或缓冲液重构。所述组合物可以与传统的粘合剂及载体如甘油三酸酯一起配制成栓剂。口服制剂可以包含标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素，以及碳酸镁。任何常见的已知的药物载体，例如无菌盐水溶液或芝麻油，都可以使用。介质亦可包含常规的药物辅助材料例如：举例而言，调节渗透压的药学上可接受的盐、缓冲剂、防腐剂等。可以在所述的组合物及给药方法中使用的其他介质是生理盐水和芝麻油。

治疗、施用药物及递送方法

本文提供了治疗由H3流感病毒引发的疾病或感染，或其症状的方法。所述方法包含向受试者(例如：哺乳动物)，特别是人类受试者，施用治疗有效量的如本文所述的广泛反应、泛表位免疫原或包含所述免疫原的医药组合物或疫苗(例如：VLP疫苗)。一个实施例涉及一种治疗患有由H3流感病毒引发的疾病或感染或其症状，或具有该风险或易感性的疾病或症状的受试者的方法。该方法包含向受试者(例如：哺乳动物受试者)施用一定量或治疗量的免疫原性组合物或疫苗，其包含非自然发生、广泛反应，泛表位H3病毒抗原多肽，例如HA多肽，或HA多肽VLP，在治疗疾病、感染及/或其症状的条件下，足以治疗由H3流感病毒引发的疾病、感染或其症状。

在一实施例中，本文所述的方法包含向受试者(包含被确定需要这种治疗的人类受试者)施用有效量的非自然发生、广泛活性，泛表位H3病毒抗原多肽，例如H3病毒HA多肽，或疫苗，或本文所述的组合物，以产生这种效果。将治疗方法适当地施用于患有、具有、易感，或处于换上疾病、病症、感染或其症状，即流感或流行性感冒的受试者，特别是人类。识别需要这种治疗的受试者可以基于受试者或卫生保健专业人员的判断，并且可以是主观的或客观的。简而言之，可以通过诊断测试(例如：基因检测、酶或蛋白质标记物检测)、标记分析、家族史等的任何客观或主观判断，包含受试者或医疗保健提供者的意见，来确定需要治疗或“存在风险的”或“易感的”的那些主体。非自然发生、广泛活性泛表位H3免疫原，例如本文所述的H3HA多肽免疫原和疫苗，亦可用于治疗任何其他可能涉及由H3流感病毒引发的感染或疾病的障碍。接受治疗的受试者可以是非人类哺乳动物，例如兽医受试者或人类受试者(也称作“患者”)。

另外，提供了预防方法，预防或保护针对由H3流感病毒引发的疾病或感染或其症状。这种方法包含施用治疗有效量的医药组合物，其包含如本文所述的H3免疫原性组合物或疫苗(例如：H3 VLP疫苗)，以对受试者(例如：诸如人类的哺乳动物)，特别是，受试者感染前或疾病发作前，例如H3病毒相关疾病。

在另一实施例中，提供了一种监测由H3病毒引发的H3病毒感染或疾病的进展，或监测H3感染或疾病的治疗的方法。所述方法包含确定患有或易受与H3流感病毒有关的感染、疾病或其症状的受试者的诊断标志物或生物标志物的水平或诊断测量值，其中已向受试者施用足以治疗感染、疾病或其症状的一定量的本文所述的非自然发生、广泛反应、泛表位H3病毒HA蛋白，或本文所述的疫苗。

在所述方法中确定的标志物或生物标志物(例如蛋白质)的水平或数量，可与健康、正常对照样品中的标志物或生物标志物的已知水平进行比较；在受试者的感染前或疾病前样品中；或在其他患疾/感染/患病的患者中确定治疗主体的疾病状况。为了监测，在比确定第一水平或量较晚的时间点，确定从受试者获得的样品中的标记物或生物标志物的第二水平或量，并且可以比较两种标记物或生物标记物的水平或数量，以监测疾病或感染的过程，或疗法/治疗的功效。在某些实施例中，诚如所述，在开始治疗之前确定受试者中(例如：从受试者获得的样品中)标志物或生物标志物的治疗前水平；然后可以在治疗开始后及/或在治疗过程中，将所述标志物或生物标志物的治疗前水平与受试者中标志物或生物标志物的水平进行比较，以确定疾病治疗的功效(监测功效)。

所述非自然发生、广泛反应、泛表位H3病毒抗原多肽，如所述的H3病毒HA多肽，以及包含H3 HA多肽的VLP或其组合物，可以通过正常情况下的任何途径施用于受试者，以用于将重组蛋白、包含重组蛋白的组合物或重组病毒引入受试者。施用途径及方法，包含但不限于皮内、肌内、腹膜内、鞘内、肠胃外，例如静脉内(IV)或皮下(SC)、阴道、直肠、鼻内、吸入、眼内、颅内或口服。肠胃外施用药物，例如皮下、静脉内或肌内施用药物，通常通过注射(免疫)来实现。注射剂可以常规形式和制剂形式制备，可以为液体溶液或悬浮液，亦可为适合于在注射前以溶液或悬浮液形式存在的固体形式(例如冻干形式)，或可为乳剂。注射溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒及片剂制备。施用药物可以是系统的或局部的。

所述非自然发生、广泛反应、泛表位H3病毒多肽，例如所述的H3病毒HA多肽，以及包含H3 HA多肽的VLP，或其组合物，可以任何合适的方式进行施用药物，例如与药学上可接受的如上所述(supra)的载体。药学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定免疫原或组合物，以及用于施用该组合物的特定方法。因此，可以使用多种合适的且生理上和药学上可接受的制剂，来制备包含非自然发生、广泛活性、泛表位H3病毒多肽的医药组合物，如H3病毒HA多肽，以及包含H3 HA多肽的VLP或其组合物。

可以通过单剂量或多剂量来施用广泛反应、泛表位H3病毒抗原多肽，如H3病毒HA多肽，以及包含HA多肽的VLP，或其组合物。施予受试者的剂量应随时间足以在受试者中诱导有益的治疗反应，例如抑制、阻断、减少、改善、防范，或预防H3流感病毒的疾病或感染。其取决于受试者的种类、年龄、体重和一般状况，根据所治疗的感染的严重程度，根据所使用的特定组合物以及根据施用药物方式，受试者之间的所需剂量将有所不同。合适的剂量可以由本领域技术人员，例如临床医生或执业医生，仅使用常规实验来确定。

进一步提供的是，通过向受试者施用本文揭露的非自然发生、广泛活性，泛表位H3流感HA蛋白，含有H3流感HA蛋白的融合蛋白，含有流感HA蛋白的VLP，或如本文中所述的其组合物，以引发受试者对H3流感病毒的免疫反应的方法。在一些实施例中，H3 HA蛋白、HA融合蛋白或VLP可以使用任何合适的施用途径来施用，例如：通过肌内注射。在一些实施例中，H3 HA蛋白、融合蛋白，或VLP是以包含药学上可接受的载体的组合物的形式给药。在一些实施例中，所述组合物包含，选自如明矾、弗氏完全或不完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)的佐剂。在其他实施例中，所述组合物可以与另一种治疗剂或分子组合施用。

亦提供了一种免疫受试者以抵抗由H3流感病毒引发的感染或疾病或其症状的方法，其中所述方法包含向受试者施用含有非自然发生、泛表位、广泛反应H3流感HA蛋白的VLP，或施用如本文所述的免疫原性组合物。在所述方法的一些实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的载体及/或佐剂。在该方法的一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体及/或佐剂。例如：佐剂可以是明矾、弗氏完全或不完全佐剂、生物佐剂或免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)。在一个实施例中，H3 VLP(或其组合物)是通过肌内施用。

在引发免疫反应或使受试者免疫的方法的一些实施例中，针对由H3流感病毒引发或相关的感染或疾病，向受试者施用至少1μg含有非自然发生、广泛活性泛表位H3病毒HA蛋白的VLP，例如至少5μg、至少10μg、至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少40μg或至少50μg含有非自然发生、广泛活性泛表位H3病毒HA蛋白的VLP，例如约1至约50μg或约1至约25μg含有H3HA蛋白的VLP。在特定实例中，向受试者施用约5至约20μg的VLP，或约10至约15μg的VLP。在特定但非限制性的实例中，向受试者施用约15μg的VLP。但是，本领域技术人员能够确定适合于对需要治疗或防止病毒感染的受试者施用药物的VLP的治疗有效量(例如：提供治疗效果或针对H3流感病毒感染提供保护的量)。

据预期，施用如本文所述包含非自然发生、广泛活性泛表位H3 HA蛋白的VLP，将引发高滴度的中和抗体，所述中和抗体针对H3 HA蛋白免疫原上的抗原决定簇的多样性，以及针对许多代表性H3分离株的H3HA抑制(HAI)抗体的保护水平，并将提供针对H3病毒及/或相关H3病毒类型的致命攻击的全面保护。本文所述的包含非自然发生、广泛活性泛表位H3流感HA蛋白的VLP引发了更广泛的免疫反应(例如：与多价H3流感病毒疫苗引发的免疫反应相比，可引发针对更广泛范围的H3病毒分离株的中和抗体)。

佐剂及联合疗法

所述H3病毒免疫原或包含H3蛋白抗原的免疫原性组合物(例如：H3HA抗原)，或如本文所述的含有H3病毒的VLP，可以单独使用或与其它治疗剂联合施用，以增强抗原性或免疫原性，即，增加受试者的免疫反应，例如引发特异性抗体。举例而言，H3流感VLP可与佐剂一起施用，如明矾、弗氏的不完全佐剂、弗氏的完全佐剂、生物佐剂，或免疫刺激性寡核苷酸(如CpG寡核苷酸)。

一种或多种细胞因子，例如白血球介素-1(IL-2)、白介素-6(IL-6)、白介素-12(IL-12)、蛋白质记忆T细胞引诱剂“受激活调节正常T细胞表达和分泌因子”(RANTES)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，或干扰素-γ(IFN-γ)；一种或多种生长因子，例如GM-CSF或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；如期望或必要，可将一种或多种分子用作生物佐剂，例如属于TNF超家族(4-1BBL)的TNF配体超家族成员4配体(OX40L)或2型跨膜糖蛋白受体，或此等分子的组合。(参见，例如：Salgaller等人，1998，外科肿瘤学杂志68(2):122-38；Lotze等人，2000,Cancer J.Sci.Am.期刊6(Suppl 1):S61-6；Cao等人，1998，Stem Cells期刊16(Suppl 1):251-60；Kuiper等人，2000，实验医学与生物学进展丛书465:381-90)。此等分子可以施用于受试者全身(或局部)。

体外和体内诱导细胞反应的几种方法是本领域已知及实践的。脂质已被鉴定为能够在体内辅助引发针对各种抗原的细胞毒性淋巴细胞(CTL)的试剂。例如：棕榈酸残基可以连接(例如：通过一个或多个连接残基，例如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)到赖氨酸残基的α和ε氨基上，然后与免疫原性肽连接(美国专利号5,662,907)。然后可以将脂质化的肽直接以胶束形式注射，掺入脂质体或在佐剂中乳化。作为另一个例子，当共价附于合适的肽时，大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸-丝氨酸-丝氨酸可以用于引发肿瘤特异性CTL(参见，例如：Deres等人，1989，自然期刊342：561)。)。此外，中和抗体的诱导还可以用与显示适当表位的肽缀合的相同分子引发，并且可以组合两种组合物以引发体液反应和细胞介导的反应，其中这种组合被认为是合乎需要的。

尽管治疗方法可能涉及施用包含本文所述的非自然发生、广泛活性、泛表位H3 HA免疫原性蛋白的VLP，但本领域技术人员将理解，非自然发生、广泛活性、泛表位H3HA免疫原性蛋白H3流感HA蛋白本身(在不存在病毒颗粒的情况下)，作为药学上可接受的组合物的组分或作为融合蛋白，可以施用于需要其的受试者以引发受试者的免疫反应。

试剂盒

本文亦提供试剂盒，其含有非自然发生、广泛活性、泛表位H3病毒免疫原，或疫苗，或包含免疫原的药学上可接受的组合物，和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药用组合物，例如：用于向受试者施用药物。如本文所述，免疫原可以是H3病毒蛋白(多肽)或多核苷酸(编码H3病毒多肽的多核苷酸，例如H3HA蛋白)的形式。本文亦提供了包含一种或多种质粒或如本文所述的质粒集合的试剂盒。如本领域技术人员将理解的，这样的试剂盒可以包含一个或多个容纳免疫原、疫苗或组合物，必要时的稀释剂或赋形剂，以及使用说明书。

重组多肽表达

除非另有说明，否则本发明的实施采用分子生物学的常规技术(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学，其皆在技术人员的能力范围内。此类技术已在文献中得到充分说明，诸如“分子克隆：实验室手册”，第二版(Sambrook，1989)；“寡核苷酸合成”(Gait，1984)；“动物细胞培养”(Freshney，1987)；“酶学方法”，“实验免疫学手册”(Weir，1996年)；“哺乳动物细胞的基因转移载体”(Miller和Calos，1987年)；“分子生物学的当前方案”(Ausubel，1987年)；“PCR：聚合酶链反应”(Mullis，1994年)；“目前的免疫学方案”(Coligan，1991年)。此等技术适用于生产本发明的多核苷酸及多肽，并且，例如：可以在进行和实施本发明时加以考虑。在以下部分中将讨论用于特定实施例的特别有用的技术。

实例

提供以下示例以说明特定特征及/或实施例。不应将示例解释为将本申请限制为所描述的特定特征或实施例。

实例1

血凝抑制(HAI)测定

血凝抑制(HAI)测定法用于评估针对HA蛋白的功能性抗体，所述抗体能够抑制豚鼠、马或火鸡红血球(red blood cells(RBCs))的凝集。

用于测定的血清包含用含有H3病毒HA抗原序列(如本文所述)的VLP免疫动物(小鼠)后产生的抗体，例如本文所述的TJ2、TJ-3、TJ5-9(图1A至1C)、其他H3病毒HA序列(例如Bris/07、Perth/09、Vic/11、Tx/12、Switz/13、HK/14)，野生型H3 HA序列，及/或PBS对照。

为了免疫，每组使用5只小鼠。每只动物每剂接受3μg HA抗原/VLP以及鲨烯佐剂(AF03)(MF Klucker,2012,J.Pharm.Sci.,101(12):4490-4500)。采用了同源抗原、辅助剂、增幅免疫/施用药物方案。在第56天用免疫原增幅免疫，随后在第77天将小鼠放血，如下表1所示。

表1

所述方案改编自WHO流感实验室监测手册(Gillim-Ross和Subbarao，2006,，临床微生物学评论期刊19(4)：614-636)，并使用受试者物种，所述受试者物种通常用于表征当代H3N2菌株，所述菌株与α(2，6)连接的唾液酸受体具有优先结合能力。火鸡或豚鼠红血球是用于根据所使用的红血球的类型来比较HAI是否存在差异。

为了灭活非特异性抑制剂，在测试前用受体破坏酶(RDE)(东研实业公司，日本)处理血清。(Bright等人，2005，刺胳针期刊366(9492)：1175-1181；Bright等人，2003，病毒学杂志308(2)：270-278；Bright等人，2006，美国医学会杂志295(8)：891-894；Mitchell等人，2004，疫苗期刊21(9-10)：902-914；Ross等人，2000，自然-免疫学期刊1(2)：127-131)。简言的，将三份RDE加入一份血清中并在37℃下孵育过夜。通过在56℃孵育约30分钟(～30分钟)使RDE失活。经RDE处理的血清在v型底部微量滴定板中进行一系列的两倍系列稀释。将等体积的每种病毒，例如H3N2病毒，调整到大约8个血凝单位(HAU/50μl，添加到每个孔中。覆盖板并在室温下孵育20分钟，随后在磷酸盐缓冲液(PBS)中添加0.75％或0.8％的豚鼠红血球(Lampire Biologicals公司，派珀斯维尔，宾夕法尼亚州，美国)。红血球(erythrocytes)在4℃下储存，并在制备后72小时内使用。

通过搅拌将板混合并覆盖，并且使RBC在室温下沉降1小时。HAI滴度是通过倒数稀释含有未凝集RBC的最后一个孔来确定的。每个板包含阳性和阴性血清对照。在疫苗接种的前，所有小鼠的针对当前流行的人流感病毒的抗体均呈阴性(HAI≤1:10)。根据WHO和欧洲药品委员会评估流感疫苗的定义，血清保护定义为HAI滴度>1:40，血清转化定义为滴度与基线相比增加4倍。

经常检查更严格的阈值>1:80。因为在接种疫苗时小鼠是未与抗原接触

图2A至2C显示，与使用不同的H3病毒HA序列(图2B)或PBS(图2C)产生的VLP相比，使用上述和本文(图2A)所述的免疫/施用药物方案，针对包含H3病毒HA免疫原(免疫原序列)的VLP产生的抗体的血凝抑制抗体滴度。

例子2

类病毒颗粒(疫苗)的制备

使用前文所述的方法(参见，例如：美国专利申请公开号US2015/0030628)，用表达流感病毒神经氨酸酶(A/mallard/Alberta/24/01,H7N3)，HIV p55 Gag序列，或广泛反应HA表达质粒的一(例如：包含编码图1A至1C中所示的HA免疫原的序列)的三种哺乳动物表达质粒中的每一种转染哺乳动物293T细胞。在37℃下孵育72小时后，收集来自瞬间转染细胞的上清液，离心去除细胞碎片，并通过0.22μm的孔膜过滤。通过在20℃甘油垫上以135,000x g在4℃下超速离心4小时，纯化并沉淀哺乳动物类病毒颗粒(VLP)。将VLP重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并使用常规的二辛可宁酸测定法(BCA)评估总蛋白浓度。通过将等体积的火鸡或豚鼠红血球(RBCs)添加到V型底部96孔板中，并与连续稀释的VLP一起孵育30分钟，在室温(RT)下孵育，从而确定每种VLP制剂的血凝活性。完全凝集的RBCs将VLP的最高稀释度视为终点HA滴度。

实例3

酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定HA含量

以5至10μg的VLP总蛋白包覆高亲和力、96孔、平底ELISA板，并将ELISA碳酸盐缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)中连续稀释的重组H3抗原(3006_H3_Vc，蛋白质科学，梅里登，CT)添加至孔中。将板在摇杆上于4℃温育过夜。第二天早上，以PBS于0.05％Tween-20(PBST)洗涤板，并将非特异性表位在PBST溶液中用1％牛血清白蛋白(BSA)封闭，在室温下放置1小时。除去缓冲液，以及茎特异性2族抗体CR8020(Tharakaraman，K.等人，2014，细胞受试者和微生物期刊，第15卷，第644至651页；Ekiert，DC等人，2012，科学期刊，333(6044)：843至850；Creative Biolabs公司，雪莉，纽约)加入到板，接着在在37℃孵化1小时。洗涤板，接着用山羊抗人IgG山葵过氧化物酶偶联二抗(2040-05，Southern Biotech公司，伯明罕，阿拉巴马州)在37℃下探测1小时。

洗涤板。刚制备的邻苯二胺二盐酸盐(OPD)(P8287，Sigma公司，市，州，USA)在柠檬酸盐缓冲液(P4922，Sigma公司)中的底物添加至孔中，随后加入1N H

实例4

小鼠及雪貂研究

小鼠研究

BALB/c小鼠(家鼷鼠，雌性，年龄6至8周)购自Jackson实验室(巴尔港，缅因州，美国)，容纳于微型隔离单元并允许自由获得食物及饮水。根据乔治亚大学研究动物资源大学实验动物指南照护动物。所有程序均经由实验动物照护及使用委员会(IACUC)的审查及批准。根据来自ELISA定量的HA含量，用纯化的类病毒颗粒(3.0μg/鼠)为小鼠(每组5只小鼠)接种疫苗，并在第0周通过肌内注射将VLP免疫原(疫苗)传递给动物。在第4周和第8周，以相同剂量的相同免疫原(疫苗)对动物进行加强免疫。每种剂量的疫苗均采用乳化鲨烯水佐剂(Sanofi Pasteur，里昂，法国)配制。与VLP 1：1混合后的最终浓度为2.5％鲨烯。每次接种后第28天，通过颌下颊收集血液样本，并将样本转移至微量离心管中。将试管在10,000rmp离心10分钟。除去血清样本并冷冻于-20℃±5℃。

雪貂研究

购自马歇尔农场(美国宾夕法尼亚州萨尔市)的雪貂(蒙眼貂，雌性，年龄6至12个月)。将雪貂成对安置于装有Sani-chips实验动物垫料(PJ Murphy Forest Products，蒙特维尔，新泽西州，美国)的不锈钢笼中(Shor-line，堪萨斯城，堪萨斯州，美国)。向雪貂提供Teklad Global雪貂饮食(Harlan Teklad，麦迪逊市，威斯康星州，美国)和淡水任食。

将纯化的VLP在pH 7.2的PBS中稀释，以达到最终浓度。在第0周时，根据密度测定法测定的HA含量，通过肌肉注射在四头肌中以0.25ml的体积向雪貂(n＝3)接种15μg的纯化VLP，接着在第3周以相同剂量加强免疫。疫苗在使用前应储存于-80℃下，并在使用前与

其他实施方式

从前述说明中，将显而易见的是，可以对本文描述的发明进行变化和修改，以将其应用于各种用途和条件。此类实施例亦于所附权利要求的范围内。

本文对变量的任何定义中的元素列表的列举包含将该变量定义为所列元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文对实施例的叙述包含该实施例作为任何单个实施例或与任何其他实施例或其部分组合。

本文中提及的所有专利及出版物均以相同程度通过引用并入本文，正如同每件独立的专利及出版物均被具体地和单独地指出通过引用并入。