真骨鱼恒定链癌症疫苗

摘要

本发明涉及多肽、编码这种多肽的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、包含这种多核苷酸的载体的集合以及这种多肽、多核苷酸、载体用于治疗或预防疾病，特别是肿瘤疾病的用途，所述多肽包含任选地与一种或多于一种抗原融合的真骨鱼恒定链片段或与一种或多于一种抗原或其抗原片段融合的真骨鱼恒定链。真骨鱼恒定链多肽或其片段用作“T细胞增强子”，其将非免疫原性抗原序列转化为免疫原性T细胞抗原。

说明书

本发明涉及多肽、编码这种多肽的多核苷酸、包含这种多核苷酸的载体、包含这种多核苷酸的载体的集合以及这种多肽、多核苷酸、载体用于治疗或预防增生性疾病，优选癌症、病毒性疾病、真菌性疾病或细菌性疾病的用途，所述多肽包含任选地与一种或多于一种抗原融合的真骨鱼恒定链片段或与一种或多于一种抗原或其抗原片段融合的真骨鱼恒定链。真骨鱼恒定链多肽或其片段用作“T细胞增强子”，其将非免疫原性抗原序列转化为免疫原性T细胞抗原。

发明背景

有时疫苗引起次优或无T细胞免疫应答。这种T细胞免疫应答诱导不良的现象在针对抗原的疫苗接种的情况下更常见，所述抗原是完全自分子(self molecule)(例如癌症特异性抗原)或部分自分子(例如癌症特异性新抗原)。癌症特异性新抗原主要衍生自基因编码区的点突变，这导致了造成一种氨基酸变化的非同义单核苷酸变体。蛋白质序列中的单一氨基酸变化很少产生能够诱导有效免疫应答的新表位。在大部分情况下，这种小的变化完全无法产生新表位或可能产生非常弱的表位。因为预先存在的针对自身抗原的中枢耐受，所以通过疫苗接种来诱导针对癌症特异性抗原的有效免疫应答仍是具有挑战性的任务。为了克服癌症特异性抗原和新抗原的免疫原性缺乏或不良，已经采用了几种策略以挽救一些基因疫苗的免疫原性缺乏或不良。恒定链已经显示在基因疫苗接种的情况下增强CD8

在癌症疫苗接种中，重要的是避免肿瘤通过出现不能被疫苗诱导的T细胞识别的新的癌症特异性抗原而逃脱。癌症疫苗在治疗癌症方面的挑战是诱导能够立刻识别和消除尽可能多的癌细胞的免疫T细胞的多样性群体，以减少癌细胞“逃脱”T细胞应答的机会。因此，期望疫苗编码相当大量的癌症特异性抗原。这与最近描述的基于癌症特异性新抗原的个性化疫苗方法特别相关。为了优化成功概率，疫苗应该靶向尽可能多的新抗原，然而载体的最大插入物尺寸受到限制。全长INV序列或其大片段占据了疫苗抗原插入物的相对大的部分。因此，在抗癌疫苗接种的情况下，特别是当在疫苗中使用几种癌症特异性抗原时，使用短多肽作为T细胞增强子是优选的。

基于腺病毒的基因疫苗接种平台，特别是类人猿衍生的腺病毒(GAd)的病毒载体显示对诱导T细胞应答非常有效，并且类人猿衍生的腺病毒(GAd)适合于以人工基因的格式编码大的抗原，所述人工基因由编码一个接一个相连的不同蛋白质片段的多核苷酸组成(Borthwick，N.等人，Mol Ther，2014.22(2)：第464-75页)。出人意料地，当用于癌症特异性新抗原时，不能诱导T细胞介导的免疫应答。

本发明人确定了能够恢复免疫原性的特异性INV序列。这种INV序列适于克服癌症特异性新抗原的免疫原性缺乏或不良。特别是确定了非人真骨鱼(Teleostei)INV的两种短片段都不包含作为有效T细胞增强子的跨膜结构域。

在接种疫苗的情况下，使用人INV或动植物种类史密切相关物种的INV可能导致针对该自身序列的免疫应答的不期望的诱导。自身免疫应答在这种情况下将针对表达INV的正常组织。本发明人出人意料地发现真骨鱼的INV虽然与哺乳动物的INV完全不同，但增加了哺乳动物中针对抗原的T细胞应答，该T细胞应答增强效果作用在与真骨鱼恒定链融合的多种抗原上并且真骨鱼INV的短片段已经足以引起这种应答。因此，本发明特别提供了：(i)哺乳动物中针对抗原的T细胞应答的改善增强子，其中引起针对健康组织的不期望的T细胞应答的可能性降低，(ii)针对多种抗原的T细胞应答的增强子，和(iii)能够引发T细胞的短片段，所述T细胞使融合大量抗原或其抗原片段的能力最大化。

发明内容

在本发明的第一方面，本发明涉及多肽，其包含：

(a)真骨鱼的恒定链(INV)的片段，其包含或组成为真骨鱼INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个连续氨基酸，其中该片段具有T细胞应答增强子活性并且MPD的特征在于选自以下的氨基酸序列：

(i)NQRX

其中

X

其中该片段优选与SEQ ID NO：3具有至少60％的一致性；或

(ii)DQKQQIQZ

其中

Z

其中该片段优选与SEQ ID NO：10具有至少60％的一致性；

和任选一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段；

或

(b)全长真骨鱼INV和一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段，所述全长真骨鱼INV选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12，或其变体，其具有T细胞应答增强子活性，其中变体的MPD的氨基酸序列与SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：10具有至少60％的一致性。

在第二方面，本发明还涉及编码根据本发明的第一方面的多肽的多核苷酸，其中多核苷酸为DNA或RNA，优选DNA。

在第三方面，本发明涉及包含根据本发明的第二方面的多核苷酸的载体。

在第四方面，本发明涉及两种或多于两种不同载体的集合，其中每种不同的载体包含根据本发明的第二方面的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据本发明的第一方面的多肽。

在第五方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的第一方面的多肽、本发明的第二方面的多核苷酸或本发明的第三方面或第四方面的载体/载体的集合、药学上可接受的赋形剂和任选的一种或多于一种佐剂。

在第六方面，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的第五方面的药物组合物和分别包装的至少一种免疫调节剂，或编码免疫调节剂的至少一种多核苷酸，或包含编码免疫调节剂的多核苷酸的载体。

在第七方面，本发明涉及根据第一方面的多肽、根据第二方面的多核苷酸、根据第三方面或第四方面的载体或载体的集合、或根据第五方面或第六方面的药物组合物或包含这种药物组合物的试剂盒用于预防或治疗增殖性疾病，优选癌症、病毒性疾病、真菌性疾病或细菌性疾病的用途。

附图说明

在下文中，描述了本说明书中包括的附图的内容。在本上下文中，还请参考上文和/或下文的本发明的详细描述。

图1：编码与penta抗原的N末端相连的BP和PO全长恒定链(BP_INV FL[SEQ ID NO：9]和PO_INV_FL[SEQ ID NO：2])或其片段FRAG_A(BP_INV FRAG_A[SEQ ID NO：10]和PO_INVFRAG_A[SEQ ID NO：3])以及FRAG_B(BP_INV FRAG_B[SEQ ID NO：11]和其PO_INV FRAG_B[SEQ ID NO：4])的GAd-penta(penta)和GAd载体的免疫原性。用每种载体的10

具体实施方式

在下面详细描述本发明之前，应理解本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为它们可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求的限制。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

优选地，本文使用的术语定义如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W，Nagel，B.andKlbl，H.eds.(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland)中所述，和如Axel Kleemann和Jurgen Engel的“Pharmaceutical Substances：Syntheses，Patents，Applications”，Thieme Medical Publishing，1999；Susan Budavari等人编辑的″MerckIndex：An Encyclopedia of Chemicals，Drugs，and Biologicals″，CRC Press，1996和United States Pharmcopeial Convention，Inc.出版的the United StatesPharmacopeia-25/National Formulary-20，Rockville Md.，2001中所述。

在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则单词“包含”、和其变体将被理解为意味着收录所陈述的特征、整数或步骤或特征、整数或步骤组但不排除任何其他特征、整数或步骤或特征、整数或步骤组。在以下段落中，更详细地定义了本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他方面结合，除非明确的相反指示。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他特征组合。

在本说明书的全文中引用了若干文献。无论是上文还是下文，本文引用的每个文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用整体并入本文。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类公开内容。本文引用的一些文献的特征在于“通过引用并入”。在这种并入的引用的定义或教导与本说明书中引用的定义或教导之间发生冲突的情况下，以本说明书的文本为准。

在下文中，将描述本发明的要素。这些要素与特定实施方案一起列出，但应该理解的是，它们可以以任何方式和任何数量组合以创建额外的实施方案。不同描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明限制为仅明确描述的实施方案。该描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素相结合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则应认为本申请的描述中公开了本申请中所有所描述要素的任何排列和组合。

为了实践本发明，除非另有说明，否则使用化学、生物化学和重组DNA技术的常规方法，其在领域的文献中进行了解释(参见例如Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第二版，J.Sambrook等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor 1989)。

在下文中，提供了本说明书中常用术语的一些定义。在说明书的其余部分中，这些术语在其使用的每种情况下将分别具有定义的含义和优选的含义。

如本说明书和所附权利要求中所使用的，要素前无数量词包括复数指代物，除非内容另有明确说明。

术语跨膜结构域(TMD)在本发明中用于指代恒定链序列(INV)的TMD，其定义为从所有INV中保守的Gln(Q)残基的17个残基N末端开始到保守的Q的8个残基C末端结束的氨基酸片段，因此总共包括26个残基。

术语膜近端结构域(MPD)在本发明中用于指代紧邻INV的TMD的C末端的27个残基的片段。

术语“佐剂”在本发明中用作增强对抗原的应答的物质。另外，佐剂还逐渐发展为有助于稳定抗原制剂的物质。向疫苗中添加佐剂以刺激免疫系统对靶抗原的应答，但不提供自身免疫。需要佐剂来改善对抗原的路径和适应性免疫应答。佐剂通过不同的机制来发挥其作用。例如，通过扩展抗原在血液中的存在或/和帮助抗原呈递细胞吸收抗原，和/或激活巨噬细胞和淋巴细胞和/或支持细胞因子的产生。一些佐剂，例如明矾，通过产生在注射部位捕获抗原的贮库起递送系统的作用，提供持续刺激免疫系统的缓慢释放。在所述的佐剂类型中，有i)无机化合物：明矾、氢氧化铝、磷酸铝、碱式磷酸钙；ii)矿物油：石蜡油；iii)细菌产品：杀灭百日咳博德特氏菌、牛分枝杆菌、类毒素；iv)非细菌性有机物：角鲨烯；v)递送系统：洗涤剂(Quil A)；vi)来自皂树(见Quillaia)的植物皂甙、大豆、美远志；vii)细胞因子：IL-1、IL-2、IL-12；viii)组合：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂。

术语“免疫调节剂”在本发明中用于指代对免疫系统起作用的任何药物或物质。免疫调节剂可以调节免疫响应以通过i)增强虚弱的免疫系统；ii)控制过度活跃的免疫系统来校正水平。能够增强虚弱的免疫系统的特定类型的免疫调节剂是免疫检查点分子(MCM)的调节剂，其组成为

i)激动激活剂MCM，如肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员，优选CD27、CD40、OX40、GITR或CD137

ii)拮抗抑制性MCM，如PD-1、CD274、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA或B7-CD28超家族成员、CD28或ICOS或其配体的拮抗剂。

可以增强虚弱的免疫系统的另一类免疫调节剂是细胞因子，其作为T细胞生长因子。这种细胞因子的优选实例为IL-2、IL-12、IL-15或IL-17。

在本发明的上下文中，术语“抗原”用于指由免疫应答的分子识别的任何结构，例如抗体、T细胞受体(TCR)等。优选的抗原是与特定疾病有关的细胞或外源性(例如病毒、细菌或真菌)蛋白质。抗原被适应性免疫系统的高度可变的抗原受体(B细胞受体或T细胞受体)识别，并可能引发体液或细胞免疫应答。引起这种应答的抗原也称为免疫原。不论细胞中的蛋白质是外源的还是细胞的，细胞内的一部分蛋白质都被加工为较小的肽，并由主要的组织相容性复合物(MHC)呈递。

术语“其抗原片段”指仍被免疫系统的分子识别的给定抗原的一部分。抗原片段将包括至少一种表位或抗原决定簇。优选地，本发明的抗原片段包括至少一种T细胞表位。

在本发明的上下文中使用的术语“表位”(也称为抗原决定簇)指抗原的片段，优选由免疫系统分子，例如B细胞受体、T细胞受体或抗体结合的肽。与抗体或B细胞结合的表位称为“B细胞表位”，与T细胞结合的表位称为“T细胞表位”。在本上下文中，术语“结合”优选地涉及特异性结合，其被定义为抗体或T细胞受体(TCR)和相应表位之间具有结合常数的结合，该结合常数为1×10

在本发明的上下文中，术语“癌症特异性抗原”指在癌细胞中特异性表达的蛋白质或在癌细胞中比在健康细胞中更丰富的蛋白质。癌症特异性抗原包括以下类型的抗原：

(i)癌胚胎的(一般仅在胚胎组织或在癌变体细胞中表达)；或

(ii)肿瘤病毒的(由致瘤转化病毒编码)；或

(iii)过度表达/积累的(由正常组织和瘤组织表达，肿瘤中表达水平高度升高)，例如黑色素瘤中的酪氨酸酶或乳腺癌中的Her-2受体；或

(iv)癌-睾丸(仅由癌细胞和成人生殖组织如睾丸和胎盘表达)；或

(v)谱系限制的(主要由单个癌组织型表达)；或

(vi)癌症特异性同种型(转录物外显子组成的改变)。

在本发明的上下文中，术语“癌症特异性新抗原”用于指正常/种系细胞中不存在但出现在转化的特别是癌细胞中的抗原。癌症特异性新抗原可以包括一种或多于一种，例如2种、3种、4种或5种或多于5种新表位。优选选择包括在本发明的多肽中的每种癌症特异性新抗原的长度，以确定它们包含出现在正常/种系细胞中的表位的可能性低。通常，这可以通过癌症特异性新抗原包含产生新表位的氨基酸变化的12个或少于12个氨基酸C末端和/或N末端来确定。

癌症特异性抗原优选由DNA水平出现的突变产生，其中突变的蛋白质可以包含

a)由非同义SNV点突变导致的一种或多于一种单一的aa变化；和/或

b)由导致移码肽的插入/缺失引起的非野生型氨基酸序列；和/或

c)由外显子边界改变或由产生内含子保留的突变引起的非野生型氨基酸序列；和/或

d)由基因融合产生的突变癌症蛋白。

在本发明的上下文中，由基因组点突变非同义SNV引起的一种或多于一种单个氨基酸变化导致的新抗原被称为单个氨基酸突变肽。

术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链和双链核苷酸聚合物。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或修饰形式的核苷酸。所述修饰包括碱基修饰如溴尿嘧啶核苷和肌苷衍生物、核糖修饰如2′，3′-双脱氧核糖，以及核苷酸间键合修饰如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、二硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯。多核苷酸的实例是DNA和RNA。

“分离的多核苷酸”是基因组的DNA或RNA、mRNA、cDNA或合成来源的或其一些组合，其与多核苷酸的全部或一部分不相关，其中分离的多核苷酸是自然界中发现的，或与其在自然界中不连接的多核苷酸连接。

在本发明的上下文中使用的术语“表达盒”指包含至少一种待表达的核酸序列的多核苷酸，例如编码融合到本发明的恒定链的一系列癌症特异性新抗原或其一部分的核酸，其可操作地连接至转录和/或翻译控制序列。优选地，表达盒包括用于有效表达给定基因例如启动子、起始位点和/或聚腺苷酸化位点的顺式调节元件。优选地，表达盒含有患者细胞中表达多核苷酸所需的所有其他元件。因此，典型的表达盒含有与待表达的多核苷酸序列可操作地连接的启动子，以及转录物、核糖体结合位点和翻译终止的有效聚腺苷酸化所需的信号。盒的其他元件可以包括例如增强子。表达盒还优选在结构基因的下游包含转录终止区，以提供有效的终止。终止区可以由与启动子序列相同的基因获得，或者可以由不同的基因获得。

在本发明的上下文中使用的术语“可操作地连接”指元件的布置，其中如此描述的部件被配置为执行其通常的功能。当多核苷酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，它被“可操作地连接”。例如，如果启动子影响一个或多于一个转基因的转录，则其可操作地连接至一个或多于一个转基因。此外，可操作地连接至编码序列的控制元件能够实现编码序列的表达。控制元件不必与编码序列邻接，只要它们起到指导其表达的作用即可。因此，例如，在启动子序列和编码序列之间可以存在介于中间的未翻译但仍被转录的序列，并且仍然可以认为该启动子序列“可操作地连接”至编码序列。

术语“载体”或“表达载体”可互换使用，是指多核苷酸、某些类型包膜(例如病毒外壳或脂质体)内的多核苷酸，或与能够被引入或能够将本发明的多核苷酸引入细胞，优选哺乳动物细胞的蛋白质相络合的多核苷酸。载体的实例包括但不限于质粒、黏粒、噬菌体、脂质体、病毒或人工染色体。特别地，使用载体将本发明的启动子和多核苷酸转运到合适的宿主细胞中。表达载体可以包含有助于表达载体在宿主细胞中的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。一旦进入宿主细胞，表达载体可以独立于宿主染色体DNA或与宿主染色体DNA同时复制，并且可以产生载体及其插入的DNA的几个拷贝。在使用无复制能力的表达载体的情况下(这通常是出于安全原因)，载体可能不复制，而只是直接表达多核苷酸。根据表达载体的类型，表达载体可能从细胞中丢失，即仅瞬时表达由多核苷酸编码的新抗原，或者可以在细胞中稳定。表达载体通常包含表达盒，即允许多核苷酸转录成mRNA分子的必需元件。如果多核苷酸是RNA，则转录不是必须的，因此RNA分子只需要翻译控制元件。

术语“T细胞增强子氨基酸序列”是指在基因疫苗接种的情况下，当与抗原序列融合时增加T细胞诱导的多肽序列。

在本发明上下文中使用的术语“制剂”和“组合物”旨在包括活性化合物的制剂，例如带有载体和/或赋形剂的本发明的类人猿腺病毒。

在本发明的上下文中使用的“药学上可接受的”指由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于动物，更特别是人类的药物。

如本文所用的术语“载体”是指药学上无活性的物质，例如但不限于稀释剂、赋形剂、表面活性剂、稳定剂、生理缓冲溶液或与其一起施用治疗性活性成分的载体。这些药物载体可以是液体或固体。液体药物载体包括但不限于无菌液体，例如水和油中的盐溶液，包括但不限于石油、动物、植物或合成来源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。也可以将盐溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液用作液体载体，特别是用于可注射溶液。当静脉内施用药物组合物时，盐溶液是优选的载体。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中。

合适的药物“赋形剂”包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。

“表面活性剂”包括阴离子、阳离子和非离子表面活性剂，例如但不限于脱氧胆酸钠、十二烷基硫酸钠、Triton X-100和聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯65和聚山梨酯80。

“稳定剂”包括但不限于甘露醇、蔗糖、海藻糖、白蛋白以及蛋白酶和/或核酸酶拮抗剂。

可以在本发明的上下文中使用的“生理缓冲溶液”包括但不限于氯化钠溶液、除盐水以及合适的有机或无机缓冲溶液，例如但不限于磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4(2羟乙基)哌嗪并]乙磺酸)或MOPS缓冲剂(3吗啉代-1丙磺酸)。相应缓冲剂的选择通常取决于期望的缓冲剂摩尔浓度。磷酸盐缓冲液适用于例如注射和输注溶液。

“有效量”或“治疗有效量”是足以达到预期目的的治疗剂的量。给定治疗剂的有效量将随诸如该治疗剂的性质，给药途径，接受该治疗剂的动物的大小和种类以及给药目的等因素而变化。每种情况下的有效量可以由技术人员根据本领域中已建立的方法凭经验确定。

本文所用的疾病或病症的“治疗”、“处理”、或“疗养”是指实现以下一项或多于一项：(a)减轻病症的严重程度；(b)限制或预防所治疗病症的症状发展；(c)抑制所治疗疾病的症状恶化；(d)限制或预防先前患有该病症的个体的病症复发；和(e)限制或预防先前有该病症症状的个体的症状复发。

在下文中，将更详细地定义本发明的不同方面。如此定义的每个方面可以与任何其他方面结合，除非有明确的相反指示。特别地，指示为优选或有利的任何特征可以与指示为优选或有利的任何其他特征组合。

在本发明的第一方面，本发明涉及多肽，其包含：

(a)真骨鱼的恒定链(INV)的片段，其包含或组成为真骨鱼INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个连续氨基酸，其中该片段具有T细胞应答增强子活性并且MPD的特征在于选自以下的氨基酸序列：

(i)NQRX

其中

X

其中该片段优选与SEQ ID NO：3[PO的MPD]具有至少60％的一致性；或(ii)DQKQQIQZ

其中

Z

其中该片段优选与SEQ ID NO：10[BP的MPD]具有至少60％的一致性；

和任选的一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段；

或

(b)全长真骨鱼INV和一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段，所述全长真骨鱼INV选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：12，或其变体，其具有T细胞应答增强子活性，其中变体的MPD的氨基酸序列与SEQ ID NO：3[PO的MPD]或SEQ ID NO：10[BP的MPD]具有至少60％的一致性。

通常希望INV的片段尽可能短，同时保持其T细胞抗原刺激作用。优选地，该片段包含，更优选组成为16个至17个、17个至26个、18个至25个、19个至24个、20个至23个、21个至22个INV的MPD的连续氨基酸，优选根据SEQ ID NO：3[PO的MPD]或SEQ ID NO：310[BP的MPD]的MPD的连续氨基酸。

根据本发明第一方面的替代方案(i)的一个优选的最小片段具有如下氨基酸序列：

DIKSLEEQX

根据本发明第一方面的替代方案(i)的更优选的最小片段具有氨基酸序列DIKSLEEQHSGLNEQL(SEQ ID NO：4)或DIKSLEEQNSNLQAEM(SEQ ID NO：7)，其中最优选的最小片段为氨基酸序列DIKSLEEQHSGLNEQL(SEQ ID NO：4)。

根据本发明第一方面的替代方案(ii)的优选的最小片段具有如下氨基酸序列：

QIQZ

根据本发明第一方面的替代方案(ii)的更优选的最小片段具有氨基酸序列QIQGLQTSNQRLEKQM(SEQ ID NO：11)或QIQDLQATNQRMEKQV(SEQ ID NO：14)，其中最优选的最小片段为氨基酸序列QIQGLQTSNQRLEKQM(SEQ ID NO：11)。

虽然INV片段可以包含MPD的N末端和/或C末端的另外的序列，但优选片段中不包含这种序列，因此，优选片段由MPD的相应连续氨基酸组成。

如果INV片段包含MPD的N末端和/或C末端的另外的序列，优选该片段包含整个MPD，即27个氨基酸。优选该片段不包含TMD，但包含INV的另外的C末端氨基酸。优选地，这些C末端氨基酸紧邻MPD。

MPD序列优选基于根据SEQ ID NO：003的牙鲆(Paralichthys olivaceus\，PO)或根据SEQ ID NO：010的大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris，BP)的MPD序列。优选地，该片段包含或组成为MPD的16个至27个氨基酸，其中MPD与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：010具有至少60％，优选至少70％，更优选至少75％，更优选至少80％，更优选至少90％的一致性。

该片段包含INV另外的N末端和/或C末端氨基酸序列。因此，优选INV片段的总体长度为16个至80个、17个至72个、18个至55个、19个至50个、20个至45个、21个至40个、22个至35个、23个至30个连续氨基酸。

在本发明的第一方面的多肽的一个优选实施方案中，多肽包含真骨鱼恒定链(INV)的片段，其包含或组成为真骨鱼INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个连续氨基酸，其中该片段具有T细胞应答增强子活性，并且MPD的特征在于氨基酸序列DIKSLEEQX

在本发明的第一方面的多肽的一个优选实施方案中，多肽包含真骨鱼恒定链(INV)的片段，其包含或组成为真骨鱼INV的膜近端结构域(MPD)的16个至27个连续氨基酸，其中该片段具有T细胞应答增强子活性，并且MPD的特征在于氨基酸序列QIQZ

在本发明的第一方面的多肽的一个优选实施方案中：

(a)根据权利要求1的替代方案(a)(i)的MPD的氨基酸序列为SEQ ID NO：3[MPDPO]和SEQ ID NO：6[MPD Z1]中的任一种；

(b)根据权利要求1的替代方案(a)(ii)的MPD的氨基酸序列为SEQ ID NO：10[MPDBP]和SEQ ID NO：13[MPD Z2]中的任一种；和/或

(c)根据权利要求1的替代方案(b)的真骨鱼恒定链的氨基酸序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：9中的任一种。

如果片段由INV的MPD的16个至27个氨基酸组成，则优选的片段长度为根据SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13的INV的MPD的16个至27个、17个至26个、18个至25个、19个至24个、20个至23个、21个至22个连续氨基酸。

在上述每种情况下，片段或变体具有T细胞应答增强子活性。T细胞应答增强子活性可以如本领域已知的或如所附实验中所述的测量。当与相同抗原或一系列抗原偶联时，优选T细胞应答增强子活性为根据SEQ ID NO：004的INV片段的T细胞应答增强子活性的至少50％，优选至少80％。

在本发明的第一方面的多肽的一个优选实施方案中，片段由MPD的至少16个至27个N末端氨基酸和紧邻MPD的N-末端的真骨鱼INV的跨膜结构域(TMD)的1个至26个连续氨基酸组成，其中真骨鱼的INV的TMD优选特征在于氨基酸序列(SEQ ID NO：15)

AB

其中

B

如果片段包含INV另外的N-末端和/或C-末端氨基酸序列，则优选INV片段的总长度为28个至72个、30个至65个或35个至46个连续氨基酸。

本发明人出人意料地发现，对两种或多于两种抗原，优选新抗原的强T细胞应答可以通过使本发明的第一方面的替代方案(a)的INV片段或本发明的第一方面的替代方案(b)的INV与两种或多于两种抗原和/或其抗原片段融合来诱导。这允许同时诱导T细胞对多种抗原的应答。因此，对于本发明的第一方面的替代方案(a)和本发明的第一方面的替代方案(b)，优选多肽包含多种抗原和/或其抗原片段。例如，优选多肽包含至少5种不同的抗原和/或其抗原片段，更优选至少20种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的抗原和/或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的抗原和/或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的抗原和/或其抗原片段。

为了在一种多肽中容纳最大数量的不同抗原，特别优选该多肽包含抗原的抗原片段。

根据相应治疗应用选择抗原。如果期望针对增殖性疾病的治疗性或预防性疫苗接种，则抗原选自癌症特异性抗原或癌症特异性新抗原。如上所述，特别是在癌症疫苗接种的情况下，优选第一方面的多肽包含两种或多于两种不同的抗原。优选多肽包含至少5种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的癌症特异性抗原或其抗原片段。或者，优选多肽包含至少5种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的癌症特异性新抗原或其抗原片段。或者，优选多肽包含至少5种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的癌症特异性抗原或新抗原或其抗原片段。

或者，抗原是病毒蛋白质或其抗原片段、细菌蛋白质或其抗原片段或真菌蛋白质或其抗原片段。

通常，针对病毒、细菌或真菌感染的预防性或治疗性疫苗接种不需要像治疗增殖性疾病那样需要那么多不同的抗原才有效。然而，存在一些具有大的表位多样性的病毒，例如HIV，特别是在外壳蛋白中。为了引起广泛的免疫应答，可以包括多种抗原。因此，优选多肽包含至少5种不同的病毒抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的病毒抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的病毒抗原或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的病毒抗原或其抗原片段。抗原可以选自相同病毒的不同菌株和/或不同的病毒种。在后者的情况下，疫苗允许对多种不同的病毒种免疫。

或者，优选多肽包含至少5种不同的细菌抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的细菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的细菌抗原或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的细菌抗原或其抗原片段。

或者，优选多肽包含至少5种不同的真菌抗原或其抗原片段，更优选至少20种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少50种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少100种不同的真菌抗原或其抗原片段，甚至更优选至少200种不同的真菌抗原或其抗原片段和甚至更优选至少300种不同的真菌抗原或其抗原片段。

在所有上述实施方案中，优选抗原是T细胞抗原。T细胞抗原是由MHC呈递并引起T细胞应答的那些T细胞抗原。

优选地，抗原或抗原中的每一种或其抗原片段的长度为8个至100个氨基酸，更优选8个至50个，更优选8个至30个氨基酸。

在本发明第一方面的多肽的一个优选实施方案中，一种或多于一种抗原和/或其一种或多于一种抗原片段位于根据本发明第一方面的替代方案(a)的INV片段或根据本发明第一方面的替代方案(b)的全长INV的C末端。特别优选抗原和/或其抗原片段紧邻根据本发明第一方面的替代方案(a)或(b)的INV的C末端。

优选本发明的多肽在待疫苗接种的患者的细胞内产生。胞内表达是MHC呈递的先决条件，从而刺激T细胞应答。因此，在第二方面，本发明涉及编码根据本发明的第一方面的多肽的多核苷酸。优选地，多核苷酸是DNA或RNA。RNA优选用于直接引发经编码的多肽的翻译。编码第一方面的多肽的DNA通常被插入表达盒中，其指导编码本发明的多肽的mRNA的转录。然而，如果多核苷酸被包含在载体中并且载体是RNA病毒，则多核苷酸还可以是RNA。指导应用的一个优选的RNA是自扩增RNA(SAM)。最优选地多核苷酸是RNA。

在第三方面，本发明涉及包含根据本发明的第二方面的多核苷酸的载体。优选本发明的多核苷酸可操作地连接至表达控制序列。

如果不同的待递送至患者的抗原及其抗原片段的数量很大，使得编码INV的融合多肽和所有抗原或其抗原片段的多核苷酸不能容纳于选定的载体中，则使用两种或多于两种载体。因此，在第四方面，本发明涉及两种或多于两种不同载体的集合，其中每种不同的载体包含根据本发明的第二方面的多核苷酸，所述多核苷酸编码根据本发明的第一方面的多肽。

第三方面的载体或第四方面的载体的集合，其中每种情况下的载体独立地选自质粒；黏粒；脂质体颗粒、病毒载体或病毒样颗粒；优选甲病毒载体、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒载体、辛德毕斯(SIN)病毒载体、塞姆利基森林病毒(SFV)病毒载体、猿猴或人巨细胞病毒(CMV)载体、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、牛痘病毒载体或改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)载体。优选载体的集合，其中集合中的每个都包含编码不同抗原或其片段的多核苷酸，因此其通常使用相同的载体类型(例如腺病毒衍生载体)同时施用。

最优选的载体是腺病毒载体，特别是衍生自人或非人的类人猿的腺病毒载体。优选的衍生腺病毒的类人猿是黑猩猩(Pan)、大猩猩(Gorilla)和猩猩(Pongo)，优选倭黑猩猩(Pan paniscus)和普通黑猩猩(Pan troglodytes)。通常，从相应类人猿的粪便样本中分离天然存在的非人的类人猿腺病毒。最优选的载体是基于hAd5、hAd11、hAd26、hAd35、hAd49、ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd55、ChAd63、ChAd73、ChAd82、ChAd83、ChAd146、ChAd147、PanAd1、PanAd2和PanAd3载体的非复制型腺病毒载体或具有复制能力的Ad4和Ad7载体。人腺病毒hAd4、hAd5、hAd7、hAd11、hAd26、hAd35和hAd49是本领域众所周知的。基于天然存在的ChAd3、ChAd4、ChAd5、ChAd6、ChAd7、ChAd8、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd20、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 and ChAd82的载体在WO 2005/071093中详细描述。在WO 2010/086189中详细描述了基于天然存在的PanAd1、PanAd2、PanAd3、ChAd55、ChAd73、ChAd83、ChAd146和ChAd147的载体。

在第五方面，本发明涉及药物组合物，其包含本发明的第一方面的多肽、本发明的第二方面的多核苷酸或本发明的第三方面的载体或本发明的第四方面的载体的集合，和药学上可接受的赋形剂以及任选的一种或多于一种佐剂。

本发明人已经发现，施用至少一种免疫调节剂，例如检查点分子的调节剂(MCM)，进一步改善了T细胞对抗原或其片段的应答的强度。因此，在第五方面的优选的实施方案中，药物组合物包含至少一种免疫调节剂，例如MCM，或编码例如MCM的免疫调节剂的至少一种多核苷酸，或包含编码例如MCM的免疫调节剂的多核苷酸的载体或脂质体颗粒。

在第六方面，本发明涉及试剂盒，其包含本发明的第五方面的药物组合物和分别包装的至少一种免疫调节剂，例如MCM，或编码例如MCM的免疫调节剂的至少一种多核苷酸，或包含编码例如MCM的免疫调节剂的多核苷酸的载体。

在第五方面或第六方面的优选的实施方案中，免疫调节剂是MCM，并选自：

(a)肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员的激动剂，优选CD27的激动剂(例如Varlilumab)、CD40的激动剂(例如CP-870893)、OX40的激动剂(例如INCAGN01949或MEDI0562)、GITR的激动剂(例如MEDI1873)或CD137的激动剂(例如Utomilumab)；

(b)PD-1的拮抗剂(例如派姆单抗或纳武单抗)、CD274的拮抗剂(阿特朱单抗或Durvalumab)、A2AR的拮抗剂(例如Preladenant)、B7-H3的拮抗剂(例如MGA271)、B7-H4的拮抗剂、BTLA的拮抗剂、CTLA-4的拮抗剂(例如Tremelimumab或AGEN1884)、IDO的拮抗剂、KIR的拮抗剂、LAG3的拮抗剂、TIM-3的拮抗剂(例如CA-327或RMT3-23)或VISTA的拮抗剂(例如CA-170)，或B7-CD28超家族成员的拮抗剂，优选CD28或ICOS，或其配体的拮抗剂。

其他优选的免疫调节剂是作为T细胞生长因子的细胞因子，特别是IL-2、IL-12或IL-15。

在第七方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的多肽、根据本发明的第二方面的多核苷酸、根据本发明的第三或第四方面的载体或载体的集合，或根据本发明的第五方面的药物组合物或根据本发明的第六方面的包含这种药物组合物的试剂盒，用于预防或治疗增殖性疾病，优选癌症、病毒性疾病、真菌性疾病或细菌性疾病。

在根据本发明第一方面的多肽、根据本发明的第二方面的多核苷酸、或根据本发明的第三方面或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明的第五方面的药物组合物或包含这种药物组合物的试剂盒的一个优选实施方案中，其中癌症选自唇、口腔、咽、消化器官、呼吸器官、胸内器官、骨、关节软骨、皮肤、间皮组织、软组织、乳房、女性生殖器官、男性生殖器官、尿道、脑和中枢神经系统的其它部分、甲状腺、内分泌腺、淋巴组织和造血组织的恶性肿瘤。

在根据本发明第一方面的多肽、根据本发明的第二方面的多核苷酸、或根据本发明的第三或第四方面的载体或载体的集合、或根据本发明的第五方面的药物组合物或包含这种药物组合物的试剂盒的一个优选实施方案中，其中在施用根据本发明的第一方面的多肽、根据本发明的第二方面的多核苷酸、或根据本发明的第三方面或第四方面的载体或载体的集合，或根据本发明的第五方面的药物组合物或包含这种药物组合物的试剂盒之前、同时或之后施用至少一种免疫调节剂，例如MCM，或编码例如MCM的免疫调节剂的至少一种多核苷酸，或包含编码例如MCM的免疫调节剂的至少一种多核苷酸的载体或脂质体颗粒。

在本发明第七方面的一个优选实施方案中，在开始施用疫苗之前施用检查点分子调节剂，或其中在开始施用疫苗之后施用检查点抑制剂，或其中与开始施用疫苗同时开始施用检查点抑制剂。

在本发明第七方面的一个优选实施方案中，疫苗接种方案是用两种不同的病毒载体的异源加强免疫方案。优选的组合是用于引发的类人猿衍生的腺病毒载体和用于增强的痘病毒载体、牛痘病毒载体或修饰的安卡拉痘苗(MVA)载体。优选地，这些以至少1周，优选6周的间隔按顺序施用。

在第八方面，本发明涉及根据本发明的第一方面的多肽、根据本发明的第二方面的多核苷酸或根据本发明的第三方面或第四方面的载体或载体的集合，其用作药剂。

实施例

真骨鱼恒定链及其片段将非免疫原性癌症抗原转变为免疫原性抗原

在BalBC近交系小鼠中评估了编码源自CT26小鼠肿瘤细胞系的五种癌症新抗原(表1，SEQ ID NO：16至SEQ ID NO：20)的类人猿腺病毒载体的免疫原性。仅编码首尾相连的五种癌症新抗原(penta)加上初始Met和C末端HA标签(SEQ ID NO：21)的载体GAd-penta被发现没有免疫原性，除非全长真骨鱼恒定链序列(BP_INV FL[SEQ ID NO：9]或PO_INV FL[SEQ ID NO：2])或其片段(片段BP_FRAG_A[SEQ ID NO：10]或BP_FRAG_B[SEQ ID NO：11]或PO_FRAG_A[SEQ ID NO：3]或PO_FRAG_B[SEQ ID NO：4])被添加到penta抗原的N末端(SEQID NO：22至SEQ ID NO：27)。以10

表1：Penta抗原：Penta抗原的组成。CT26新抗原按所示顺序存在于组装的Penta抗原中。对于每种新抗原，突变的氨基酸用粗体和下划线表示。

材料和方法

小鼠免疫

从Envigo实验室购买六周大的雌性BalBC小鼠。通过以10

IFNγ ELISpot

接种后两周通过ELISPOT分析来评估产生IFNγ的T细胞。在4℃下用10μg/ml抗小鼠IFNγ(U-CyTech Utrecht，荷兰)过夜涂覆MSIP S4510板(Millipore)。洗涤和阻断后，小鼠脾细胞以两种不同密度(2.5x10