基于流式细胞仪和高通量测序技术联用的超微藻检测方法

摘要

本发明公开了一种基于流式细胞仪和高通量测序技术联用的超微藻检测方法，涉及超微藻检测技术领域，包括以下步骤：(1)对流式细胞仪进行参数设置和调整，并调节进样速度；将水样和荧光微球混合进样，调节流速，记录事件数，计算藻细胞的浓度；(2)对分选型流式细胞仪进行所述参数设置及调节，将所述水样进样，设置分选模式和分选速度，收集分选后超微藻；(3)对所述分选后超微藻进行DNA提取和PCR扩增，PCR产物经纯化回收后进行高通量测序。本发明综合运用流式细胞技术和高通量测序技术进行方法的互补融合和多功能联动，不仅需要水样少，而且大大提高水体中超微藻检测的准确性，从而更好地揭示超微藻的结构特征和生物多样性。

说明书

技术领域

本发明涉及超微藻检测技术领域，尤其涉及一种基于流式细胞仪和高通量测序技术联用的超微藻检测方法。

背景技术

将2μm以下的所有自养光合藻类统称为超微藻(超微浮游植物)，根据细胞结构和生理特性，超微藻可简单分为超微原核藻和超微真核藻。超微藻是水体中藻种群结构的重要组成部分，由于独特的生长特性和丰富的物种组成近年来受到国内外学者的广泛关注，成为水体中微生物构成的研究热点。超微藻在数量上虽不如传统的非超微藻，但其对水体初级生产力和群落结构多样性及稳定性等方面贡献巨大，在一定程度上会对水体的营养状态、物质构成比例与分布产生影响，深入了解超微藻的动态变化规律有利于更好的评估水体水质质量。

对于超微藻的研究，主要存在几个难点。第一，超微藻细胞很小，光学显微镜由于放大倍数和分辨率的限制，无法实现对超微藻的准确观测和统计计数，具有耗时长、人为误差明显的缺点。第二，超微藻的很多物种形态特征不明显，肉眼无法分辨，无法实现对超微藻的准确识别；荧光显微镜对自发荧光较弱且混合生长的藻群辨认准确率低，不能反映藻细胞的生理状况。第三，大部分超微藻不能直接分离纯培养，划线法等计数方法的运用受到普遍限制，环境因子对超微藻的影响作用探究无法通过室内模拟对比实验进行。第四，超微藻的细胞结构相对脆弱，在分选样本的保存方面存在困难。第五，目前应用于超微藻多样性研究的靶基因序列主要包括16S rDNA、18S rDNA及叶绿体16S rDNA，还有一些功能基因rbcL，核糖体基因间隔区ITS1及ITS2等，水样过滤方法收集藻细胞后进行高通量测序，存在大量异养模版的干扰，目标序列比重较低，测序覆盖度较低。目前，对超微藻进行检测的手段很少，且具有局限性。

针对以上难点，流式细胞仪和高通量测序技术的运用为超微藻总量测定和种群识别提供了新方向。流式细胞仪能对超微藻进行计数和荧光检测，得到藻细胞数量，根据色素含量及与纯培养藻细胞位置的对照完成藻群识别，但一般只能精确到门级别，需要分子生物学手段的辅助从而获得更加准确的种属信息。高通量测序技术作为分子生物学技术的一个重要分支，明确不同微生物的注释信息和相对丰度变化信息，有助于对微生物多样性及其分布模式进行更深入的探究，但针对超微蓝藻和超微真核藻的高通量测序方法还有待进一步研究和优化。在测序微生物的收集方法上，传统的水样过滤方法在很大程度上造成了对环境中超微藻多样性的低估，流式细胞仪的分选功能可有效去除水体中大部分不能自发荧光的细菌、真菌等，减少异样模版的竞争，提高超微藻序列在整个克隆库中的比例，解决了对超微藻细胞进行有效收集和保存的难题。近年来已有研究尝试使用流式细胞仪分选功能进行真核藻类的分选，但研究范围比较局限。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种基于流式细胞仪和高通量测序技术联用的超微藻检测方法，针对超微藻检测进行方法体系的构建和优化调整，流式细胞仪对超微藻的分选功能可以弥补高通量测序技术异养细菌干扰的缺点，而高通量测序技术鉴定精确到种级别的优点可以弥补流式细胞仪对超微藻识别不精确的问题。通过细胞大小和荧光分析对藻群变化有个初步认识，再利用流式细胞仪分选目标藻群，随后进行高通量测序，更好地揭示超微藻的结构特征和生物多样性。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是由于藻类含有色素能够自发荧光，使得流式细胞仪在超微藻研究当中的运用成为可能，根据细胞的大小及色素的荧光差异对特定种群进行识别、计数与分选；高通量测序技术能够获得不同微生物的注释信息和相对丰度变化信息；流式细胞仪的分选功能可有效去除水体中大部分不能自发荧光的细菌、真菌等，减少异样模版的竞争，提高超微藻序列在整个克隆库中的比例，解决了对超微藻细胞进行有效收集和保存的难题；流式细胞仪对超微藻的分选功能可以弥补高通量测序技术异养细菌干扰的缺点，而高通量测序技术鉴定精确到种级别的优点可以弥补流式细胞仪对超微藻识别不精确的问题，实现对超微藻的定性定量检测。本发明提出综合运用流式细胞技术和高通量测序技术进行方法的互补融合和多功能联动，是非常重要而基础的方法改进，不仅需要水样少，而且大大提高水体中超微藻检测的准确性，从而更好地揭示超微藻的结构特征和生物多样性。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于流式细胞仪和高通量测序技术联用的超微藻检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对流式细胞仪进行参数设置，选择激发波长488nm和633nm，设置五个荧光通道FSC、SSC、PE、APC、PC5.5；调整各通道阈值和电压值，并调节进样速度；将水样和荧光微球混合进样，调节流速，记录事件数，计算藻细胞的浓度；

(2)对分选型流式细胞仪进行所述参数设置及调节，将所述水样进样，设置分选模式和分选速度，收集分选后超微藻；

(3)对所述分选后超微藻进行DNA提取和PCR扩增，PCR产物经纯化回收后进行高通量测序。

进一步地，所述水样通过40μm滤网过滤。

进一步地，所述荧光微球的粒径为2μm。

进一步地，所述进样速度为使每秒细胞数在100-1000之间。

进一步地，所述分选模式为Purity-Mode1。

进一步地，所述分选速度为2.0-4.0。

进一步地，所述DNA提取采用E.Z.N.A Water DNA提取试剂盒。

进一步地，所述PCR扩增选用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNAPolymerase 20μL反应体系。

进一步地，所述PCR扩增的引物选定双前向引物A23SrVF1:GGACARAAAGACCCTATG，A23SrVF2：CARAAAGACCCTATGMAGCT和双逆向引物A23SrVR1:AGATCAGCCTGTTATCC,A23SrVR2:TCAGCCTGTTATCCCTAG。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益技术效果：

1、本发明能够实现对超微藻的准确计数；

2、本发明极大减少了细菌等异养模版的干扰，获得更多的超微藻序列，对低相对丰度藻属的检出率大大提高；

3、本发明需要水样少，快速。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明的一个方法构建流程图；

图2是本发明的一个较佳实施例的荧光微球调整前的二维散点图；

图3是本发明的一个较佳实施例的荧光微球调整后的二维散点图；

图4是本发明的一个较佳实施例的超微藻分选区域的二维散点图。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

如若有未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如相关说明书或者手册进行实施。

实施例1、方法的构建

综合运用流式细胞技术和高通量测序技术对超微藻进行检测，方法构建流程如图1所示，通过流式细胞仪的分析、分选功能和高通量测序技术的联用，获得超微藻的数量和种属信息，对特定采样周期的样本进行分析获得超微藻构成的动态变化特征。

实施例2、溶液的配制

鞘液的配制：准确称量NaCl(80g)、KCl(2g)、Na

荧光微球的配制：荧光微球(FluoSpheres

实施例3、超微藻的浓度测定

采用流式细胞仪(Beckman Coulter，BD)对样本中的藻细胞进行分析，仪器配备水冷氩离子激光器，选用激发波长为488nm和633nm。由于藻细胞含有叶绿素和藻胆素等天然色素，可自发荧光无需染色，根据光合色素的光学特征，设置五个荧光通道：前向散射光(FSC，488/10)表征细胞大小；侧向散射光(SSC，488/10)表征细胞内部结构的复杂程度；PE，585/42，表征藻红蛋白的含量；APC，780/60，表征藻蓝蛋白的含量；PC5.5，690/50，表征叶绿素a的含量。

水样通过40μm的滤网过滤，防止阻塞仪器。进行预实验验证荧光通道的有效性并对仪器参数进行调整，主要分为以下三个步骤：(1)作为空白对照，1mL无菌水置于5mL无菌流式管中进行上样，调整各通道阈值，使无荧光黑团消失，去除水中杂质、破碎细胞及无关细菌的干扰；(2)1mL适当浓度的荧光微球置于5mL无菌流式管中进行上样，调节各通道电压值，使荧光微球聚集且成像清晰，若出现荧光微球分散的情况，重新配制中间液，并保证溶液混合均匀，与步骤(1)空白对照组进行比较，去除杂质，调整前的二维散点图如图2所示，调整后的二维散点图如图3所示；(3)1mL过滤后的实际水体样本置于5mL无菌流式管中，微调电压值使细胞全部成像于二维散点图中，调节进样速度，使每秒细胞数在100-1000之间。

正式上机时，1mL过滤后的实际水体样本与荧光微球混合上样，流速设置为中等流速30mL/min，待进样稳定后点击record，每个样品运行3min，每组实验设置三个平行。在二维散点图中将荧光通道两两组合，含有相似色素或荧光特征的藻细胞聚集在一起，根据藻细胞藻蓝蛋白、藻红蛋白、叶绿素a荧光强度的相对强弱进行藻群的区分，并与纯培养细胞的相对位置进行比对，记录事件数events，藻细胞的浓度计算方法为：

实施例4、超微藻的分选方法

在运用流式细胞仪进行超微藻的分选时，水样预先通过40μm的滤网过滤，防止阻塞仪器。过滤后每3mL样品放于5mL锁扣盖式无菌BD Falcon流式管中用于上机分选操作，采用流式细胞仪(FACSAria IIr，BD)对样品中的全部超微藻细胞(包括超微真核藻和超微原核藻)进行分选，溶液的配制同实施例2，激光波长和荧光通道设置同实施例3。观察分选通道中细胞通过状态及偏移程度，检验进样口和收集口是否处于无菌环境，预实验以无菌水为空白对照去除细菌等杂质的干扰，根据荧光微球在FSC轴的位置划定分选区域，选用1.5倍镜，调节荧光通道阈值和电压值使分选区域位于散点图中央，如图4所示。

正式分选实验时，保证进样口和取样口处于无菌环境，开启样本搅拌功能，设置分选模式为Purity-Mode1，分选速度设定为2.0-4.0，每秒细胞数在1000左右。收集分选细胞的流式管中加入1mL无菌PBS缓冲液和细胞溶解液，每个样品分选约35000个细胞，在基因组DNA提取及23S rDNA高通量测序操作前置于-80℃冰柜。

实施例5、高通量测序方法

购买E.Z.N.A Water DNA提取试剂盒(OMEGA，美国)进行基因组DNA的提取，用于目的片段PCR扩增。

随机选取样品进行PCR预实验，调整参数并评估扩增效果，最终确定正式试验程序，所采用的PCR仪为ABI

流式细胞仪分析的原始数据以FCS格式储存，藻细胞的计数和荧光分析通过CytoFLEX软件完成，根据色素荧光、细胞大小和复杂程度，对照典型藻种纯培养实验结果相对位置，进行水体中藻群的分组，图片以BMP格式输出。藻细胞浓度的计算以及藻群的统计通过Microsoft Excel 2019完成，图表绘制使用Origin软件。

高通量测序的原始数据以FASTQ格式保存，对序列长度、模糊碱基、错误碱基、低质量碱基进行质量过滤，使用Mothur软件进行二次质量筛选去除嵌合体，获得最终的优质序列。运用Uparse7.0软件对97％相似水平下的OTU进行聚类分析，采用RDP classifier贝叶斯算法进行每个OTU对应的物种分类学分析，与Silva(Release132http://www.arb-silva.de)基因数据库进行比对，分别在各个分类水平域、界、门、纲、目、科、属、种统计各样本的群落物种组成。OTU丰度数据进行标准化以确保不同样品间的一致性，去除丰度小于3的OUT，去除注释到叶绿体、线粒体的OTU，基于最小样本序列数进行抽平。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。