公开/公告号CN112921089A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-06-08
原文格式PDF
申请/专利权人 北京起源聚禾生物科技有限公司;
申请/专利号CN202110200262.2
申请日2021-02-23
分类号C12Q1/6886(20180101);C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101);
代理机构11357 北京同辉知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人孙艳敏
地址 100123 北京市大兴区中关村科技园区大兴生物医药产业基地华佗路50号院6号楼4层401室
入库时间 2023-06-19 11:19:16
技术领域
本发明涉及核酸体外诊断技术领域,尤其涉及将特定的基因甲基化标志物应用于妇科肿瘤早期检测及其辅助诊断。
背景技术
宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌是我国妇科肿瘤中最常见的三大恶性肿瘤。我国宫颈癌的发病率较高,近几年子宫内膜癌的发病率也在逐年上升。就患者生存率而言,子宫内膜癌的肿瘤细胞由于局限于子宫内,因此不易扩散,早期患者的5年生存率可达到70%~80%;在医疗条件较好的地区,早期宫颈癌的5年生存率也可达到约80%。卵巢癌虽然发病率不及另外两种妇科肿瘤,但死亡率却不容小觑,而且晚期卵巢癌患者往往预后不佳,数据显示,我国约75%的卵巢癌患者初诊时即为晚期,5年生存率不足30%。
宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,发病率在我国女性恶性肿瘤中居第二位,位于乳腺癌之后。据世界范围内统计,每年约有50万左右的宫颈癌新发病例,占所有癌症新发病例的5%,其中80%以上的病例发生在发展中国家。我国每年约有新发病例13万,占世界宫颈癌新发病例总数的28%。患病的高峰年龄为40~60岁,近年来大量研究表明,宫颈癌的发病年龄呈年轻化趋势。宫颈癌发病率分布有地区差异,农村高于城市,山区高于平原,发展中国家高于发达国家。因此,十分有必要在全国范围内规范宫颈癌的诊断与治疗。另一方面,宫颈癌的发生可通过对癌前病变的检查和处理得以有效控制。西方国家的经验显示,宫颈癌的发生率在密切筛查的人群中减少了70%~90%。
早期筛查是预防宫颈癌癌前病变及宫颈癌的一种有效方法,目前临床上常用的检测手段主要包括液基细胞学检测和HPV检测。相较于传统的巴氏涂片法(灵敏度在30~87%之间,有时灵敏度甚至低于20%),液基细胞学检测具有一定的提升,但仍有一定比例的假阴性结果(有研究表明,假阴性概率约为50%)。由于持续性的高危型HPV感染是宫颈病变的首要原因,对HPV核苷酸的检测在对宫颈病变的检测上具有极高的灵敏度(文献数据约为90%),但由于仅有小部分的高危HPV感染患者会表现出宫颈病变,因而HPV检测表现出极低的特异性(约为60.7%),特别是在年轻女性中。因此目前还是缺少一种准确性、特异性更好的检测方法应用于临床诊断中。
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,又称子宫体癌,是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一。其多发生于围绝经期及绝经后妇女。随着人口平均寿命的增加以及生活习惯的改变,子宫内膜癌的发病率近20年呈持续上升和年轻化趋势。在西方国家,子宫内膜癌已经占据女性生殖系统恶性肿瘤发病率首位,在我国,作为继宫颈癌之后第二个常见的妇科恶性肿瘤,约占妇科恶性肿瘤的20%~30%。部分发达城市的子宫内膜癌发病率已达妇科恶性肿瘤第一位。
早期筛查同样是预防子宫内膜癌的一种有效方法,目前临床上常用的检测手段主要包括B超检查和宫腔镜检查。B超检查可以了解子宫大小、子宫内膜厚度、有无回声不均或宫腔内赘生物,有无肌层浸润及其程度等,其诊断符合率达80%以上。由于子宫内膜癌患者肥胖者甚多,因此经阴道超声比经腹部超声更具优势。由于B超检查方便及无创,因此成为诊断子宫内膜癌最常规的检查,也是初步筛查的方法。宫腔镜下可直接观察宫腔及宫颈管有无癌灶存在,癌灶部位、大小、病变范围,及宫颈管有否受累等;直视下对可疑病变取材活检,有助于发现较小的或较早期的病变,减少了对子宫内膜癌的漏诊率。宫腔镜直视下活检准确率接近100%。宫腔镜检查和分段诊刮均有发生出血、感染、子宫穿孔、宫颈裂伤、人流综合反应等并发症,宫腔镜检查尚有发生水中毒等风险。对于宫腔镜检查是否可导致子宫内膜癌播散尚有争议,目前大部分研究认为宫腔镜检查不会影响子宫内膜癌的预后。
在我国,卵巢癌年发病率居女性生殖系统肿瘤第3位,位于子宫颈癌和子宫体恶性肿瘤之后,呈逐年上升的趋势,而死亡率位于女性生殖道恶性肿瘤之首,是严重威胁女性健康的恶性肿瘤。卵巢恶性肿瘤包括多种病理类型,其中最常见的是上皮性癌,约占卵巢恶性肿瘤的70%,其次是恶性生殖细胞肿瘤和性索间质肿瘤,各约占20%和5%。
目前,监测卵巢癌的治疗和复发主要有影像学检查,如经阴道超声(TVUS)等,肿瘤标志物检查,如CA125、HE4等、组织病理学检查等。经阴道超声检查(TVS)探头接近卵巢,图像分辨率高,不受肥胖及肠气干扰,对卵巢癌的诊断有更高的敏感度和特异度。没有性生活史的女性可采用经直肠超声。经腹超声是阴道超声的重要补充,比如肿瘤过大,阴道超声无法获得整个肿瘤的视野。此外,经腹超声还可以评估卵巢癌对周围脏器的侵犯、腹膜后淋巴结转移及腹腔种植转移情况,如有无输尿管扩张、腹水、腹膜种植。超声介入方面,对于预计难以满意减瘤或体弱难以耐受大手术的患者,可选择超声引导下穿刺获取细胞学或病理学诊断。穿刺部位可选择盆腔肿瘤、增厚的大网膜、腹膜等部位。另外盆底腹膜增厚明显者,可经阴道或直肠超声引导下穿刺活检。但需要指出的是,对于术前综合影像评估无明确转移的孤立性卵巢肿瘤,尤其是可疑早期卵巢癌者,需谨慎选择穿刺活检,原因是避免因穿刺导致的医源性肿瘤播散。作为常用的卵巢癌肿瘤标志物,尤其是浆液性卵巢癌的首选肿瘤标志物,CA125的阳性率与肿瘤分期、组织学类型有关,晚期、浆液性癌患者的阳性率显著高于早期及非浆液性癌患者(早期卵巢癌的阳性率约43.50%~65.70%,晚期卵巢癌的阳性率约84.10%~92.40%)。有研究发现,CA125在绝经后人群的应用价值更高,在绝经后人群中,CA125诊断卵巢癌的敏感度(79.1%~90.7%)和特异度(79.1%~89.8%)均优于绝经前人群(敏感度69.8%~87.5%,特异度63.3%~85.7%)。外科手术或化疗后,87%~94%的卵巢癌病例中血CA125浓度与疾病进程相关性较好,可提示肿瘤的进展或消退。满意减瘤术后,7天内CA125可下降到最初水平的75%以下。大多数卵巢恶性肿瘤合并腹水或胸腔积液,行腹水或胸腔积液细胞学检查可发现癌细胞。组织病理学是诊断的金标准。对于临床高度可疑为晚期卵巢癌的患者,腹腔镜探查活检术不但可以获得组织标本,还可以观察腹盆腔内肿瘤转移分布的情况,评价是否可能实现满意减瘤手术。
非侵入性且成本低是癌症早期筛查的理想特征。对于上述的恶性妇科肿瘤均有相应的临床常规检测手段,但是这些检测手段显示出的检测率较低,且特异性也不够理想。目前在临床上还没有有效的早期筛查方法。
DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰方式,研究显示,DNA甲基化能影响正常哺乳细胞的基因表达和沉默;同时,在人类肿瘤研究中发现,DNA甲基化通常能导致肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛变化。肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化或者低甲基化都可能导致细胞转化,而使DNA甲基化状态成为肿瘤检测的潜在标志物。
DNA甲基化主要发生在基因的启动子区域,通常与抑癌基因的表达失活紧密相关。目前应用于基因甲基化检测的方法主要有:甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)、亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)和高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)等。甲基化特异性PCR主要依靠引物与目标模板的结合以进行PCR扩增来检测甲基化位点;亚硫酸氢盐测序法依靠测序引物进行PCR扩增,在此基础上进行后续测序以实现对甲基化位点的检测;高分辨率溶解曲线法主要通过样本中的CG含量的变化导致的溶解温度的变化以此对甲基化与非甲基化情况进行区分。每种方法都有各自的特点,BSP法结果准确性较高,易于直观进行判读,但灵敏度较低,操作相对更为繁琐,成本高;HRM法灵敏度相对较低,同时结果分析略复杂;PCR法检测灵敏度高,对样本的要求相对较低,同时检测时长较短、成本较低,结果易于判读。
随着对肿瘤研究的深入,逐渐发现在癌症的诊断和治疗过程中组织活检技术有一定的局限性。主要表现为:肿瘤具有异质性;某些患者因各种原因很难获取组织;接受穿刺活检时,也有加速肿瘤转移的风险;组织活检的滞后性对患者的治疗也是不利的。因此对于癌症的诊断和检测技术有更高的要求。
液体活检技术的出现,解决了上述问题,也提前了癌症的诊断时间。液体活检是一种技术,更是一种临床解决方案。液体活检的优势就在于能通过非侵入性取样降低活检的危害,而且有效延长患者生存期,性价比高。相对组织较易获得,且对患者无创。但血浆中肿瘤循环DNA的量较少,且易发生降解。因此,检测血浆中基因的甲基化难度相对较大,除了应当注意样本的前处理过程,保证bis-DNA的质量外,对于扩增反应体系内引物、探针序列设计要求也非常高,引物探针序列的设计直接关系到整个检测手段最终的检出灵敏度和特异性。因此,对于此类检测试剂盒的开发,要提高检测体系的灵敏度和特异性,除了样本获取,基本都需要重点关注在目标基因的选取,引物、探针序列的设计上。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题,提供一种灵敏度和特异性高的早期检测多种恶性妇科肿瘤的组合物,一次检测即可获知多种恶性肿瘤发生风险,准确度高,省时省力。
本发明具体技术方案详述如下:
本发明提供了甲基化无创早期检测妇科肿瘤的组合物,包括目标基因检测引物,用于检测目标基因的甲基化位点,所述目标基因为PTGER4、HAND2、PAX1、HOXA9、FOXD3、OPCML、HS3ST2和JAM3。
前列腺素E受体基因PTGER4(prostaglandin E receptor 4gene)甲基化程度参与了多个妇科肿瘤中的调控作用。
HAND2(Heart And Neural Crest Derivatives Expressed 2)是一个蛋白质编码基因。与HAND2相关的疾病包括心肌病等。其相关途径包括心脏发育、NFAT和心脏肥大。HAND2甲基化过程参与子宫内膜癌等肿瘤的发生发展,与之密切相关。
PAX1(paired box gene 1)基因是位于20号染色体的PAX基因家族中的一员,对胎儿发育和细胞增殖有着关键作用。PAX1基因启动子的甲基化在肿瘤的发生和发展中起着重要的表观遗传学调控作用。PAX1在宫颈癌和卵巢癌中发生甲基化而沉默,因而PAX1也被当作是肿瘤抑制基因。
HOXA9(Homeobox A9)属于HOX基因家族,它编码转录因子,这些转录因子对胚胎发生至关重要,并与多种不同癌症类型的中的癌变有关。在最近的一项研究中,我们发现高HOXA9启动子甲基化与卵巢癌等患者更差的癌症特异性生存有关。
FOXD3(Forkhead Box D3)基因,作为叉头基因家族中的一员,在发育、细胞维持等活动中扮演重要作用,同时与其它转录因子相互作用而影响肿瘤的发生发展。研究显示FOXD3在多种不同癌症中作为肿瘤抑制因子。Yan等人发现FOXD3在非小细胞肺癌中能抑制肿瘤生长;Li等人揭示了FOXD3能够抑制结直肠癌的发生。在2019年,Luo等人研究发现FOXD3在卵巢癌组织样本中甲基化水平高于正常卵巢组织样本,同时FOXD3在卵巢癌组织样本中表达降低;表明FOXD3有望成为人卵巢癌的标志物。
OPCML(Opioid binding protein/cell adhesion molecule-like)基因是一种质膜蛋白,起着阿片受体作用。研究表明OPCML基因在上皮性卵巢癌、脑癌、非小细胞癌、膀胱癌、胆管癌、原发性鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、乳腺和宫颈癌中都存在表观遗传的失活情况,表明OPCML在许多癌肿中都有着肿瘤抑制作用,OPCML甲基化以及表达量降低被认为与存活率低有关联性。同时,有研究发现,OPCML在人上皮性卵巢癌中的表观沉默现象超过80%。
HS3ST2(heparan sulfate glucosamine 3sulfotransferase 2)基因编码硫酸乙酰肝素3-O-硫转移酶2酶,这是硫酸乙酰肝素(HS)精细结构生物合成中参与多种生物活性的关键成分。这种级联中的每一种酶都具有组织特异性的作用,并作为后续反应的底物。因此,即使是一种酶的变化,包括硫酸乙酰肝素3-O-硫转移酶2,导致不同的HS结构参与几种类型的癌症。
JAM3(junctional adhesion molecule 3)是JAM基因家族中的一员,JAM基因家族能直接对上皮细胞和内皮细胞的紧密连接作用产生影响。大量文献研究报告JAM3,通常也被称作JAMC,是连接调节因子。近年来,许多文献报告JAM3在肿瘤发展中对肿瘤有重要的调节作用,如其甲基化在结直肠癌和宫颈癌中均有表现。
虽然在恶性妇科肿瘤的研究中已经发现了诸多相关性标志基因,但在以往的研究中,并未发现各标志基因之间有什么关联性,大都单独得出与疾病相关联的结论,且关联性强弱也存在差别,不足以用于临床诊断。而发明人经过的大量的系统性研究后发现,虽然上述8个基因的每个均与多种癌症相关,但是这8种基因的DNA甲基化水平在宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌等妇科恶性肿瘤中比正常细胞或妇科良性肿瘤中明显升高,并且多个基因在不同组织病理类型的妇科肿瘤患者中甲基化状态形成互补,可以最大限度覆盖妇科肿瘤患者的检测,用来作为辅助妇科肿瘤的早期诊断。
通过针对这8个目标基因的甲基化位点设计相应的引物,或者引物加探针,检测患者血液中游离DNA中的PTGER4、HAND2、PAX1、HOXA9、FOXD3、OPCML、HS3ST2和JAM3基因甲基化区域,就能通过各个基因甲基化状态结果的相互结合,实现早期诊断的目的,一次检测即可同时获取多种妇科恶性肿瘤发生的风险高低。
优选的,上述组合物中,目标基因检测引物的核苷酸序列如下所示:
PTGER4基因检测引物:SEQ ID NO:1~2;
HAND2基因检测引物:SEQ ID NO:3~4;
PAX1基因检测引物:SEQ ID NO:5~6;
HOXA9基因检测引物:SEQ ID NO:7~8;
FOXD3基因检测引物:SEQ ID NO:9~10;
OPCML基因检测引物:SEQ ID NO:11~12;
HS3ST2基因检测引物:SEQ ID NO:13~14;
JAM3基因检测引物:SEQ ID NO:15~16。
上述目标基因检测引物均为针对目标基因转化后的非甲基化特异性引物,能够对目标基因的甲基化状态进行检测。上述引物中,在正向和反向引物分布较少的CG位点甚至不含CG位点,这样能精准捕获转化后的序列,而减少与转化之前的模板序列结合,提高检测的特异性,为之后探针进行的甲基化区域检测提供基础,增强探针检出的灵敏度。
上述引物基因之间的扩增相互之间不产生干扰,一个检测体系中多个基因的扩增效率与其单重扩增效率一致,也就是说,上述各引物,在多重反应体系中基因的扩增效率没有受到抑制,因此,检测体系可以设置为一管对五个基因进行检测,包括四个目标基因和一个内参基因,此时需要将五个基因通过不同的荧光通道以Ct值的形式体现出来。
上述引物再结合准确病理信息的临床样本经过ROC曲线确定合理的阳性判断值,能提高反应体系筛选的准确性和妇科肿瘤早期检测的可靠性,最大限度地避免假阳性和假阴性结果的出现,使得检测性能整体得到提升。
优选的,上述组合物中,还包括目标基因检测探针,具体核苷酸序列如下所示:
PTGER4基因检测探针:SEQ ID NO:17;
HAND2基因检测探针:SEQ ID NO:18;
PAX1基因检测探针:SEQ ID NO:19;
HOXA9基因检测探针:SEQ ID NO:20;
FOXD3基因检测探针:SEQ ID NO:21;
OPCML基因检测探针:SEQ ID NO:22;
HS3ST2基因检测探针:SEQ ID NO:23;
JAM3基因检测探针:SEQ ID NO:24;
目标基因的检测探针5’端进行荧光标记,3’端进行MGB标记,且同一检测体系内不同的目标基因标记不同的荧光基团。
上述目标基因检测探针,均为MGB探针,探针与甲基化模板和探针与非甲基化模板的结合自由能ΔG相差20kcal mol
优选的,上述组合物中,荧光标记和MGB的具体标记位置如下所示:
PTGER4基因检测探针:序列5’端标记FAM,3’端标记MGB;
HAND2基因检测探针:序列5’端标ROX,3’端标记MGB;
PAX1基因检测探针:序列5’端标记CY5,3’端标记MGB;
HOXA9基因检测探针:序列5’端标记HEX,3’端标记MGB;
FOXD3基因检测探针:序列5’端标记FAM,3’端标记MGB;
OPCML基因检测探针:序列5’端标记ROX,3’端标记MGB。
HS3ST2基因检测探针:序列5’端标记CY5,3’端标记MGB;
JAM3基因检测探针:序列5’端标记HEX,3’端标记MGB。
上述不同荧光通道标记的MGB探针,不同荧光标记的目标基因检测探针可放在一管中反应,能够保证样本中5个不同目标基因的扩增效率最佳,荧光曲线为标准的S型扩增曲线,与各基因单重扩增相比荧光曲线保持一致的趋势。
优选的,上述组合物中,还包括内参基因GAPDH和β-actin的检测引物,具体核苷酸序列如下:
GAPDH基因检测引物:SEQ ID NO:25~26,
β-actin基因检测引物:SEQ ID NO:27~28。
优选的,上述组合物中,还包括内参基因GAPDH和β-actin的检测探针,具体核苷酸序列如下:
GAPDH基因检测探针:SEQ ID NO:29,序列5’端标记JOE,3’端标记BHQ1;
β-actin基因检测探针:SEQ ID NO:30,序列5’端标记JOE,3’端标记BHQ1。
使用上述双内参基因作为对照,并设计特异性引物探针,能够进一步增加检测的准确性,减少检测间的误差。
本发明还提供了一种甲基化无创早期检测妇科肿瘤的试剂盒,包括以上任一所述的组合物,以及PCR反应液。
优选的,上述试剂盒中,所述PCR反应液每一人份由浓度1U/μL的DNA Taq聚合酶0.5~1μL、浓度25mM的dNTPs 2-5μL、浓度1.5mM的Mg
该PCR反应体系是专门针对重亚硫酸盐转化之后的bis-DNA扩增,且包含多重引物探针,因此PCR反应液的选择尤其重要,体系中每一个基因引物探针的扩增效率需与其对应的单重扩增时类似,确保体系中的引物或者探针之间不相互干扰,充分发挥每一组引物探针的扩增效果。需要对不同的DNA Taq聚合酶以及与其他组分之间的配比进行筛选验证,确保整个多重扩增体系扩增效率最佳。
本发明还提供了上述试剂盒的使用方法,是以血浆为样本,提取游离DNA,进行重亚硫酸盐转化,得到Bis-DNA;以Bis-DNA作为模板,进行PCR扩增,PCR反应条件为:96℃预变性5min;94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环;25℃保持10min。重亚硫酸盐转化能够使DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶,而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变,最后得到Bis-DNA。转化过程中要保证DNA的转化效率以及最后的Bis-DNA的转化得率。
在血浆游离DNA提取时,优选使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(DP710),同时进行DNA质量监控。重亚硫酸盐转化则优选使用天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)。
优选的,上述使用方法中,所得PCR扩增后,通过逻辑回归算法原理和ROC曲线对阳性判断值进行确定,根据目标基因扩增所得Ct值与双内参基因扩增所得Ct值平均值的差值ΔCt值进行逻辑回归算法计算,得到P值,若P值大于0.05,则发生甲基化,即判定为恶性妇科肿瘤的发生为高风险。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明研究发现PTGER4、HAND2、PAX1、HOXA9、FOXD3、OPCML、HS3ST2和JAM3组合以后,针对上述基因进行甲基化状态检测,其结果能够相互结合用以判断妇科恶性肿瘤的发生风险,且结果准确度非常高,能够直接应用于临床诊断,实现一次检测即可早期预知多种恶性肿瘤的目的。
本发明优选的检测引物针对基因PTGER4、HAND2、PAX1、HOXA9、FOXD3、OPCML、HS3ST2和JAM3甲基化的位点设计,不仅包括基因的启动子区域,还包括基因的编码区域,由于妇科肿瘤种类多样性,选择多基因甲基化区域联合检测,形成功能间的互补,显著提升对妇科肿瘤检出的灵敏度,但对正常及妇科良性肿瘤具有很高特异性。该检测组合物通过分子表观遗传手段,利用甲基化检测技术对妇科恶性肿瘤可能的患者提早检出,提早进行预防治疗。
本发明试剂盒主要采用多基因多通道荧光检测手段,利用五种荧光探针标记通过特异性引物探针与甲基化序列准确识别,以及优化的特殊的甲基化DNA Taq聚合酶,对PTGER4、HAND2、PAX1、HOXA9、FOXD3、OPCML、HS3ST2和JAM3基因甲基化位点精确检测。对比于仅用PCR特异性引物进行检测的方法,加上特异性探针对甲基化模板序列可以进行双重识别,可以显著提高检测的灵敏度、准确性。同时引入双内参基因做对照,进一步增加检测的准确性,减少检测间的误差。
本发明采用这种技术进行多重多通道荧光多基因的甲基化检测,涉及到的检测样本相对容易获取、无创性、检测方法操作简单、判读直观、8个小时内出结果,通用的荧光定量PCR仪均能满足检测需求,整套实验流程采用一站式全封闭形式,操作更简便,也避免了交叉污染的可能。
因本发明整个检测体系包括引物探针、DNA聚合酶等的设计技巧具有很高的检测灵敏性,同时对低浓度模板有更好的检测率,且所选目标基因相互补充,引物探针特异性好,扩增效率高,对于早期妇科恶性肿瘤的检测非常灵敏。本试剂盒检测的高灵敏性适用于早期妇科恶性肿瘤的检测。
附图说明
图1为靶基因与内参基因的PCR荧光检测结果示例图(引物探针混合液1的检测结果);
图2为靶基因与内参基因的PCR荧光检测结果示例图(引物探针混合液2的检测结果);
图3为实施例1中甲基化检测试剂盒检测300例样本所得ROC曲线;
图4为实施例2中甲基化检测试剂盒检测300例样本所得ROC曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
检测妇科恶性肿瘤相关基因PTGER4、HAND2、PAX1、HOXA9、FOXD3、OPCML、HS3ST2和JAM3甲基化试剂盒的检测试验。
所用引物和探针的具体核苷酸序列如下表所示:
注:F表示正向检测引物,R表示反向检测引物,FP表示检测探针。本表格中,所展示的探针序列已经进行了荧光标记和淬灭标记。
试剂盒组分如下表:
选取已知明确病理信息结果的70例卵巢癌样本:30例鉴定为高级别浆液性癌、20例低级别浆液性癌、10例透明细胞癌、10例黏液性癌;40例为卵巢良性样本。
选取已知明确病理信息结果的60例子宫内膜癌样本:15例鉴定为子宫内膜样癌、15例子宫内膜黏液性癌、15例子宫内膜浆液性癌、15例子宫内膜透明细胞癌;40例为子宫内膜良性样本。
选取已知明确病理信息结果的50例卵巢癌样本:40例鉴定为宫颈鳞癌、10例鉴定为宫颈腺癌;40例为宫颈良性样本。
1、使用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(DP710),对上述300例妇科良恶性肿瘤样本进行血浆游离DNA的提取,同时进行DNA质量监控。
2、采用天根生化科技(北京)有限公司的DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(DP215)对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化,DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶(C)不变,得到转化后的bis-DNA。此试剂盒的转化效率能够达到99%,高于市场上多数重亚硫酸盐转化试剂盒。
3、配制PCR反应液和引物探针混合液;
PCR反应液(25μL/人份)
引物探针混合液1(10μL/人份)
引物探针混合液2(10μL/人份)
4、加样:向上述配制的体系中分别加入20μL阴、阳性质控品和转化好的Bis-DNA临床样本。进行PCR反应,条件为:96℃预变性5min;94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环;25℃保持10min。
5、扩增程序如下:
step1:96℃预变性5min;
step2:94℃变性15s,60℃退火延伸35s,45个循环;
step3:25℃,10min;
信号收集,60℃收集FAM、HEX、ROX、Joe以及CY5信号。
6、结果判读
(1)内标通道有S型扩增曲线且Ct值≤38为结果有效;
(2)8个基因分别的ΔCt值为:ΔCt(PTGER4)=Ct(PTGER4)-Ct(mean内参)、ΔCt(HAND2)=Ct(HAND2)-Ct(mean内参)、ΔCt(PAX1)=Ct(PAX1)-Ct(mean内参)、ΔCt(HOXA9)=Ct(HOXA9)-Ct(mean内参)、ΔCt(FOXD3)=Ct(FOXD3)-Ct(mean内参)、ΔCt(OPCML)=Ct(OPCML)-Ct(mean内参)、ΔCt(HS3ST2)=Ct(HS3ST2)-Ct(mean内参)、ΔCt(JAM3)=Ct(JAM3)-Ct(mean内参)、Ct(mean内参)=[Ct(GAPDH)+Ct(β-actin)]/2。
(3)综合上述8个基因的ΔCt值运用逻辑回归算法确定cut-off值P值,当P值大于0.05时,则该检测结果为发生甲基化;反之,当P值小于等于0.05时,则检测结果为未发生甲基化。
7、检测结果分析
利用上述试剂盒反应体系检测共300例样本,其中包括卵巢癌样本70例,卵巢良性样本40例,子宫内膜癌样本60例,子宫内膜良性样本40例,宫颈癌样本50例,宫颈良性样本40例。检测结果如下表。
表.300例样本的检测结果
对比临床病理结果,使用本甲基化检测试剂盒得到的联合ROC曲线面积为0.942(参见图2),整体特异性为95.0%,卵巢癌检出灵敏度为92.8%,子宫内膜癌检出灵敏度为90%,宫颈癌检出灵敏度为92%。其中,对高级别浆液性卵巢癌、低级别浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌和黏液性卵巢癌的检出率分别为93.3%、95%、90%和90%;对子宫内膜样癌、子宫内膜黏液性癌、子宫内膜浆液性癌和子宫内膜透明细胞癌的检出率分别为86.7%、86.7%、93.3%和93.3%。对宫颈鳞癌和宫颈腺癌的检出率为95%和90%。从以上结果可以看出,本试剂盒能较好区别妇科良恶性肿瘤样本。
实施例2
所用引物和探针的具体核苷酸序列如下表所示:
注:F表示正向检测引物,R表示反向检测引物,FP表示检测探针。本表格中,所展示的探针序列已经进行了荧光标记和淬灭标记。
试剂盒中其他成分与实施例1相同。
对比临床病理结果,使用本甲基化检测试剂盒得到的联合ROC曲线面积为0.894(参见图4),整体特异性为97.5%,卵巢癌检出灵敏度为90%,子宫内膜癌检出灵敏度为86.7%,宫颈癌检出灵敏度为86%。其中,对高级别浆液性卵巢癌、低级别浆液性卵巢癌、透明细胞卵巢癌和黏液性卵巢癌的检出率分别为90%、90%、90%和90%;对子宫内膜样癌、子宫内膜黏液性癌、子宫内膜浆液性癌和子宫内膜透明细胞癌的检出率分别为80%、86.7%、86.7%和93.3%。对宫颈鳞癌和宫颈腺癌的检出率为90%和70%。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述,以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离该发明构思的前提下,所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进,均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京起源聚禾生物科技有限公司
<120> 甲基化无创早期检测妇科肿瘤的组合物及试剂盒
<130>
<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 1
aggtcgagta gggttttagt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 2
cttactcatt accacctccc t 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 3
tttagtttag gagaattat 19
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 4
aaaatctaaa accctaaata aacc 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 5
ttgtttttta gatttagagt t 21
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 6
ccctcctatc cccaaa 16
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 7
attattgttt aattttatgt ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 8
caattaatca cgccatcaaa aa 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 9
gttagttatg gtttttttat 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 10
ataactatta attaatctac ta 22
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 11
gggggtagaa ggttttatg 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 12
aaacacgaca atcgacacga 20
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 13
ggttattttt taaatag 17
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 14
cgatctaact cttcgaa 17
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 15
agtgttgtgt tttttagaa 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 16
caaacctcga aactctacc 19
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 17
ttacgagcgg gatgg 15
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 18
ttcggttatc gcgtaga 17
<210> 19
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 19
ttcgtcggtc gcgt 14
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 20
tcgttggtcg tattcgt 17
<210> 21
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 21
tttacgtcgt tttta 15
<210> 22
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 22
gttcgagggg cgttcgt 17
<210> 23
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 23
tcggtagcgc gtttcgt 17
<210> 24
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 24
gagcggggga cgtag 15
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 25
aggttaaata tagttgttga 20
<210> 26
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 26
caacccaaac ccccaac 17
<210> 27
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 27
ggggaagttt gtttt 15
<210> 28
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 28
caacacacaa taaca 15
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 29
tagttggggg tttgggtt 18
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 30
aaacttacta aacct 15
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 31
ttgcgtcgag ggggaggt 18
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 32
tttgggagaa gaatgaatga at 22
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 33
gagaaaacgt cgagtat 17
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 34
ggcggaggtt tttaaggtag ag 22
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 35
tggttgagga agaaggaga 19
<210> 36
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 36
gaagatcgac gtgaaa 16
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 37
tttttttgta ggggttttgg ttg 23
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 38
tgggttagaa ggtagaattt t 21
<210> 39
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 39
agcgaaggta tcgt 14
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 40
ttgggttttg tattttttcg 20
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 41
agggaaaggt tgatgatga 19
<210> 42
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 42
tcgggtttcg taggt 15
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 43
gtaggttttt gcggttttta a 21
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 44
ggtttttttt agttatgaga at 22
<210> 45
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 45
gaggaggcgt atcgttg 17
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 46
gtgattatgt atttggaagt tt 22
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 47
ttgataaaag gtttgttggt t 21
<210> 48
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 48
ttcgattcgc gattcgt 17
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 49
agaagttttt tttatttag 19
<210> 50
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 50
gcagtttttt taaggagag 19
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 51
atcgttaggc ggcggt 16
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 52
tttgtatata tttttttatt t 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 53
ctaaaccgac acataaattc 20
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Based on Homo sapiens
<400> 54
tttttcgtta agttt 15
机译: 通过使用下一代系统对HLA基因扩增子进行深度测序来对混合物进行定量分析,从而对固体器官移植排斥反应进行无创早期检测
机译: 通过使用下一代系统对HLA基因扩增子进行深度测序来对混合物进行定量分析,从而对固体器官移植排斥进行无创早期检测
机译: 检测肺癌早期DNA甲基化标记的试剂盒及检测方法